專利名稱：用于精神分裂癥診斷的血漿特異性蛋白獲取方法及應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種人體血漿中六種特異性蛋白的獲取方法，并闡述了這些特定蛋白質的表達量在精神分裂癥診斷方面的應用。本發明提供了精神分裂癥診斷上分子生物學方面的指標，將會有力地推進該病的預防和治療。本發明屬于生物檢測技術領域。
背景技術：
精神分裂癥是一類常見的嚴重危害人類身心健康的精神疾病，其發病率居各類精神障礙之首。流行病學調查資料顯示精神分裂癥在世界各地的發病率約為0.5％-1％，全球有近5000萬精神分裂癥患者。患者常有感知、思維、情感、行為等多方面的障礙和精神活動的不協調。對患者的治療將投入巨大的人力資源和社會財富，患者對其所在的家庭也造成嚴重的影響。精神分裂癥是多因素復雜疾病，其發病是遺傳因素和環境因素共同作用的結果，有多個基因在其發生過程中發揮作用，每個基因的作用都有限。過去對精神分裂癥致病機制的研究主要從以下三方面進行藥物研究，尸體解剖和腦影像技術研究，遺傳基因組研究。盡管作了大量的研究工作，但是迄今還沒有找到一個明確的精神分裂癥的致病原因，導致精神分裂癥的分子機制仍然是個謎。由于人們對該疾病的發病機制所知甚少，因而還沒有一個確定的生物學診斷標準。目前，臨床上對精神分裂癥的診斷基本上是依據各種量表，而缺少儀器分析標準和量化手段，在某種意義上依賴于醫生的主觀判斷。如果能找到分子生物學方面確定的診斷標準，無疑會巨大地推進該病的預防和治療。
蛋白是基因轉錄后的最終表現形式，是包括環境、遺傳以及其它未知因素在內的多種因素相互作用的最終結果，因此從蛋白水平上探索精神分裂癥致病機制是一條直接的路線。現代蛋白質組學技術具有高通量、高分辨率的特點，它直接對相關組織中的蛋白進行大規模地分析，并對這些相關蛋白的結構、功能、作用通路作進一步的研究。蛋白質組的概念，最早于1994年由澳大利亞學者Wilkins提出，指的是“一個細胞或一個組織基因組所表達的全部蛋白質。”蛋白質組學是從整體的角度，分析細胞內動態變化的蛋白質組成成份、表達水平與修飾狀態，了解蛋白質之間的相互作用與聯系，揭示蛋白質功能與細胞生命活動規律的研究領域。
中樞神經系統疾病的研究需要以腦組織為樣本，而通常情況下獲得的腦組織不是活體組織。相反，體液可以在疾病發生和發展整個過程中的任意時刻被抽取，因而通過對體液蛋白的研究可以獲得許多信息。許多生理上以及疾病引起的變化可能改變體液內在代謝過程中起重要調控作用的關鍵蛋白的表達水平。因此，研究體液蛋白有利于對疾病進行實時監控，測定與疾病特定相關的體液蛋白的表達水平因而具有重要的臨床診斷、預防及治療意義。血液流經全身，通過血液-腦脊液屏障(BCB，blood-CSF barrier)以及血腦屏障(BBB，blood-brain barrier)分別與腦脊液和腦組織相通，血漿中部分蛋白表達水平的改變部分地反映了腦脊液或腦組織中的代謝異常。同時血漿蛋白濃度高達腦脊液的100多倍，約為60-80mg/ml。由于血漿具有取材方便，無創傷性，并可連續檢測的優點，因此用血漿作為診斷神經系統疾病的生物材料，使診斷具有極大的臨床應用的可能。
近年來精神免疫學方面對血漿及腦脊液的研究表明精神分裂癥、重型抑郁癥和燥狂癥等精神類疾病的發病伴隨著急性期反應。急性期反應是機體在遭受急性應激、疾病、感染、創傷等各種內外刺激時出現的反應，此時，血漿中珠蛋白、α1-酸糖蛋白等正性急性期蛋白濃度增高；轉鐵蛋白、白蛋白等負性急性期蛋白濃度降低；同時伴有二價微量元素血濃度的改變。有不同研究小組發現精神分裂癥個體血漿和腦脊液珠蛋白水平顯著高于正常對照(Wong CT etal.，Acute phase proteins in male Chinese schizophrenic patients inSingapore.Schizophr.Res.1996；22，165-171)；單卵雙生子的研究亦表明精神分裂癥患者的珠蛋白水平顯著高于非患者(Vander Putten DM et al.，Plasma protein variations in monozygotic twins discordant forschizophrenia.Biol.Psychiatry 1996；40，437-442)。這些研究提示血漿及腦脊液等體液中可能蘊涵著與精神分裂癥有關的重要信息。
在血漿蛋白質組水平上研究精神分裂癥為診斷和治療這一疾病提供了新的希望，蛋白質組學的技術發展也為研究者提供了有利條件，但目前國際上用血漿蛋白表達譜研究精神分裂癥的文章還非常少。
發明內容
本發明的目的在于針對現有技術的不足及臨床上對精神分裂癥確切診斷的需求，提供一種通過檢測血漿中表達的蛋白質水平來診斷精神分裂癥的方法，以期利用這一方法進行精神分裂癥的分子生物學診斷，為目前量表分析的診斷方法提供更高的準確性和客觀性。
為實現上述發明目的，本發明利用雙向凝膠電泳的方法分離待測個體血漿蛋白質，從雙向凝膠電泳圖譜上得到α珠蛋白、α1抗胰蛋白酶、α1巨球蛋白、血清淀粉樣蛋白P組份、抗纖維蛋白酶III和維生素D結合蛋白的表達量，并將此六個特異性蛋白的表達量作為判斷被測個體是否患精神分裂癥的參考依據。當被測者血漿中這些蛋白質的表達量高于參考值時，可確定該被測者患精神分裂癥，從而達到利用分子標記客觀地診斷精神分裂癥的目的。
本發明的方法包括如下步驟(1)收集待測者的靜脈血液樣品，經離心分離得到血漿；(2)紫外分光光度計測定血漿蛋白濃度；取含0.8mg蛋白的血漿，用樣品緩沖液稀釋血漿至450ul，樣品緩沖液的成份是7M尿素，2M硫尿，4％CHAPS，60mM二硫蘇糖醇，0.5％IPG緩沖液；離心得到可進行第一相等電聚焦電泳的樣品；(3)經離心后的樣品通過水化上樣的方式上樣至24cm、pH4-7非線性干膠條，進行第一相等電聚焦電泳；第一相等電聚焦電泳完成后，將膠條放入含0.02％二硫蘇糖醇的膠條平衡液平衡一次；再將膠條放入含0.025％碘乙酰胺的膠條平衡液平衡一次，膠條平衡液的成份是6M尿素，1.5MTris-Cl，30％甘油和20％十二烷基硫酸鈉；平衡后的膠條進行12.5％十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺電泳，得到一張二維電泳凝膠；(4)將二維電泳凝膠經固定、染色、脫色三個步驟完成考馬斯亮藍染色，得到一張染色后的二維電泳凝膠；(5)用圖像掃描儀對染色后的二維電泳凝膠進行掃描得到一張二維電泳凝膠圖譜；(6)用二維電泳凝膠圖像分析軟件分析二維電泳凝膠圖譜上α珠蛋白、α1抗胰蛋白酶、α1巨球蛋白、血清淀粉樣蛋白P組份、抗纖維蛋白酶III和維生素D結合蛋白的表達量，得到上述可用于精神分裂癥診斷的六個血漿特異性蛋白的相對表達量。
將上述方法測得的六個蛋白相對表達量與精神分裂癥病人的參考值進行比較，當它們的濃度高于參考值時，表示該個體患精神分裂癥，當它們的濃度低于參考值時，表示該個體不患有精神分裂癥，由此可根據比較結果綜合判斷被測個體是否患精神分裂癥。
在六個血漿差異表達的蛋白質中，α珠蛋白、α1抗胰蛋白酶、α1巨球蛋白、血清淀粉樣蛋白P組份這4種蛋白都屬于陽性急性期反應蛋白，此4種蛋白質的表達量一致表現為在精神分裂癥病人中高于正常人。這一結果與精神免疫學方面對血漿及腦脊液的研究相互支持。珠蛋白在病人的表達量是正常人的1.89倍，其變化最為明顯。珠蛋白表達量是本發明方法中的最重要的一個標準。
本發明首次提出利用上述六個血漿特異性蛋白可進行精神分裂癥的臨床診斷，而此六個血漿特異性蛋白的含量測定并不限于凝膠電泳方法，還可以采用其它方法，如酶免疫測定方法。酶免疫測定方法的過程是先將上述蛋白的單克隆或多克隆抗體固定于微量滴定板或膜上；然后加入人血漿進行免疫反應；之后再加入酶標抗體進行底物顯色反應；最后用酶標儀測定吸光度，根據吸光度計算上述蛋白的濃度。
本發明提供的精神分裂癥的分子水平的診斷方法與目前正在使用的依據各種量表評價的診斷方法相比，它是一種客觀的方法，不依賴于醫生對診斷對象的主觀判斷。由于血漿具有取材方便，無創傷性，并可連續檢測的優點，因此本發明使診斷具有極大的臨床應用的可能。
本發明涉及的6種血漿蛋白質不僅是疾病診斷的分子標記，也是該疾病的藥物候選靶點。本發明的診斷精神分裂癥的方法，不僅適用于人類，也可診斷實驗動物，用于精神分裂癥治療藥物的開發和藥效的評價，促進開發治療精神分裂癥藥物的進程。
圖1為血漿蛋白雙向電泳圖譜。
圖1中，點1是抗纖維蛋白酶III，點2，3，4是維生素D結合蛋白；點5，6，7，8是α1抗胰蛋白酶；點13是α1巨球蛋白；點14是血清淀粉樣蛋白P組份；點16，17，18是α珠蛋白。
具體實施例方式
本發明將結合基于雙向電泳方法尋找精神分裂癥的診斷標記這一具體實施例作進一步說明，這一實施例僅用于支持本發明的技術方案，而不用于限制本精神分裂癥患者來自于上海市精神衛生中心，以CCMD-2-R(中國精神病分類方案與診斷標準第二版修訂版)為診斷標準。匹配的對照個體由上海地區醫院門診部提供，未經診斷是否患精神分裂癥。在經過本人或患者家屬同意的前提下采集血液，并簽署了經上海市人類遺傳資源委員會批準的知情同意書。
采集到的靜脈血經2000rpm×4℃×10min離心分離血漿，Beckman DUSeries 600紫外分光光度計測定蛋白濃度，蛋白濃度為60-80mg/ml，分裝后于-80℃保存。取0.8mg的血漿蛋白(約13ul的血漿)，用第一相電泳的樣品緩沖液稀釋血漿至450ul。第一相電泳的樣品緩沖液的成分為7M尿素，2M硫尿，4％CHAPS，60mM二硫蘇糖醇，0.5％IPG緩沖液(Amersham Biosciences)，少量溴酚蘭。經49,000rpm×4℃×15分鐘離心，得到可進行第一相等電聚焦電泳的樣品。
經離心后的樣品通過水化上樣的方式上樣至24cm、pH4-7非線性干膠條(Amersham Biosciences)上，上樣量為0.8mg/膠條。膠條水化和第一相等電聚焦電泳均是在Amersham IPGphor上進行的。水化和等電聚焦電泳程序為100V，1400Vhr；500V，500Vhr；1000V，1000Vhr；4000V，4000Vhr；8000V，72000Vhrs。
第一相等電聚焦電泳完成后，從Amersham IPGphor上取下干膠條，進行兩次膠條平衡。第一次是將IPG膠條浸泡在10ml含二硫蘇糖醇的平衡溶液中，二硫蘇糖醇濃度為0.02g/ml。第二次用碘乙酰胺代替二硫蘇糖醇，碘乙酰胺濃度為0.025g/ml。每步平衡時間約為15分鐘。膠條平衡液的組成是6M尿素，1.5MTris-Cl(PH 8.8)，30％甘油，20％十二烷基硫酸鈉。
平衡后的膠條應立即進行12.5％十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺電泳，電泳緩沖液是Tris-甘氨酸。電泳是在Amersham EttanDALTsix中進行的，電泳的方式采取恒定功率，分兩步進行(第一步2.5瓦/膠，30分鐘；第二步15瓦/膠，4小時)。二相電泳結束后，得到一張二維電泳凝膠。
用50％甲醇、5％正磷酸固定凝膠2小時；8％硫酸銨，5％正磷酸，0.1％w/v考馬斯亮藍染料G-250，20％甲醇，12小時染色；染色后的脫色分三步進行，每一步使用20％硫酸銨脫色溶液，最后一次在脫色液中加入幾滴疊氮鈉以防止細菌污染。由此得到一張染色后的二維電泳凝膠。
質譜分析前的蛋白點處理是在Ettan蛋白點自動處理工作臺(AmershamBiosciences)中完成的。二維凝膠上的蛋白點經過蛋白點的切割、脫色、干燥、酶解、肽段混合物提取的步驟，最后點樣至特定的質譜點樣板上。蛋白的質譜分析是在MALDI-ToF-MS/Pro(Amersham Biosciences)中通過單個質譜獲取肽質量譜完成的。肽質量譜在蛋白數據庫中的自動搜索是借助于儀器自帶的軟件包完成的。
凝膠圖像掃描在Amersham ImageScanner圖像掃描儀中進行，掃描后得到一張二維電泳凝膠圖譜，如圖1所示。
血漿樣品二維凝膠的圖像分析以及蛋白點的定量用Amersham ImageMasterPlatium軟件完成。精神分裂癥患者和正常人之間血漿蛋白表達差異的顯著性是通過Student’s two-tailed t-test計算得到的。42個精神分裂癥患者和46個正常人之間血漿蛋白表達差異的顯著性是通過SPSS 10.0軟件計算得到的。在病人組和正常對照組間血漿蛋白表達有差別的蛋白有6種，表達量見下表表1.精神分裂癥患者和正常人血漿蛋白的表達相對量蛋白質 精神分裂癥組/參考值 正常對照組 P值α珠蛋白1.25±0.41 0.66±0.3 ＜0.01α1抗胰蛋白酶 2.54±0.61 2.08±0.49 ＜0.01α1巨球蛋白 0.04±0.01 0.03±0.01 ＜0.01血清淀粉樣蛋白P組份 0.12±0.04 0.10±0.05 0.034抗纖維蛋白酶III 0.17±0.04 0.14±0.05 ＜0.01維生素D結合蛋白 0.25±0.08 0.19±0.06 ＜0.01注表中各欄是某一蛋白質的表達量在總血漿蛋白中的百分數，數據用均值±標準差表示。
6個差異表達的蛋白質中有α珠蛋白、α1抗胰蛋白酶、α1巨球蛋白、血清淀粉樣蛋白P組份這4種蛋白屬于陽性急性期反應蛋白，此4種蛋白質的表達量在精神分裂癥病人中高于正常人。這反映了精神分裂癥發病期間伴隨著急性期反應。在6個血漿差異表達的蛋白質中，珠蛋白在病人的表達量是正常人的1.89倍，其變化最為明顯，被測者血漿中珠蛋白的表達量是本發明中一項診斷精神分裂癥的最重要的數據。
權利要求
1.一種用于精神分裂癥診斷的血漿特異性蛋白獲取方法，其特征在于包括以下步驟1)收集待測者的靜脈血液樣品，經離心分離得到血漿；2)紫外分光光度計測定血漿蛋白濃度；取含0.8mg蛋白的血漿，用樣品緩沖液稀釋血漿至450ul，樣品緩沖液的成份是7M尿素，2M硫尿，4％CHAPS，60mM二硫蘇糖醇，0.5％IPG緩沖液；最后離心得到可進行第一相等電聚焦電泳的樣品；3)經離心后的樣品通過水化上樣的方式上樣至24cm、pH4-7非線性干膠條，進行第一相等電聚焦電泳；第一相等電聚焦電泳完成后，將膠條放入含0.02％二硫蘇糖醇的膠條平衡液平衡一次；再將膠條放入含0.025％碘乙酰胺的膠條平衡液平衡一次，膠條平衡液的成份是6M尿素，1.5M Tris-Cl，30％甘油和20％十二烷基硫酸鈉；平衡后的膠條進行12.5％十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺電泳，得到一張二維電泳凝膠；4)將二維電泳凝膠經固定、染色、脫色三個步驟完成考馬斯亮藍染色，得到一張染色后的二維電泳凝膠；5)用圖像掃描儀對染色后的二維電泳凝膠進行掃描，得到一張二維電泳凝膠圖譜；6)用二維電泳凝膠圖像分析軟件分析二維電泳凝膠圖譜上α珠蛋白、α1抗胰蛋白酶、α1巨球蛋白、血清淀粉樣蛋白P組份、抗纖維蛋白酶III和維生素D結合蛋白的表達量，得到上述可用于精神分裂癥診斷的六個血漿特異性蛋白的相對表達量。
2.一種血漿特異性蛋白的應用，其特征在于所述特異性蛋白為α珠蛋白、α1抗胰蛋白酶、α1巨球蛋白、血清淀粉樣蛋白P組份、抗纖維蛋白酶III及維生素D結合蛋白，將此六個蛋白的相對表達量與精神分裂癥病人的參考值進行比較，根據比較結果綜合判斷被測個體是否患精神分裂癥。
全文摘要
本發明提供一種用于精神分裂癥診斷的血漿特異性蛋白獲取方法及應用，利用雙向凝膠電泳的方法分離待測個體血漿蛋白質，從雙向凝膠電泳圖譜上得到α珠蛋白、α1抗胰蛋白酶、α1巨球蛋白、血清淀粉樣蛋白P組份、抗纖維蛋白酶III和維生素D結合蛋白的表達量，并將此六個特異性蛋白的表達量作為判斷被測個體是否患精神分裂癥的參考依據。本發明利用分子標記客觀地診斷精神分裂癥，而不依賴于醫生對診斷對象的主觀判斷。由于血漿具有取材方便，無創傷性，并可連續檢測的優點，因此本發明使診斷具有極大的臨床應用的可能。本發明同時可用于評價治療精神分裂癥藥物的療效，指導藥物開發。
文檔編號G01N21/77GK1654957SQ20051002410
公開日2005年8月17日 申請日期2005年2月28日 優先權日2005年2月28日
發明者賀林, 萬春玲, 江蕾, 喇玉娟, 朱慧, 楊異鳳, 馮國鄞 申請人:上海交通大學