專利名稱：一種黃曲霉毒素b1的速測方法
技術領域：
本發明涉及一種對食品以及飼料中黃曲霉毒素B1的速測方法。
背景技術：
真菌毒素是產毒真菌分泌產生的次生代謝產物，是能引起人畜各種損害的天然有毒化合物。在已經發現的真菌毒素中黃曲霉毒素B1(aflatoxin B1，簡稱AFB1)是毒性最強的真菌毒素，其毒性、致癌性和污染頻率均居生物毒素的首位。它污染食品及飼料后，直接或間接進入人類食品鏈，威脅人類的健康和生命安全，危害程度與黃曲霉毒素的攝入量成正比。黃曲霉毒素廣泛存在于大米、玉米、花生、芝麻、大豆、菜籽等農產品和魚肉等食品中，其污染食品及飼料的環節多，為此世界各國都規定了黃曲霉毒素B1在食品及飼料中的最大允許含量并作為強制性標準，因此加強對食品及飼料中黃曲霉毒素B1的檢測、特別是速測，以便及時了解和掌握食品及飼料的衛生信息，是增強食品安全性的一個重要環節。
現有黃曲霉毒素B1的檢測方法包括薄層層析法、精密儀器分析法和免疫學分析法。其中薄層層析法是檢測黃曲霉毒素最常用的檢測方法，不需要特殊的儀器設備，一般實驗室都可進行，但試劑用量大、操作繁瑣、其它組分干擾嚴重、準確性差，不能準確定量，且對實驗人員和環境的污染危害較大，不適合于現場快速檢測。精密儀器分析法包括熒光分光光度法和高效液相色譜法，其靈敏度高，準確性好，但儀器昂貴，要求黃曲霉毒素樣品純化程度高，樣品前處理過程繁瑣，耗時長，對實驗環境要求高，難以實現快速檢測。免疫學分析法包括酶免疫法、放射免疫法和時間分辨熒光法，酶免疫法，具有特異性強、靈敏度高、成本低、適于批量檢測等優點，但一般為定性或半定量方法，在檢測成分復雜的農產品中黃曲霉毒素時易受干擾，并存在假陽性的比例較高，檢測準確度不高等缺點。放射免疫法與酶免疫法相似，但放射免疫法還存在放射污染，對操作者及環境容易帶來額外不利影響，現應用較少。時間分辨熒光法是近年已有應用，檢測靈敏度比前兩者更高，但前處理仍較復雜，且所需儀器昂貴，限于醫學臨床診斷領域使用。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是針對上述現有技術存在的不足而提供一種樣品處理和檢測較為簡便，檢測的精度和穩定性較高，檢測時間短，安全性高，可適于快速檢測的黃曲霉毒素B1的速測方法。
本發明為解決上述提出的問題所采用的技術方案為取2～10g已磨細待測樣品放入具塞試管，加入10～25ml濃度為50～80％的甲醇氯化鈉水溶液，在40～60℃水浴中超聲波提取，中速定性濾紙抽濾，取出4～10ml濾液；在濾液中加入2～4ml重蒸石油醚，振蕩混勻，靜置分層，取下層溶液1～4ml，在取出的下層溶液中加入4～20ml純水，然后過黃曲霉毒素B1免疫親和微柱，再用5～10ml濃度為10～40％甲醇水溶液洗黃曲霉毒素B1免疫親和微柱，爾后用0.5～2.0ml純甲醇洗脫，收集洗脫液，在洗脫液中加入0.2～1.0ml測試劑A，放入熒光分光光度計或類似測量儀器測定。所述的測試劑A由1～5％磷酸二氫銨(NH4H2PO4)溶液和0.01～0.1％氯化汞(HgCl2)溶液按1∶2體積混合而成。
按上述方案，所述的黃曲霉毒素B1免疫親和微柱由氨基修飾的硅膠顆粒(微球)偶聯黃曲霉毒素B1多克隆抗體于玻璃微柱中裝填而成；所述的黃曲霉毒素B1免疫親和微柱所用玻璃微柱的規格為Φ2～10mm×40～100mm。
按上述方案，所述的濃度為50～80％甲醇氯化鈉水溶液是將500～800ml甲醇和重量為10～20克的氯化鈉用純水定容至1000ml制成；所述的濃度為10～40％甲醇水溶液是將100～400ml甲醇用純水定容至1000ml制成；所述的重蒸石油醚由分析石油醚重蒸而成；所述的純水是將去離子水用超純水器純化而成。所述的在40～60℃水浴中超聲波提取的時間可為3～5分鐘。所述靜置分層的時間可為2～5分鐘。
本發明采用抗體連接微球技術，經超聲波提取，石油醚萃取來去除雜質，進行快速簡便的前處理，然后通過黃曲霉毒素B1免疫親和微柱分離純化黃曲霉毒素B1，提高黃曲霉毒素B1檢測的特異性和靈敏度，縮短測試時間，以適于黃曲霉毒素定量快速檢測。
本發明的有益效果在于(1)操作簡單、測定快速。樣品處理簡單，自動化程度高，可批量測定，整個測定時間僅需20～30分鐘/樣次，而其它傳統方法均需要幾個小時至幾天時間。
(2)性能穩定，技術指標先進。采用抗體免疫技術，可以特效性地將黃曲霉毒素分離出來，分離效率和回收率高，正確性和可靠性強，靈敏度高，可定量測定，最低檢測限可為0.1μg/kg，特異性高，重復性好，回收率可達90％。
(3)污染少，安全性高。該方法所需有機試劑和其他有毒試劑少，特別是取消了黃曲霉毒素標準品的使用，大大減小了對操作人員和環境的污染。
(4)與小型專用熒光分光測量儀配置使用可實現黃曲霉毒素B1的現場速測，有利于一線工作人員對食品衛生的及時檢測和監控。
圖1為本發明速測方法的流程框圖。
具體實施例方式
下面結合附圖進一步說明本發明的實施例。
實施例1稱取10g已磨細大米樣品放入具塞試管，加入20ml濃度為50～60％甲醇氯化鈉水溶液，甲醇氯化鈉水溶液中按重量計含1～2％氯化鈉，在50℃水浴中超聲波提取3分鐘，再用中速定性濾紙抽濾，抽出10ml濾液；在濾液中加入2～4ml重蒸石油醚，振蕩混勻，靜置2分鐘后取下層溶液4ml，在取出的下層溶液中加入20ml純水，然后過黃曲霉毒素B1免疫親和微柱，所述的黃曲霉毒素B1免疫親和微柱所用玻璃微柱的規格為Φ2～4mm(內徑)×60mm(長度)，每克氨基修飾的硅膠顆粒(微球)含1.0～3.0毫克黃曲霉毒素B1多克隆抗體；再用5ml濃度為10～40％甲醇水溶液洗黃曲霉毒素B1免疫親和微柱2次，然后用1.0ml純甲醇洗脫，收集洗脫液，加入0.2ml測試劑A，所述的測試劑A由2～3％磷酸二氫銨(NH4H2PO4)溶液和0.03～0.05％氯化汞(HgCl2)溶液按1∶2體積混合而成；放入熒光分光光度計測定。根據黃曲霉毒素B1熒光分光光度計測定標準溶液，繪制標準曲線，定量計算得所測大米中黃曲霉毒素B1含量為0.5μg/kg。
實施例2稱取8.0g已磨碎山東大花生樣品放入具塞試管，加入25ml濃度為80％甲醇氯化鈉水溶液，甲醇氯化鈉水溶液中按重量計含1.8％氯化鈉，在60℃水浴中超聲波提取5分鐘，用中速定性濾紙抽濾，抽出5ml濾液；在濾液中加入3ml重蒸石油醚，振蕩萃取，靜置2分鐘后取下層溶液1ml，將取出的下層溶液加入4ml純水，然后過黃曲霉毒素B1免疫親和微柱，再用10ml濃度為10％甲醇水溶液洗黃曲霉毒素B1免疫親和微柱2次，然后用2.0ml純甲醇洗脫，收集洗脫液，加入1.0ml測試劑A，放入熒光分光光度計測定。根據黃曲霉毒素B1熒光分光光度計測定標準溶液，繪制標準曲線，定量計算得所測大米中黃曲霉毒素B1含量為2.8μg/kg。
實施例3稱取2.0g植物油樣品放入具塞試管，加入10ml濃度為70％甲醇氯化鈉水溶液，甲醇氯化鈉水溶液中按重量計含1.5％氯化鈉，在40～60℃水浴中超聲波提取3分鐘，用中速定性濾紙抽濾，抽出8ml濾液；在濾液中加入4ml重蒸石油醚，振蕩萃取，靜置2-3分鐘后取下層溶液2ml，在取出的下層溶液中加入8ml超純水，然后過黃曲霉毒素B1免疫親和微柱，再用5ml濃度為10％甲醇水溶液洗黃曲霉毒素B1免疫親和微柱，爾后用1.0ml純甲醇洗脫，收集洗脫液，加入0.5ml測試劑A，放入熒光分光光度計測定。根據黃曲霉毒素B1熒光分光光度計測定標準溶液，繪制標準曲線，定量計算得所測大米中黃曲霉毒素B1含量為1.2μg/kg。
實施例4稱取5.0g已磨碎混勻豬飼料樣品放入具塞試管，加入15ml濃度為60％甲醇氯化鈉水溶液，甲醇氯化鈉水溶液中按重量計含1.0％氯化鈉，在50℃水浴中超聲波提取5分鐘，用中速定性濾紙抽濾，抽出6ml濾液；在濾液中加入3ml重蒸石油醚，振蕩萃取，靜置2分鐘后取下層溶液3ml，將取出的下層溶液加入6ml純水，然后過黃曲霉毒素B1免疫親和微柱，再用10ml濃度為15％甲醇水溶液洗黃曲霉毒素B1免疫親和微柱2次，然后用1.0ml純甲醇洗脫，收集洗脫液，加入1.0ml測試劑A，放入熒光分光光度計測定。根據黃曲霉毒素B1熒光分光光度計測定標準溶液，繪制標準曲線，定量計算得所測豬飼料中黃曲霉毒素B1含量為3.2μg/kg。
權利要求
1.一種黃曲霉毒素B1的速測方法，其特征在于取2～10g已磨細待測樣品放入具塞試管，加入10～25ml濃度為50～80％的甲醇氯化鈉水溶液，在40～60℃水浴中超聲波提取，中速定性濾紙抽濾，取出4～10ml濾液；在濾液中加入2～4ml重蒸石油醚，振蕩混勻，靜置分層，取下層溶液1～4ml，在取出的下層溶液中加入4～20ml純水，然后過黃曲霉毒素B1免疫親和微柱，再用5～10ml濃度為10～40％甲醇水溶液洗黃曲霉毒素B1免疫親和微柱，爾后用0.5～2.0ml純甲醇洗脫，收集洗脫液，在洗脫液中加入0.2～1.0ml測試劑A，放入熒光分光光度計測定，所述的測試劑A由1～5％磷酸二氫銨溶液和0.01～0.1％氯化汞溶液按1∶2體積混合而成。
2.按權利要求1所述的黃曲霉毒素B1的速測方法，其特征在于所述的黃曲霉毒素B1免疫親和微柱由氨基修飾的硅膠顆粒偶聯黃曲霉毒素B1多克隆抗體于玻璃微柱中裝填而成。
3.按權利要求2所述的黃曲霉毒素B1的速測方法，其特征在于所述的黃曲霉毒素B1免疫親和微柱所用玻璃微柱的規格為Φ2～10mm×40～100mm。
4.按權利要求2或3所述的黃曲霉毒素B1的速測方法，其特征在于每克氨基修飾的硅膠顆粒含1.0～3.0毫克黃曲霉毒素B1多克隆抗體。
5.按權利要求1或2所述的黃曲霉毒素B1的速測方法，其特征在于所述的濃度為50～80％甲醇氯化鈉水溶液是將500～800ml甲醇和重量為10～20克的氯化鈉用純水定容至1000ml制成。
6.按權利要求1或2所述的黃曲霉毒素B1的速測方法，其特征在于所述的濃度為10～40％甲醇水溶液是將100～400ml甲醇用純水定容至1000ml制成。
7.按權利要求1或2所述的黃曲霉毒素B1的速測方法，其特征在于所述的重蒸石油醚由分析石油醚重蒸而成。
8.按權利要求1或2所述的黃曲霉毒素B1的速測方法，其特征在于所述的純水是將去離子水用超純水器純化而成。
9.按權利要求1或2所述的黃曲霉毒素B1的速測方法，其特征在于所述的在40～60℃水浴中超聲波提取的時間為3～5分鐘。
10.按權利要求1或2所述的黃曲霉毒素B1的速測方法，其特征在于所述的測試劑A由2～3％磷酸二氫銨溶液和0.03～0.05％氯化汞溶液按1∶2體積混合而成。
全文摘要
本發明涉及一種對食品以及飼料中黃曲霉毒素B1的速測方法。取2～10g已磨細待測樣品放入具塞試管，加入10～25ml濃度為50～80％的甲醇氯化鈉水溶液，在40～60℃水浴中超聲波提取，中速定性濾紙抽濾，取出4～10ml濾液；在濾液中加入2～4ml重蒸石油醚，振蕩混勻，靜置分層，取下層溶液1～4ml，在取出的下層溶液中加入4～20ml純水，然后過黃曲霉毒素B1免疫親和微柱，再用5～10ml濃度為10～40％甲醇水溶液洗黃曲霉毒素B1免疫親和微柱，爾后用0.5～2.0ml純甲醇洗脫，收集洗脫液，在洗脫液中加入0.2～1.0ml測試劑A，放入熒光分光光度計或類似測量儀器測定。本發明的特點是樣品處理和檢測較為簡便，檢測的精度和穩定性較高，檢測時間短，安全性高，可適于快速檢測黃曲霉毒素B1。
文檔編號G01N33/543GK1673746SQ20051001855
公開日2005年9月28日 申請日期2005年4月15日 優先權日2005年4月15日
發明者李培武, 張文, 丁小霞, 楊金娥, 謝立華, 楊湄, 李光明 申請人:中國農業科學院油料作物研究所