生物樣品中胡黃連苷－i含量的測(cè)定方法

專利名稱：生物樣品中胡黃連苷－i含量的測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于藥物分析領(lǐng)域，具體涉及生物樣品中胡黃連苷-I的含量測(cè)定方法。
背景技術(shù)：
胡黃連作為傳統(tǒng)中藥材具有消蒸退熱功效，始載于唐《新修本草》，胡黃連苷-I是胡黃連的主要有效成分，屬于環(huán)烯醚萜類化合物。目前雖然對(duì)該化合物的化學(xué)分析方法已經(jīng)有論述，但對(duì)生物樣品中胡黃連苷-I的含量分析方法僅在1997年有過(guò)一篇關(guān)于血漿中胡黃連苷-I的含量測(cè)定的報(bào)道(Joural Chromatography B，698(1997)317-320)，該法采用高效液相紫外檢測(cè)法測(cè)定了口服給藥100mg后兔血漿中胡黃連苷-I的濃度，血漿樣品經(jīng)甲醇沉淀蛋白、乙酸乙酯提取處理后，在275nm波長(zhǎng)下進(jìn)行檢測(cè)，該法定量下限為50ng/mL，且僅測(cè)定給藥后5小時(shí)血漿樣品中胡黃連苷-I的含量，靈敏度較低，且該報(bào)道中所用預(yù)處理方法復(fù)雜，回收率低，重現(xiàn)性極差，不能用于生物體內(nèi)胡黃連苷-I含量的測(cè)定。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種測(cè)定生物樣品中胡黃連苷-I含量的方法。
本發(fā)明主要采用高效液相色譜法對(duì)胡黃連苷-I在生物樣品中的含量進(jìn)行測(cè)定，采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量。
本發(fā)明所測(cè)對(duì)象為胡黃連苷-I，其外觀淺黃色或類白色疏松塊狀物，結(jié)構(gòu)式C24H28O11，化學(xué)結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1。
本發(fā)明采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量。內(nèi)標(biāo)的選用原則選用理化性質(zhì)與被測(cè)組分接近、與被測(cè)物有相近的水相和有機(jī)相分配行為，且與代謝物不反應(yīng)、以及不影響待測(cè)物測(cè)定的化合物作為內(nèi)標(biāo)。本發(fā)明采用的內(nèi)標(biāo)為芍藥苷。
本發(fā)明所用的對(duì)照品為胡黃連苷-I和內(nèi)標(biāo)，該對(duì)照品的溶解溶劑可為乙腈、甲醇或水等。
色譜條件可為以十八烷基硅烷健合硅膠固定相，以乙腈-水溶液為流動(dòng)相，采用梯度洗脫程序；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)范圍為250nm～290nm。
本發(fā)明所用儀器包括紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，高效液相色譜儀，色譜柱，紫外檢測(cè)器等。
本發(fā)明所需材料為生物樣品，胡黃連苷-I對(duì)照品，內(nèi)標(biāo)對(duì)照品，內(nèi)標(biāo)溶解溶劑，抗氧化劑，微孔濾膜等。
對(duì)照品溶液的制備精密稱取適量的胡黃連苷-I對(duì)照品，加溶解溶劑，配制成一定濃度的胡黃連苷-I對(duì)照品溶液，然后按倍比稀釋得不同濃度的胡黃連苷-I對(duì)照品溶液；精密稱取內(nèi)標(biāo)對(duì)照品，加溶解溶劑配制成一定濃度的內(nèi)標(biāo)對(duì)照品溶液。所有溶液于4℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?br> 上述溶解溶劑可以是乙腈，也可是甲醇和水等。
本發(fā)明所采用的技術(shù)方案的主要包括生物樣品的采集；生物樣品的預(yù)處理；生物樣品中胡黃連苷-I標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備；生物樣品中胡黃連苷-I含量的測(cè)定。為了更好地說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案，現(xiàn)敘述如下1.生物樣品的采集取健康動(dòng)物，隔夜禁食，自由飲水，給予一定濃度的胡黃連苷-I藥物溶液。藥后取血；膽管插管術(shù)進(jìn)行膽汁引流，收集膽汁。代謝籠收集尿糞，取心、肝、脾、肺、腎、腦、胃、腸、子宮、睪丸、脂肪、肌肉等組織器官。
上述動(dòng)物包括嚙齒類動(dòng)物和非嚙齒類動(dòng)物，如犬、兔、鼠等。
該發(fā)明也適用于人，即給予一定濃度的胡黃連苷-I藥物溶液后，采集血液，收集尿液，糞便等。
上述生物樣品包括血液，膽汁，尿，糞，及心、肝、脾、肺、腎、腦、胃、腸、子宮、睪丸、脂肪、肌肉等組織器官。
上述胡黃連苷-I可以原料藥形式存在，也可以不同制劑形式存在。其劑型可包括單體制劑和復(fù)方制劑，可以是凍干粉針劑、注射劑、片劑、膠囊劑、顆粒劑、貼劑、丸劑等。
上述胡黃連苷-I制劑可以不同形式的途徑給藥，包括口服、靜脈滴注、靜脈注射、經(jīng)皮等。
2.生物樣品的預(yù)處理血液離心后制備成血漿；組織用勻漿機(jī)研磨制成勻漿；膽汁用雙蒸水稀釋4-6倍；尿液用雙蒸水稀釋；糞烘干后用雙蒸水稀釋。
取經(jīng)上述處理過(guò)的生物樣品，加入一定量的抗氧化劑，對(duì)生物樣品進(jìn)行抗氧化處理。
對(duì)血漿、膽汁、組織等生物樣品進(jìn)行除蛋白處理取已加入抗氧化劑的血漿、膽汁、組織等生物樣品，置含有內(nèi)標(biāo)的試管中，加入蛋白質(zhì)沉淀劑，混勻后吸取上清置另一試管中；于殘?jiān)性偌尤氲鞍踪|(zhì)沉淀劑，混勻，合并兩次上清液，揮干；于殘留物中加入乙腈或甲醇或水，或其混合物，混勻，離心，吸取上清，微孔濾膜過(guò)濾。
對(duì)尿液的進(jìn)一步處理取一定體積的內(nèi)標(biāo)溶液，揮干；加入等體積經(jīng)過(guò)濾且已加入抗氧化劑的尿液，混勻，注入已活化的固相萃取柱中；依次用水、2.5％乙腈-水溶液洗脫除雜，再用50％～100％乙腈-水溶液洗脫，收集洗脫液；揮干，用乙腈或甲醇或水，或其混合物復(fù)溶，混勻，微孔濾膜過(guò)濾。
上述抗氧化劑可以是抗壞血酸等。
蛋白質(zhì)沉淀劑可以為有機(jī)溶劑，包括乙腈、甲醇、丙酮、乙醇等。
3.生物樣品中胡黃連苷-I標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備本發(fā)明所用的對(duì)照品為胡黃連苷-I和內(nèi)標(biāo)，其溶解溶劑為乙腈，也可是甲醇和水等。
本發(fā)明采用高效液相色譜法測(cè)定胡黃連苷-I在生物樣品中的含量，其色譜條件可為以十八烷基硅烷健合硅膠為固定相；以乙腈-水溶液為流動(dòng)相；采用梯度洗脫程序。
生物樣品中胡黃連苷-I標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備過(guò)程(1)取一定體積的內(nèi)標(biāo)溶液，分別加入等體積不同濃度的胡黃連苷-I溶液，揮干；(2)于殘?jiān)屑尤氲韧S連苷-I溶液體積的空白生物樣品，加入蛋白質(zhì)沉淀劑，混勻，吸取上清置另一試管；于殘?jiān)屑尤氲鞍踪|(zhì)沉淀劑，混勻；合并兩次的上清，揮干；(3)于殘留物中加入等同于空白生物樣品溶液體積的流動(dòng)相，混勻，離心，吸取上清，微孔濾膜過(guò)濾；(4)精密吸取濾液，注入高效液相色譜儀，記錄胡黃連苷-I和內(nèi)標(biāo)的峰面積；(5)分別以胡黃連苷-I的濃度為橫坐標(biāo)，以胡黃連苷-I與內(nèi)標(biāo)的峰面積比為縱坐標(biāo)，用加權(quán)最小二乘法進(jìn)行回歸計(jì)算，求得線性方程即為標(biāo)準(zhǔn)曲線。
所述蛋白質(zhì)沉淀劑可以是乙腈、甲醇、丙酮、乙醇等。
4.生物樣品中胡黃連苷-I含量的測(cè)定生物樣品經(jīng)上述預(yù)處理后，吸取濾液10μL注入色譜儀中。將峰面積比代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算即得該生物樣品中胡黃連苷-I的含量。
以上為實(shí)現(xiàn)定量測(cè)定胡黃連苷-I在生物體內(nèi)含量的總技術(shù)方案。
本發(fā)明的重點(diǎn)利用抗氧化劑對(duì)生物樣品進(jìn)行預(yù)處理，解決了藥物結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定性問(wèn)題；通過(guò)比較液液萃取和沉蛋白方法，優(yōu)化了預(yù)處理方法；利用梯度洗脫有效地控制了內(nèi)標(biāo)和胡黃連苷-I的保留時(shí)間；在單純采用沉蛋白方法不能解決內(nèi)源性物質(zhì)對(duì)內(nèi)標(biāo)和藥物的干擾時(shí)，采用固相萃取柱對(duì)生物樣品先除雜后測(cè)定，收到了較好的效果。
本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)靈敏度好，專屬性強(qiáng)，重現(xiàn)性好，回收率高。操作簡(jiǎn)單，所用儀器、藥品、試劑均常見(jiàn)易得，在普通實(shí)驗(yàn)室即可實(shí)施。生物樣品預(yù)處理方法簡(jiǎn)便，快速，回收率大于90％。采用梯度洗脫程序有效地縮短了測(cè)定時(shí)間。


圖1胡黃連苷-I的化學(xué)結(jié)構(gòu)圖2利用高效液相色譜法檢測(cè)胡黃連苷-I的典型色譜圖a)空白生物樣品色譜圖；b)胡黃連苷-I對(duì)照品色譜圖；c)內(nèi)標(biāo)(芍藥苷)對(duì)照品色譜圖；d)空白血漿中加入胡黃連苷-I和內(nèi)標(biāo)色譜圖；e)靜脈注射胡黃連苷-I 2min后血漿樣品色譜圖。
具體實(shí)施例用以下的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步闡述，但本發(fā)明并不限于下列實(shí)施例包含的內(nèi)容。
實(shí)施例1注射用胡黃連苷-I凍干粉針劑在大鼠體內(nèi)血藥濃度測(cè)定1.儀器與材料1.1儀器Shimadzu SPD-10ATVP雙泵液相色譜儀；保護(hù)柱Shim-packGVP-ODS(10mm×4.6mm，5μm)(日本島津公司)；N2000色譜工作站1.2材料胡黃連苷I對(duì)照品(北大世佳研究中心提供，批號(hào)010114)；內(nèi)標(biāo)對(duì)照品芍藥苷(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)0736-200219)；胡黃連苷I凍干粉針劑(北大世佳研究中心提供，批號(hào)020912規(guī)格60mg/支，純度96.63％)；乙腈(色譜純，DIKMA公司)；甲醇(色譜純)；抗壞血酸、四氯化碳(均由北京化學(xué)試劑公司提供)；三蒸水(北京大學(xué)化學(xué)系提供)；0.22μm微孔濾膜(國(guó)產(chǎn))；Wistar大鼠，雌雄各半，體重200～240g，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，合格證號(hào)scxk京11-00-0006。
2.實(shí)驗(yàn)方法2.1色譜條件色譜柱Agilent XDB C18柱(250mm×4.6mm，5μm)；流動(dòng)相A相∶乙腈，B相∶水；梯度洗脫程序?yàn)锳∶B(0-1min)20∶80，(1-2min)24∶76，(2-6min)24∶76，(6-8min)20∶80，(7-14)20∶80；流速1.0mL·min-1；柱溫室溫；檢測(cè)波長(zhǎng)277nm；靈敏度0.0100AUFS，進(jìn)樣量10μL。
2.2對(duì)照品溶液的配制精密稱取胡黃連苷-I對(duì)照品15mg，置100mL容量瓶中，加乙腈溶解，定容至刻度，得濃度為150μg·mL-1的胡黃連苷-I乙腈溶液，然后倍比稀釋，得系列濃度的胡黃連苷-I對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。精密稱取芍藥苷對(duì)照品50mg，置50mL容量瓶中，加乙腈溶解，定容至刻度，得濃度為1000μg·mL-1的內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備溶液。所有儲(chǔ)備溶液于4℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?br> 2.3血漿樣品的采集分別取成年健康Wistar大鼠30只，隨機(jī)分為3組，雌雄各半，隔夜禁食12h，自由飲水，將胡黃連苷-I凍干粉針劑以生理鹽水溶解，按7、14、40mg/kg尾靜脈注射給藥。分別于給藥前及藥后0.5、2、10、15、20、30、45、60、90、120、150、180min取血0.5～1mL，置肝素化具塞試管中，離心，取血漿195μL，并加入25％抗壞血酸水溶液5μL，混勻，于-20℃冷藏備用。
2.4血漿樣品預(yù)處理取芍藥苷乙腈溶液200μL，置5mL試管，40℃水浴中N2氣吹干；加入25％抗壞血酸水溶液5μL和空白血漿195μL，置含內(nèi)標(biāo)的試管中，加入500μL乙腈，渦旋混勻1min，吸取上清置另一試管，于殘?jiān)性偌尤?00μL乙腈，渦旋1min，合并兩次的上清，40℃水浴中N2氣吹干；于殘留物中加入200μL流動(dòng)相，渦旋混勻，離心，吸取上清，0.22μm微孔濾膜過(guò)濾；取濾液10μL，注入色譜儀中。
3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.1方法學(xué)確證3.1.1分析方法的專屬性分別將大鼠空白血漿色譜圖與血漿中胡黃連苷-I、芍藥苷及藥后血漿樣品色譜圖進(jìn)行比較。結(jié)果表明含胡黃連苷-I和芍藥苷的血漿樣品經(jīng)預(yù)處理后，在上述色譜條件下能被檢測(cè)到，且血漿中內(nèi)源性物質(zhì)及藥物在體內(nèi)代謝產(chǎn)物不干擾胡黃連苷-I與芍藥苷的測(cè)定。胡黃連苷-I保留時(shí)間為9.9min，內(nèi)標(biāo)芍藥苷的保留時(shí)間為5.9min。結(jié)果見(jiàn)圖2。
3.1.2靈敏度及標(biāo)準(zhǔn)曲線性關(guān)系考察取芍藥苷乙腈溶液200μL，分別加入200μL胡黃連苷-I系列濃度的乙腈儲(chǔ)備溶液，40℃水浴中N2氣吹干；加入空白血漿195μL和25％抗壞血酸水溶液5μL，使大鼠血漿中胡黃連苷-I的濃度分別為0.1、0.5、5、50、100、150μg/mL，其余步驟按照2.4“血漿樣品的預(yù)處理”項(xiàng)下操作，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。分別以血漿中胡黃連苷-I的濃度為橫坐標(biāo)，以胡黃連苷-I與內(nèi)標(biāo)的峰面積比為縱坐標(biāo)，用加權(quán)最小二乘法(權(quán)重W＝1/X2)進(jìn)行回歸計(jì)算，求得線性方程為Y＝4.47×10-4+1.77×10-2X(r＝0.9994)胡黃連苷-I最低檢測(cè)限為0.025μg/mL。
3.1.3方法回收率制備胡黃連苷-I高、中、低三個(gè)濃度的樣品(其中胡黃連苷-I濃度為0.5、50、100μg/mL)，每個(gè)濃度平行制備6份，依上述方法測(cè)定。分別記錄胡黃連苷-I的峰面積，與相應(yīng)濃度的胡黃連苷-I對(duì)照品溶液直接進(jìn)樣的峰面積(三次測(cè)定的平均值)相比，計(jì)算胡黃連苷-I的絕對(duì)回收率(n＝6)。結(jié)果分別為94.70±3.27％、95.09±0.78％、95.91±0.83％，平均值為95.23±0.62％。內(nèi)標(biāo)三個(gè)濃度的回收率分別為95.25±2.56％、90.87±3.81％、93.72±3.21％，平均值為93.28±2.22％。
3.1.4日內(nèi)、日間精密度準(zhǔn)確度制備胡黃連苷-I高、中、低三個(gè)濃度的樣品，每個(gè)質(zhì)控濃度平行制備6份樣品，重復(fù)測(cè)定3日，以當(dāng)日的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算質(zhì)控樣品的濃度。計(jì)算日內(nèi)精密度RSD和日內(nèi)準(zhǔn)確度RE，及日間RSD和日間RE。結(jié)果高、中、低濃度日內(nèi)RSD分別為3.21％、1.65％、2.08％。日內(nèi)RE分別為1.47％、3.01％、7.11％。日間RSD分別為3.68％、3.82％、4.96％，日間RE分別為0.44％、2.95％、4.32％。
3.2血漿中胡黃連苷-I的測(cè)定結(jié)果血漿中胡黃連苷-I的濃度＝(胡黃連苷-I峰面積/芍藥苷峰面積-標(biāo)準(zhǔn)曲線A值)/標(biāo)準(zhǔn)曲線B值。結(jié)果見(jiàn)下表表血漿中胡黃連苷-I的測(cè)定結(jié)果

4.結(jié)論本發(fā)明人采用高效液相色譜法檢測(cè)血漿樣品中胡黃連苷-I的含量，該方法專屬性強(qiáng)，無(wú)代謝產(chǎn)物及內(nèi)源性物質(zhì)干擾胡黃連苷-I的測(cè)定；重現(xiàn)性好，日內(nèi)、日間精密度均小于10％；回收率高，絕對(duì)回收率大于90％。同時(shí)對(duì)靜脈注射胡黃連苷-I三個(gè)劑量后藥物在大鼠血漿中的濃度進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示藥后血漿中能夠檢測(cè)到胡黃連苷-I，最低檢測(cè)極限為0.1μg·mL-1。
實(shí)施例2胡黃連苷-I凍干粉針劑在Beagle犬體內(nèi)血藥濃度測(cè)定實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為非嚙齒類動(dòng)物Beagle犬。按實(shí)施例1所述相同步驟進(jìn)行操作。
結(jié)果顯示胡黃連苷-I在Beagle犬血漿中測(cè)定，方法學(xué)中日內(nèi)及日間精密度分別為5.23％、6.19％，回收率為91.73％-95.87％。犬靜脈注射胡黃連苷-I 2.5mg/kg后，血漿中能夠檢測(cè)到胡黃連苷-I，藥后2min血中平均濃度為17.05μg/mL。
實(shí)施例3胡黃連苷-I凍干粉針劑在大鼠組織中的濃度測(cè)定對(duì)大鼠尾靜脈注射胡黃連苷-I 7mg/kg后，取心、肝、脾、肺、腎、腦、胃、腸、子宮、睪丸、脂肪、肌肉等組織器官，生理鹽水制備組織勻漿，以乙腈沉蛋白后進(jìn)行測(cè)定。色譜條件同實(shí)施例1。結(jié)果顯示胡黃連苷-I在各組織中均能被檢測(cè)到，藥后5min腎組織中平均藥物濃度最高，為66.61μg/mL；腦組織濃度最低，為0.65μg/mL。
實(shí)施例4胡黃連苷-I凍干粉針劑在大鼠尿中的濃度測(cè)定大鼠尾靜脈注射胡黃連苷-I 7mg/kg后，以代謝籠收集藥后不同時(shí)間段的尿，加入抗壞血酸，并用固相萃取柱進(jìn)行固相萃取，除雜后測(cè)定。結(jié)果顯示方法學(xué)中胡黃連苷-I絕對(duì)回收率大于90％。藥后2小時(shí)尿中藥物平均濃度為124μg/mL。
實(shí)施例5注射用胡黃連苷-I凍干粉針劑在大鼠膽汁中的濃度測(cè)定大鼠以10％烏拉坦按1mL/100g的量腹腔麻醉后進(jìn)行膽管插管術(shù)，尾靜脈注射胡黃連苷-I7mg/kg，收集給藥后不同時(shí)間的膽汁，加入抗壞血酸抗氧化，加入乙腈沉淀蛋白，測(cè)定。結(jié)果顯示方法學(xué)中胡黃連苷-I絕對(duì)回收率大于90％。藥后半小時(shí)膽汁中藥物平均濃度約為583μg/mL。
實(shí)施例6胡黃連苷-I片劑口服給藥后大鼠體內(nèi)血藥濃度測(cè)定分別取健康成年Wistar大鼠30只，隨機(jī)分為3組，雌雄各半，隔夜禁食12h，自由飲水，將胡黃連苷-I片劑研磨，以生理鹽水溶解，按10、20、40mg/kg灌胃給藥。其它過(guò)程均按照實(shí)施例1進(jìn)行操作。
結(jié)果表明該方法專屬性強(qiáng)，無(wú)代謝產(chǎn)物和內(nèi)源性物質(zhì)干擾胡黃連苷-I的測(cè)定；重現(xiàn)性好，日內(nèi)、日間精密度均小于10％；回收率高，絕對(duì)回收率大于90％。同時(shí)對(duì)胡黃連苷-I片劑三個(gè)劑量灌胃給藥后，對(duì)胡黃連苷-I在大鼠血漿中的濃度進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示藥后血漿中能夠檢測(cè)到胡黃連苷-I。
權(quán)利要求
1.胡黃連苷-I在生物樣品中的含量測(cè)定方法，其特征在于采用高效液相色譜法對(duì)胡黃連苷-I在生物樣品中的含量進(jìn)行測(cè)定。具體包括如下步驟(1)生物樣品的采集；(2)生物樣品的預(yù)處理；(3)生物樣品中胡黃連苷-I標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備；(4)生物樣品中胡黃連苷-I含量的測(cè)定。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于以內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于生物樣品經(jīng)預(yù)處理后，要選擇合適的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，色譜條件可為以十八烷基硅烷健合硅膠為固定相，以乙腈-水溶液為流動(dòng)相，采用梯度洗脫程序；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)范圍為250nm～290nm。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于可選用理化性質(zhì)與被測(cè)組分接近、與被測(cè)物有相近的水相和有機(jī)相分配行為，且與代謝物不反應(yīng)、以及不影響胡黃連苷-I測(cè)定的化合物作為內(nèi)標(biāo)。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于內(nèi)標(biāo)可為芍藥苷。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于胡黃連苷-I對(duì)照品和內(nèi)標(biāo)對(duì)照品的溶解溶劑可為乙腈、甲醇或水等。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述生物可以包括人、犬、鼠、兔等動(dòng)物。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于生物樣品包括血漿、膽汁、尿、糞、以及心、肝、脾、肺、腎、腦、胃、腸、子宮、睪丸、脂肪、肌肉等組織器官。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于胡黃連苷-I可以不同制劑形式存在。
10.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于胡黃連苷-I制劑包括單體制劑和復(fù)方制劑。
11.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于制劑可以是凍干粉針劑、注射劑、片劑、膠囊劑、顆粒劑、貼劑、丸劑等。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于胡黃連苷-I可以不同形式的途徑給藥，包括口服、靜脈、經(jīng)皮等。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物樣品的預(yù)處理，其特征在于血液經(jīng)離心后制備成血漿；組織用勻漿機(jī)研磨成勻漿；膽汁、尿液用雙蒸水稀釋；糞烘干后用雙蒸水稀釋。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述生物樣品的預(yù)處理，其特征在于使用抗氧化劑對(duì)生物樣品進(jìn)行預(yù)處理。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述生物樣品的預(yù)處理，其特征在于抗氧化劑可以是抗壞血酸。
16.根據(jù)權(quán)利要求13所述生物樣品的預(yù)處理，其特征在于對(duì)血漿、膽汁、組織等生物樣品進(jìn)行去蛋白處理取已加入抗氧化劑的血漿、膽汁、組織等生物樣品，置含有內(nèi)標(biāo)的試管中，加入蛋白質(zhì)沉淀劑，混勻后吸取上清置另一試管中；于殘?jiān)性偌尤氲鞍踪|(zhì)沉淀劑，混勻，合并兩次上清液，揮干；于殘留物中加入乙腈或甲醇或水，或其混合物，混勻，離心，吸取上清，微孔濾膜過(guò)濾。
17.據(jù)權(quán)利要求13所述生物樣品的預(yù)處理，其特征在于對(duì)尿液的預(yù)處理包括取一定體積的內(nèi)標(biāo)溶液，揮干；加入等體積經(jīng)過(guò)濾且已加入抗氧化劑的尿液，混勻，注入已活化的固相萃取柱中；依次用水、2.5％乙腈-水溶液洗脫除雜，再用50％～100％乙腈-水溶液洗脫，收集洗脫液；揮干，用乙腈或甲醇或水，或其混合物復(fù)溶，混勻，微孔濾膜過(guò)濾。
18.根據(jù)權(quán)利要求1所述生物樣品中胡黃連苷-I標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備，其特征在于包含如下步驟(1)取一定體積的內(nèi)標(biāo)溶液，分別加入等體積不同濃度的胡黃連苷-I溶液，揮干；(2)于殘?jiān)屑尤氲韧S連苷-I體積的空白生物樣品，加入蛋白質(zhì)沉淀劑，混勻，吸取上清置另一試管；于殘?jiān)屑尤氲鞍踪|(zhì)沉淀劑，混勻；合并兩次的上清，揮干；(3)于殘留物中加入等同于空白生物樣品體積的流動(dòng)相，混勻，離心，吸取上清，微孔濾膜過(guò)濾；(4)精密吸取濾液，注入高效液相色譜儀，記錄內(nèi)標(biāo)和藥物的峰面積；(5)分別以胡黃連苷-I的濃度為橫坐標(biāo)，以胡黃連苷-I與內(nèi)標(biāo)的峰面積比為縱坐標(biāo)，用加權(quán)最小二乘法進(jìn)行回歸計(jì)算，求得線性方程即為標(biāo)準(zhǔn)曲線。
19.根據(jù)權(quán)利要求16和18所述的方法，其特征在于蛋白質(zhì)沉淀劑可以是乙腈、甲醇、丙酮、乙醇等。
20.根據(jù)權(quán)利要求1所述生物樣品中胡黃連苷-I含量的測(cè)定，其特征在于生物樣品經(jīng)預(yù)處理后，取濾液測(cè)定，將峰面積比代入標(biāo)準(zhǔn)曲線即得該生物樣品中胡黃連苷-I含量。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種利用高效液相色譜法快速測(cè)定生物樣品中胡黃連苷－I含量的方法。采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量，以十八烷基硅烷健合硅膠柱為固定相，以乙腈－水為流動(dòng)相，采用梯度洗脫方法。本發(fā)明所述的生物樣品需要經(jīng)抗氧化劑處理并用有機(jī)溶劑沉淀蛋白后再進(jìn)行測(cè)定。該方法具有操作簡(jiǎn)單；靈敏度高，最低定量限為0.1μg·mL
文檔編號(hào)G01N30/06GK1815222SQ200510004888
公開(kāi)日2006年8月9日 申請(qǐng)日期2005年2月3日 優(yōu)先權(quán)日2005年2月3日
發(fā)明者周亞偉 申請(qǐng)人:周亞偉