專利名稱：磷酸化及對應非磷酸化蛋白質多克隆抗體在制備疾病診斷試劑中的應用及其制備方法
技術領域：
本發明涉及一種蛋白質多克隆抗體的新用途及其制備方法，具體涉及一種抗特定位點氨基酸磷酸化蛋白質多克隆抗體及對應非磷酸化蛋白質多克隆抗體在制備疾病診斷試劑中的應用及其制備方法。本發明的抗體制備方法，實際是一種可以應用于疾病診斷的試劑的制備方法，這些疾病包括與蛋白質磷酸化狀態和程度相關聯疾病，如腫瘤、神經系統疾病、老年病等，診斷手段包括酶聯免疫測定法(ELISA)、免疫印跡測定法(Western Blot)和免疫組織化學(IHC)。
背景技術：
當前利用免疫方法來診斷疾病的方法，一般都是通過檢測病變細胞分泌不同于正常細胞的特異性蛋白或某種分泌明顯增加或減少的特征蛋白，來區分正常細胞和病變細胞，對于那些僅僅出現蛋白質分子修飾的改變(如可逆性磷酸化)而無蛋白質表達量改變的疾病，現行方法是不能檢測的，而許多信號轉導通路相關的疾病的發生機理，就是因為發生蛋白質修飾的改變，根據目前的研究結果，已能證明很多疾病在某些蛋白的幾個特定位點磷酸化程度明顯增強或減弱。這就提示我們能夠利用抗這種蛋白的幾個特定位點氨基酸磷酸化蛋白抗體，通過檢測該蛋白幾個特定位點的磷酸化狀態和程度來區分病變細胞與正常細胞，從而達到診斷疾病的目的。但是目前的現有技術中沒有這種診斷疾病的試劑和方法。
具體地說蛋白質的大多數調控機制是通過蛋白質的構象變化介導的，而構象發生變化常常是通過變構效應和蛋白質一級結構上發生的各種共價修飾來實現的。其中，磷酸化是最常見、最重要的共價修飾方式。蛋白質加上或者切除一個或多個磷酸基，不但會改變它的立體構象，并且會改變它的表面電荷，從而改變它的功能或表現出其它的功能。可以說，蛋白質的磷酸化與脫磷酸化是細胞內普遍存在的一種共價修飾的生理調節方式，幾乎涉及所有的生理及病理過程，如代謝、生長發育、神經遞質的合成與釋放、甚至癌變等。
最早關于蛋白質磷酸化可以調節酶活性的報道是在1955年(Fischer andKrebs)，但蛋白質磷酸化在調節細胞生理上的重要性直到二十幾年后才得到重視，目前，蛋白質的可逆磷酸化在控制細胞對胞外刺激的反應過程中的重要作用已經得到廣泛的認知，而且細胞的生長、發育、分化及許多其他受到信號轉導調控的生理學反應大多都建立在蛋白質可逆磷酸化的基礎之上。細胞信號轉導的各個系統中，一個共同的環節就是由蛋白激酶和蛋白磷酸酶催化的蛋白質可逆磷酸化反應，它對于信號的快速、精確傳遞起著無可替代的作用。
隨著生命科學和醫學研究的發展，人們已認識到許多疾病的發生發展與細胞信號轉導的阻滯或錯誤等異常情況有密切的關系。如保羅·格林加德發現，蛋白質磷酸化可影響神經細胞內具有不同功能的一系列蛋白質。其中一些蛋白組成了細胞膜上的離子通道。當某一特定的離子通道被磷酸化時，這一神經細胞的功能也就發生改變，譬如興奮性的改變。(Greengard P.Phosphorylated proteins as physiological effectors.Science.1978，199(4325)146-52.)保羅·格林加德由于此項研究與其他兩位兩位研究神經細胞信號轉導的科學家一起分享了2000年諾貝爾生理學或醫學獎。
近期研究表明細胞周期蛋白依賴性激酶功能失調與阿爾茨海默病的tau蛋白的異常磷酸化和細胞的異常APP代謝有關，其在阿爾茨海默病的發病過程中可能發揮重要作用。
細胞癌變最基本的特征是生長失控及分化異常。近年來人們認識到絕大多數的癌基因表達產物都是細胞信號轉導系統的組成成分，它們可以從多個環節干擾細胞信號轉導過程，導致腫瘤細胞增殖與分化異常。某些癌基因可通過編碼非受體TPK或絲/蘇氨酸激酶類影響細胞信號轉導過程。例如src癌基因產物具有較高的TPK活性，可催化下游信號轉導分子的酪氨酸磷酸化，促進細胞異常增殖。
Rb基因是最早發現的腫瘤抑制基因，定位于核內，有磷酸化和非磷酸化兩種形式，非磷酸化形式稱活性型，能促進細胞分化，抑制細胞增殖。處于分裂增殖的腫瘤細胞只含有磷酸化型的Rb蛋白。說明Rb蛋白的磷酸化修飾作用對細胞生長、分化起著重要的調節作用。Rb基因對腫瘤的抑制作用與轉錄因子(E-2F)有關。E-2F是一類激活轉錄作用的活性蛋白，低磷酸化型的Rb蛋白與E-2F結合成復合物，使E-2F處于非活化狀態；Rb蛋白被磷酸化后與E-2F解離，E-2F變成游離狀態，于是細胞增殖活躍，導致腫瘤發生。
楊志芳等研究抑癌基因PTEN發現，PTEN可依賴其磷酸酶活性抑制FAK和Akt的磷酸化，并誘導肝癌細胞發生失巢調亡。(楊志芳等.PTEN依賴其磷酸酶活性誘導肝癌細胞發生失巢凋亡機制的探討。中華腫瘤雜志2005，27(5))。
朱吉莉等研究發現，AKT的磷酸化具有明顯的Ang II濃度依賴性，隨AngII濃度的增加而逐漸受到抑制，并與細胞凋亡指數呈顯著負相關(r-0.90。P＜0.01)。由此認為Ang II可以誘導腎小管上皮細胞凋亡并抑制細胞的增殖，可能部分是通過抑制PI3K-AKT信號傳導途徑實現的(朱吉莉等血管緊張素II通過抑制AKT/蛋白激酶B磷酸化誘導腎小管上皮細胞凋亡。中華腎臟病雜志2005，21(3))。
傅志超等的研究表明，在γ射線誘發的小鼠白血病骨髓細胞中，癌變組骨髓細胞中P44/42MAPK蛋白及磷酸化水平均高于輻射未癌變組和對照組。(傅志超等P44/42MAPK和STAT3在γ射線誘發的小鼠白血病骨髓細胞中的表達。生物化學與生物物理進展2003，30(2)199-203)。
以上研究證明，細胞內蛋白質一些特定位點的磷酸化程度和狀態與許多疾病相關，由此我們認為利用抗特定位點氨基酸磷酸化蛋白抗體，通過檢測組織或細胞中某些蛋白質特定位點的磷酸化程度和狀態，能夠達到準確診斷某些疾病的目的。
抗特定位點氨基酸磷酸化蛋白抗體是基于細胞信號轉導領域研究飛速發展的需要而開發出來的新型研究工具，具有特異性好，操作簡捷可靠，結果容易判定，應用方式多樣等特點，目前在信號轉導基礎研究領域已得到廣泛應用，人們通過這類抗體可以直接檢測組織或細胞中目標蛋白的磷酸化狀態和程度，從而可以比較病變細胞與正常細胞的區別，達到揭示疾病發生機理的目的。
傳統的磷酸化蛋白質的分析是利用體外激酶反應使蛋白質被磷酸化修飾，產生足夠用于分析的磷酸化蛋白，經化學或質譜分析確定磷酸化位點，例如Edman測序和串聯質譜測序。此法雖然證明了特定的磷酸化位點體外研究的生物學意義，但必須證實體內情況下，發生功能作用的磷酸化位點與其相同。這一點，通常通過比較磷酸化蛋白質的二維磷酸肽圖得以證實，如果體內和體外磷酸肽在二維圖譜中共遷移，則可認為磷酸化位點相同。這個方法不能直接分析出體內蛋白質磷酸化情況，且比較煩瑣，成本高，不可能普及應用于疾病診斷。因此，在抗特定位點氨基酸磷酸化蛋白抗體開發出來以前，幾乎不可能通過臨床檢測患者的蛋白磷酸化狀態和程度來診斷疾病。
通過放射性同位素標記鑒定磷酸化位點也是研究磷酸化蛋白的傳統方法，但很難在組織樣品中應用，且放射性同位素對操作人員的健康和環境都是有害的。雖然現在已經用非同位素來代替放射性同位素做標記，但這種方法一次只能分析一個目的蛋白，也不適應醫院臨床診斷。
另外，抗特定位點氨基酸磷酸化蛋白抗體應用于磷酸化蛋白研究僅僅幾年，還未見用于臨床診斷，主要因為目前能規模化生產的抗特定位點氨基酸磷酸化蛋白抗體種類還不多，很多理論上能用于疾病診斷的抗體的產量很低，僅能提供研究用。
發明內容
本發明的目的是提供一種抗特定位點氨基酸磷酸化蛋白質多克隆抗體及對應非磷酸化蛋白質多克隆抗體在制備疾病診斷試劑中的應用方法，以及這種抗特定位點氨基酸磷酸化蛋白質多克隆抗體及對應非磷酸化蛋白質多克隆抗體的制備方法。利用本發明可以進行診斷的疾病包括與蛋白質磷酸化狀態和程度相關聯疾病，如腫瘤、神經系統疾病、老年病等多種與細胞信號轉導異常相關的疾病；診斷手段包括酶聯免疫測定法(ELISA)、免疫印跡測定法(Western Blot)和免疫組織化學(IHC)。
完成上述發明任務的技術方案是抗特定位點氨基酸磷酸化蛋白質多克隆抗體及對應非磷酸化蛋白質多克隆抗體在制備疾病診斷試劑中的應用，所述的抗特定位點氨基酸磷酸化蛋白質多克隆抗體及對應非磷酸化蛋白質多克隆抗體是指以一端帶半胱氨酸(Cys)的，長度為13-15個氨基酸的，其中含有磷酸化氨基酸的多肽為半抗原，用磺基琥珀酰亞胺4-[N甲基馬來酸]-1-羧環已烷(Sul-SMCC)做偶聯劑，與鑰孔嘁血藍蛋白(KLH)連接成半抗原-載體蛋白系統，經一定免疫程序免疫兔子后，取血分離血清，血清經兩步抗原親和層析后純化出抗特定位點氨基酸磷酸化蛋白和抗對應非磷酸化蛋白的多克隆抗體。
以上方案的進一步細化，所述的抗特定位點氨基酸磷酸化蛋白質多克隆抗體及對應非磷酸化蛋白質多克隆抗體為分別選擇目標蛋白的氨基酸序列中，其磷酸化狀態和程度與蛋白質功能相關聯的氨基酸兩側的氨基酸序列，設計并人工合成數對多肽，每對多肽序列相同，N端或C端天然帶有或人為添加一個半胱氨酸(Cys)，其中一條多肽鏈上至少包含一個相當于上述特定磷酸化位點的氨基酸為磷酸化氨基酸。也就是說，以上方案中也包括在一條合成多肽同時包含2個或2個以上位點的磷酸化氨基酸的情況；相應制備的抗體分別為抗上述不同位點氨基酸磷酸化的蛋白的多克隆抗體。
以上方案中所述的多肽的長度(氨基酸的數量)，對其作為抗原的活性沒有明顯影響，所以，在滿足上述限定特征的多肽上增加或減少一個或幾個氨基酸所構成的多肽，均應視為本方案的等同替代方案。本中請推薦采用13～15肽，特別是14肽。
其作為疾病診斷試劑的具體應用方法是1、使用抗特定位點磷酸化蛋白多克隆抗體的酶聯免疫檢測(ELISA)方法，包括間接法和雙抗體夾心法，均是通過ELISA方法檢測人細胞裂解液(人組織裂解液)中某一或幾種蛋白的磷酸化狀態和程度，即能夠達到準確診斷某些疾病的目的。
2、使用抗特定位點磷酸化蛋白多克隆抗體的免疫組織化學方法(Immunohistochemistry，IHC)是指用抗特定位點氨基酸磷酸化兔多克隆抗體通過IHC方法檢測人實體腫瘤石蠟切片中疾病相關蛋白磷酸化狀態和程度，達到準確診斷某些疾病的目的。
3、使用抗特定位點磷酸化蛋白抗體的免疫印跡法(Western Blot)是使用抗特定位點氨基酸磷酸化兔多克隆抗體通過檢測人細胞裂解液(組織裂解液)中某一或幾種蛋白的磷酸化狀態和程度，達到準確診斷某些疾病的目的。
抗特定位點氨基酸磷酸化蛋白質多克隆抗體及對應非磷酸化蛋白質多克隆抗體的制備方法，包括以下步驟分別選擇目標蛋白的氨基酸序列中，其磷酸化狀態和程度與蛋白質功能相關聯的氨基酸兩側的氨基酸序列，設計并人工合成數對多肽，每對多肽序列相同，N端或C端天然帶有或人為添加一個半胱氨酸(Cys)，其中多肽鏈上包含一個相當于上述特定磷酸化位點的氨基酸為磷酸化氨基酸，以該多肽為半抗原，用磺基琥珀酰亞胺4-[N甲基馬來酸]-1-羧環已烷(Sul-SMCC)做偶聯劑，與鑰孔嘁血藍蛋白(KLH)連接成半抗原-載體蛋白系統，經一定免疫程序免疫兔子后，取血分離血清，經兩步抗原親和層析后純化出抗特定位點氨基酸磷酸化蛋白和抗對應非磷酸化蛋白的多克隆抗體。
以上所述的“經一定免疫程序免疫兔子”可以采用現有技術中的常規動物免疫程序，例如采用本申請實施例中推薦的程序。
更具體和更優化地說，本發明中抗特定位點氨基酸磷酸化蛋白質多克隆抗體及對應非磷酸化蛋白質多克隆抗體的制備方法的步驟是1、合成多肽根據目標蛋白的氨基酸序列，選擇其磷酸化狀態和程度與蛋白質功能相關聯的位點的氨基酸兩側的氨基酸序列，分別設計并人工合成數對多肽，每對多肽序列相同，N端或C端天然帶有或人為添加一個半胱氨酸(Cys)，其中一條多肽鏈上，至少包括一個相當于上述特定位點的氨基酸為磷酸化氨基酸；2、用雙功能偶聯劑磺基琥珀酰亞胺4-[N甲基馬來酸]-1-羧環已烷(Sulfo-SMCC)作為偶聯劑，與鑰孔嘁血藍蛋白(KLH)上游離氨基反應，使之活化，然后用G25脫鹽柱去除未偶聯的SMCC，收集蛋白峰即為活化的KLH(即KLH-SMCC)；3、KLH-SMCC與多肽通過Cys上的巰基連接，構成適合用于免疫動物的多肽-KLH抗原系統。
4、按每只兔子300μg多肽-KLH的劑量對兔子實行基礎免疫，基礎免疫后第21天進行第一次加強免疫，以后每隔21天進行一次加強免疫，在第四次加強免疫完成后7天根據ELISA檢測結果，收集達到采血標準的陽性血清；5、制備親和層析用抗原柱選用已活化好的Sulfolink Gel，按2ml膠偶聯2mg多肽的比例將兩者混合，用半胱氨酸(Cys)封閉多余活化位點，將偶聯好的膠裝填在空層析柱中，用交聯緩沖液洗柱；6、親和層析將陽性血清過濾，并調整PH，已制備好的磷酸化多肽層析柱用PBS洗柱，然后取出與血清混合，將血清和膠的混合物重新裝入層析柱中，收集穿透液，然后用PH2.8的甘氨酸對結合了抗體的柱子進行洗脫，洗脫液迅速用PH7.6的Tris-HCl中和，測定洗脫液在波長280nm處的光吸收值(OD280)，收集OD2800.15以上的洗脫液，該洗脫液內含抗特定位點絲氨酸磷酸化蛋白多克隆抗體及非磷酸化蛋白多克隆抗體，將洗脫液與制備好的非磷酸化多肽層析膠反應，從非磷酸化多肽層析柱穿透出來的液體即含抗特定位點絲氨酸磷酸化蛋白多克隆抗體，從非磷酸化多肽層析柱洗脫下來的液體即為相對應抗原表位的非磷酸化蛋白多克隆抗體。
本申請推薦以下優化的具體操作方案1、合成多肽根據在Swiss-Prot站點中查得的目標蛋白的氨基酸序列，選擇其磷酸化狀態和程度與蛋白質功能相關聯的位點的氨基酸兩側的氨基酸序列，分別設計并人工合成數對多肽。每對多肽序列相同，N端或C端天然帶有或人為添加一個半胱氨酸(Cys)，其中一條多肽鏈上，至少包括一個相當于上述特定位點的氨基酸為磷酸化氨基酸；2、用雙功能偶聯劑磺基琥珀酰亞胺4-[N甲基馬來酸]-1-羧環已烷(Sulfo-SMCC)作為偶聯劑，與鑰孔嘁血藍蛋白(KLH)上游離氨基反應，使之活化，KLH與Sulfo-SMCC的質量比為4/1，然后用G25脫鹽柱去除未偶聯的SMCC，收集蛋白峰即為活化的KLH(即KLH-SMCC)；3、KLH-SMCC與多肽通過Cys上的巰基連接，構成適合用于免疫動物的多肽-KLH抗原系統。偶聯的具體步驟為合成多肽溶于純水中，然后與活化好的KLH混合，兩者的質量比為1∶1，該混合物4℃緩慢攪拌過夜，然后用2倍于多肽量的半胱氨酸(Cys)封閉KLH上的多余活化位點，封閉條件為4℃2小時，封閉結束后，多肽-KLH用10mMPBS透析，去除游離的多肽和半胱氨酸，即成偶聯好的抗原，該抗原在-70℃保存；4、按每只兔子300μg多肽-KLH的劑量對兔子實行基礎免疫，取規定劑量的KLH-多肽用10mMPBS稀釋至1ml，與1ml完全福氏佐劑混合，用雙聯注射器反復推拉，制成乳化劑，免疫途徑為皮下多點。基礎免疫后第21天進行第一次加強免疫，加強免疫使用的抗原劑量為200μg，抗原液體積仍為1ml，佐劑改用1ml不完全福氏佐劑，以后每隔21天進行一次加強免疫，期間采血分離血清，用BSA偶聯的多肽做檢測抗原，進行ELISA檢測，在第四次加強免疫完成后7天根據ELISA檢測結果，收集達到采血標準的陽性血清；5、制備親和層析用抗原柱選用已活化好的Sulfolink Gel，按2ml膠偶聯2mg多肽的比例將兩者混合，4℃緩慢攪拌過夜，然后用半胱氨酸(Cys)封閉多余活化位點，封閉完成后，將偶聯好的膠裝填在空層析柱中，用交聯緩沖液洗柱，最后用含0.05％疊氮鈉的保存液保存偶聯好的柱子，保存條件為4℃，磷酸化多肽和非磷酸化多肽各偶聯一根柱子；6、親和層析將陽性血清用0.45μm的濾器過濾，并用PH7.6的Tris-HCl調整血清的PH，Tris-HCl的使用量為血清量的10％，已制備好的磷酸化多肽層析柱用10mM PBS(磷酸緩沖生理鹽水洗柱)，然后取出與血清混合，4℃緩慢攪拌過夜，第二天將血清和膠的混合物重新裝入層析柱中，收集穿透液，然后用PH2.8的甘氨酸對結合了抗體的柱子進行洗脫，洗脫液迅速用PH7.6的Tris-HCl中和，測定洗脫液在波長280nm處的光吸收值(OD280)，收集OD2800.15以上的洗脫液，該洗脫液內含抗特定位點絲氨酸磷酸化蛋白多克隆抗體及非磷酸化蛋白多克隆抗體，將洗脫液與制備好的非磷酸化多肽層析膠反應，反應條件與洗脫方法同磷酸化多肽層析柱，從非磷酸化多肽層析柱穿透出來的液體即含抗特定位點絲氨酸磷酸化蛋白多克隆抗體，從非磷酸化多肽層析柱洗脫下來的液體即為相對應抗原表位的非磷酸化蛋白多克隆抗體。
7、兩種抗體經透析和濃縮后，加入50％甘油，即成為抗體試劑成品。
特異性抗磷酸蛋白的抗體，可以通過酶聯測試，免疫印記，熒光免疫，病理切片等手段，用于檢測病變的細胞如癌變細胞與正常細胞的區別，是蛋白質研究、細胞信號轉導研究、細胞病變研究、重大疾病診斷和新藥篩選的十分重要的工具。
本發明提供的抗特定位點氨基酸磷酸化蛋白質多克隆抗體及對應非磷酸化蛋白質多克隆抗體在制備疾病診斷藥物的試劑或藥物中的應用，為臨床疾病的診斷提供了新的工具。這些可被診斷的疾病包括與蛋白質磷酸化狀態和程度相關聯疾病，如腫瘤、神經系統疾病、老年病等，診斷手段包括酶聯免疫測定法(ELISA)、免疫印跡測定法(Western Blot)和免疫組織化學(IHC)。本發明提供的制備方法，能大量生產出抗這些與疾病相關磷酸化位點的蛋白的純化抗體，這些抗體適用于ELISA、Western Blot、IHC等常規免疫診斷的方法，且成本很低。
具體實施例方式
實施例1多克隆抗體制備方法1、合成多肽根據在Swiss-Prot站點中查得c-Jun的氨基酸序列，選擇73位點絲氨酸附近的序列，設計并人工合成兩條14肽，這兩條多肽序列相同，多肽鏈的N端或C端增加一個Cys，其中一條多肽鏈N端計算第7位(相當于c-Jun的第73位點)的絲氨酸為磷酸化氨基酸。
2、用雙功能偶聯劑磺基琥珀酰亞胺4-[N甲基馬來酸]-1-羧環已烷(Sulfo-SMCC)作為偶聯劑，與鑰孔嘁血藍蛋白(KLH)上游離氨基反應，使之活化。具體方法是將KLH復溶在雙蒸水中，加入Sulfo-SMCC(質量比KLH/SMCC為4/1)，室溫緩慢攪拌60分鐘，然后用G25脫鹽柱去除未偶聯的SM CC，收集蛋白峰即為活化的KLH(KLH-SMCC)，經測定活化得率在85％以上。
3、KLH-SMCC與多肽通過Cys上的巰基連接，構成適合用于免疫動物的多肽-KLH抗原系統。具體方法是將合成多肽溶于純水中，然后與活化好的KLH混合，兩者的質量比為1∶1，該混合物4℃緩慢攪拌過夜，然后用2倍于多肽量的半胱氨酸(Cys)封閉KLH上的多余活化位點，封閉條件為4℃2小時。封閉結束后，多肽-KLH用10mMPBS透析，去除游離的多肽和半胱氨酸。偶聯好的抗原在-70℃保存。
4、按每只兔子300μg多肽-KLH的劑量對兔子實行基礎免疫，具體方法是取規定劑量的多肽-KLH用10mMPBS稀釋至1ml，與1ml完全福氏佐劑混合，用雙聯注射器反復推拉，制成乳化劑，對兔子進行基礎免疫，免疫途徑為皮下多點。基礎免疫后第21天進行第一次加強免疫，加強免疫使用的抗原劑量為200μg，抗原液體積仍為1ml，佐劑改用1ml不完全福氏佐劑，免疫途徑為皮下多點和肌肉。以后每隔21天進行一次加強免疫，期間采血分離血清，用BSA偶聯的多肽做檢測抗原，進行ELISA檢測。在第四次加強免疫完成后7天根據ELISA檢測結果，收集達到采血標準的陽性血清。按照上述方法，四次加強免疫完成后，兔子的血清滴度均達到1∶64000以上，免疫效果極佳。
5、制備親和層析用抗原柱選用已活化好的Sulfolink Gel，按2ml膠偶聯2mg多肽的比例將兩者混合，4℃緩慢攪拌過夜，然后用半胱氨酸(Cys)封閉多余活化位點，封閉完成后，將偶聯好的膠裝填在空層析柱中，用交聯緩沖液洗柱，最后用含0.05％疊氮鈉的保存液保存偶聯好的柱子，保存條件為4℃。磷酸化多肽和非磷酸化多肽各偶聯一根柱子。
6、親和層析將陽性血清用0.45μm的濾器過濾，并用PH7.6的Tris-HCl(三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液)調整血清的PH，Tris-HCl的使用量為血清量的10％。已制備好的磷酸化多肽層析柱用10mM PBS洗柱，然后取出與血清混合，4℃緩慢攪拌過夜，第二天將血清和膠的混合物重新裝入層析柱中，收集穿透液，然后用PH2.8的甘氨酸對結合了抗體的柱子進行洗脫，洗脫液迅速用PH7.6的Tris-HCl中和，測定洗脫液在波長280nm處的光吸收值(OD280)，收集OD2800.15以上的洗脫液，該洗脫液內含抗第73位點絲氨酸磷酸化c-Jun蛋白多克隆抗體及非磷酸化c-Jun蛋白多克隆抗體，將洗脫液與制備好的非磷酸化多肽層析膠反應，反應條件與洗脫方法同磷酸化多肽層析柱，從非磷酸化多肽層析柱穿透出來的液體即為含抗第73位點絲氨酸磷酸化c-Jun蛋白多克隆抗體及非磷酸化c-Jun蛋白(67-79)多克隆抗體，從非磷酸化多肽層析柱洗脫下來的液體即為相對應抗原表位的非磷酸化c-Jun蛋白多克隆抗體。
7、兩種抗體經透析和濃縮后，加入50％甘油，即成為抗體試劑成品。
本實施例中描述的使用抗特定位點磷酸化蛋白多克隆抗體的酶聯免疫檢測(ELISA)共有二種，即間接法和雙抗體夾心法，均是通過ELISA方法檢測人細胞裂解液(人組織裂解液)中某一或幾種蛋白的磷酸化狀態和程度。
1、間接ELISA法人腫瘤細胞裂解液包被96孔酶標板，這些腫瘤包括乳腺癌、宮頸癌、卵巢癌、非小細胞肺癌、黑色素瘤、白血病、胃癌、前列腺癌、肝癌，同時以人正常細胞裂解液做對照，包被濃度5ug/孔，包被液為PH9.6的碳酸鈉溶液，包被條件為4℃過夜。第二天取出后，用含0.1％的PBS洗滌三次，以5％脫脂奶粉封閉多余位點，封閉條件為37℃1.5小時，封閉完成后洗滌三次，加入抗特定位點磷酸化蛋白的兔多克隆抗體，37℃反應1.5小時，洗滌三次后加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG，37℃反應1小時，洗滌三次，最后加入TMB底物，反應20分鐘后以2N硫酸中止反應，在酶標儀上讀取450nm處的OD值。結果表明抗特定位點磷酸化蛋白的兔多克隆抗體對以上腫瘤細胞裂解液均有不同程度的反應，而對正常細胞裂解液反應較弱。
2、雙抗體夾心法用抗某個抗原表位的純化非磷酸化蛋白兔多克隆抗體包被酶標板，包被濃度1ug/孔，包被液為PH7.4的PBS，包被條件為4℃過夜。洗滌封閉同ELISA間接法。然后加入腫瘤細胞裂解液(或組織裂解液)，腫瘤細胞的種類同ELISA間接法，以正常細胞裂解液(正常組織裂解液)做對照，室溫反應2小時，洗滌三次后加入生物素標記的純化抗特定位點磷酸化蛋白的兔多克隆抗體(該抗體與包被用抗體是針對同一蛋白分子不同抗原表位的)，37℃反應1小時，洗滌后加入辣根過氧化物酶標記的的親和素，37℃反應30分鐘，最后加入TMB底物，反應20分鐘后以2N硫酸中止反應，在酶標儀上讀取450nm處的OD值。在雙抗體夾心法中，先用純化非磷酸化蛋白兔多克隆抗體有效地捕捉裂解液中的總目標蛋白，然后用純化抗特定位點磷酸化蛋白的兔多克隆抗體檢測總蛋白中磷酸化蛋白的數量，用生物素-親和素系統能提高靈敏度，故所得的結果OD值明顯高于間接法，表明雙抗體夾心法比間接法更適合用來檢測組織或細胞裂解液中的目標蛋白及用于臨床診斷。
本實施例中描述的免疫印跡法(Western Blot)是使用抗特定位點氨基酸磷酸化兔多克隆抗體通過檢測人細胞裂解液(組織裂解液)中某一或幾種蛋白的磷酸化狀態和程度。
1、用常規方法制備SDS-PAGE膠，本實驗中選用10％分離膠和5％的分離膠，膠制備完成后，將各種細胞裂解液分別加入2×SDS樣品緩沖液，100℃煮沸5分鐘，然后將腫瘤細胞裂解液和正常細胞裂解液分別加入各泳道，100V恒壓跑濃縮膠，120V恒壓跑分離膠。
2、SDS-PAGE結束后，用常規方法將蛋白轉到硝酸纖維膜上，轉膜采用100mA恒流，在冷環境下轉膜2小時。轉膜后用5％脫脂奶粉4℃封閉過夜。
3、封閉完成的膜按泳道切成小條，與抗特定位點氨基酸磷酸化兔多克隆抗體反應，37℃1小時，洗滌后加入堿性磷酸酶標記的羊抗兔IgG，37℃1小時，洗滌后加入底物顯色。
實驗結果表明針對同一蛋白，不同腫瘤細胞的磷酸化程度不一樣，但大都高于正常細胞，因此，抗特定位點氨基酸磷酸化兔多克隆抗體，通過免疫印跡法檢測人腫瘤細胞裂解液中疾病相關蛋白的磷酸化狀態或程度用于臨床診斷是可行的。
本實施例中描述的免疫組織化學方法(Immunohistochemistry，IHC)是指用抗特定位點氨基酸磷酸化兔多克隆抗體，通過IHC方法檢測人實體腫瘤石蠟切片中疾病相關蛋白磷酸化狀態和程度。
1、按常規方法對人腫瘤組織石蠟切片進行脫蠟、水化、滅活酶、抗原修復、封閉等處理，這些腫瘤包括乳腺癌、宮頸癌、卵巢癌、非小細胞肺癌、胃癌、前列腺癌、肝癌。
2、將抗特定位點氨基酸磷酸化兔多克隆抗體稀釋到合適濃度，滴加到切片上，37℃，濕盒孵育1小時。
3、洗滌后滴加生物素標記的羊抗兔IgG，37℃，濕盒孵育30分鐘。
4、洗滌后滴加辣根過氧化物酶標記的親和素20ul，37℃，濕盒孵育30分鐘。
5、洗滌后加入AEC顯色試劑，濕盒，37℃顯色15分鐘。用蒸餾水中止顯色，然后用蘇木素復染。
6、將切片組織周圍的水份吸干，在每塊片子上面加入2滴AEC水性封片劑。
7、在顯微鏡下觀察結果。
實驗結果表明，人腫瘤組織切片中腫瘤細胞部分呈陽性染色，正常組織部分不著色或弱著色，表明抗特定位點氨基酸磷酸化兔多克隆抗體能特異檢測對應蛋白的磷酸化狀態或程度，用于某疾病相關蛋白的磷酸化狀態或程度檢測能用于臨床診斷該疾病。
實施例2，與實施例1基本相同，但有如下改變人工合成的兩條多肽改為根據c-Jun蛋白的氨基酸序列中63絲氨酸位點兩側氨基酸序列設計合成，長度改為13個氨基酸。
實施例3，與實施例1基本相同，但有如下改變人工合成的兩條多肽改為根據c-Jun蛋白的243絲氨酸位點兩側氨基酸序列設計合成，長度改為15個氨基酸。
實施例4，與實施例1基本相同，但有如下改變人工合成的兩條多肽改為根據c-Jun蛋白的91蘇氨酸位點兩側氨基酸序列設計合成，長度改為12個氨基酸。
實施例5，與實施例1基本相同，但有如下改變人工合成的兩條多肽改為根據c-Jun蛋白的氨基酸序列中93蘇氨酸位點兩側氨基酸序列設計合成，長度改為16個氨基酸。
實施例6，與實施例1基本相同，但有如下改變人工合成的兩條14肽改為根據c-Jun蛋白的氨基酸序列中239蘇氨酸位點兩側氨基酸序列設計合成。
實施例7，與實施例1基本相同，但有如下改變人工合成的兩條14肽改為根據c-Jun蛋白的氨基酸序列中170酪氨酸位點兩側氨基酸序列設計合成。
實施例8，與實施例1基本相同，但有如下改變人工合成的兩條14肽改為根據NFkB-p65蛋白的第276絲氨酸位點兩側氨基酸序列設計合成。
實施例9～12，與實施例1基本相同，但有如下改變人工合成的兩條14肽改為分別根據NFkB-p65蛋白的第276、468、536或311絲氨酸位點兩側氨基酸序列設計合成。
實施例13、14，與實施例1基本相同，但有如下改變人工合成的兩條14肽改為分別根據NFkB-p65蛋白的第254或435的蘇氨酸位點兩側氨基酸序列設計合成。
實施例15、16，與實施例1基本相同，但有如下改變人工合成的兩條14肽改為分別根據NFkB-p100/p52蛋白的第865或869的絲氨酸位點兩側氨基酸序列設計合成。
實施例17～22，與實施例1基本相同，但有如下改變人工合成的兩條14肽改為分別根據NFkB-p105/p50蛋白的第337、893、907、923、927或932絲氨酸位點兩側氨基酸序列設計合成。
實施例23、24，與實施例1基本相同，但有如下改變人工合成的兩條14肽改為分別根據Rel蛋白的第503絲氨酸位點，或第475的蘇氨酸位點兩側氨基酸序列設計合成。
實施例25、26，與實施例1基本相同，但有如下改變人工合成的兩條14肽改為分別根據JunB蛋白的第79或259的絲氨酸位點兩側氨基酸序列設計合成。
實施例27，與實施例1基本相同，但有如下改變人工合成的兩條14肽改為根據JunD蛋白的第255絲氨酸位點的兩側氨基酸序列設計合成。實施例28～36，與實施例1基本相同，但有如下改變人工合成的兩條14肽改為分別根據ATF-2蛋白的第44、94、322、349、472或480絲氨酸位點，或第51、53或55的蘇氨酸位點兩側氨基酸序列設計合成。
實施例37～41，與實施例1基本相同，但有如下改變人工合成的兩條14肽改為分別根據Myc蛋白的第62或373絲氨酸位點，或第58、358或400的蘇氨酸位點兩側氨基酸序列設計合成。
實施例42～25，與實施例1基本相同，但有如下改變人工合成的兩條14肽改為分別根據ELK1蛋白的第389或383的絲氨酸位點，或第417或400的蘇氨酸位點兩側氨基酸序列設計合成。
實施例46～49，與實施例1基本相同，但有如下改變人工合成的兩條14肽改為根據MEF2A蛋白的第355或408的絲氨酸位點，或第417或400的蘇氨酸位點兩側氨基酸序列設計合成。
實施例50～53，與實施例1基本相同，但有如下改變人工合成的兩條14肽改為分別根據MEF2C蛋白的第180或387的絲氨酸位點，或第293或300的蘇氨酸位點兩側氨基酸序列設計合成。
實施例54～56，與實施例1基本相同，但有如下改變人工合成的兩條14肽改為分別根據MEF2D蛋白的第180、212或444的絲氨酸位點兩側氨基酸序列設計合成。
實施例57～63，與實施例1基本相同，但有如下改變人工合成的兩條14肽改為分別根據GATA-1蛋白的第26、72、105、142、178、187或310的絲氨酸位點兩側氨基酸序列設計合成。
實施例64，與實施例1基本相同，但有如下改變人工合成的兩條14肽改為根據HNF-4α蛋白的第304的絲氨酸位點兩側氨基酸序列設計合成。實施例65～71，與實施例1基本相同，但有如下改變人工合成的兩條14肽改為分別根據IRF-3蛋白的第385、386、396、398、402或405絲氨酸位點，或第404的蘇氨酸位點兩側氨基酸序列設計合成。
實施例72、73，與實施例1基本相同，但有如下改變人工合成的兩條14肽改為分別根據STAT-1蛋白的第727絲氨酸位點，或第701的酪氨酸位點兩側氨基酸序列設計合成。
實施例74、75，與實施例1基本相同，但有如下改變人工合成的兩條14肽改為分別根據STAT-3蛋白的第727絲氨酸位點，或第705的酪氨酸位點兩側氨基酸序列設計合成。
實施例76、77，與實施例1基本相同，但有如下改變人工合成的兩條14肽改為根據STAT-4蛋白的第721絲氨酸位點，或第693酪氨酸位點的兩側氨基酸序列設計合成。
實施例78～81，與實施例1基本相同，但有如下改變人工合成的兩條14肽改為分別根據STAT-5A蛋白的第726或780絲氨酸位點，或第757的蘇氨酸位點，或第694的酪氨酸位點兩側氨基酸序列設計合成。。
實施例82～86，與實施例1基本相同，但有如下改變人工合成的兩條14肽改為分別根據STAT-5B蛋白的第730絲氨酸位點，或第699、679、724或742酪氨酸位點的兩側氨基酸序列設計合成。
實施例87～89，與實施例1基本相同，但有如下改變人工合成的兩條14肽改為分別根據STAT-6蛋白的第756絲氨酸位點，或第645蘇氨酸位點，或第641的酪氨酸位點兩側氨基酸序列設計合成。
實施例90～96，與實施例1基本相同，但有如下改變人工合成的兩條14肽改為分別根據CREB蛋白的第108、111、114、129、133、142或143的絲氨酸位點兩側氨基酸序列設計合成。
實施例97、98，與實施例1基本相同，但有如下改變人工合成的兩條14肽改為分別根據ATF-4蛋白的第219或245絲氨酸位點的兩側氨基酸序列設計合成。
實施例99～101，與實施例1基本相同，但有如下改變人工合成的兩條14肽改為分別根據c/EBP-α蛋白的第21絲氨酸位點，或第226或230的蘇氨酸位點的兩側氨基酸序列設計合成。
實施例102、103，與實施例1基本相同，但有如下改變人工合成的兩條14肽改為分別根據c/EBP-β蛋白的第288絲氨酸位點或第235的蘇氨酸位點兩側氨基酸序列設計合成。
實施例104，與實施例1基本相同，但有如下改變人工合成的兩條14肽改為根據MyoD蛋白的第115的蘇氨酸位點兩側氨基酸序列設計合成。
實施例105，與實施例1基本相同，但有如下改變人工合成的兩條14肽改為根據PPARG蛋白的第112的絲氨酸位點兩側氨基酸序列設計合成。實施例106～111，與實施例1基本相同，但有如下改變人工合成的兩條14肽改為分別根據AKT1蛋白的第124或473絲氨酸位點，或第308或450的蘇氨酸位點，或第326或474的酪氨酸位點的兩側氨基酸序列設計合成。
實施例112、113，與實施例1基本相同，但有如下改變人工合成的兩條14肽改為分別根據AKT2蛋白的第474絲氨酸位點，或第309的蘇氨酸位點兩側氨基酸序列設計合成。
實施例114～117，與實施例1基本相同，但有如下改變人工合成的兩條14肽改為分別根據AKT3蛋白的第120或472絲氨酸位點，或第305或447的蘇氨酸位點兩側氨基酸序列設計合成。
實施例118～121，與實施例1基本相同，但有如下改變人工合成的兩條14肽改為分別根據PDK1蛋白的第241絲氨酸位點，或第9、373或376的酪氨酸位點兩側氨基酸序列設計合成。
實施例122～128，與實施例1基本相同，但有如下改變人工合成的兩條14肽改為分別根據PTEN蛋白的第370、380或385的絲氨酸位點，或第382或383的蘇氨酸位點，或第240或315的酪氨酸位點兩側氨基酸序列設計合成。
實施例129～132，與實施例1基本相同，但有如下改變人工合成的兩條14肽改為分別根據FOXO-3A蛋白的第253、315或644的絲氨酸位點，或第32蘇氨酸位點兩側氨基酸序列設計合成。
實施例133～137，與實施例1基本相同，但有如下改變人工合成的兩條14肽改為分別根據FOXO-1A蛋白的第256、319、322或325的絲氨酸位點，或第24蘇氨酸位點兩側氨基酸序列設計合成。
實施例138～142，與實施例1基本相同，但有如下改變人工合成的兩條14肽改為分別根據FOXO-4蛋白的第197或262的絲氨酸位點、或第451或455的蘇氨酸位點兩側氨基酸序列設計合成。
實施例143～146，與實施例1基本相同，但有如下改變人工合成的兩條14肽改為分別根據eNOS蛋白的第614、632或1176絲氨酸位點，或第494蘇氨酸位點兩側氨基酸序列設計合成。
實施例147～152，與實施例1基本相同，但有如下改變人工合成的兩條14肽改為分別根據MEK1蛋白的第217、221或297的絲氨酸位點，或第285、291或385的蘇氨酸位點兩側氨基酸序列設計合成。
實施例153，與實施例1基本相同，但有如下改變人工合成的兩條14肽改為分別根據MEK2蛋白的第394蘇氨酸位點兩側氨基酸序列設計合成。
實施例154、155，與實施例1基本相同，但有如下改變人工合成的兩條14肽改為分別根據GSK3β蛋白的第9絲氨酸位點，或第216酪氨酸位點兩側氨基酸序列設計合成。
實施例156、157，與實施例1基本相同，但有如下改變人工合成的兩條14肽改為分別根據GSK3α蛋白的第21絲氨酸位點，或第279酪氨酸位點兩側氨基酸序列設計合成。
實施例158～172，與實施例1基本相同，但有如下改變人工合成的兩條14肽改為分別根據RAF蛋白的第29、43、233、259、289、296、339、/338、499、621或642的絲氨酸位點，或第269或491的蘇氨酸位點，或第340或341的酪氨酸位點兩側氨基酸序列設計合成。
實施例173～177，與實施例1基本相同，但有如下改變人工合成的兩條14肽改為分別根據Bcl-2蛋白的第70或87的絲氨酸位點，或第56、69或74蘇氨酸位點兩側氨基酸序列設計合成。
實施例178～180，與實施例1基本相同，但有如下改變人工合成的兩條14肽改為分別根據Bcl-XL蛋白的第62絲氨酸位點，或第47或115蘇氨酸位點兩側氨基酸序列設計合成。
實施例181～187，與實施例1基本相同，但有如下改變人工合成的兩條14肽改為分別根據BAD蛋白的第75、99、112、118、136或155絲氨酸位點，或第80蘇氨酸位點兩側氨基酸序列設計合成。
實施例188～198，與實施例1基本相同，但有如下改變人工合成的兩條14肽改為分別根據ER-α蛋白的第102、104、106、118、154、167、236、294或305的絲氨酸位點，或第311蘇氨酸位點，或第537酪氨酸位點兩側氨基酸序列設計合成。
實施例199～209，與實施例1基本相同，但有如下改變人工合成的兩條14肽改為PR蛋白的第20、81、102、130、162、190、213、294、345、400或676絲氨酸位點兩側氨基酸序列設計合成。
實施例210～220，與實施例1基本相同，但有如下改變人工合成的兩條14肽改為HER2蛋白的第1174絲氨酸位點，或第686蘇氨酸位點，或第877、1023、1112、1139、1172、1196、1221、1222或1248酪氨酸位點兩側氨基酸序列設計合成。
實施例221～239，與實施例1基本相同，但有如下改變人工合成的兩條14肽改為分別根據EGFR蛋白的第695、768、991、1026、1070、1071、1081、1166或1190絲氨酸位點，或第678或693的蘇氨酸位點，或第869、1016、1069、1092、1110、1125、1172或1197酪氨酸位點兩側氨基酸序列設計合成。
實施例240～247，與實施例1基本相同，但有如下改變人工合成的兩條14肽改為分別根據VEGFR2蛋白的第801、951、996、1008、1054、1059、1175或1214的酪氨酸位點兩側氨基酸序列設計合成。
實施例248～255，與實施例1基本相同，但有如下改變人工合成的兩條14肽改為分別根據IGF1R蛋白的第973、980、1161、1165、1166、1280、1281或1346酪氨酸位點兩側氨基酸序列設計合成。
實施例256～272，與實施例1基本相同，但有如下改變人工合成的兩條14肽改為分別根據P53蛋白的第6、9、15、20、33、37、46、215、315、366、376、378或392絲氨酸位點，或第18、55、81或387的蘇氨酸位點兩側氨基酸序列設計合成。
實施例273～283，與實施例1基本相同，但有如下改變人工合成的兩條14肽改為分別根據TAU蛋白的第199、202、214、235、262、356、396或404絲氨酸位點，或第181、205或231蘇氨酸位點兩側氨基酸序列設計合成。
權利要求
1.抗特定位點氨基酸磷酸化蛋白質多克隆抗體及對應非磷酸化蛋白質多克隆抗體在制備疾病診斷試劑中的應用，所述的抗特定位點氨基酸磷酸化蛋白質多克隆抗體及對應非磷酸化蛋白質多克隆抗體是指以一端帶半胱氨酸的，長度為13-15個氨基酸的，其中含有磷酸化氨基酸的多肽為半抗原，用磺基琥珀酰亞胺4-[N甲基馬來酸]-1-羧環己烷做偶聯劑，與鑰孔嘁血藍蛋白連接成半抗原-載體蛋白系統，經免疫程序免疫兔子后，取血分離血清，血清經兩步抗原親和層析后純化出抗特定位點氨基酸磷酸化蛋白和抗對應非磷酸化蛋白的多克隆抗體。
2.按照權利要求1所述的抗特定位點氨基酸磷酸化蛋白質多克隆抗體及對應非磷酸化蛋白質多克隆抗體在制備疾病診斷試劑中的應用，其特征在于，所述的抗特定位點氨基酸磷酸化蛋白質多克隆抗體及對應非磷酸化蛋白質多克隆抗體為分別選擇目標蛋白的氨基酸序列中，其磷酸化狀態和程度與蛋白質功能相關聯的氨基酸兩側的氨基酸序列，設計并人工合成數對多肽，每對多肽序列相同，N端或C端天然帶有或人為添加一個半胱氨酸，其中一條多肽鏈上至少包含一個相當于上述特定磷酸化位點的氨基酸為磷酸化氨基酸；相應制備的抗體分別為抗上述不同位點氨基酸磷酸化的蛋白的多克隆抗體。
3.按照權利要求1或2所述的抗特定位點氨基酸磷酸化蛋白質多克隆抗體及對應非磷酸化蛋白質多克隆抗體在制備疾病診斷試劑中的應用，其特征在于，所述的抗體作為疾病診斷試劑的具體應用方法是使用抗特定位點磷酸化蛋白多克隆抗體的酶聯免疫檢測方法，包括間接法和雙抗體夾心法，均是通過ELISA方法檢測人細胞裂解液中某一或幾種蛋白的磷酸化狀態和程度，即能夠達到準確診斷某些疾病的目的；使用抗特定位點磷酸化蛋白多克隆抗體的免疫組織化學方法是指用抗特定位點氨基酸磷酸化兔多克隆抗體通過IHC方法檢測人實體腫瘤石蠟切片中疾病相關蛋白磷酸化狀態和程度，達到準確診斷某些疾病的目的；使用抗特定位點磷酸化蛋白多克隆抗體的免疫印跡法是使用抗特定位點氨基酸磷酸化兔多克隆抗體通過檢測人細胞裂解液中某一或幾種蛋白的磷酸化狀態和程度，達到準確診斷某些疾病的目的。
4.一種權利要求1所述的抗特定位點氨基酸磷酸化蛋白質多克隆抗體及對應非磷酸化蛋白質多克隆抗體的制備方法，包括以下步驟分別選擇目標蛋白的氨基酸序列中，其磷酸化狀態和程度與蛋白質功能相關聯的氨基酸兩側的氨基酸序列，設計并人工合成數對多肽，每對多肽序列相同，N端或C端天然帶有或人為添加一個半胱氨酸，其中一條多肽鏈上至少包含一個相當于所述特定磷酸化位點的氨基酸為磷酸化氨基酸，以該多肽為半抗原，用磺基琥珀酰亞胺4-[N甲基馬來酸]-1-羧環己烷做偶聯劑，與鑰孔嘁血藍蛋白連接成半抗原-載體蛋白系統，經免疫程序免疫兔子后，取血分離血清，經兩步抗原親和層析后純化出抗特定位點氨基酸磷酸化蛋白和抗對應非磷酸化蛋白的多克隆抗體。
5.按照權利要求4所述的抗特定位點氨基酸磷酸化蛋白質多克隆抗體及對應非磷酸化蛋白質多克隆抗體的制備方法，其特征在于，具體步驟是合成多肽根據目標蛋白的氨基酸序列，選擇其磷酸化狀態和程度與蛋白質功能相關聯的位點的氨基酸兩側的氨基酸序列，分別設計并人工合成數對多肽，每對多肽序列相同，N端或C端天然帶有或人為添加一個半胱氨酸，其中一條多肽鏈上，至少包括一個相當于上述特定位點的氨基酸為磷酸化氨基酸；用雙功能偶聯劑磺基琥珀酰亞胺4-[N甲基馬來酸]-1-羧環己烷作為偶聯劑，與鑰孔嘁血藍蛋白上游離氨基反應，使之活化，然后用G25脫鹽柱去除未偶聯的SMCC，收集蛋白峰即為活化的KLH；KLH-SMCC與多肽通過Cys上的巰基連接，構成適合用于免疫動物的多肽-KLH抗原系統；按每只兔子300μg多肽-KLH的劑量對兔子實行基礎免疫，基礎免疫后第21天進行第一次加強免疫，以后每隔21天進行一次加強免疫，在第四次加強免疫完成后7天根據ELISA檢測結果，收集達到采血標準的陽性血清；制備親和層析用抗原柱選用已活化好的Sulfolink Gel，按2ml膠偶聯2mg多肽的比例將兩者混合，用半胱氨酸封閉多余活化位點，將偶聯好的膠裝填在空層析柱中，用交聯緩沖液洗柱；親和層析將陽性血清過濾，并調整PH，已制備好的磷酸化多肽層析柱用PBS洗柱，然后取出與血清混合，將血清和膠的混合物重新裝入層析柱中，收集穿透液，然后用PH2.8的甘氨酸對結合了抗體的柱子進行洗脫，洗脫液迅速用PH7.6的Tris-HCl中和，測定洗脫液在波長280nm處的光吸收值OD280，收集OD2800.15以上的洗脫液，該洗脫液內含抗特定位點絲氨酸磷酸化蛋白多克隆抗體及非磷酸化蛋白多克隆抗體，將洗脫液與制備好的非磷酸化多肽層析膠反應，從非磷酸化多肽層析柱穿透出來的液體即含抗特定位點絲氨酸磷酸化蛋白多克隆抗體，從非磷酸化多肽層析柱洗脫下來的液體即為相對應抗原表位的非磷酸化蛋白多克隆抗體。
6.按照權利要求4或5所述的抗特定位點氨基酸磷酸化蛋白質多克隆抗體及對應非磷酸化蛋白質多克隆抗體的制備方法，其特征在于，具體步驟是合成多肽根據在Swiss-Prot站點中查得的目標蛋白的氨基酸序列，選擇其磷酸化狀態和程度與蛋白質功能相關聯的位點的氨基酸兩側的氨基酸序列，分別設計并人工合成數對多肽，每對多肽序列相同，N端或C端天然帶有或人為添加一個半胱氨酸——Cys，其中一條多肽鏈上，至少包括一個相當于上述特定位點的氨基酸為磷酸化氨基酸；用雙功能偶聯劑磺基琥珀酰亞胺4-[N甲基馬來酸]-1-羧環己烷作為偶聯劑，與鑰孔嘁血藍蛋白上游離氨基反應，使之活化，鑰孔嘁血藍蛋白與磺基琥珀酰亞胺4-[N甲基馬來酸]-1-羧環己烷的質量比為4/1，然后用G25脫鹽柱去除未偶聯的磺基琥珀酰亞胺4-[N甲基馬來酸]-1-羧環己烷，收集蛋白峰即為活化的鑰孔嘁血藍蛋白——鑰孔嘁血藍蛋白—磺基琥珀酰亞胺4-[N甲基馬來酸]-1-羧環己烷；鑰孔嘁血藍蛋白—磺基琥珀酰亞胺4-[N甲基馬來酸]-1-羧環己烷與多肽通過Cys上的巰基連接，構成適合用于免疫動物的多肽-鑰孔嘁血藍蛋白抗原系統，偶聯的具體步驟為合成多肽溶于純水中，然后與活化好的鑰孔嘁血藍蛋白—磺基琥珀酰亞胺4-[N甲基馬來酸]-1-羧環己烷混合，兩者的質量比為1∶1，該混合物4℃緩慢攪拌過夜，然后用2倍于多肽量的半胱氨酸封閉鑰孔嘁血藍蛋白上的多余活化位點，封閉條件為4℃2小時，封閉結束后，鑰孔嘁血藍蛋白-多肽用10mMPBS透析，去除游離的多肽和半胱氨酸，即成偶聯好的抗原，該抗原在-70℃保存；按每只兔子300μg鑰孔嘁血藍蛋白-多肽的劑量對兔子實行基礎免疫，取規定劑量的鑰孔嘁血藍蛋白-多肽用10mMPBS稀釋至1ml，與1ml完全福氏佐劑混合，用雙聯注射器反復推拉，制成乳化劑，免疫途徑為皮下多點，基礎免疫后第21天進行第一次加強免疫，加強免疫使用的抗原劑量為200μg，抗原液體積仍為1ml，佐劑改用1ml不完全福氏佐劑，以后每隔21天進行一次加強免疫，期間采血分離血清，用BSA偶聯的多肽做檢測抗原，進行ELISA檢測，在第四次加強免疫完成后7天根據ELISA檢測結果，收集達到采血標準的陽性血清；制備親和層析用抗原柱選用已活化好的Sulfolink膠，按2ml膠偶聯2mg多肽的比例將兩者混合，4℃緩慢攪拌過夜，然后用半胱氨酸封閉多余活化位點，封閉完成后，將偶聯好的膠裝填在空層析柱中，用交聯緩沖液洗柱，最后用含0.05％疊氮鈉的保存液保存偶聯好的柱子，保存條件為4℃，磷酸化多肽和非磷酸化多肽各偶聯一根柱子；親和層析將陽性血清用0.45μm的濾器過濾，并用PH7.6的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液調整血清的PH，三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液的使用量為血清量的10％，已制備好的磷酸化多肽層析柱用10mM磷酸緩沖生理鹽水洗柱，然后取出與血清混合，4℃緩慢攪拌過夜，第二天將血清和膠的混合物重新裝入層析柱中，收集穿透液，然后用PH2.8的甘氨酸對結合了抗體的柱子進行洗脫，洗脫液迅速用PH7.6的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液中和，測定洗脫液在波長280nm處的光吸收值OD280，收集OD2800.15以上的洗脫液，該洗脫液內含抗特定位點絲氨酸磷酸化蛋白多克隆抗體及非磷酸化蛋白多克隆抗體，將洗脫液與制備好的非磷酸化多肽層析膠反應，反應條件與洗脫方法同磷酸化多肽層析柱，從非磷酸化多肽層析柱穿透出來的液體即含抗特定位點絲氨酸磷酸化蛋白多克隆抗體，從非磷酸化多肽層析柱洗脫下來的液體即為相對應抗原表位的非磷酸化蛋白多克隆抗體；兩種抗體經透析和濃縮后，加入50％甘油，即成為抗體試劑成品。
全文摘要
抗特定位點氨基酸磷酸化蛋白質多克隆抗體及對應非磷酸化蛋白質多克隆抗體在制備疾病診斷試劑中的應用，多克隆抗體是指以一端帶半胱氨酸的含有磷酸化氨基酸的多肽為半抗原，用磺基琥珀酰亞胺4－[N甲基馬來酸]－1－羧環已烷做偶聯劑與鑰孔嘁血藍蛋白連接成半抗原－載體蛋白系統，經免疫程序免疫兔子后，取血分離血清，血清經兩步抗原親和層析后純化出抗特定位點氨基酸磷酸化蛋白和抗對應非磷酸化蛋白的多克隆抗體。該多克隆抗體的制備方法是合成多肽、用偶聯劑與鑰孔嘁血藍蛋白連接成半抗原－載體蛋白系統、經免疫程序免疫兔子后取血分離血清，經兩步抗原親和層析后純化出抗特定位點氨基酸磷酸化蛋白和抗對應非磷酸化蛋白的多克隆抗體。
文檔編號G01N33/53GK1727896SQ20051004114
公開日2006年2月1日 申請日期2005年7月22日 優先權日2005年7月22日
發明者彭早元, 張薇, 林世康, 胡云龍 申請人:南京川博生物技術有限公司