專利名稱：無毒體系免疫層析檢測黃曲霉毒素的試紙及其制備方法
技術領域：
本發明涉及一種檢測黃曲霉毒素的試紙及其制備方法，尤其是一種無毒體系免疫層析檢測黃曲霉毒素的試紙及其制備方法。
背景技術：
黃曲霉毒素是由黃曲霉、寄生曲霉或模式曲霉產生的一種毒素，可引起動物和人的急性中毒、慢性中毒、致癌、致畸和致突變等。由于能產毒的黃曲霉菌株廣泛地存在于自然界中，因此它極可能通過食物鏈進入人體，從而對人體健康構成巨大的威脅。要完全避免黃曲霉毒素對糧食，飼料，副食品，油料作物以及發酵食品等的污染非常困難。唯一有效的辦法是加強對該類樣品的監控檢測，及時發現污染的食品、飼料及其原材料，并立即剔除，防止毒素超標污染的食品進入人類的食物鏈。
對黃曲霉毒素檢測的公知方法，目前主要有薄層層析法、酶聯免疫法、液相色譜法、膠體金免疫層析法和乳膠沉淀法。薄層層析法是采用硅膠G薄板進行毒素層析分離，在365納米紫外光下觀察黃曲霉毒素產生的熒光并與標準毒素的遷移率比較以確定毒素的存在(見GB/T5009，22-1996)，酶聯免疫法(CN1153908)是采用黃曲霉毒素—蛋白復合體包被酶聯板，然后將樣品與識別黃曲霉毒素的抗體混合，在酶聯板的小孔中進行免疫反應，通過比色確定樣品中黃曲霉毒素的濃度，液相色譜法測定的黃曲霉毒素的精度與酶聯免疫法相似。上述各方法都存在如下缺點操作程序復雜，只能在實驗室進行；需要專業人員操作，用專門的儀器和設備，檢測時間長，所需費用高，其費用在200-1000元人民幣/每個樣品。乳膠沉淀法(CN1254843)是快速測定法，具有簡單、快速、常溫保存、單份測定、除商品試劑外不需任何儀器設備的優點，適合現場黃曲霉毒素的現場快速檢測。
免疫層析是出現于80年代初期的一種獨特的免疫分析方式，它往往以條狀纖維層析材料為固相，通過毛細作用使樣品溶液在層析條上泳動，并同時使樣品中的待測物與層析材料上針對待測物的受體(如抗體或抗原)發生高特異高親和性的免疫反應，層析過程中免疫復合物被富集或截留在層析材料的一定區域(檢測帶)，通過酶反應或直接運用可目測的標記物(如膠體金)而得到直觀的實驗現象(如顯色)。而游離標記物則越過檢測帶，達到與結合標記物自動分離之目的。免疫層析技術目前已廣泛應用于臨床醫療檢測中。國內外現有的商品供應及文獻報道的檢測項目主要包括以下方面違禁藥物檢測(苯丙胺、可卡因、大麻、嗎啡、海洛因等)、傳染病病原檢測(梅毒螺旋體、淋球菌、沙眼衣原體、幽門螺桿菌等)、激素檢測、寄生蟲、腫瘤標記物、心血管病檢測標志物等。免疫層析技術常見的示蹤粒子有膠體金，乳膠，膠體硒、明膠等，其中運用最成功的標記物為膠體金。黃曲霉毒素膠體金免疫層析法(CN1410771)是將膠體金免疫層析技術運用于黃曲霉毒素檢測中的一個成功方法。
上述的這些方法在制備或檢測過程中都涉及到要使用黃曲霉毒素標品的問題，如膠體金免疫層析法中檢測線上噴的就是黃曲霉毒素—蛋白復合體。
眾所周知，黃曲霉毒素毒性很強，其中黃曲霉毒素B1是已知毒性最強的天然物質，比氰化鉀的毒性高10倍，以黃曲霉毒素作為材料進行生產或以黃曲霉毒素作為對照品進行檢測，極有可能存在二次污染的隱患，對生產和操作人員的健康有極大的危害。再者，我國所需的高濃度的毒素標品目前全部依賴進口，價格昂貴，使檢測試劑的成本居高不下。更為麻煩的是，在“9.11”恐怖襲擊以后，西方國家加大了對劇毒化學藥品的出口管制力度，在我國幾乎無法從國外購買到所需的黃曲霉毒素，從而造成了我國該類試劑的生產舉步為艱的局面。
應用無毒體系來檢測黃曲霉毒素是檢測技術發展的一個方向，目前尚未見到應用無毒體系檢測黃曲霉毒素的免疫層析法的報道。
發明內容
本發明的目的在于提供一種無毒體系免疫層析檢測黃曲霉毒素的試紙及其制備方法。
本發明的技術方案為一種無毒體系免疫層析檢測黃曲霉毒素的試紙，包括底板，樣品墊，示蹤粒子結合物墊，硝酸纖維素膜，吸水墊，檢測線，質控線，其中在底板上按順序有樣品墊，示蹤粒子結合物墊，硝酸纖維素膜，吸水墊；示蹤粒子結合物墊上有示蹤粒子標記的抗黃曲霉毒素單克隆的抗體，硝酸纖維素膜上還設有檢測線和質控線，檢測線由能與抗黃曲霉毒素單克隆抗體結合的黃曲霉毒素無毒體系線狀點樣組成，質控線由能與抗黃曲霉毒素單克隆抗體結合驢抗小白鼠抗體線狀點樣組成。
一種無毒體系免疫層析檢測黃曲霉毒素的試紙的制備，包括如下步驟1.待檢樣品的處理；2.硝酸纖維素膜檢測線和質控線的制備用能與抗黃曲霉毒素單克隆抗體結合的黃曲霉毒素無毒體系線狀點樣作為檢測線；
用能與抗黃曲霉毒素單克隆抗體結合驢抗小白鼠抗體線狀點樣作為質控線。
3.示蹤粒子結合物墊的制備選用能與黃曲霉毒素無毒體系(噬菌體)結合的抗黃曲霉毒素單克隆抗體標記示蹤粒子。把標記好的示蹤粒子，分散在玻璃纖維紙上。
4.試紙條的組裝①在底板上加上有檢測線和質控線的硝酸纖維素膜；②在底板上加上示蹤粒子結合物墊；③在底板上加上樣品墊；④在底板上加上吸水墊；組裝為試紙條。
方案可細分為四部分1.待檢樣品的處理；2.硝酸纖維素膜檢測線和質控線的制備；3.示蹤粒子結合物墊的制備；4.試紙條的組裝。
1.待檢樣品的處理將被檢測的樣品粉碎為20目并取20克粉末放入25-60毫升的抽提液(每100毫升含60毫升甲醇，40毫升蒸餾水，4克氯化鈉)經充分混合5分鐘，再靜置10-20分鐘后輕輕吸取上清液，按1∶3的比例與樣品緩沖液(PBS+0.5％BSA)混合，混合液用于測定。必要時可用濾紙過濾上清液，取濾過的樣品進行測定。
2.硝酸纖維素膜檢測線和質控線的制備將硝酸纖維素膜按20-30mm寬的尺寸剪裁。將經純化濃度調整為0.1-1.0mg/ml的無毒體系(噬菌體)，在膜上線狀點樣作為檢測線，檢測線點樣位置離膜底邊15-18mm。將經純化濃度調整為0.2-1.5mg/ml的相應驢抗小白鼠免疫球蛋白抗體，在膜上線狀點樣作為質控線，質控線點樣位置離膜底邊11-13mm。硝酸纖維素膜室溫干燥30min，置于1％牛血清白蛋白的生理鹽水中浸泡30min，取出吸干水分，于37孵育30min，置室溫下干燥處密封儲藏。
3.示蹤粒子結合物墊的制備(1)示蹤粒子的制備和標記①膠體金溶膠制備標記膠體金溶膠制備取0.01％四氯化金水溶液200ml，加熱至沸騰，加入1-20ml 1％檸檬酸鈉水溶液，煮沸5min，出現橙紅色，膠體金顆粒直徑由電鏡測定為10-80nm；膠體金標記抗體取50ml膠體金，用0.1mol/L碳酸鉀調pH至8.2，攪拌下將膠體金溶膠和抗黃曲霉毒素的單克隆抗體混合，再加入聚乙二醇水溶液，使最終濃度為0.05％。將粗制品6000g離心45min，沉淀用生理鹽水混懸至1.5ml，4℃保存。
②膠體硒溶膠制備和抗體標記膠體硒溶膠制備在1升容量的四頸圓底燒瓶內加入去離子水550ml和聚丙烯酸10g，通氮室溫攪拌并加入水合肼69.5ml，繼續攪拌20分鐘。亞硒酸9.63g溶解于280ml水，室溫攪拌下滴入反應混合液內，得到120nm紅色硒溶膠。
膠體硒抗體標記抗體用20mmol/L pH7.3磷酸鹽緩沖液配成4.6mg/ml濃度溶液，加25μl于pH7.3的25ml硒溶膠中，室溫攪拌10分鐘后加1％PEG80001ml，混勻，于4℃以5000rpm離心5分鐘，得到松軟的紅色沉淀，用含0.05％NaN3的磷酸鹽緩沖液配成1ml懸液。
③乳膠的制備和抗體標記彩色乳膠顆粒購自Bangs LA、B、Oratories公司。抗體標記程序為用pH7.1的磷酸鹽緩沖液將乳膠稀釋到1％濃度，攪拌下加入一定量的抗黃曲霉毒素的單克隆抗體溶液，室溫攪拌30分鐘后于37℃水浴孵化60分鐘，4℃放置4-5小時。15000rpm離心30分鐘，用適量磷酸鹽緩沖液重懸。
(2)示蹤粒子結合物墊的制備將標記了示蹤粒子的抗黃曲霉毒素的單克隆抗體按比例混合分散在厚度為1mm的玻璃纖維紙上，烘干或凍干后密封干燥保存。
4.試紙條的組裝在底板上加上有檢測線和質控線的硝酸纖維素膜；②在底板上加上示蹤粒子結合物墊；③在底板上加上樣品墊；④在底板上加上吸水墊；⑤將粘貼了硝酸纖維素膜、結合物墊、樣品墊和吸水墊的底板用切刀剪成3-5mm寬，組裝為試紙條。
本發明的優點及應用范圍本發明同以往檢測糧食、發酵制品和飼料中黃曲霉毒素的技術相比具有如下優點(1)生產過程中不需要黃曲霉毒素，避免了黃曲霉毒素的二次污染；(2)檢測過程無需黃曲霉毒素標品作為指示，而直接通過顏色判斷結果；(3)除商品試劑外不需任何儀器設備，所耗費用低；(4)靈敏度較高，可達10ppb；(5)室溫保存、單份測定，可現場進行檢測；(6)操作簡便、快捷，僅需10-15分鐘。
本發明屬于食品安全領域，主要用于糧食、發酵制品和飼料中黃曲霉毒素的檢測。本發明的試紙條的使用單位主要是國家相關執法部門，如農業部門的畜牧局、質量技術監督局、動植物檢疫局、商檢局、防疫站等，食品加工企業為了保證其產品的質量可靠性，保證品牌及市場占有率，也有大量需求，同時隨著人民群眾對食品安全的重視，黃曲霉毒素試紙條還將走進許多家庭。
實驗例一膠體金免疫層析檢測黃曲霉毒素的方法及試紙的制備并用于檢測玉米樣品本實驗例分為5部分(1)待檢樣品的處理；(2)硝酸纖維素膜的制備；(3)膠體金結合物墊的制備；(4)試紙條的組裝；(5)檢測和結果判斷(1)待檢樣品的處理將被檢測的玉米樣品粉碎為20目并取20克粉末放入25-60毫升的抽提液(每100毫升含60毫升甲醇，40毫升蒸餾水，4克氯化鈉)經充分混合5分鐘，再靜置10-20分鐘后輕輕吸取上清液，按1∶3的比例與樣品緩沖液(PBS+0.5％BSA)混合，混合液用于測定。必要時可用濾紙過濾上清液，取濾過的樣品進行測定。
(2)硝酸纖維素膜的制備將硝酸纖維素膜按20-30mm寬的尺寸剪裁。將經純化濃度調整為0.1-1.0mg/ml的無毒體系(噬菌體)，在膜上線狀點樣作為檢測線，檢測線點樣位置離膜底邊15-18mm。將經純化濃度調整為0.2-1.5mg/ml的相應驢抗小白鼠免疫球蛋白抗體，在膜上線狀點樣作為質控線，質控線點樣位置離膜底邊11-13mm。硝酸纖維素膜室溫干燥30min，置于1％牛血清白蛋白的生理鹽水中浸泡30min，取出吸干水分，于37孵育30min，置室溫下干燥處密封儲藏。
(3)膠體金結合物墊的制備分別取50ml顆粒直徑為30-50nm膠體金，用0.1mol/L碳酸鉀調pH至8.2，攪拌下將膠體金溶膠和抗黃曲霉毒素的單克隆抗體混合，再加入聚乙二醇水溶液，使最終濃度為0.05％。將粗制品6000g離心45min，沉淀用生理鹽水混懸至1.5ml，4℃保存。將標記膠體金顆粒的抗體混合并分散在厚度為1mm的玻璃纖維紙上，凍干或烘干后密封干燥保存。
(4)試紙條的組裝①在底板上加上有檢測線和質控線的硝酸纖維素膜；②在底板上加上膠體金結合物墊；③在底板上加上樣品墊；④在底板上加上吸水墊；組裝為檢測試紙條。
(5)檢測和結果判斷檢測取處理好的樣本0.5ml，離心片刻，垂直插入試紙條，插入深度不超過樣品墊，在樣本中停留約15分鐘后觀察結果。
結果判斷如下檢測線有紅線出現為陰性，無紅線出現為陽性，若質控線有紅線出現說明試紙條有效，若質控線無紅線出現說明試紙條無效。
實驗例二乳膠顆粒或明膠顆粒免疫層析檢測黃曲霉毒素試紙的制備并用于檢測玉米樣品本實驗例分為5部分(1)待檢樣品的處理；(2)硝酸纖維素膜的制備；(3)膠體金結合物墊的制備；(4)試紙條的組裝；(5)檢測和結果判斷(1)待檢樣品的處理將被檢測的玉米樣品粉碎為20目并取20克粉末放入25-60毫升的抽提液(每100毫升含60毫升甲醇，40毫升蒸餾水，4克氯化鈉)經充分混合5分鐘，再靜置10-20分鐘后輕輕吸取上清液，按1∶3的比例與樣品緩沖液(PBS+0.5％BSA)混合，混合液用于測定。必要時可用濾紙過濾上清液，取濾過的樣品進行測定。
(2)硝酸纖維素膜的制備將硝酸纖維素膜按20-30mm寬的尺寸剪裁。將經純化濃度調整為0.1-1.0mg/ml的無毒體系(噬菌體)，在膜上線狀點樣作為檢測線，檢測線點樣位置離膜底邊15-18mm。將經純化濃度調整為0.2-1.5mg/ml的相應驢抗小白鼠免疫球蛋白抗體，在膜上線狀點樣作為質控線，質控線點樣位置離膜底邊11-13mm。硝酸纖維素膜室溫干燥30min，置于1％牛血清白蛋白的生理鹽水中浸泡30min，取出吸干水分，于37孵育30min，置室溫下干燥處密封儲藏。
(3)乳膠結合物墊的制備彩色乳膠顆粒購自Bangs Laboratories公司，明膠顆粒購自Zodolabs公司，顏色為蘭色。用pH7.1的磷酸鹽緩沖液將乳膠顆粒或明膠顆粒稀釋到1％濃度，分別取50ml，攪拌下將乳膠溶液和不同株的抗A，抗B和抗H單克隆抗體混合，室溫攪拌30分鐘后于37℃水浴孵化60分鐘，4℃放置4-5小時。15000rpm離心30分鐘，用2ml磷酸鹽緩沖液重懸。將標記乳膠顆粒或明膠顆粒的抗體混合并分散在厚度為1mm的玻璃纖維紙上，凍干密封干燥保存。
(4)試紙條的組裝①在底板上加上有檢測線和質控線的硝酸纖維素膜；②在底板上加上膠體金結合物墊；③在底板上加上樣品墊；④在底板上加上吸水墊；組裝為檢測試紙條。
(5)檢測和結果判斷檢測取處理好的樣本0.5ml，離心片刻，垂直插入試紙條，插入深度不超過樣品墊，在樣本中停留約15分鐘后觀察結果。
結果判斷如下檢測線有蘭色線出現為陰性，無蘭色線出現為陽性，若質控線有蘭色線出現說明試紙條有效，若質控線無蘭色線出現說明試紙條無效。
實驗例三膠體硒免疫層析檢測黃曲霉毒素試紙的制備并用于檢測玉米樣品本實驗例分為5部分(1)待檢樣品的處理；(2)硝酸纖維素膜的制備；(3)膠體金結合物墊的制備；(4)試紙條的組裝；(5)檢測和結果判斷(1)待檢樣品的處理將被檢測的玉米樣品粉碎為20目并取20克粉末放入25-60毫升的抽提液(每100毫升含60毫升甲醇，40毫升蒸餾水，4克氯化鈉)經充分混合5分鐘，再靜置10-20分鐘后輕輕吸取上清液，按1∶3的比例與樣品緩沖液(PBS+0.5％BSA)混合，混合液用于測定。必要時可用濾紙過濾上清液，取濾過的樣品進行測定。
(2)硝酸纖維素膜的制備將硝酸纖維素膜按20-30mm寬的尺寸剪裁。將經純化濃度調整為0.1-1.0mg/ml的無毒體系(噬菌體)，在膜上線狀點樣作為檢測線，檢測線點樣位置離膜底邊15-18mm。將經純化濃度調整為0.2-1.5mg/ml的相應驢抗小白鼠免疫球蛋白抗體，在膜上線狀點樣作為質控線，質控線點樣位置離膜底邊11-13mm。硝酸纖維素膜室溫干燥30min，置于1％牛血清白蛋白的生理鹽水中浸泡30min，取出吸干水分，于37孵育30min，置室溫下干燥處密封儲藏。
(3)膠體硒結合物墊的制備膠體硒抗體標記抗黃曲霉毒素的單克隆抗體20mmol/L pH7.3磷酸鹽緩沖液配成4.6mg/ml濃度溶液，分別取25ul加入25ml硒溶膠中，室溫攪拌10分鐘后加1％PEG8000 1ml，混勻，于4℃以5000rpm離心5分鐘，得到松軟的紅色沉淀，用含0.05％NaN3的磷酸鹽緩沖液配成1ml懸液。將標記膠體硒顆粒的抗體混合并分散在厚度為1mm的玻璃纖維紙上，凍干密封干燥保存。
(4)試紙條的組裝①在底板上加上有檢測線和質控線的硝酸纖維素膜；②在底板上加上膠體金結合物墊；③在底板上加上樣品墊；④在底板上加上吸水墊；組裝為檢測試紙條。
(5)檢測和結果判斷檢測取處理好的樣本0.5ml，離心片刻，垂直插入試紙條，插入深度不超過樣品墊，在樣本中停留約15分鐘后觀察結果。
結果判斷如下檢測線有紅色線出現為陰性，無紅色線出現為陽性，若質控線有紅色線出現說明試紙條有效，若質控線無紅色線出現說明試紙條無效。
實驗例四磁性顆粒免疫層析檢測黃曲霉毒素試紙的制備并用于檢測玉米樣品。
本實驗例分為5部分(1)待檢樣品的處理；(2)硝酸纖維素膜的制備；(3)磁性顆粒結合物墊的制備；(4)試紙條的組裝；(5)檢測和結果判斷(1)待檢樣品的處理將被檢測的玉米樣品粉碎為20目并取20克粉末放入25-60毫升的抽提液(每100毫升含60毫升甲醇，40毫升蒸餾水，4克氯化鈉)經充分混合5分鐘，再靜置10-20分鐘后輕輕吸取上清液，按1∶3的比例與樣品緩沖液(PBS+0.5％BSA)混合，混合液用于測定。必要時可用濾紙過濾上清液，取濾過的樣品進行測定。
(2)硝酸纖維素膜的制備將硝酸纖維素膜按20-30mm寬的尺寸剪裁。將經純化濃度調整為0.1-1.0mg/ml的無毒體系(噬菌體)，在膜上線狀點樣作為檢測線，檢測線點樣位置離膜底邊15-18mm。將經純化濃度調整為0.2-1.5mg/ml的相應驢抗小白鼠免疫球蛋白抗體，在膜上線狀點樣作為質控線，質控線點樣位置離膜底邊11-13mm。硝酸纖維素膜室溫干燥30min，置于1％牛血清白蛋白的生理鹽水中浸泡30min，取出吸干水分，于37孵育30min，置室溫下干燥處密封儲藏。
(3)磁性顆粒結合物墊的制備磁性顆粒購自Bangs Laboratories公司。用pH7.1的磷酸鹽緩沖液將磁性顆粒稀釋到1％濃度，分別取50ml，攪拌下將其和抗黃曲霉毒素的單克隆抗體混合，室溫攪拌30分鐘后于37℃水浴孵化60分鐘，4℃放置4-5小時。15000rpm離心30分鐘，用2ml磷酸鹽緩沖液重懸。將標記磁性顆粒的抗體混合并分散在厚度為1mm的玻璃纖維紙上，凍干或烘干后密封干燥保存。
(4)試紙條的組裝①在底板上加上有檢測線和質控線的硝酸纖維素膜；②在底板上加上膠體金結合物墊；③在底板上加上樣品墊；④在底板上加上吸水墊；組裝為檢測試紙條。
(5)檢測和結果判斷檢測取處理好的樣本0.5ml，離心片刻，垂直插入試紙條，插入深度不超過樣品墊，在樣本中停留約15分鐘后用磁讀取儀判斷結果。
結果判斷如下相應位置出現磁性增強為陰性，無磁性增強為陽性。
圖1為本發明一種無毒體系免疫層析檢測黃曲霉毒素的試紙結構示意圖。
附圖標記底板1、樣品墊2、結合物墊3、硝酸纖維素膜4、吸水墊5、檢測線6、質控線7。
具體實施例方式
實施例1一種無毒體系免疫層析檢測黃曲霉毒素的試紙，包括底板1，樣品墊2，示蹤粒子結合物墊3，硝酸纖維素膜4，吸水墊5，檢測線6，質控線7，其中在底板1上按順序有樣品墊2，示蹤粒子結合物墊3，硝酸纖維素膜4，吸水墊5；示蹤粒子結合物墊3上有示蹤粒子標記的抗黃曲霉毒素單克隆的抗體，硝酸纖維素膜4上還設有檢測線6和質控線7，檢測線6由能與抗黃曲霉毒素單克隆抗體結合的黃曲霉毒素無毒體系線狀點樣組成，質控線7由能與抗黃曲霉毒素單克隆抗體結合驢抗小白鼠抗體線狀點樣組成。
檢測原理在樣品墊2上滴加樣品，如果樣品中有足量的黃曲霉毒素，經層析作用移動到結合物墊3，和示蹤粒子標記的抗黃曲霉毒素單克隆抗體結合，當移動到檢測線6時抗黃曲霉毒素單克隆抗體不能再與檢測線6上的黃曲霉毒素的無毒體系抗原結合，因此檢測線6上無顏色。多余的示蹤粒子標記抗體繼續向前移動到質控線7和質控線7上的驢抗小白鼠抗體結合并顯色，表示檢測試紙條有效。若樣品中無黃曲霉素，則結合物墊3上的示蹤粒子標記的抗黃曲霉素單克隆的抗體和檢測線6上的檢測抗原結合，因此檢測線6上顯色。多余的示蹤粒子標記抗體和質控線7上驢抗小白鼠抗體結合并顯色，表示檢測試紙條有效。
實施例2一種無毒體系免疫層析檢測黃曲霉毒素的試紙的制備方法，包括如下步驟待檢樣品的處理；硝酸纖維素膜4檢測線6和質控線7的制備；示蹤粒子結合物墊3的制備；組裝試紙條；其特征是硝酸纖維素膜4檢測線6和質控線7的制備，包括如下步驟用能與抗黃曲霉毒素單克隆抗體結合的黃曲霉毒素無毒體系線狀點樣作為檢測線6；用能與抗黃曲霉毒素單克隆抗體結合驢抗小白鼠抗體線狀點樣作為質控線7。其余同實施例1。
實施例3一種無毒體系免疫層析檢測黃曲霉毒素的試紙的制備方法，其特征是制備檢測線6的無毒體系是這樣選擇的抗黃曲霉毒素單克隆抗體100μl(100μg/ml)4℃包被過夜，3％脫脂牛奶4℃封閉2h，用Tris-鹽酸洗滌液(TBST，50mM Tris-HCl pH7.5，150mM NaCl，0.1％Tween20)洗滌6次，每孔加入噬菌體肽庫100μl，室溫下結合1h，再用TBST洗滌10次，每孔加入洗脫液(Gly-HCL pH2.2)100μl洗脫；中和洗脫液后留一部分作滴度測定，其余加到20ml接種有處于對數生長前期的E.coli ER2738的LB培養液中進行擴增培養，37℃震蕩培養4.5h后，4℃ 10000r/min離心10min，上清液加入1/6體積的聚乙二醇沉淀劑(PEG/NaCl)，4℃沉淀過夜；4℃ 10000r/min離心15min，去上清，再用1ml TBST懸浮噬菌體，加入1/6體積的PEG/NaCl冰上孵育60min；4℃離心15min，去上清，沉淀用200μl TBST懸浮；測滴度后，進行第二次、第三次和第四次親和篩選；每次加入的噬菌體量都為2×1011pfu，包被的抗體量分別為75、50和25μg/ml，TBST中Tween20的濃度增至0.5％，其余步驟與第一輪篩選相同；第4輪篩選后的洗脫產物經滴度測定后，用滅菌牙簽從噬菌斑的平板上挑選藍色噬菌斑，分別置1ml接種有處于對數生長前期的E.coli ER2738的LB培養液中進行擴增培養、純化；用ELISA法鑒定得到的特異性結合的陽性噬菌體克隆，并用競爭ELISA法篩選黃曲霉毒素的模擬表位，挑選親和性強，靈敏度高的噬菌體進行擴增培養、純化用于制備檢測線6。其余同實施例2。
Gly-HCL pH2.2溶液可以參考《從噬菌體展示隨機肽庫中淘選多肽藥物》，(北京大學/政學者論文集/2002年版/454-466頁)提供的方法制備得到。其中Gly是甘氨酸的簡稱。
TBST為Tris-鹽酸洗滌液的簡稱，Tris為三羥甲基氨基甲烷的簡稱，紐英倫生物技術(北京)有限公司可以提供Tris-鹽酸洗滌液。
E.coli ER2738的LB培養液可以由友誼中聯生物科技有限公司提供。
實施例4一種無毒體系免疫層析檢測黃曲霉毒素的試紙的制備方法，其特征是制備質控線7的抗體是這樣選擇的通過在驢體內注射小白鼠免疫球蛋白，取其含抗體的血清并經純化后制得的，其分子量為80.000道爾頓，在聚丙稀酰胺凝膠電泳上呈現兩條帶，一條是分子量為55000道爾頓，另一條是分子量為25.000道爾頓；將純化后的抗體線狀點樣制備質控線7。其余同實施例2。
實施例5一種無毒體系免疫層析檢測黃曲霉毒素的試紙的制備方法，其特征是檢測線6和質控線7是這樣制備的將硝酸纖維素膜4按20-30mm寬的尺寸剪裁；將經純化濃度調整為0.1-1.0mg/ml的無毒體系(噬菌體)，在膜上線狀點樣作為檢測線6，檢測線6點樣位置離膜底邊15-18mm；將經純化濃度調整為0.2-1.5mg/ml的相應驢抗小白鼠免疫球蛋白抗體，在膜上線狀點樣作為質控線7，質控線7點樣位置離膜底邊11-13mm；硝酸纖維素膜4室溫干燥30min，置于1％牛血清白蛋白的生理鹽水中浸泡30min，取出吸干水分，于37孵育30min，置室溫下干燥處密封儲藏。其余同實施例2。
實施例6
一種無毒體系免疫層析檢測黃曲霉毒素的試紙的制備方法，其特征是示蹤粒子結合物墊3的制備包括如下步驟選用能與黃曲霉毒素無毒體系(噬菌體)結合的抗黃曲霉毒素單克隆抗體標記示蹤粒子；把標記好的示蹤粒子，分散在玻璃纖維紙上。其余同實施例2。
實施例7一種無毒體系免疫層析檢測黃曲霉毒素的試紙的制備方法，其特征是制備示蹤粒子結合物墊3的抗體是這樣選擇的按Davis的方法將黃曲霉毒素—蛋白復合體(AFB1-BSA)溶于同體積的磷酸生理鹽水(PBS)和完全佐劑中，免疫BALB/C小鼠，取小鼠脾臟與SP2/0小鼠骨髓細胞融合，融合細胞在選擇性培養液中培養7～14d，采用間接競爭ELISA方法篩選分泌抗體的雜交細胞株，雜交細胞株進行三次克隆化，產生的克隆細胞株一部分液氮凍存，一部分注入小鼠腹腔產生腹水，經純化后得到的單克隆抗體用于標記示蹤粒子。其余同實施例6。
實施例8一種無毒體系免疫層析檢測黃曲霉毒素的試紙的制備方法，其特征是制備示蹤粒子結合物墊3的示蹤粒子為如下一種①膠體金顆粒；②乳膠顆粒；③膠體硒顆粒；④明膠顆粒；⑤磁性顆粒。其余同實施例6。
實施例9一種無毒體系免疫層析檢測黃曲霉毒素的試紙的制備方法，其特征是組裝試紙條，步驟如下在底板1上加上有檢測線6和質控線7的硝酸纖維素膜4；在底板1上加上示蹤粒子結合物墊3；在底板1上加上樣品墊2；在底板1上加上吸水墊5；將粘貼了硝酸纖維素膜4、結合物墊、樣品墊2和吸水墊5的底板1用切刀剪成3-5mm寬，組裝為試紙條。
權利要求
1.一種無毒體系免疫層析檢測黃曲霉毒素的試紙，包括底板(1)，樣品墊(2)，示蹤粒子結合物墊(3)，硝酸纖維素膜(4)，吸水墊(5)，檢測線(6)，質控線(7)，其特征在于在底板(1)上按順序有樣品墊(2)，示蹤粒子結合物墊(3)，硝酸纖維素膜(4)，吸水墊(5)；示蹤粒子結合物墊(3)上有示蹤粒子標記的抗黃曲霉毒素單克隆的抗體，硝酸纖維素膜(4)上還設有檢測線(6)和質控線(7)，檢測線(6)由能與抗黃曲霉毒素單克隆抗體結合的黃曲霉毒素無毒體系線狀點樣組成，質控線(7)由能與抗黃曲霉毒素單克隆抗體結合驢抗小白鼠抗體線狀點樣組成。
2.根據權利要求1所述的一種無毒體系免疫層析檢測黃曲霉毒素的試紙的制備方法，包括如下步驟待檢樣品的處理；硝酸纖維素膜(4)檢測線(6)和質控線(7)的制備；示蹤粒子結合物墊(3)的制備；組裝試紙條；其特征是硝酸纖維素膜(4)檢測線(6)和質控線(7)的制備，包括如下步驟用能與抗黃曲霉毒素單克隆抗體結合的黃曲霉毒素無毒體系線狀點樣作為檢測線(6)；用能與抗黃曲霉毒素單克隆抗體結合驢抗小白鼠抗體線狀點樣作為質控線(7)。
3.根據權利要求書2所述的一種無毒體系免疫層析檢測黃曲霉毒素的試紙的制備方法，其特征是制備檢測線(6)的無毒體系是這樣選擇的抗黃曲霉毒素單克隆抗體100μl(100μg/ml)4℃包被過夜，3％脫脂牛奶4℃封閉2h，用Tris-鹽酸洗滌液(TBST，50mM Tris-HCl pH7.5，150mM NaCl，0.1％Tween20)洗滌6次，每孔加入噬菌體肽庫100μl，室溫下結合1h，再用TBST洗滌10次，每孔加入洗脫液(Gly-HCL pH2.2)100μl洗脫；中和洗脫液后留一部分作滴度測定，其余加到20ml接種有處于對數生長前期的E.coliER2738的LB培養液中進行擴增培養，37℃震蕩培養4.5h后，4℃10000r/min離心10min，上清液加入1/6體積的聚乙二醇沉淀劑(PEG/NaCl)，4℃沉淀過夜；4℃10000r/min離心15min，去上清，再用1ml TBST懸浮噬菌體，加入1/6體積的PEG/NaCl冰上孵育60min；4℃離心15min，去上清，沉淀用200μl TBST懸浮；測滴度后，進行第二次、第三次和第四次親和篩選；每次加入的噬菌體量都為2×1011pfu，包被的抗體量分別為75、50和25μg/ml，TBST中Tween20的濃度增至0.5％，其余步驟與第一輪篩選相同；第4輪篩選后的洗脫產物經滴度測定后，用滅菌牙簽從噬菌斑的平板上挑選藍色噬菌斑，分別置1ml接種有處于對數生長前期的E.coli ER2738的LB培養液中進行擴增培養、純化；用ELISA法鑒定得到的特異性結合的陽性噬菌體克隆，并用競爭ELISA法篩選黃曲霉毒素的模擬表位，挑選親和性強，靈敏度高的噬菌體進行擴增培養、純化用于制備檢測線(6)。
4.根據權利要求書2所述的一種無毒體系免疫層析檢測黃曲霉毒素的試紙的制備方法，其特征是制備質控線(7)的抗體是這樣選擇的通過在驢體內注射小白鼠免疫球蛋白，取其含抗體的血清并經純化后制得的，其分子量為80.000道爾頓，在聚丙稀酰胺凝膠電泳上呈現兩條帶，一條是分子量為55000道爾頓，另一條是分子量為25.000道爾頓；將純化后的抗體線狀點樣制備質控線(7)。
5.根據權利要求書2所述的一種無毒體系免疫層析檢測黃曲霉毒素的試紙的制備方法，其特征是檢測線(6)和質控線(7)是這樣制備的將硝酸纖維素膜(4)按20-30mm寬的尺寸剪裁；將經純化濃度調整為0.1-1.0mg/ml的無毒體系(噬菌體)，在膜上線狀點樣作為檢測線(6)，檢測線(6)點樣位置離膜底邊15-18mm；將經純化濃度調整為0.2-1.5mg/ml的相應驢抗小白鼠免疫球蛋白抗體，在膜上線狀點樣作為質控線(7)，質控線(7)點樣位置離膜底邊11-13mm；硝酸纖維素膜(4)室溫干燥30min，置于1％牛血清白蛋白的生理鹽水中浸泡30min，取出吸干水分，于37孵育30min，置室溫下干燥處密封儲藏。
6.根據權利要求書2所述的一種無毒體系免疫層析檢測黃曲霉毒素的試紙的制備方法，其特征是示蹤粒子結合物墊(3)的制備包括如下步驟選用能與黃曲霉毒素無毒體系(噬菌體)結合的抗黃曲霉毒素單克隆抗體標記示蹤粒子；把標記好的示蹤粒子，分散在玻璃纖維紙上；
7.根據權利要求書6所述的一種無毒體系免疫層析檢測黃曲霉毒素的試紙的制備方法，其特征是制備示蹤粒子結合物墊(3)的抗體是這樣選擇的按Davis的方法將黃曲霉毒素—蛋白復合體(AFB1-BSA)溶于同體積的磷酸生理鹽水(PBS)和完全佐劑中，免疫BALB/C小鼠，取小鼠脾臟與SP2/O小鼠骨髓細胞融合，融合細胞在選擇性培養液中培養7～14d，采用間接競爭ELISA方法篩選分泌抗體的雜交細胞株，雜交細胞株進行三次克隆化，產生的克隆細胞株一部分液氮凍存，一部分注入小鼠腹腔產生腹水，經純化后得到的單克隆抗體用于標記示蹤粒子。
8.根據權利要求書6所述的一種無毒體系免疫層析檢測黃曲霉毒素的試紙的制備方法，其特征是制備示蹤粒子結合物墊(3)的示蹤粒子為如下一種①膠體金顆粒②乳膠顆粒③膠體硒顆粒④明膠顆粒⑤磁性顆粒
9.根據權利要求書2所述的一種無毒體系免疫層析檢測黃曲霉毒素的試紙的制備方法，其特征是組裝試紙條，步驟如下在底板(1)上加上有檢測線(6)和質控線(7)的硝酸纖維素膜(4)；在底板(1)上加上示蹤粒子結合物墊(3)；在底板(1)上加上樣品墊(2)；在底板(1)上加上吸水墊(5)；將粘貼了硝酸纖維素膜(4)、結合物墊、樣品墊(2)和吸水墊(5)的底板(1)用切刀剪成3-5mm寬，組裝為試紙條。
全文摘要
本發明涉及一種無毒體系免疫層析檢測黃曲霉毒素的試紙及其制備方法，它包括底板，樣品墊，示蹤粒子結合物墊，硝酸纖維素膜，吸水墊，檢測線，質控線，其中在底板上按順序有樣品墊，示蹤粒子結合物墊，硝酸纖維素膜，吸水墊；示蹤粒子結合物墊上有示蹤粒子標記的抗黃曲霉毒素單克隆的抗體，硝酸纖維素膜上還設有檢測線和質控線，檢測線由能與抗黃曲霉毒素單克隆抗體結合的黃曲霉毒素無毒體系線狀點樣組成，質控線由能與抗黃曲霉毒素單克隆抗體結合驢抗小白鼠抗體線狀點樣組成。本發明生產過程中不需要黃曲霉毒素，避免了二次污染；檢測過程無需黃曲霉毒素標品作為指示，而直接通過顏色判斷結果；所耗費用低；靈敏度高；操作簡便、快捷。
文檔編號G01N33/558GK1687784SQ20051001860
公開日2005年10月26日 申請日期2005年4月23日 優先權日2005年4月23日
發明者賴衛華, 熊勇華, 陳高明, 李林, 曾祥敏 申請人:江西中德大地生物工程有限公司