有機氯農藥硫丹人工抗原和抗體及其制備方法與應用的制作方法

專利名稱：有機氯農藥硫丹人工抗原和抗體及其制備方法與應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于農藥小分子化合物(分子量小于1000道爾頓)免疫化學和殘留分析技術領域。尤其涉及具有環戊二烯類殺蟲劑硫丹等小分子農藥人工半抗原、特異性抗原的設計合成，和免疫動物特異性抗體的制備及其在建立免疫分析方法方面的應用。
背景技術：
硫丹是一種極為廣譜的殺蟲劑，主要針對多種咀嚼式和刺吸式口器害蟲，同時可兼治一些蛾類。可防治鱗翅目的蛾類和蝶類幼蟲(如各種食葉性、蛀鈴、蛀果和蛀莖幼蟲等)；鞘翅目的甲蟲和象鼻蟲；同翅目的蚜蟲和葉蟬及白粉虱；半翅目的蝽象類；纓翅目的各種薊馬；雙翅目的吸漿蟲；蜱螨目的纓螨和跗線螨。對害蟲不易產生抗性。殺蟲譜廣，并可與大多數農藥混用，增效作用明顯。除防治害蟲外，亦可提高農作物品質，植株使用后，葉色更綠，更健壯。
硫丹為高毒的有機氯殺蟲劑。對人有致突變作用。對中樞神經系統有損害。主要損害中樞神經系統的運動中樞、小腦、腦干和肝、腎、生殖系統，為致腫瘤物。可引起驚厥。一般表現為頭痛、痙攣、口吐泡沫，嗜睡，震顫。
然而，由于分子量小于1000dolton(道爾頓)的小分子有毒化學品，如農藥及其代謝產物，其傳統的殘留分析方法，主要是依靠氣相色譜(GC)、液相色譜(HPLC)或質譜等物化分析手段。該傳統的理化分析方法，繁瑣復雜、成本較高、分析速度慢，難以滿足實際分析的需要，因此迫切要求發展簡便、快速、靈敏的分析技術。
與大分子不同，小分子化合物免疫分析有自身特點(1)小分子化合物〔MW≤1000dolton)一般不具有免疫原性，不能直接免疫動物產生特異性抗體、必須合成突出分子立體結構特異性部位的半抗原，并與大分子載體連接構成接合物，才能免疫動物產生針對這一目標小分子化合物的特異性抗體。這種半抗原與大分子載體的結合物稱為人工抗原。人工抗原的制備不是任意的，包括結合位點、結合方式、載體種類、以及半抗原與目標分析物任何結構上的差異如大小、形狀、成份、構型、構象、極性、電子云密度等等在內的諸因素，都可能極大地影響著相應抗體的性質，因此它們是決定產生其特異性抗體和建立免疫分析方法的關鍵。
(2)雖然小分子化合物不具有免疫原性，但具有反應原性，即具有與相應抗體發生免疫學反應的能力，并可體外定量進行，遵循質量作用定律。
(3)基于抗原抗體免疫反應檢測小分子化臺物的分析技術，目前多采用酶聯免疫分析(ELISA)。利用酶促反應顯示抗原抗體的定量結合，操作簡單，又具有相當的靈敏度，近年來發展很快。80年代以來發展起來的農藥ELISA和簡易酶免疫EIA技術，使農藥殘留分析在方法上獲得更大的生命力；對使用快速分析樣本基質過于復雜，用普通理化方法難以分析的農藥殘留，具有相當的應用價值。
免疫分析技術被引入農藥殘留分折領域，成為一種最有發展和應用潛力的報量分析技術之一，受到廣泛的重視。第一個農藥免疫分析的報道是1967年Centen等人制備的農藥馬拉硫磷的抗血清。1980年Hammock和Mumma，進一步探討了農藥免疫分析方法的理論和技術之后，使ELISA農藥分折技術，進入了一個嶄新的階段。
農藥小分子化合物(分子量小于1000道爾頓)，依靠免疫學、免疫化學基本原理和生物技術手段。該技術研究的關鍵是半抗原的分子設計、合成和人工全抗原及抗體的制備。因此，目標分析物分子免疫學特性，以及如何通過化學或生化技術突出和利用這些特性，是該領域重要的研究內容。這一技術目前已成為微量分析研究的一個嶄新領域，可與傳統分析方法并列作為一項新的分析途徑。硫丹人工抗原和特異性抗體以及以此為基礎建立免疫分析方法在國內尚未見報道。

發明內容
針對上述情況，當前急需一種簡易快速有效地檢測農藥硫丹的方法。本發明的目的，是設計合成具有環戊二烯分子結構的有機氯農藥硫丹的半抗原和人工抗原，獨特之處在于突出了這類農藥分子特異性抗原決定簇，又克服了化學合成的困難，免疫動物誘導產生親合性很高的特異性抗體；并以此為基礎建立了ELISA方法即快速免疫分析方法，準確檢測有機氯農藥硫丹。
本發明的技術方案如下。
本發明設計、合成了小分子目標分析物半抗原，并與載體蛋白質偶聯，制備有效人工抗原，免疫動物制備對小分子分析物特異性抗體，利用抗原抗體的特異性免疫學反應和易被檢測識別的標記物的放大作用，從而定性定量地檢測樣本中超微量小分子目標分析物，即可用于樣本測定。其選擇性決定于免疫學反應的特異性，其靈敏度取決于抗體的親合性和標記物的可檢性。因此可以快速準確地分析檢測農藥硫丹在樣本中的殘用量。該技術研究的關鍵是半抗原的分子設計、合成和人工全抗原及抗體的制備。
硫丹的結構如下圖所示
α-硫丹β-硫丹硫丹的分子結構可以分為兩個結構單元一部分是六氯環戊二烯，另一部分是亞硫酸酯。從免疫學的角度分析，六氯環戊二烯的空間結構復雜，分子量較大，可以作為抗原決定簇。半抗原的設計、合成是本方法成敗的關鍵所在。為突出該類農藥分子特異性抗原決定簇，本發明選擇合成了兩種環戊二烯類殺蟲劑衍生物的半抗原，其結構為 半抗原A 半抗原B本發明以半抗原A為基礎，與載體蛋白KLH相連接合成分子式為 的化合物為人工抗原；本發明以半抗原B為基礎
與辣根過氧化物酶連接作為酶標抗原；其中人工抗原再經動物免疫，取血，分出抗全血清，純化制得抗體。
農藥硫丹特異性抗體的制備方法1.半抗原設計與合成為了制備硫丹抗體和酶標記物，合成了兩種環戊二烯類殺蟲劑衍生物的半抗原。
半抗原A和B的合成1)把琥珀酸酐(1-1.5mmol)加到1-hydroxychlordene(1-1.5mmol)的2mL無水吡啶溶液中，再加入二甲氨基吡啶(DMAP)，混合體系攪拌過夜。加入30mL乙酸乙酯，有機層用酸(HCl)，水和鹽水洗，再用硫酸鎂干燥。濃縮溶液，殘留物過硅膠柱(甲醇/氯仿/乙酸1-3∶90-100∶0.1-0.5)，得到白色固體產物1mp117-118℃(氯仿/石油醚)，質譜分析H NMRδ6.01(m，H2)，5.93(m，H3)，5.61(bs，H1)，3.99(m，H3a)，3.26(dd，JH3a，H7a＝7.3Hz，JH1，H7a＝1.8Hz)，2.67(d，JH，H＝8.8Hz，COCH2)，2.67(d，COCH2)；13C NMRδ177.7(CO2H)，171.1(CO)，135.1，133.6(C2，3)，131.2(C5，6)，102.9(C8)，81.6，79.3(C4，7)，60.5(C3a)，56.6(C1，7a)，28.8(2CH2)。
2)把N-羥基琥珀酰亞胺(0.5-1mmol)加到化合物1(0.5-1mmol)的10mLDCM溶液中，再加入DMAP。混合體系攪拌過夜，過濾，蒸發，殘留物過硅膠柱(丙酮/氯仿＝1-5∶5-10)得到白色固體用二氯甲烷/石油醚重結晶，得到半抗原A。質譜分析1H NMRδ6.04(m，H2)，5.97(m，H3)，5.64(bs，H1)，4.06(m，H3a)，3.03(dd，J H3a，H7a＝7.3Hz，JH7a，H1＝1.9Hz，H7a)，2.97(t，JHH＝6.8，COCl2)，2.85(s，2×NCOCH2)，2.75(t，COCH2)；13C NMRδ169.8(CO)，168.8(2×CON)，167.5(CO)，134.9，133.7(C2，3)，131.4，128.9(C5，6)；103.8，102.9(C8)(isomers at C1)，81.6，79.6(C4，7)，60.4(C3a)，56.3(C1，7a)，28.6[C3(butane)]，26.1[C2(butane)]，25.5，25.4(2×CHCON)。
3)將1-hydroxychlordene按化合物1的處理方式，得到中間化合物A，性狀為白色固體mp 177-181℃；質譜分析′H NMRδ5.71(dd，JHI，H2＝9.6Hz，H2)，3.85(m，H1，3)，3.76(2×d，JH，H＝2.3Hz，H3a，7a)，2.81[m(11lines A2B2)，4H，2×CH2]；13C NMRδ173.7，(CO2H)，170.9(CO)，132.2(C5，6)；103.6(C8)，81.7，79.8(C4，7)，56.6(C3a，7a)，55.1(C1，3)，28.8，28.7(2×CH2)。然后將中間化合物A按半抗原I的處理方法，得到琥珀酰亞胺酯的白色固體，即半抗原B。
2.人工抗原的合成用半抗原A以酰胺基CONH為橋梁，通過活性酯法，分別連接到卵清蛋白(ovalbumin，OA)或血藍蛋白(keyhole limpet hemocyanin，KLH)上，合成人工抗原；具體做法是取半抗原A溶于N，N-二甲基甲酰胺DMF中，加入N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)溶于DMF溶液和N，N-二環己基碳二亞胺溶于DMF溶液，使半抗原A、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)與N，N-二環己基碳二亞胺三者摩爾比為1∶4-5∶3-4，在22-25℃下，攪拌反應1小時，然后放于4℃冰箱內18小時，離心除去沉淀，再將上層活化酯液加入到pH＝7.0蛋白質PBS溶液中，其半抗原與蛋白質摩爾比為10-50∶1，經攪拌后于4℃下反應5小時，最后將反應液裝入透析袋，4℃下、pH＝7.4的PBS中透析，精確量取蛋白質偶聯物溶液的體積，測定濃度和結合比，分裝，-20℃保存；3.酶標抗原的制備用半抗原B與辣根過氧化物酶連接即制成酶標抗原，用于顯色反應；其具體做法同人工抗原的合成II；
4.免疫與特異性抗體制備·免疫免疫動物選用雌性大白兔，免疫方法采用皮下和肌肉注射法，初免后進行四次加強免疫，加強免疫分別于初次免疫后2周、4周和6周后免疫三次，此后間隔一個月，第五次免疫完后9天時由兔子的耳緣靜脈取血，進行效價檢測；具體做法是初次免疫取1mg上述人工抗原溶于0.9％的NaCl溶液和弗氏完全佐劑等體積所配制的溶液中，進行動物免疫；加強免疫用0.5mg上述人工抗原溶于0.9％的NaCl溶液和弗氏不完全佐劑等體積所配制的溶液，進行動物免疫；·抗體純化定時監測動物抗體效價，當抗體對一定的包被抗原達到適宜效價時，采集血液，并離心獲得抗血清，使用G-Sepharose蛋白親和層析柱對抗血清進行純化，制備IgG抗體。
上述制備的農藥硫丹抗體可用于硫丹的免疫檢測。
免疫分析方法的建立和測定條件的優選利用方陣實驗分別確定抗原抗體結合效價、親和性以及ELISA方法的抗體和酶標記物的最適效價。本發明建立了的快速免疫檢測方法和實驗室標準檢測方法，并對pH值、離子強度等影響測定的因素進行分析，確定最佳工作條件，建立標準曲線即目標分析物濃度對抗體的抑制率(或結合率B/B0)的相關曲線。目標分析物濃度對抗體的抑制率I＝(Amax-Amin)-(Ai-Amin)/(Amax-Amin)*100抗體與抗原的結合率B/B0＝(Ai-Amin)/(Amax-Amin)*100式中Amax空白孔平均吸光值；Amin免疫前免血清對照孔平均吸光值。Ai加樣孔平均吸光值。以抑制率或結合率B/B0為縱坐標、分析物濃度C為橫坐標繪制標準曲線。
抗體特異性以抗體與結構類似化合物的交叉反應程度，以抑制抗體最大結合率的50％所需目標分析物的濃度I50i與所需各種結構類似化合物的濃度I50M之比的百分數表示，即交叉反應率C.R(％)。
C.R(％)＝I50i/I50M*100交叉反應越小，抗體特異性越高。
上述制備的農藥硫丹抗體可用于硫丹的免疫檢測方法中，其方法如下·包被將制備好的抗體溶于50mmol、pH9-10的碳酸緩沖液中，配制成10mg/mL的包被液，酶標條的每個孔加100μl包被液12-16小時，將包被好的酶標條的每個孔，用PBST即磷酸鹽緩沖液0.05％(v/v)，Tween20洗液洗滌三次；·封閉每孔加入150-200μl、1％牛血清蛋白(BSA)/PBS封閉液，封閉一小時；
·封閉每孔加入150-200μl、1％牛血清蛋白(BSA)/PBS封閉液，封閉一小時；·加樣將待測樣品溶于含有1％BSA的PBS中，西維因標樣也溶于含有1％BSA的PBS中，加樣時每孔加入50μl上述待測樣品或標樣；·競爭反應將酶標抗原溶于含有0.1％魚皮膠(FG)-PBS緩沖液中，加入待測樣品或標樣后，每孔加入50μl酶標抗原溶液，孵育10分鐘或60分鐘后用洗板液洗滌三次；·顯色顯色底物使用四甲基聯苯胺(TMB)，每孔加入150μl四甲基聯苯胺(TMB)-雙氧水溶液(5mg四甲基聯苯胺溶液溶于1ml底物緩沖液)，顯色5分鐘或30分鐘后每孔加入50μl 5mol/L的硫酸終止；反應液在自動酶標儀上讀數。
需要說明的是上述待測樣品為待測物品的農藥硫丹提取物，該提取物的快速提取方法采用甲醇提取法。
甲醇提取法的具體做法是用5倍體積的甲醇，浸泡未經粉碎的樣品12-16小時；或用10g粉碎后的樣品浸泡于50ml甲醇中，振蕩2分鐘；或用10g粉碎后的樣品浸泡于50ml甲醇中，攪拌2分鐘，靜置、取上請液，即得到待測樣品。
本發明的有益效果如下。
與其他同類方法相比，本發明具有特異、靈敏、準確、快速、方便、廉價等特點。該設計、合成的半抗原與目標待測物相似程度高，對待測物的特征結構保留完整，為制備特異性良好的抗體奠定了基礎。其抗體具有良好的特異性和靈敏度，檢測極限達到0.8μg/kg，而且抗體的稀釋度可達到1/1×106。所得抗體和酶標抗原穩定，具有常溫保藏時間長的優點。
經試驗驗證，上述半抗原，其合成方法簡便，且所用主要原料價格較為低廉、容易獲得，在一般化學試劑公司都可購買。由于合成效率高、反應步驟少，半抗原只需三步反應既可合成，從而提高了反應的可控性。另外，合成產物的提取、純化方法簡便，只需要對合成產物進行結晶，即可獲得高純度的目的產物。因此，本發明合成半抗原的方法與其他方法相比較，更加易于推廣普及。
本發明提供的快速檢測方法操作簡便、快速，完成全部檢測操作過程只需40-60分鐘，而且檢測的精確度可達90％以上，非常適合現場檢測的需要。由于抗體和酶標抗原，在常溫下可以保藏1周、酶標抗原包備的酶標板在4℃下可以保藏6個月以上，從而為進行大規模樣品的集中檢測，提供了極大的方便。因此，本發明不僅在實驗室檢測中表現出色，并為開發出成本低廉、檢測效率高、操作簡便的酶聯免疫快速檢測工具，奠定了基礎，具有良好的應用前景；既有經濟效益又有社會效益。


圖1、圖2分別為半抗原A、B；圖3為人工抗原；圖4為酶標抗原。
實施例11.半抗原合成半抗原A和B的合成把琥珀酸酐(1-1.5mmol)加到1-hydroxychlordene(1-1.5mmol)的2mL無水吡啶溶液中，再加入二甲氨基吡啶(DMAP)，混合體系攪拌過夜。加入30mL乙酸乙酯，有機層用酸(HCl)，水和鹽水洗，再用硫酸鎂干燥。濃縮溶液，殘留物過硅膠柱(甲醇/氯仿/乙酸1-3∶90-100∶0.1-0.5)，得到白色固體產物1。
1)把N-羥基琥珀酰亞胺(0.5-1mmol)加到化合物1(0.5-1mmol)的10mLDCM溶液中，再加入DMAP。混合體系攪拌過夜，過濾，蒸發，殘留物過硅膠柱(丙酮/氯仿＝1-5∶5-10)得到白色固體用二氯甲烷/石油醚重結晶，得到半抗原A。
2)將1-hydroxychlordene按化合物1的處理方式，得到中間化合物A，然后將中間化合物A按半抗原I的處理方法，得到琥珀酰亞胺酯的白色固體，即半抗原B。
2.人工抗原的合成用半抗原A以酰胺基CONH為橋梁，通過活性酯法，分別連接到卵清蛋白(ovalbumin，OA)或血藍蛋白(keyhole limpet hemocyanin，KLH)上，合成人工抗原；具體做法是取半抗原A溶于N，N-二甲基甲酰胺DMF中，加入N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)溶于DMF溶液和N，N-二環己基碳二亞胺溶于DMF溶液，使半抗原A、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)與N，N-二環己基碳二亞胺三者摩爾比為1∶4-5∶3-4，在22-25℃下，攪拌反應1小時，然后放于4℃冰箱內18小時，離心除去沉淀，再將上層活化酯液加入到pH＝7.0蛋白質PBS溶液中，其半抗原與蛋白質摩爾比為10-50∶1，經攪拌后于4℃下反應5小時，最后將反應液裝入透析袋，4℃下、pH＝7.4的PBS中透析，精確量取蛋白質偶聯物溶液的體積，測定濃度和結合比，分裝，-20℃保存；3.酶標抗原的制備用半抗原B與辣根過氧化物酶連接即制成酶標抗原，用于顯色反應；其具體做法同人工抗原的合成II；
4.免疫與特異性抗體制備·免疫動物選擇雄性大白兔，月齡3個月，體重1.5公斤，飼養于標準實驗動物房中，連續觀察3天，確定身體狀況正常后進行免疫。
初次免疫精確稱取1mg人工抗原溶于0.5ml 0.9％的NaCl溶液和0.5ml弗氏完全佐劑所配制的溶液免疫。
加強免疫用0.5mg人工抗原溶于0.5ml 0.9％的NaCl溶液和0.5ml弗氏不完全佐劑所配制的溶液免疫。加強免疫分別于初次免疫后2周、4周和6周后免疫三次，此后間隔一個月。第五次免疫完后9天時由兔子的耳緣靜脈取血，進行效價檢測。
·由抗血清中純化制備抗體定時監測動物抗體效價，當終點效價達到20萬以上時，由頸動脈采全血。將采集的全血22℃靜止2小時后在4度下靜止8小時，然后3500轉/min離心10分鐘，收集上清液于-20℃保存。將離心后獲得的血清用G-SepharoseCL-4B免疫親和層析柱過濾，對抗血清進行純化，制備IgG抗體。
5.免疫檢測方法的建立擬測物品為紅葡萄。使用快速免疫檢測方法，檢測樣品硫丹的含量步驟如下1)提取待測樣品----甲醇提取法①分別用50ml甲醇浸泡10克紅葡萄樣品1小時。其浸泡液即為待測樣品。
2)檢測方法及方陣試驗評價方法采用快速免疫檢測方法(試驗使用8孔酶標條)·包被將制備好的抗體溶于50mmol、pH9.6的碳酸緩沖液中，配制成10μg/mL的包被液。在標條的每個孔內，加100μl包被液，12小時。將包被好的酶標條的每個孔用PBST(磷酸鹽緩沖液0.05％(v/v)，Tween 20)洗液洗滌三次。
·封閉每孔加入150μl、1％牛血清蛋白(BSA)/PBS封閉液，封閉一小時。
·加樣將待測樣品溶于含有1％BSA的PBS中，硫丹標樣也溶于含有1％BSA的PBS中。加樣時每孔加入50μl上述待測樣品或標樣。
·競爭反應將酶標抗原溶于含有0.1％魚皮膠(FG)-PBS緩沖液中，加入待測樣品或標樣后，每孔加入50μl酶標抗原溶液，孵育10分鐘后用洗板液洗滌三次。
·顯色顯色底物使用四甲基聯苯胺(TMB)。每孔加入150μl四甲基聯苯胺(TMB)-雙氧水溶液(5mg四甲基聯苯胺溶液溶于1ml底物緩沖液)，顯色5分鐘后每孔加入50μl 5mol/L的硫酸終止。反應液在自動酶標儀上讀數。
上述檢測方法方陣試驗結果如下西維因的抑制率標準曲線所示。在圖1中(◆)和(■)分別為1％的BSA-PBS標樣和紅葡萄提取液的硫丹抑制率標準曲線。從試驗結果可以看出，西維因抗體的特異性很好。
·硫丹直接競爭ELISA檢測方法性能指標的評價1.檢測限對于直接競爭ELISA法，檢測限是指抑制率為15％時的標準物濃度，研究建立的硫丹直接競爭ELISA檢測方法IC15＝1.0±0.2ppb，其檢測限為1.0±0.2ppb2.精密度嚴格控制分析條件，按標準操作，對于建立的硫丹ELISA檢測方法進行了精密度的測試，分別以板內變異和板間變異表示。
2.1板內變異取六個不同濃度的硫丹標準溶液，進行ELISA分析，每個濃度作10個復孔，測得抑制率(IC)進行分析，結果見表2。
表2硫丹直接競爭ELISA板內變異

2.2板間變異取六個不同濃度的硫丹標準溶液，進行ELISA分析，每個濃度每天作兩次分析，綜合5天測得的抑制率(IC)吸光度值進行分析，結果見表3。
表3硫丹直接競爭ELISA板間變異


試驗結果表明本發明可以滿足快速檢測方法的需要。
實施例2免疫檢測時，提取樣品采用甲醇提取法①即分別用10g綠葡萄，胡蘿卜，菠菜，茶葉，煙草等五種樣品為待測物品，浸泡于50ml甲醇中振蕩60分鐘、靜置、取上請液，即得到待測樣品。所得浸泡液即為待測樣品。其它同實施例1。
實施例3檢測方法采用實驗室檢測方法(試驗使用8孔酶標條)·包被將制備好的抗體溶于50mmol、pH9.6的碳酸緩沖液中，配制成10mg/mL的包被液。酶標條的每個孔加100μl包被液過夜。將包被好的酶標條的每個孔用PBST(磷酸鹽緩沖液0.05％(v/v)，Tween 20)洗液洗滌三次。
·封閉每孔加入150μl、1％牛血清蛋白(BSA)/PBS封閉液，封閉一小時。
·加樣將待測樣品溶于含有1％BSA的PBS中，硫丹標樣也溶于含有1％BSA的PBS中。加樣時每孔加入50μl上述待測樣品或標樣。
·競爭反應將酶標抗原溶于含有0.1％魚皮膠(FG)-PBS緩沖液中，加入待測樣品或標樣后，每孔加入50μl酶標抗原溶液，孵育60分鐘后用洗板液洗滌三次。
·顯色顯色底物使用四甲基聯苯胺(TMB)。每孔加入150μl四甲基聯苯胺(TMB)-雙氧水溶液(5mg四甲基聯苯胺溶液溶于1ml底物緩沖液)，顯色30分鐘后每孔加入50μl 5mol/L的硫酸終止。反應液在自動酶標儀上讀數。其它同實施例1。
權利要求
1.有機氯農藥硫丹人工抗原和抗體，其特征在于合成了兩種環戊二烯類殺蟲劑衍生物的半抗原，其結構為 半抗原A 半抗原B以半抗原A為基礎，與載體蛋白KLH相連接，合成分子式為 的化合物為人工抗原；以半抗原B為基礎 與辣根過氧化物酶連接作為酶標抗原；其中人工抗原再經動物免疫，取血，分出抗全血清，純化制得抗體。
2.權利要求1所述的農藥硫丹人工抗原和抗體的制備方法，其特征在于是由下述步驟制得I.半抗原的設計與合成為制備硫丹抗體和酶標記物，合成了兩種環戊二烯類殺蟲劑衍生物的半抗原；半抗原A和B的合成1)把琥珀酸酐1-1.5mmol加到1-hydroxychlordene(1-1.5mmol)的2mL無水吡啶溶液中，再加入二甲氨基吡啶DMAP，混合體系攪拌過夜；加入30mL乙酸乙酯，有機層用酸HCl、水和鹽水洗，再用硫酸鎂干燥；濃縮溶液，殘留物過硅膠柱(甲醇/氯仿/乙酸1-3∶90-100∶0.1-0.5)，得到白色固體產物1mp117-118℃，氯仿/石油醚，質譜分析H NMR δ6.01(m，H2)，5.93(m，H3)，5.61(bs，H1)，3.99(m，H3a)，3.26(dd，JH3a，H7a＝7.3Hz，JH1，H7a＝1.8Hz)，2.67(d，JH，H＝8.8Hz，COCH2)，2.67(d，COCH2)；13C NMRδ177.7(CO2H)，171.1(CO)，135.1，133.6(C2，3)，131.2(C5，6)，102.9(C8)，81.6，79.3(C4，7)，60.5(C3a)，56.6(C1，7a)，28.8(2 CH2)；2)把N-羥基琥珀酰亞胺0.5-1mmol加到化合物1為0.5-1mmol的10mL DCM溶液中，再加入DMAP；混合體系攪拌過夜，過濾，蒸發，殘留物過硅膠柱(丙酮/氯仿＝1-5∶5-10)，得到白色固體用二氯甲烷/石油醚重結晶，得到半抗原A；質譜分析1H NMR δ6.04(m，H2)，5.97(m，H3)，5.64(bs，H1)，4.06(m，H3a)，3.03(dd，J H3a，H 7a＝7.3Hz，J H 7a，H1＝1.9Hz，H7a)，2.97(t，JHH＝6.8，COCl2)，2.85(s，2×NCOCH2)，2.75(t，COCH2)；13C NMRδ169.8(CO)，168.8(2×CON)，167.5(CO)，134.9，133.7(C2，3)，131.4，128.9(C5，6)；103.8，102.9(C8)(isomers at Cl)，81.6，79.6(C4，7)，60.4(C3a)，56.3(C1，7a)，28.6[C3(butane)]，26.1[C2(butane)]，25.5，25.4(2×CHCON)；3)將1-hydroxychlordene按化合物1的處理方式，得到中間化合物A，性狀為白色固體mp 177-181℃；質譜分析1H NMR δ5.71(dd，JH1，H2＝9.6Hz，H2)，3.85(m，H1，3)，3.76(2×d，JH，H＝2.3Hz，H3a，7a)，2.81[m(11 lines A2B2)，4H，2×CH2]；13C NMRδ173.7，(CO2H)，170.9(CO)，132.2(C5，6)；103.6(C8)，81.7，79.8(C4，7)，56.6(C3a，7a)，55.1(C1，3)，28.8，28.7(2×CH2)；然后將中間化合物A按半抗原I的處理方法，得到琥珀酰亞胺酯的白色固體，即半抗B；II.人工抗原的合成用半抗原A以酰胺基CONH為橋梁，通過活性酯法，分別連接到卵清蛋白(ovalbumin，OA)或血藍蛋白(keyhole limpet hemocyanin，KLH)上，合成人工抗原；具體做法如下取半抗原A溶于N，N-二甲基甲酰胺DMF中，加入N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)溶于DMF溶液和N，N-二環己基碳二亞胺溶于DMF溶液，使半抗原A、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)與N，N-二環己基碳二亞胺三者摩爾比為1∶4-5∶3-4，在22-25℃下，攪拌反應1小時，然后放于4℃冰箱內18小時，離心除去沉淀，再將上層活化酯液加入到pH＝7.0蛋白質PBS溶液中，其半抗原與蛋白質摩爾比為10-50∶1，經攪拌后于4℃下反應5小時，最后將反應液裝入透析袋，4℃下、pH＝7.4的PBS中透析，精確量取蛋白質偶聯物溶液的體積，測定濃度和結合比，分裝，-20℃保存；III.酶標抗原的制備用半抗原B與辣根過氧化物酶連接即制成酶標抗原，用于顯色反應；其具體做法同人工抗原的合成II；IV.免疫與特異性抗體制備·免疫免疫動物選用雌性大白兔，免疫方法采用皮下和肌肉注射法，初免后進行四次加強免疫，加強免疫分別于初次免疫后2周、4周和6周后免疫三次，此后間隔一個月，第五次免疫完后9天時由兔子的耳緣靜脈取血，進行效價檢測；具體做法是初次免疫取1mg上述人工抗原溶于0.9％的NaCl溶液和弗氏完全佐劑等體積所配制的溶液中，進行動物免疫；加強免疫用0.5mg上述人工抗原溶于0.9％的NaCl溶液和弗氏不完全佐劑等體積所配制的溶液，進行動物免疫；·抗體純化定時監測動物抗體效價，當抗體對一定的包被抗原達到適宜效價時，采集血液，并離心獲得抗血清，使用G-Sepharose蛋白親和層析柱對抗血清進行純化，制備IgG抗體。
3.權利要求1所述的農藥硫丹人工抗原和抗體在硫丹的免疫檢測方法中的應用，其特征在于該方法如下·包被將制備好的抗體溶于50mmol、pH9-10的碳酸緩沖液中，配制成10mg/mL的包被液，酶標條的每個孔加100μl包被液12-16小時，將包被好酶標條的每個孔，用PBST即磷酸鹽緩沖液0.05％(v/v)，Tween20洗液洗滌三次；·封閉每孔加入150-200μl、1％牛血清蛋白(BSA)/PBS封閉液，封閉一小時；·加樣將待測樣品溶于含有1％BSA的PBS中，硫丹標樣也溶于含有1％BSA的PBS中，加樣時每孔加入50μl上述待測樣品或標樣；·競爭反應將酶標抗原溶于含有0.1％魚皮膠(FG)-PBS緩沖液中，加入待測樣品或標樣后，每孔加入50μl酶標抗原溶液，孵育10分鐘或60分鐘后用洗板液洗滌三次；·顯色顯色底物使用四甲基聯苯胺(TMB)，每孔加入150μl四甲基聯苯胺(TMB)-雙氧水溶液(5mg四甲基聯苯胺溶液溶于1ml底物緩沖液)，顯色5分鐘或30分鐘后每孔加入50μl 5mol/L的硫酸終止；反應液在自動酶標儀上讀數。
4.權利要求3所述的農藥硫丹人工抗原和抗體在硫丹免疫檢測方法中的應用，其特征在于待測樣品為待測物品的農藥硫丹提取物，該提取物的快速提取方法采用甲醇提取法，其具體做法是用5倍體積的甲醇，浸泡未經粉碎的樣品1-2小時。
全文摘要
本發明涉及農藥硫丹人工抗原抗體及其制備方法與應用，具體涉及環戊二烯類殺蟲劑硫丹等小分子化合物人工半抗原、抗原和抗體的制備及其在建立免疫分析方法方面的應用。它以硫丹的衍生物為半抗原，分別與血藍蛋白等載體蛋白、辣根過氧化物酶連接合成人工抗原和酶標抗原。所合成的半抗原不僅最大程度保留了硫丹的核心結構，而且在空間結構上與硫丹分子高度相似。同時半抗原上的活性基團位置合適，反應活性高，利于半抗原與載體蛋白的連接。人工抗原再經動物免疫、取血、分出抗血清、純化制得抗體。該抗體穩定、具有良好的特異性和靈敏度，合成方法簡便，可用于農藥硫丹的快速免疫檢測，具有良好的應用前景。
文檔編號G01N33/535GK1700001SQ20051000870
公開日2005年11月23日 申請日期2005年2月24日 優先權日2005年2月24日
發明者王碩 申請人:黃永