專(zhuān)利名稱(chēng):?jiǎn)渭?xì)胞藻流式分析微流控芯片的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及一種利用流式細(xì)胞儀原理設(shè)計(jì)制作的適用于海洋單細(xì)胞藻檢測(cè)的微流控芯片。
背景技術(shù):
微全分析系統(tǒng)(Micro-total analysis system,μ-TAS)概念的提出在分析科學(xué)領(lǐng)域產(chǎn)生了重大影響,引導(dǎo)化學(xué)分析設(shè)備向著微型化、集成化與便攜化的趨勢(shì)發(fā)展。它利用微加工工藝在芯片上制作微閥、微管道、微反應(yīng)器、微流量傳感器、微檢測(cè)器等功能單元構(gòu)成微型化學(xué)系統(tǒng)。微流控芯片系統(tǒng)具有高效、低耗、微型化和集成化的特點(diǎn),適于各類(lèi)現(xiàn)場(chǎng)分析和實(shí)時(shí)測(cè)定。1995年Mathies和Woolley首次采用微電泳芯片進(jìn)行了DNA測(cè)序研究,在有效分離長(zhǎng)度3.5cm的通道上,10min內(nèi)測(cè)序約150個(gè)堿基,準(zhǔn)確率97%。1998年Ramsey等在微流控芯片上集成了細(xì)胞消解、PCR擴(kuò)增和電泳分離等功能的微芯片基因分析系統(tǒng)。
流式細(xì)胞儀的工作原理是將待測(cè)細(xì)胞染色后制成單細(xì)胞懸液,用一定壓力將待測(cè)樣品壓入流動(dòng)室,不含細(xì)胞的磷酸緩沖液在高壓下從鞘液管?chē)姵?,鞘液管入口方向與待測(cè)樣品流成一定角度,這樣,鞘液就能夠包繞著樣品高速流動(dòng),組成一個(gè)圓形的流束,待測(cè)細(xì)胞在鞘液的包被下單行排列,依次通過(guò)檢測(cè)區(qū)域。
使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)微型浮游植物正為越來(lái)越多的研究者所采用,Paau等和Yentsch等都作了相關(guān)研究,促進(jìn)了流式細(xì)胞計(jì)在海洋微型浮游植物檢測(cè)中的運(yùn)用。流式細(xì)胞儀通常以激光作為發(fā)光源。經(jīng)過(guò)聚焦整形后的光束,垂直照射在樣品流上,細(xì)胞體內(nèi)色素及其他物質(zhì)在激光束的照射下,產(chǎn)生散射光和激發(fā)熒光。前向角散射光的強(qiáng)度與細(xì)胞的大小有關(guān)。側(cè)向散射光的測(cè)量主要用來(lái)獲取有關(guān)細(xì)胞內(nèi)部精細(xì)結(jié)構(gòu)的顆粒性質(zhì)的有關(guān)信息。特定波長(zhǎng)熒光信號(hào)的強(qiáng)度代表了所測(cè)單細(xì)胞藻中色素的組成和含量。但目前,流式細(xì)胞儀價(jià)格昂貴,結(jié)構(gòu)復(fù)雜,不適用于現(xiàn)場(chǎng)分析,微流控芯片的出現(xiàn)為流式細(xì)胞技術(shù)的現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用提供了可能。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種微型、便攜且適于現(xiàn)場(chǎng)分析的微流控芯片,它可以對(duì)海洋單細(xì)胞藻進(jìn)行計(jì)數(shù)和種群組成分析。
本發(fā)明是以標(biāo)準(zhǔn)光刻技術(shù)為基礎(chǔ),以玻璃為微流控芯片材料,在芯片上構(gòu)建微通道和微儲(chǔ)液池,使樣品的進(jìn)樣、檢測(cè)集成在芯片上來(lái)完成。微流控芯片包括結(jié)構(gòu)對(duì)稱(chēng)的基片和蓋片,在基片和蓋片上構(gòu)建有液流系統(tǒng)和用于檢測(cè)的光纖通道。液流系統(tǒng)采用ψ型結(jié)構(gòu),中間通道為樣品通道,兩側(cè)支通道稱(chēng)為鞘流通道,鞘流通道的作用是樣品中的藻細(xì)胞以單行排列,樣品通道與鞘流通道尺寸一致,鞘流通道為1/4圓弧狀,樣品通道與鞘流通道端點(diǎn)切線(xiàn)方向相一致,這樣鞘流與樣品流同向匯合,避免液流匯合產(chǎn)生渦流擾動(dòng),保證了液流系統(tǒng)的穩(wěn)定性;樣品通道與鞘流通道的末端分別構(gòu)建有儲(chǔ)液池,樣品通道的另一端還有一廢液池;在芯片上構(gòu)建與進(jìn)樣通道垂直的光纖通道,使激光器耦合光纖水平插入該通道,將激發(fā)光引入到分離通道的檢測(cè)區(qū)域附近。在進(jìn)樣通道的另一側(cè)與入射光光纖通道平行的位置構(gòu)建光纖通道,用于將前向散射光引入相應(yīng)檢測(cè)器。在芯片進(jìn)樣通道監(jiān)測(cè)區(qū)域上方安置光學(xué)檢測(cè)系統(tǒng),檢測(cè)熒光和側(cè)向散射光,當(dāng)藻細(xì)胞經(jīng)過(guò)檢測(cè)口時(shí),受到激光照射,產(chǎn)生熒光(黃熒光、紅熒光、綠熒光)和散射光(前向散射和側(cè)向散射),通過(guò)對(duì)幾種光信號(hào)的綜合分析,對(duì)藻進(jìn)行計(jì)數(shù)和分類(lèi)。該芯片省去了由多個(gè)光學(xué)元件才能完成的三維準(zhǔn)直、反射和會(huì)聚復(fù)雜光路系統(tǒng),將光傳輸過(guò)程中的強(qiáng)度損失降到最低,實(shí)現(xiàn)了微流控芯片系統(tǒng)的微型化、便攜化和集成化的特點(diǎn)。
本發(fā)明將流式細(xì)胞儀液流系統(tǒng)和光學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)集成,體現(xiàn)了微流控芯片系統(tǒng)的微型化和集成化的特點(diǎn),適于各類(lèi)現(xiàn)場(chǎng)分析和實(shí)時(shí)測(cè)定。廣泛應(yīng)用于單細(xì)胞藻、培養(yǎng)細(xì)胞、血球等領(lǐng)域。
本發(fā)明的微流控芯片的設(shè)計(jì)和制作方法如下所述A.將根據(jù)微流控芯片結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)的芯片圖形制成掩膜,圖形區(qū)為透明區(qū),可透射光,非圖形區(qū)為黑色區(qū),吸光而不能透射光。
B.將掩膜覆蓋在63mm×63mm×1.5mm的勻膠鉻板(鉻型LRC;鉻厚T145nm膠類(lèi)正性感光膠;膠厚570nm)上,在紫外線(xiàn)照射下曝光,感光膠發(fā)生光化學(xué)反應(yīng)。
C.曝光后的鉻板在顯影液中顯影,以除去被曝光的正性感光膠,掩膜上的圖形被復(fù)制到光膠層上。
D.室溫下用鉻膜刻蝕液(硫酸鈰∶高氯酸∶水=50克∶15毫升∶300毫升)腐蝕裸露的鉻膜,高純水沖洗干凈后,烘干。光膠層上的圖形被轉(zhuǎn)移到了基片上,同時(shí)保證非圖形區(qū)的光膠層和鉻膜不被破壞。
E.濕法刻蝕微通道。以0.5M HF/0.5M NH4F為刻蝕劑刻蝕微通道,速率約為10μm/h,得橫截面為梯形的凹微通道。再依次用丙酮和鉻膜刻蝕液除去殘存的光膠層和鉻膜,用高純水沖洗干凈即得干凈透明的基片。
F.在基片的儲(chǔ)液池位置用微型臺(tái)鉆處打孔,作為芯片出入口。
G.截取與基片同樣尺寸的勻膠鉻板,依次用丙酮、鉻膜刻蝕液浸泡2分鐘,以除去光膠層和鉻膜,高純水沖洗干凈即得蓋片。
H.將基片與蓋片依次在丙酮、H2O-H2O2-NH4OH(5∶1∶1)溶液、H2SO4∶H2O2(4∶1)溶液和高純水中超聲清洗5-10分鐘,氮?dú)獯蹈?,然后在超凈環(huán)境中將兩者對(duì)齊密封。高溫下鍵合,升溫程序?yàn)橐?0℃/min從室溫升至550℃,時(shí)間30分鐘;以20℃/min從550℃升至610℃,時(shí)間30分鐘;以20℃/min從610℃升至635℃,時(shí)間30分鐘;以10℃/min從635℃升至650℃,時(shí)間6小時(shí);然后自然冷卻到室溫。
本發(fā)明在利用流式細(xì)胞儀基本原理設(shè)計(jì)制作的微流控芯片上構(gòu)建了實(shí)現(xiàn)流式細(xì)胞技術(shù)所需的液流系統(tǒng)和檢測(cè)通道,實(shí)現(xiàn)了單細(xì)胞藻流式分析系統(tǒng)的微型化、集成化和簡(jiǎn)單化;制造成本低,易于實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化和規(guī)?;a(chǎn)。
圖1是本發(fā)明的微流控芯片的結(jié)構(gòu)示意圖。
其中,1-樣品入口;2,3-鞘流入口;4-廢液池;5-樣品通道;6,7-鞘流通道;8-通道交匯點(diǎn);9-入射光纖通道,10-出射光纖通道。
圖2是單細(xì)胞藻流式分析芯片系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)示意圖。
其中,11,12,13-微型泵;14,16-鞘流;15-樣品;17,18,19-熒光檢測(cè)器;20-側(cè)向散射光檢測(cè)器;21-帶通濾波器;22-二向色濾光片;23-激光器,24-檢測(cè)器。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合附圖并通過(guò)具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明。
實(shí)施例1微流控芯片的結(jié)構(gòu)如圖1所示,微流控芯片結(jié)構(gòu)分兩部分液流系統(tǒng)和檢測(cè)系統(tǒng)。液流系統(tǒng)采用ψ型結(jié)構(gòu),中間通道為樣品通道5,兩側(cè)支通道為鞘流通道6和7,鞘流通道的作用是使樣品中的藻細(xì)胞呈單行排列,樣品通道5與鞘流通道6和7尺寸一致,鞘流通道為1/4圓弧狀,鞘流通道6和7在交匯點(diǎn)8的切線(xiàn)方向與樣品通道5方向相一致,這樣,鞘流與樣品流同向匯合,避免液流匯合產(chǎn)生渦流擾動(dòng),保證了液流系統(tǒng)的穩(wěn)定性;在芯片上構(gòu)建與樣品通道垂直的光纖通道9,10,使激光器23耦合光纖水平插入該通道,將激發(fā)光引入到分離通道的檢測(cè)區(qū)域附近。在進(jìn)樣通道的另一側(cè)與入射光光纖通道平行的位置構(gòu)建光纖通道,用于將前向散射光引入檢測(cè)器24。在芯片進(jìn)樣通道檢測(cè)區(qū)域上方安置光學(xué)檢測(cè)系統(tǒng),熒光檢測(cè)器17,18,19和側(cè)向散射光檢測(cè)器20分別接收相應(yīng)光信號(hào),當(dāng)藻細(xì)胞經(jīng)過(guò)檢測(cè)口時(shí),受到激光照射,產(chǎn)生熒光(紅熒光、黃熒光、綠熒光)和散射光(前向散射和側(cè)向散射),熒光和散射光通過(guò)二向色濾光片22和帶通濾波器21的選擇性透射和反射,到達(dá)相應(yīng)檢測(cè)器。通過(guò)對(duì)幾種光信號(hào)的綜合分析,對(duì)藻進(jìn)行計(jì)數(shù)和分類(lèi)。該芯片省去了由多個(gè)光學(xué)元件才能完成的三維準(zhǔn)直、反射和會(huì)聚復(fù)雜光路系統(tǒng),將光傳輸過(guò)程中的強(qiáng)度損失降到最低,實(shí)現(xiàn)了微流控芯片系統(tǒng)的微型化、便攜化和集成化的特點(diǎn)。
實(shí)施例2微流控芯片的制作1.玻璃基片的制作掩膜膠片上微通道的尺寸設(shè)計(jì)流體通道,30μm;光纖通道,60μm;光纖通道與分離通道間的距離d400μm。將掩膜膠片置于63mm×63mm×1.5mm的勻膠鉻板上,紫外線(xiàn)曝光180秒(波長(zhǎng)365nm),顯影液中顯影100秒后,100℃下烘干半小時(shí)。在室溫下用鉻膜刻蝕液(硫酸鈰∶高氯酸∶水=50克∶15毫升∶300毫升)腐蝕鉻膜,然后用高純水沖洗干凈,烘干。通過(guò)數(shù)碼顯微鏡攝像,測(cè)得鉻板上的通道尺寸為流體通道,40μm;光纖通道,70μm。用0.5M HF/0.5M NH4F刻蝕劑腐蝕裸露的硼硅玻璃,速率約為10μm/h,刻蝕6小時(shí)后,再依次用丙酮、鉻膜刻蝕液除去殘余光膠層和鉻膜,即得基片。用微型臺(tái)鉆打孔,鉆頭為1mm的金剛鉆頭,孔的直徑即為液池直徑1mm。顯微鏡下測(cè)定微通道尺寸微流體通道,上底寬160μm,下底寬50μm,深度60μm;光纖通道,上底寬190μm,下底寬80μm,深度60μm;光纖通道與分離通道間的距離d340μm;將除光纖通道外的其他區(qū)域用膠帶保護(hù)好,繼續(xù)刻蝕光纖通道,直到通道尺寸達(dá)到上底寬600μm,下底寬80μm,深度270μm;光纖通道與分離通道間的距離d120μm2.蓋片的制作與基片制作方法相同,構(gòu)造相同,但不打孔。
3.將基片與蓋片依次在丙酮、H2O-H2O2-NH4OH(5∶1∶1)溶液、H2SO4∶H2O2(4∶1)溶液和高純水中超聲清洗5-10分鐘,用氮?dú)獯蹈?,然后在超凈環(huán)境中將兩者對(duì)齊密封,高溫下鍵合。升溫程序?yàn)橐?0℃/min從室溫升至550℃,時(shí)間30分鐘;以20℃/min從550℃升至610℃,時(shí)間30分鐘;以20℃/min從610℃升至635℃,時(shí)間30分鐘;以10℃/min從635℃升至650℃,時(shí)間6小時(shí)。然后自然冷卻到室溫。經(jīng)顯微鏡下觀測(cè),鍵合后通道無(wú)變形,且達(dá)到完全密封。鍵合后的芯片微通道呈橢圓形,樣品通道長(zhǎng)軸長(zhǎng)約190μm,短軸長(zhǎng)約120μm;光線(xiàn)通道長(zhǎng)軸約600μm,短軸約540μm。
實(shí)施例3微流控芯片分析檢測(cè)系統(tǒng)如圖2所示,在樣品通道5的進(jìn)口1接進(jìn)樣泵12,兩側(cè)鞘流通道6和7在其入口2和3處接鞘流14,16。樣品和鞘流液通過(guò)泵11、12和13輸送,鞘流與樣品同向流動(dòng),鞘流液與樣品在匯合點(diǎn)8匯合后以層流的形式向前流動(dòng),通過(guò)調(diào)節(jié)鞘流和樣品流速,使樣品中細(xì)胞呈單行排列,并向前移動(dòng)通過(guò)檢測(cè)區(qū),在檢測(cè)區(qū)域細(xì)胞被來(lái)自光纖的激光激發(fā),通道另一側(cè)的光纖接受前向散射光,并將其傳輸?shù)焦鈱W(xué)檢測(cè)器24,側(cè)向的光經(jīng)二向色濾光片22和帶通濾波器21的分光、濾光,分別被側(cè)向散射光檢測(cè)器20、紅色熒光檢測(cè)器17、黃色熒光檢測(cè)器18和綠色熒光檢測(cè)器19接收記錄,綜合各類(lèi)光信號(hào)得到微型浮游植物數(shù)量和群落結(jié)構(gòu)的信息。
權(quán)利要求
1.一種單細(xì)胞藻流式分析微流控芯片,其特征在于它包括結(jié)構(gòu)對(duì)稱(chēng)的基片和蓋片,在基片和蓋片上構(gòu)建有包括中間樣品通道和兩側(cè)鞘流通道的ψ型結(jié)構(gòu)的液流系統(tǒng)和用于檢測(cè)的光纖通道。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微流控芯片,其特征在于所述的鞘流通道為1/4圓弧狀,樣品通道與鞘流通道通端點(diǎn)切線(xiàn)方向相一致。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微流控芯片,其特征在于所述的光纖通道與進(jìn)樣通道互相垂直。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微流控芯片,其特征在于它是以玻璃為材料制作的。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種單細(xì)胞藻流式分析微流控芯片,它包括結(jié)構(gòu)對(duì)稱(chēng)的基片和蓋片,在基片和蓋片上構(gòu)建有包括中間樣品通道和兩側(cè)鞘流通道的ψ型液流系統(tǒng)和用于檢測(cè)的光纖通道;樣品通道與鞘流通道尺寸一致,鞘流通道為1/4圓弧狀,樣品通道與鞘流通道端點(diǎn)切線(xiàn)方向相一致;在芯片上構(gòu)建與進(jìn)樣通道垂直的光纖通道,使激光器耦合光纖水平插入該通道,將激發(fā)光引入到分離通道的檢測(cè)區(qū)域附近;在芯片進(jìn)樣通道監(jiān)測(cè)區(qū)域上方安置光學(xué)檢測(cè)系統(tǒng),檢測(cè)熒光和側(cè)向散射光,通過(guò)對(duì)光信號(hào)的綜合分析,對(duì)藻進(jìn)行計(jì)數(shù)和分類(lèi)。該芯片省去了由多個(gè)光學(xué)元件才能完成的三維準(zhǔn)直、反射和會(huì)聚復(fù)雜光路系統(tǒng),將光傳輸過(guò)程中的強(qiáng)度損失降到最低,實(shí)現(xiàn)了微流控芯片系統(tǒng)的微型化、便攜化和集成化的特點(diǎn)。
文檔編號(hào)G01N15/00GK1712926SQ20051004385
公開(kāi)日2005年12月28日 申請(qǐng)日期2005年6月19日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月19日
發(fā)明者王修林, 蘇榮國(guó), 韓秀榮 申請(qǐng)人:中國(guó)海洋大學(xué)