專利名稱：一種伏馬菌素b1的薄層層析測定方法
技術領域：
本發明涉及的是一種真菌產生的毒素的分析測試技術，特別是對飼料、食品，尤其是玉米污染的毒素分析測試技術。
背景技術：
伏馬菌素是一組主要由串珠鐮刀菌產生的真菌毒素，迄今為止，已發現的伏馬菌素相關組分包括FB1、FB2、FB3、FB4；FA1和FA2(分別為FB1、FB2的N-乙酰基衍生物)；FBS的水解產物，FC1、FC2、FC3、FC4和FP1。它們在世界范圍內污染飼料和食品，尤其是玉米。伏馬菌素毒性大而且在世界范圍內分布廣泛，它們在食品安全中的意義，已經引起越來越多的關注。國際癌癥研究機構已將鐮刀菌毒素列為2B類物質，可能的致癌物質。
伏馬菌素可引起馬腦白質軟化癥(equine leukoencephalomalacia，ELEM)，用伏馬菌素飼料喂馬，腦部病理學檢查發現有明顯的肝病樣改變和延髓髓質水腫；引起豬的肺水腫病(porcine pulmonary oedema，PPE)，使豬的胰腺發生病變，肝臟和肺部嚴重損傷。豬攝入含有伏馬菌素的飼科后，最典型的病變為胸膜腔積水和肺水腫，并伴有胰臟和肝臟損傷；對雞胚具有致病性和致死性，早期雞胚變化包括腦積水、啄大、頸長，病理改變包括肝、腎、心、肺、肌肉骨骼系統和腸等；對大鼠具有腎臟損傷，包括細胞增生、變性和細胞程序性死亡。在對懷孕大鼠的影響研究中發現，FB1無致畸作用。但可引起母鼠神情淡漠、食欲不振、消瘦、吞食仔鼠、甚至死亡，并使胎仔產前死亡數增加、體重減輕、頂臀長度變短、腦水腫和骨骼異常發生率增加，仔鼠毒性可能與母鼠毒性有關。組織學檢查顯示肝腎病變，并出現肝細胞質改變和個別肝細胞壞死。
關于伏馬菌素B1的檢測國外已建立了多種方法，已報道的方法主要有酶聯免疫(ELISA)、高效液相色譜(HPLC)、液相色譜-質譜聯用(LC-MS)、薄層色譜(TLC)、氣相色譜(GC)和毛細管電泳。迄今被AOAC(Association ofOfficial Analytical Chemists)接納為其公定方法的伏馬菌素檢測方法只有一個，即“液相色譜測定玉米中伏馬菌素B1，B2，B3”。
目前國內尚沒有成形的薄層層析法檢測伏馬菌素B1。在伏馬菌素的眾多檢測方法中，國外學者多采用HPLC和LC-MS，這些方法需要昂貴精密的儀器設備，而我國幅員遼闊，各地區經濟發展不平衡，大部分基層實驗室根本不具備這些條件，使這些方法的推廣應用受到限制。薄層層析分析法，方法簡單易行，檢測成本低廉，適于我國具體國情。
發明內容
本發明的目的在于提供一種既簡單易行又經濟可靠的測試伏馬菌素B1方法。
本發明的技術方案為(1)制作標準溶液準確吸取2mL乙腈-水(1∶1，V/V)的混合溶液加入1mg伏馬菌素B1標準品中，輕輕振搖，使之溶解，避光，置于-4℃冰箱保存。該標準溶液為0.5mg/mL。準確吸取0.2mL標準溶液于1mL離心管中，加乙腈-水(1∶1，V/V)混合液至刻度，混勻。此溶液每毫升相當于100μg伏馬菌素B1；按此法逐級配制成每毫升相當于50μg，25μg，5μg，1μg；(2)制作樣品溶液稱取50g粉碎并通過120目篩的樣品，置于250mL具塞錐形瓶中，加入100mL甲醇-水(3∶1，V/V)混合溶液，在瓶塞上涂上一層水，蓋嚴防漏。振蕩30min后，離心混合液(3000r/min，10min)，取上清液50mL，于40～60℃水浴蒸發近干，用甲醇溶解，定容至5mL，3000r/min離心10min，過濾得上清液。將SAX柱安裝到鐵架臺上，依次用5mL甲醇、5mL甲醇-水(3∶1，V/V)活化柱子；取3mL濾液過柱(流速≤2mL/min)，然后依次用5mL甲醇-水(3∶1，V/V)、3mL甲醇洗柱，不要讓柱子干。用3mL冰乙酸-甲醇(1∶99，V/V)洗脫伏馬菌素(流速≤1mL/min，應特別注意控制)，洗脫液收集于5mL離心管中，作為玉米樣品分析液；(3)測試可在兩種硅膠板上測試①在硅膠HSG板上，點樣，點樣量為5μL，用氯仿∶甲醇∶水∶乙酸(55∶36∶8∶1)作展開劑，展開后FB1的Rf值為0.53。用香草醛溶液作為顯色劑，顯色后，伏馬菌素FB1(以下簡稱FB1)的斑點呈淡灰色～紫紅色，檢出限為5μg/mL，5μL，即25ng；②在硅膠F254板上，點樣，點樣量為5μL，用氯仿∶甲醇∶水∶乙酸(55∶36∶8∶1)展開后，FB1的Rf值為0.39。用香草醛溶液作為顯色劑，顯色后，FB1的斑點呈淡灰色～蘭紫色，檢出限為1μg/mL，5μL，也就是5ng。標準樣和分析樣同時點樣，可測試樣品是否含有FB1。
本發明所述的香草醛溶液為1％香草醛硫酸乙醇溶液，制備方法為在燒杯中加入19mL無水乙醇，小心量取1mL濃硫酸沿杯壁緩緩倒入，邊加邊攪拌，待燒杯放涼后，稱取0.2g香草醛溶于此乙醇溶液中，置棕色瓶中避光保存。使用時需臨用現配。
本發明所述的顯色過程為將顯色劑噴于板上，立即揮干(可用電吹風)。
目前國內尚沒有成形的薄層層析法檢測伏馬菌素B1。在伏馬菌素的眾多檢測方法中，國外學者多采用HPLC和LC-MS，這些方法需要昂貴的精密儀器，而我國大部分基層實驗室根本不具備這些條件，使這些方法的推廣應用受到限制。薄層層析法與其相比，雖然精密度以及最低檢測限不如采用HPLC等方法，但是薄層層析方法無需精密儀器設備，可以準確檢測出各種糧食食品中的伏馬菌素B1的存在，既簡單易行又經濟可靠。經過大量的與HPLC方法對比實驗，薄層層析法檢測結果與HPLC檢測結果相一致，可知對于糧食食品中的伏馬菌素B1檢測，薄層層析法的準確度和可靠性良好。
具體實施例方式
實施例1標準溶液配制及在兩種硅膠板上測試①準確吸取2mL乙腈-水(1∶1，V/V)的混合溶液加入1mg伏馬菌素B1(北京百靈威公司)標準品中，輕輕振搖，使之溶解，避光，置于-4℃冰箱保存。該標準溶液為0.5mg/mL。
②準確吸取0.2mL標準溶液(0.5mg/mL)于1mL離心管中，加乙腈-水(1∶1，V/V)混合液至刻度，混勻。此溶液每毫升相當于100μg伏馬菌素B1。
③準確吸取0.5mL此稀釋液于1mL離心管中，加乙腈-水(1∶1，V/V)混合液至刻度，混勻。此溶液每毫升相當于50μg伏馬菌素B1。
④準確吸取0.3mL伏馬菌素B1標準溶液(50μg/mL)，置于1mL離心管中，加乙腈-水(1∶1，V/V)混合液0.3mL，混勻。此溶液每毫升相當于25μg伏馬菌素B1。
⑤準確吸取0.1mL伏馬菌素B1標準溶液(25μg/mL)，置于1mL離心管中，加乙腈-水(1∶1，V/V)混合液0.4mL，混勻。此溶液每毫升相當于5μg伏馬菌素B1。
⑥準確吸取0.1mL伏馬菌素B1標準溶液(5μg/mL)，置于1mL離心管中，加乙腈-水(1∶1，V/V)混合液0.4mL，混勻。此溶液每毫升相當于1μg伏馬菌素B1。
⑦在硅膠HSG、F254板上點樣、展開、顯色，結果如表1、表2所示表1 HSG香草醛顯色結果
在硅膠HSG上，香草醛的顯色效果較好，色差明顯，檢出限低，可達到5μg/mL ，5μL，也就是25ng，用氯仿∶甲醇∶水∶乙酸(55∶36∶8∶1)展開后，FB1的Rf值為0.53，斑點呈淡灰色～紫紅色。
表2 F254香草醛的顯色結果
在薄板F254上，用香草醛顯色的檢出限為1μg/mL，5μL，也就是5ng。在硅膠F254上，用氯仿∶甲醇∶水∶乙酸(55∶36∶8∶1)展開后，FB1的Rf值為0.39，斑點呈淡灰色～蘭紫色。
實施例2稱取50g粉碎過120目篩的玉米樣品，置于250mL具塞錐形瓶中，加入100mL甲醇-水(3∶1，V/V)混合溶液，在瓶塞上涂上一層水，蓋嚴防漏。振蕩30min后，離心混合液(3000r/min，10min)，取上清液50mL，用旋轉蒸發器于45～55℃水浴蒸發近干，用甲醇溶解，定容至5mL，3000r/min離心10min，過濾上清液。
將SAX柱安裝到鐵架臺上，依次用5mL甲醇，5mL甲醇-水(3∶1，V/V)活化柱子，取3mL濾液過柱(流速≤2mL/min)，然后依次用5mL甲醇-水(3∶1，V/V)，3mL甲醇洗柱，不要讓柱子干。用3mL冰乙酸-甲醇(1∶99，V/V)洗脫伏馬菌素(流速≤1mL/min，應特別注意控制)，洗脫液收集于5mL離心管中，作為玉米樣品分析液，進行薄層分析。
取薄層板F254，用FB1標準使用液(25μg/mL)和玉米樣品分析液點樣，點樣量為5μL，用氯仿∶甲醇∶水∶乙酸(55∶36∶8∶1)展開，噴以香草醛顯色。
結果表明，與標準品斑點同一Rf值處，出現淡灰色的斑點鑒定其為伏馬菌素B1。
實施例3稱取50g粉碎過120目篩的花生樣品，置于250mL具塞錐形瓶中，加入100mL甲醇-水(3∶1，V/V)混合溶液，在瓶塞上涂上一層水，蓋嚴防漏。振蕩30min后，離心混合液(3000r/min，10min)，取上清液50mL，用旋轉蒸發器于45～55℃水浴蒸發近干，用甲醇溶解，定容至5mL，3000r/min離心10min，過濾上清液。
將SAX柱安裝到鐵架臺上，依次用5mL甲醇，5mL甲醇-水(3∶1，V/V)活化柱子，取3mL濾液過柱(流速≤2mL/min)，然后依次用5mL甲醇-水(3∶1，V/V)，3mL甲醇洗柱，不要讓柱子于。用3mL冰乙酸-甲醇(1∶99，V/V)洗脫伏馬菌素(流速≤1mL/min，應特別注意控制)，洗脫液收集于5mL離心管中，作為玉米樣品分析液，進行薄層分析。
取薄層板F254，用FB1標準使用液(25μg/mL)和花生樣品分析液點樣，點樣量為5μL，用氯仿∶甲醇∶水∶乙酸(55∶36∶8∶1)展開，噴以香草醛顯色。
結果表明，與標準品斑點同一Rf值處，出現淡灰色的斑點，鑒定其為伏馬菌素B1。
實施例4稱取50g粉碎過120目篩的玉米樣品，置于250mL具塞錐形瓶中，加入100mL甲醇-水(3∶1，V/V)混合溶液，在瓶塞上涂上一層水，蓋嚴防漏。振蕩30min后，離心混合液(3000r/min，10min)，取上清液50mL，用旋轉蒸發器于45～55℃水浴蒸發近干，用甲醇溶解，定容至5mL，3000r/min離心10min，過濾上清液。
將SAX柱安裝到鐵架臺上，依次用5mL甲醇，5mL甲醇-水(3∶1，V/V)活化柱子，取3mL濾液過柱(流速≤2mL/min)，然后依次用5mL甲醇-水(3∶1，V/V)，3mL甲醇洗柱，不要讓柱子干。用3mL冰乙酸-甲醇(1∶99，V/V)洗脫伏馬菌素(流速≤1mL/min，應特別注意控制)，洗脫液收集于5mL離心管中，作為玉米樣品分析液，進行薄層分析。
取薄層板HSG，用FB1標準使用液(25μg/mL)和玉米樣品分析液點樣，點樣量為5μL，用氯仿∶甲醇∶水∶乙酸(55∶36∶8∶1)展開，噴以香草醛顯色。
結果表明，與標準品斑點同一Rf值處，出現淡灰色的斑點，鑒定其為伏馬菌素B1。
實施例5稱取50g粉碎過120目篩的花生樣品，置于250mL具塞錐形瓶中，加入100mL甲醇-水(3∶1，V/V)混合溶液，在瓶塞上涂上一層水，蓋嚴防漏。振蕩30min后，離心混合液(3000r/min，10min)，取上清液50mL，用旋轉蒸發器于45～55℃水浴蒸發近干，用甲醇溶解，定容至5mL，3000r/min離心10min，過濾上清液。
將SAX柱安裝到鐵架臺上，依次用5mL甲醇，5mL甲醇-水(3∶1，V/V)活化柱子，取3mL濾液過柱(流速≤2mL/min)，然后依次用5mL甲醇-水(3∶1，V/V)，3mL甲醇洗柱，不要讓柱子干。用3mL冰乙酸-甲醇(1∶99，V/V)洗脫伏馬菌素(流速≤1mL/min，應特別注意控制)，洗脫液收集于5mL離心管中，作為花生樣品分析液，進行薄層分析。
取薄層板HSG，用FB1標準使用液(25μg/mL)和花生樣品分析液點樣，點樣量為5μL，用氯仿∶甲醇∶水∶乙酸(55∶36∶8∶1)展開，噴以香草醛顯色。
結果表明，與標準品斑點同一Rf值處，出現淡灰色的斑點，鑒定其為伏馬菌素B1。
權利要求
1.一種伏馬菌素B1的測定方法，其特征在于薄層層析測試方法，操作步驟為(1)制作標準溶液準確吸取2mL體積比為1∶1的乙腈-水的混合溶液加入1mg伏馬菌素B1標準品中，使之溶解，該標準溶液為0.5mg/mL；準確吸取0.2mL標準溶液于1mL離心管中，加體積比為1∶1的乙腈-水混合液至刻度，混勻；此溶液每毫升相當于100μg伏馬菌素B1；按此法逐級配制成每毫升相當于50μg，25μg，5μg，1μg；(2)制作樣品溶液稱取50g粉碎過120目篩的樣品，置于250mL具塞錐形瓶中，加入100mL體積比為3∶1的甲醇-水溶液，蓋嚴防漏，振蕩30min后，以3000r/min速度離心混合液10min，取上清液50mL，于40～60℃水浴蒸發近干，用甲醇溶解，定容至5mL，再3000r/min離心10min，過濾得上清液，依次用5mL甲醇，5mL體積比為3∶1的甲醇-水活化SAX柱子；取3mL濾液過柱，流速≤2mL/min，然后依次用5mL體積比為3∶1的甲醇-水、3mL甲醇洗柱，用3mL體積比為1∶99冰乙酸-甲醇洗脫伏馬菌素，流速≤1mL/min，洗脫液收集于5mL離心管中，作為樣品分析液；(3)測試在硅膠板上測試在硅膠F254板上用25μg/mL的FB1標準液和樣品分析液點樣，點樣量為5μL，用體積比為55∶36∶8∶1氯仿∶甲醇∶水∶乙酸混合液展開，噴以香草醛溶液顯色；與標準品斑點同一Rf值處，出現淡灰色的斑點，鑒定其為伏馬菌素B1。
2.根據權利要求1所述伏馬菌素B1的測定方法，其特征在于在硅膠板上測試，所述硅膠板為硅膠HSG板。
3.根據權利要求1所述伏馬菌素B1的測定方法，其特征在于所述的香草醛溶液為1％香草醛硫酸乙醇溶液，制備方法為在燒杯中加入19mL無水乙醇，小心量取1mL濃硫酸沿杯壁緩緩倒入，邊加邊攪拌，待燒杯放涼后，稱取0.2g香草醛溶于此乙醇溶液中，置棕色瓶中避光保存，使用時需臨用現配。
4.根據權利要求1所述伏馬菌素B1的測定方法，其特征在于所述的顯色，是將香草醛溶液噴于板上，立即揮干。
全文摘要
伏馬菌素B1的測定方法準確吸取2mL 1∶1的乙腈－水的混合液加入1mg伏馬菌素B1標準品中，使之溶解，該標準溶液為0.5mg/mL，依次逐級配制成每毫升相當于100μg，50μg，25μg，5μg，1μg的標準樣；樣品加甲醇－水溶液，振蕩，離心取上清液水浴蒸發近干，再用甲醇溶解，定容再離心得上清液，用活化SAX柱子過柱，洗柱后用冰乙酸－甲醇洗脫伏為樣品液；在硅膠F254或HSG板上用25μg/mL的標準液和樣品液點樣，點樣量為5μL，用體積比為55∶36∶8∶1氯仿∶甲醇∶水∶乙酸混合液展開，以香草醛液顯色；與標準品斑點同一Rf值處出現色斑點，鑒定其為伏馬菌素B1。
文檔編號G01N1/28GK1773278SQ20051004752
公開日2006年5月17日 申請日期2005年10月19日 優先權日2005年10月19日
發明者侯紅漫, 張笑, 趙曉燕 申請人:大連輕工業學院