專利名稱：抗百合無癥病毒的單克隆抗體及其用途的制作方法
技術領域：
本發明所屬的領域為生物技術領域，尤其是涉及一種抗百合無癥病毒的單克隆抗體及其用途。
背景技術：
百合無癥病毒(Lily symptomless virus，LSV)是麝香石竹潛隱病毒屬(Carlavirus)成員，病毒粒子為略彎曲的線狀，無包膜，長610-700nm，直徑12-15nm，螺旋對稱結構。病毒基因組為單分子線形正義ssRNA，長8394nt，含有6個ORF，其中ORF5編碼32kD外殼蛋白，基因組RNA 3′端有一個Poly(A)。LSV的寄主范圍很窄，主要侵染百合科植物，單獨侵染百合寄主時表現為隱癥，與其它病毒復合侵染時則可引起嚴重的田間癥狀，直接影響了百合的花和球莖質量，給花卉生產帶來重大經濟損失。LSV在我國百合產地廣泛流行，感染率很高，因而迫切需要建立快速、準確、簡單方便的檢測方法，為該病毒病的診斷和防治，脫毒種球的生產提供技術支撐和物質支持。目前，已報道的LSV的檢測方法有電鏡觀測和多抗組合成的血清學檢測方法兩種，但電鏡觀測法需要昂貴的電子顯微鏡而不能普及，多抗組合成的血清學檢測方法由于多抗存在非特異性高、準確性和均質性差、產量有限等缺陷而使這些血清學方法存在不足，本研究運用我們研制的LSV特異性單克隆抗體具有特異性強、均質性好、可無限量生產等優點從而使用該單抗建立的ELISA血清學方法具有準確性強、易標準化和大規模生等特點。此方法已有效地用于LSV在田間作物上的檢測，為該病毒病的診斷和防治，脫毒種苗的生產服務。
發明內容
本發明的目的是提供一種抗百合無癥病毒的單克隆抗體及其用途。
2A2、5H9、5H2和5E12共4株單克隆抗體腹水的間接ELISA效價在10-6以上；5H9和5E12的抗體類型及亞類均為IgG1，而2A2和5H2均為IgG3，4株單克隆抗體的輕鏈均為κ鏈；4株抗百合無癥病毒單抗識別4個不相關的抗原結合位點；4株單抗均與百合無癥病毒有特異性反應，而與其他病毒無交叉反應。
用單克隆抗體建立ACP-ELISA、DAS-ELISA、和TAS-ELISA方法檢測百合無癥病毒。
本發明的優點是1)提供的LSV病毒特異性單克隆抗體，運用ACP-ELISA、DAS-ELISA、和TAS-ELISA能夠高度特異、準確、靈敏的檢測LSV；2)利用本發明所制備的單克隆抗體檢測LSV，不需要昂貴的電子顯微鏡設備；3)利用本發明所制備的單克隆抗體，可有效地用于田間作物LSV的檢測。
具體實施例方式
本發明制備了LSV的特異性強、效價高、穩定性好、能大量生產的單克隆抗體，并用這些單抗建立了檢測LSV具有高度特異性、靈敏性和正確性的快速診斷方法，即ELISA，可為百合脫毒鑒定和抗病育種提供有力的技術和產品支持，對該病毒病的綜合防治及增產保收提供直接的理論依據和技術保障，同時，可應用于進出口檢驗，檢疫及LSV疫情調查分析等方面。
單克隆抗體的制備1.免疫原的制備將LSV分離于浙江麗水地區的百合，用10％PEG離心沉淀和蔗糖不連續密度梯度方法提取LSV。病毒提純液經2％磷鎢酸(pH6.7)染色后置JEOL，JEM-1200EX電鏡下觀察粒子形態。
2.免疫動物用提取LSV病毒免疫四周齡體重18-20g BALB/C雌性小鼠1mg/ml提取LSV病毒0.5ml與等體積福氏完全佐劑混合，充分乳化后，經背腹部皮下多點注射0.2ml每只，間隔3周，取與一免等量抗原和等體積的福氏不完全佐劑充分乳化后，第二次腹腔注射0.2ml每只，過3周后用加倍劑量的抗原進行腹腔注射，3天后取脾細胞進行融合。
3.細胞融合取上述免疫小鼠脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞(SP2/0)按5-10∶1的比例，在無血清的RPMI-1640(Gibco)培養基中混勻，1500rpm離心5min，去除培養基，用50％PEG(Sigma)作為融合劑，在37℃下水浴下加入0.5-0.7ml，使其融合2min，用無血清的RPMI-1640培養基終止融合后1500rpm離心5min，沉淀用HAT培養基懸浮，分裝到96孔含有飼養細胞的細胞板中，37℃，5％CO2的細胞培養器皿中培養。
4.雜交瘤細胞、陽性孔的篩選及其克隆細胞培養器皿中培養5天后，用HAT培養基換液一次，第10天用HT培養基換液，等到融合細胞覆蓋孔底5％-50％時，常規間接ELISA方法篩選陽性孔，共獲150多個對LSV有反應的陽性孔，陽性率為28％。選擇6個呈強陽性反應的細胞孔，進行有限稀釋法克隆，獲得2A2、5H9、5H2和5E12共4株能分泌抗LSV的特異性抗體的雜交瘤細胞株。經6個月以上體外傳代和多次凍存復蘇后，4株細胞株均能良好生長，并穩定分泌抗體。經擴大培養后，用于腹水制備和液氮保存。
5.單克隆抗體的特異性檢測用提純的百合無癥病毒(LSV)、香石竹斑駁病毒(CarMV)、甘蔗花葉病毒(SCMV)、蕪菁花葉病毒(TuMV)、番茄花葉病毒(ToMV)、煙草花葉病毒(TMV)、黃瓜花葉病毒(CMV)、蠶豆萎蔫病毒1(BBWV-1)、蠶豆萎蔫病毒2(BBWV-2)、香石竹環斑病毒(CaRSC)、馬鈴薯X病毒(PVX)和馬鈴薯Y病毒(PVY)1ug/ml包被ELISA反應板，以相應的健葉提取液作陰性對照，用間接ELISA法，分別測定4株單抗的特異性反應。間接ELISA方法具體為上述病毒分別用包被液稀釋成1ug/mL后100ul/孔包被ELISA板，4℃過夜或37℃2小時，使其吸附于聚苯乙烯板孔；PBST洗滌三次后用1-10％的脫脂奶粉或1-3％BSA或3-6％牛血清封閉30-60min；加入單抗100ul/孔，37℃1-2小時；PBST洗滌三次后加入按說明書稀釋10000倍的堿性磷酸脂酶(AP)標記兔抗鼠IgG二抗(Sigma公司)100ul/孔，37℃1-2小時，PBST洗滌四次后，用PNPP底物顯色，2mol/L氫氧化鈉終止反應后，用酶標儀讀取OD405的值，以與陰性OD值比值大于2.1為陽性。結果發現，4株單抗對LSV有特異性反應，而與CarMV、TMV、ToMV，CMV，SCMV、PVY、PVX、BBWV1、BBWV2、TuMV、CaRSC其他病毒均無特異性反應。
6.單克隆抗體腹水制備及純化取8周齡左右BALB/C小鼠，腹腔注射0.3-0.5ml降植烷(Sigma)，7-10天后腹腔注入5-10×105個雜交瘤細胞，注射后7-10天可見小鼠腹部明顯膨大，采取腹水，3000rpm離心3min，收集上清液，即為單克隆抗體腹水。取1倍體積腹水加2倍體積0.06M PH4.8醋酸緩沖液稀釋，加辛酸(30ul/ml腹水)，室溫下邊加邊攪拌，4℃澄清1小時，12000rpm離心20min，收集上清，再用50％飽和硫酸銨沉淀免疫球蛋白，4℃放置2小時，3000rpm離心20min，沉淀用2倍體積的PBS溶液溶解，在4℃流動透析24小時后即獲純化的腹水抗體，-70℃保存。
7.單克隆抗體的亞類鑒定和腹水效價測定將純化的單抗腹水與Sigma公司的標準抗BALB/C小鼠IgG，IgG1，IgG2a，IgG2b、IgG3，IgM抗體，作雙向瓊脂擴散試驗，結果為，5H9和5E12的抗體類型及亞類均為IgG1，而2A2和5H2均為IgG3，4株單克隆抗體的輕鏈均為κ鏈。用常規間接ELISA方法檢測單抗腹水效價，結果為上述4株腹水效價均在10-6以上。
8.AP-抗LSV單克隆抗體結合物的制備將30mgAP和1.0mg純化的單克隆抗體混勻于0.5ml PBS(0.01mol/l、PH7.2)，加入戊二醛至終濃度為0.2％，于室溫下溫和攪拌2小時。反應物中加入10mMTris-HCL(pH8.0，0.15M NaC1，1MM MgCl2)至1ml，然后用上述Tris-HCL緩沖液于4C流動透析24小時。透析以后的產物即為AP-單克隆抗體結合物，結合物中加入滅菌甘油至50％(V/V)，于-20℃保存備用。
9.單克隆抗體識別位點分析3ug/ml抗原(提純LSV)100ul/孔于96孔ELISA板中，4℃包被過夜；用PBST洗滌三次，2％BSA 150ul/孔37℃，封閉1小時，加一種單抗腹水50ul及AP標記的另一種單抗50ul，37℃1小時；PBST洗滌三次后加硝基苯磷酸鹽底物100ul/孔，37℃20分鐘，OD405測定吸收值。以單抗腹水對同一AP標記的單抗抑制為100％，以已知無關單抗腹水對標記單抗的抑制為陰性對照，計算各單抗間的抑制率。即抑制率為(1-測定值OD/陰性對照值OD)X100。抑制率＞75％為相關，＞50％為不完全相關，＜50％為不相關，＜25％為完全不相關，結果表明4株抗LSV單抗識別4個不相關的抗原結合位點。
10.用單抗建立間接抗原包被ELISA(ACP-ELISA)方法檢測病毒ACP-ELISA方法的操作步驟(1)用碳酸鹽緩沖液(pH9.6)30倍稀釋的病葉汁液100ul/孔加入ELISA板，LSV病葉為陽性對照，相應健葉為陰性對照，37℃2h，或4℃過夜；(2)PBST洗滌后用5％脫脂奶粉封閉30min；(3)單抗腹水5000倍稀釋后100ul/孔，37℃ 1h；(4)PBST洗滌后加入5000倍稀釋的AP標記的羊抗鼠IgG結合物(Sigma)，100ul/孔，37℃，1h；(5)用PBST洗滌后加入硝基磷酸鹽底物100ul/孔，室溫30min；(6)用肉眼觀察，底物顏色變成黃綠色的孔為陽性，或用酶聯免疫檢測儀測OD405值，以P/N＞2.1作為陽性判斷標準。
ACP-ELISA方法檢測靈敏度檢測單抗腹水工作濃度為5000倍稀釋，對病葉從1∶5至5120作倍比稀釋，提純病毒(5mg/l)從1∶1000至1∶512000作倍比稀釋，分別以相應稀釋度的健葉汁液作陰性對照，進行上述ACP-ELISA方法檢測。結果表明ACP-ELISA方法對1∶5～500倍稀釋的病葉汁液均呈陽性反應，即對檢測病葉的靈敏度可達到1∶500，ACP-ELISA方法對純病毒的檢測靈敏度可達2ng/ml，每孔的病毒絕對量檢測為0.2ng。表現ACP-ELISA方法具有高度的靈敏性和可靠性。
11.LSV的單抗DAS-ELISA檢測方法1)抗LSV的一株單抗5000倍稀釋100ul/孔包被聚苯乙烯板，37℃，2-4h或4℃，過夜；2)PBST洗滌三次后加1-10％的脫脂奶粉或1-3％BSA或3-6％牛血清封閉200ul/孔于37℃封閉30-60min3)加入檢測樣品100ul/孔。以LSV為陽性對照，以相應的健康樣品作陰性對照，37℃1-2h；4)PBST洗滌后加入10000倍稀釋堿性磷酸脂酶(AP)標記另一單抗結合物100ul/孔，37℃1-2h5)PBST洗滌后加PNPP底物于室溫顯色5-30min，2mol/L氫氧化鈉終止反應后，肉眼觀察底物顏色變成黃綠色的孔為陽性或用680型酶聯免疫檢測儀測405nm的OD值，以P/N＞2.1作為陽性判斷標準。
DAS-ELISA方法檢測靈敏度檢測對病葉從1∶5至5120作倍比稀釋，提純病毒(5mg/l)從1∶1000至1∶1024000作倍比稀釋，分別以相應稀釋度的健葉汁液作陰性對照，進行上述DAS-ELISA方法檢測。結果表明DAS-ELISA方法對1∶5～1000倍稀釋的病葉汁液均呈陽性反應，即對檢測病葉的靈敏度可達到1∶1000，DAS-ELISA對純病毒的檢測靈敏度可達0.2ng/ml，每孔的病毒絕對量檢測為0.02ng。表現DAS-ELISA方法具有高度的靈敏性和可靠性。
12.LSV的TAS-ELISA檢測方法12.1.TAS-ELISA方法的操作流程1)抗LSV的兔抗血清(本所自制)100ul/孔包被聚苯乙烯板，37℃，2-4h或4℃，過夜；2)PBST洗滌三次后加1-10％的脫脂奶粉或1-3％BSA或3-6％牛血清封閉200ul/孔于37℃封閉30-60min3)加入檢測樣品100ul/孔。以LSV為陽性對照，以相應的健康樣品作陰性對照，37℃1-2h；4)洗滌后用封閉液稀釋的單抗腹水100ul/孔，37℃1-2h5)PBST洗滌后加入10000倍稀釋堿性磷酸脂酶(AP)標記兔抗鼠IgG二抗結合物(Sigma)100ul/孔，37℃1-2h6)PBST洗滌后加PNPP底物于室溫顯色5-30min，2mol/L氫氧化鈉終止反應后，肉眼觀察底物顏色變成黃綠色的孔為陽性或用680型酶聯免疫檢測儀測405nm的OD值，以P/N＞2.1作為陽性判斷標準。
12.2.TAS-ELISA檢測方法最適條件的確定采用TAS-ELISA方陣試驗進行，即橫向加兔抗LSV血清(本所自制)用包被緩沖液從1∶100至1∶102400倍比稀釋；LSV 1ug/ml；縱向加用PBST緩沖液從1∶5至1∶2048000倍比稀釋單抗腹水；AP標記的兔抗鼠IgG二抗按Sigma公司說明書稀釋，1∶10000倍；按TAS-ELISA方法流程進行操作。結果為LSV的兔抗血清最適稀釋度均為1∶6000；2A2、5H9、5H2和5E12的最適稀釋度分別為1∶8000，1∶10000，1∶5000，1∶10000。
12.3.TAS-ELISA方法檢測靈敏度的確定在兔抗血清和單抗腹水最適工作濃度下，將1ug/ml的LSV用含1-3％BSAPBST倍比稀釋后進行TAS-ELISA測定，結果為TAS-ELISA檢測4株單抗的靈敏度均在0.01ng以上，說明本方法具有很好的靈敏度。
13.上述ELISA方法的田間檢測LSV的應用利用制備的LSV單抗建立的上述ELISA方法對田間百合進行檢測。在浙江麗水地區百合上采收呈病毒癥狀的病樣，作1∶30倍稀釋，然后進行上述ELISA檢測，用健株汁液作陰性對照，接種LSV的汁液作陽性對照。檢測結果表明，百合上LSV的帶毒率很高，47％樣品呈陽性，與電鏡觀察檢測結果一致，這表明所制備的單克隆抗體和建立的上述ELISA方法能很好的用于田間LSV的檢測，同時，明確了百合無癥病毒是田間百合上流行的主要病毒種類。
權利要求
1.一種抗百合無癥病毒的單克隆抗體，其特征是，2A2、5H9、5H2和5E12共4株單克隆抗體腹水的間接ELISA效價在10-6以上；5H9和5E12的抗體類型及亞類均為IgG1，而2A2和5H2均為IgG3，4株單克隆抗體的輕鏈均為κ鏈；4株抗百合無癥病毒單抗識別4個不相關的抗原結合位點；4株單抗均與百合無癥病毒有特異性反應，而與其他病毒無交叉反應。
2.一種如權利要求1所述抗百合無癥病毒的單克隆抗體的用途，其特征是，用單克隆抗體建立ACP-ELISA、DAS-ELISA、和TAS-ELISA方法檢測百合無癥病毒。
全文摘要
本發明公開了一種抗百合無癥病毒的單克隆抗體及其用途。用提純的百合無癥病毒免疫的BALB/C鼠脾細胞與SP2/0鼠骨髓瘤細胞融合，經篩選克隆，獲得4株能穩定傳代并分泌抗百合無癥病毒(LSV)單克隆抗體(MAb)的雜交瘤細胞，并分別制備它們的單抗腹水。4株單克隆抗體腹水間接ELISA效價在10
文檔編號G01N33/569GK1683412SQ200510049388
公開日2005年10月19日 申請日期2005年3月17日 優先權日2005年3月17日
發明者吳建祥, 洪健, 劉成科, 周雪平, 葉美琴 申請人:浙江大學