使用拉曼活性探針構建物來分析生物學樣品的方法和裝置的制作方法

專利名稱：使用拉曼活性探針構建物來分析生物學樣品的方法和裝置的制作方法
技術領域：
本發明一般地涉及用于鑒定樣品中分析物存在與否的方法和裝置，更具體地，涉及使用拉曼活性探針構建物來分析生物學樣品的方法和裝置。
背景技術：
基因組水平DNA測序的巨大成功使得我們可以開始獲得在25年前不可想象的的知識。為了使這些具有分水嶺意義的數據能夠轉化為對診斷人類疾病、確定人類疾病病期(staging)、了解和治療人類疾病有幫助的知識，要求我們不僅應當知道據估計＞30,000的人類蛋白質的序列，而且要求我們鑒定出預示疾病的即將發作的蛋白質表達中的關鍵變化，在分子水平精確地劃分疾病亞型，并且要求我們了解在疾病過程中密切涉及的蛋白質的功能、相互作用以及如何調節它們的活性。一種了解蛋白質功能的最基本方法是將表達水平變化作為生長條件、細胞周期階段、疾病狀態、外部刺激、其它蛋白質的表達水平或其它變量的函數而建立起聯系。盡管DNA微陣列分析為基因組范圍的(genome-wide)mRNA表達分析提供了強有力的平行方法，然而mRNA的體內濃度與其編碼的蛋白質之間常常沒有直接的關系。mRNA翻譯為蛋白質的差異速率和蛋白質體內降解的差異速率是限制由mRNA外推到蛋白質表達圖譜的兩個因素。
另外，這樣的微陣列分析不能檢測、鑒定或量化翻譯后蛋白質修飾——其經常在調節蛋白質功能方面起著關鍵的作用。蛋白質表達分析提供了潛在巨大的優勢，因為它測量生物效應物蛋白質分子的水平，而不僅僅是其信息的水平。目前，沒有一種蛋白質作圖(profiling)技術能夠接近微陣列分析的能力，同時描繪25,000或更多基因的mRNA表達的相對水平。
因此，對各種生物環境和有機環境中的低濃度分析物的檢測和分析正被給以不斷增長的關注。對這樣的分析物的定性分析一般限于較高的濃度水平，而定量分析通常要求用放射性同位素或熒光劑進行標記。此類方法一般耗時而且不方便。
近來由于它們在化學、生物和藥物研究以及疾病診斷學中日益增長的應用，固態傳感器，特別是生物傳感器已經得到相當多的關注。一般而言，生物傳感器由兩個元件組成高度特異性的識別元件和將分子識別事件轉化為可定量信號的轉換結構。生物傳感器已經被發展為檢測多種生物分子復合物，包括寡核苷酸對、抗體-抗原、激素-受體、酶-底物和凝集素-糖蛋白相互作用。一般用電化學、場效應晶體管、光學吸收、熒光或干涉測量設備完成信號轉換。
已知多孔硅膜可見的反射率變化的強度可以被應用于簡單的生物傳感器，從而可能檢測、鑒定和量化小分子。盡管這樣的生物傳感器的確有用，但是反射率變化的檢測因存在寬的峰而不是一個或多個較尖的明確的發光峰而變得復雜。
拉曼光譜術和表面等離子體共振也已被用于努力實現靈敏而準確地檢測或鑒定生物樣品中的單個分子的目標。當光通過感興趣的介質時，一定數量的光由其原來的方向變換方向，這是稱之為散射的現象。一些散射光在頻率上與原始的激發光不同，這是由于光被吸收和電子激發到更高的能態，及隨后在不同波長下發生光發射的緣故。吸收的光的能量和發射的光的能量的差異與介質的振動能量相匹配。該現象稱為拉曼散射，用拉曼散射光表征和分析介質或感興趣的分子的方法稱為拉曼光譜術。拉曼發射光譜的波長表征了樣品中拉曼散射分子的化學組成和結構，而拉曼散射光的強度取決于樣品中分子的濃度。
拉曼光譜類似于紅外光譜，是由波長分布帶組成的，其對應于被分析的樣品(分析物)的特定的分子振動。在拉曼光譜法的實踐中，來自一般為激光的光源的光束聚焦在樣品上，從而產生了非彈性散射輻射，其被光學收集并被導入波長色散光譜儀中，在其中檢測器將碰撞光子的能量轉化為電信號強度。
在歷史上，入射輻射向非彈性散射輻射的非常低的轉化率限制了拉曼光譜法應用于通過紅外光譜法難于進行的應用上，例如分析含水溶液。然而，已經發現，當非常靠近粗糙銀電極的分子接受拉曼激發源作用時，所產生的信號的強度增加了多至6個數量級。
盡管造成該散射效率出現很大增加的機理目前是相當多的研究的主題，但普遍認為如果滿足下面三個條件，則該現象發生(1)金屬的自由電子吸收可以被250與2500納米(nm)之間的波長的光激發，優選以激光束的形式激發；(2)所使用的金屬尺寸合適(一般為5至1000nm的直徑的顆粒，或者具有等價形態學的表面)，并且具有產生表面等離子體場所必需的光學性質；和(3)分析物分子具有有效匹配的光學性質(吸收)，以耦合到等離子體場。
具體而言，金、銀、銅和某些其它金屬的納米顆粒可以起著增強電磁輻射的局部效應(localized effect)的作用。位于此類顆粒附近的分子對拉曼光譜分析表現出大得多的靈敏度。SERS是利用這種表面增強拉曼散射效應來表征和分析感興趣的生物分子的技術。
在引入感興趣的分子之前或之后，當氯化鈉和氯化鋰被應用于金屬納米顆粒或金屬涂敷的表面時，它們被鑒定為可增強SERS信號的化學品。然而，使用這些化學增強劑的技術并沒有證明對于可靠檢測低濃度分析物分子例如單個核苷酸或蛋白質是足夠靈敏的，結果，SERS仍不適于分析復雜生物樣品例如血漿的蛋白質內容物(protein content)。
因此，在本領域，對提供關于結合的分析物特征的更多信息的分析物檢測方法以及使用拉曼光譜分析技術來可靠地檢測和/或鑒定各個分析物存在需求。另外，在本領域，對定性和定量檢測低濃度水平的生物分子的快速且簡單的手段存在需求。


圖1是顯示現有技術聚合物凝膠(上圖)以及浸以銀納米顆粒的本發明凝膠(下圖)的示意圖。
圖2是示意性流程圖，描述了附著有抗體探針的本發明光學條碼的制備和分離。當與各種目標分子接觸時，光學條碼構建物中的抗體與不同的分析物特異性結合。如圖示，如此形成的帶有探針的復合體進行2維分離，以準備進行光學信號諸如拉曼信號的檢測，所述信號通過照射分離的復合體而產生。
圖3為顯示了本發明活性分子拉曼代碼的四個功能作用如何與探針構建物的四個結構區域相互關聯的示意圖。
圖4是三個拉曼SERS光譜的圖，其說明了通過改變等長(21個殘基)的單鏈寡核苷酸主架上的拉曼活性標簽的數量和位置而獲得的對本發明活性分子拉曼代碼的拉曼信號的效應。RF1是具有兩個拉曼標簽ROX和FAM、但是缺少氨基基團增強子的構建物的拉曼信號，其中ROX和FAM位于寡核苷酸主架的相反端。AT3、AT11和AT19是三個構建物的拉曼光譜，它們具有共同的主架和5′氨基基團增強子，但在主架的三個不同位置上具有同樣的拉曼標簽TAMRA。
圖5是兩個拉曼SERS光譜的圖，說明了增強子在本發明活性分子拉曼代碼中的效應。產生光譜PGPT和NPGPT的構建物都具有線性單鏈多聚(dT)主架，該主架攜帶有10個殘基的多聚(dG)拉曼標簽。PGPT缺少增強子基團，而NPGPT具有附著到多聚(dG)拉曼標簽上的增強子部分(AmC6)，以增強由多聚(dG)拉曼標簽提供的拉曼信號。
圖6A-B是拉曼SERS光譜的圖，說明了本發明活性分子拉曼代碼中功能/結構區域的交叉效應。圖6A中示出的SPTA光譜由具有ThiSS活性基團、多聚(dT)主架和5′末端的單個dA標簽的分子構建物產生。該光譜顯示，拉曼活性部分是單dA殘基，分子主架提供了微小的增強子功能。圖6B中示出的ACRGAM光譜由具有5Acrd活性基團、多聚(dG)主架和在5′端的作為增強子基團的單個AmC7的分子構建物產生。拉曼光譜主要由拉曼活性多聚(dG)主架產生，增強子擴增該信號。
圖7A-D是一系列的示意性流程圖，說明了使用級聯結合以增強由固定的分析物產生的拉曼信號的本發明方法的四個不同實施方案。在每一個實施方案中，具有一抗和DNA主架的活性分子拉曼代碼將分析物固定在基質上。圖7A、7B、7C和7D分別說明了四種不同類型的次級拉曼復合體與拉曼活性核酸雜交，以增強拉曼信號具有化學連接的互補寡核苷酸的金屬納米顆粒；由互補寡核苷酸形成的樹枝狀大分子；通過雜交的寡核苷酸的連接而形成的雙鏈DNA；使用dNTP和拉曼標記的寡核苷酸對分子主架進行末端轉移酶反應。
圖8A-I是一系列的化學合成圖，其說明了使用具有DNA拉曼活性主架和作為活性基團的功能基團的本發明活性分子拉曼代碼，特異性地結合含蛋白質分子中的氨基酸殘基中的功能基團。
圖9是示意性流程圖，說明了獲得含蛋白質的樣品的蛋白質譜型的本發明方法。使用了三種對氨基酸中的氨基、巰基和羧基功能基團具有特異性的活性分子拉曼代碼。
圖10A說明了本發明的方法，其中，級聯結合和分子拉曼代碼被擴增(如圖7A-D所示)之后，在原位形成金屬納米顆粒，以產生SERS信號。圖10B說明了在SERS活性構建物的合成過程中的三個時間產生的拉曼信號的強度。
圖11說明了具有分布在不連續位置上的抗體庫的芯片。放大圖顯示了使用在活性分子拉曼代碼中的抗體亞組進行簡并級聯結合(degenerate cascade binding)之后的單個不連續位置。
圖12是示意性流程圖，說明了依據拉曼代碼設計，對SERS特征進行分類，從而對分析結果進行的多重分析。如圖12中的流程圖所示，各個信號點(圖11)可以通過進行微米級SERS掃描和信號特征分析來辨析。通過比較從對照和測試樣品獲得的結果，測定測試(患者)樣品中的異常。
發明詳述
本發明的各種實施方案涉及使用拉曼活性或SERS活性探針構建物來檢測生物樣品中的分析物，諸如體液中的含蛋白質的分析物。在某些實施方案中，拉曼活性構建物中的探針部分被選擇用來結合生物樣品中特定的已知分析物，并因此鑒定該分析物的存在與否。在其他實施方案中，拉曼活性構建物中的探針部分被設計成與在某些氨基酸中常見的功能基團發生化學相互作用，以便本發明方法提供有關樣品中含蛋白質的分析物或其片段的氨基酸組成的信息。
下面的詳細描述含有許多具體的細節，以便提供對本發明公開的實施方案更充分的理解。然而，對本領域技術人員顯而易見的是，這些實施方案無需這些具體細節也可以實施。在其他情況中，在本領域熟知的裝置、方法、程序和各個組件在本文中沒有進行詳細地描述。
如圖1所示，本發明的一個實施方案提供了固體凝膠基質300，其包括固體凝膠100和一個或多個附著有探針的SERS增強納米顆粒200，所述探針用于與分析物特異性結合。提供一系列獨特的光學特征的一系列納米顆粒也可以被整合入凝膠基質。如本文中所述，SERS增強性納米顆粒包括一個或多個拉曼活性標簽，以及與已知的分析物諸如含蛋白質的分析物特異性結合的探針。在一個方面，包含在凝膠基質中的至少一個納米顆粒可以具有凈電荷，以有助于電泳期間分析物的分離。在另一實施方案中，每一個納米顆粒可以提供獨特的SERS信號，該信號與納米顆粒的探針的結合特異性相關聯。
因為拉曼光源可以發射通過凝膠，可以在無需將分離的分析物從凝膠中取出的情況下檢測樣品中分析物的存在。
在一個方面，本發明的凝膠基質摻入復合有機-無機納米顆粒(COIN)，該COIN包括核心和表面，其中所述核心包括金屬膠體，所述膠體包括第一金屬和拉曼活性有機化合物。COIN和制備COIN的方法在本文下面的內容中詳細描述。
為了用于分離和檢測樣品諸如生物樣品中的蛋白質，本發明凝膠基質含有SERS活性納米顆粒，該顆粒攜帶與含有蛋白質的分析物的蛋白質部分特異性結合的探針，如本文中所述。此探針包括抗體、抗原、多核苷酸、寡核苷酸、受體、配體和類似物。
在本發明凝膠基質中使用的任何納米顆粒還可以包括熒光標記，該熒光標記促成了納米顆粒的光學特征。
在另一種實施方案中，本發明提供了檢測樣品中的分析物的方法，包括將含有分析物的樣品與分離凝膠諸如本發明的凝膠基質在允許分析物與一個或多個SERS增強性納米顆粒中的探針結合形成復合體的合適條件下接觸；通過電泳或磁泳(magnetophoresis)將所述復合體與其他樣品內含物分離開來；和檢測由分離的復合體在凝膠中的不同位置上發出的SERS信號(即，將復合體從凝膠中移出或不移出)。由特定復合體發射的SERS信號與特定分析物的存在有關。樣品可以是含有蛋白質或含蛋白質分析物的混合物的復雜生物樣品，在這種情況下，凝膠基質將包括許多不同的SERS增強性納米顆粒，以指示樣品中不同分析物的存在，納米顆粒中的探針特異性地與所述分析物結合。含有待被分離的生物學目標的樣品在將該混合物引入凝膠以進行分離之前與SERS增強性納米顆粒接觸，或者樣品被引入已經在其中摻有SERS活性納米顆粒的本發明凝膠中。
在另一實施方案中，在凝膠基質和凝膠分離方法中使用的納米顆粒中的探針的特異性是未知的，來自特定的結合復合體的SERS信號提供有關探針所結合的分析物的化學結構的信息。通過對復合體在所使用的特定的分離介質(例如凝膠的類型、分離的電和磁條件)中的行為的分析，獲得關于結合的分析物的其他信息，并且這樣的信息可以與從拉曼信號的分析獲得的信息一起編輯，和補充從拉曼信號的分析獲得的信息。所有被檢測的分析物的此類信息的編輯結果可以被用來產生樣品的蛋白質譜圖。
通過電泳或磁泳，或者通過這兩種方法的組合，實現凝膠基質內的復合體的分離，后者特別被用于納米顆粒含有磁性物質諸如金屬氧化物的情況下。復合體可以基于通常與凝膠分離技術相關的任何因素進行分離，除了分離將取決于分析物/SERS增強性納米顆粒復合體的電荷、重量等方面的凈差異，而不是取決于分析物它們本身的差異。因此，通過測定因探針結合到分析物而引起的分析物遷移率變化，可以檢測分析物與一個或多個納米顆粒的結合。在某些實施方案中，其中至少兩個納米顆粒具有不同的凈電荷，以在電泳期間對分析物分離施加影響。
如果感興趣的分析物是含蛋白質的分析物，可以使用聚丙烯酰胺凝膠基質，感興趣的分析物可以選自抗原、多肽、蛋白質、糖蛋白、脂蛋白和它們的組合。例如，在非變性條件下，使用的電泳技術可以是一維或者二維電泳。可選地，本發明的凝膠分離方法還可以包括將凝膠浸在化學增強溶液中，諸如LiCl或NaCl溶液，以進一步增強分離的分析物產生的SERS信號。此外，通過干燥已應用了化學增強溶液的凝膠，樣品將在檢測之前被濃縮。
當樣品包括兩個或更多個具有基本上相同尺寸和/或基本上相同電荷密度的分析物時，本發明的凝膠分離方法——其中分析物的SERS信號在不將分析物從凝膠移出的情況下進行檢測——可特別用于區別各個分析物之間的差異。當用激光照射時，兩個或更多個分析物產生的SERS信號可以被用于區分和提供有關兩個或更多個分析物之間的差異的結構信息，既便兩者具有相同的化學式。此外，獲得的SERS信號可以區分在樣品中具有基本上相同尺寸和/或基本上相同電荷密度的分析物。
在一個方面，在檢測SERS信號之前或之后，本發明的分離方法還可以包括對分析物進行層析或等電聚焦。由SERS分析獲得的信息可以與由等電聚焦和/或層析獲得的信息比較或一起編輯，以進一步增強有關特定蛋白質或樣品蛋白質譜圖的信息。
在本發明分離方法的一個實施方案中，SERS增強性納米顆粒是COIN，如本文中描述。
在還有另一實施方案中，本發明提供了制備本發明凝膠基質的方法，該方法包括通過將形成凝膠的液體和許多拉曼增強性納米顆粒混合而形成液體組合物，所述形成凝膠的液體包括處于合適的液體中的可形成凝膠的顆粒。拉曼增強性納米顆粒具有許多獨特的光學特征，并且每一個包括用于結合分析物的探針。使用本領域已知的方法由該液體組合物獲得固體凝膠基質。盡管通常用于制備分離凝膠的任何類型的形成凝膠的顆粒都可以用于本發明方法，聚丙烯酰胺和瓊脂糖凝膠普遍用于分離化學和生物學分子。為了應用在本發明篩選復雜生物學樣品的方法中，許多SERS增強性納米顆粒可以被摻入凝膠中，其中每一納米顆粒具有附著的探針，該探針可以特異性地與許多不同的分析物中的一種形成復合體，諸如本文中描述的COIN。
聚丙烯酰胺和瓊脂糖凝膠是在電泳中使用的最常見的穩定介質，本領域技術人員在制備聚丙烯酰胺和瓊脂糖凝膠中運用的原理包括如下。瓊脂糖和丙烯酰胺凝膠的廣泛使用源于這樣的事實，這些基質在電泳期間也充當“分子篩”，它們根據其尺寸和結構限制生物分子的運動。瓊脂糖和聚丙烯酰胺凝膠是交聯的、海綿狀的結構。盡管它們有高達99.5％的水，這些凝膠的孔的尺寸類似于許多蛋白質和核酸的尺寸。當分子在施用的電壓的驅使下通過凝膠，較大的分子比較小的分子更大程度地受到凝膠阻滯。對于任何特定的凝膠，小于凝膠確定的尺寸的分子根本不受阻滯；它們幾乎如在自由溶液中一樣移動。在另一極端，大于基質確定的尺寸的分子根本不能進入凝膠。因此，本領域技術人員將通過選擇適當的基質濃度，調整凝膠以篩選期望尺寸范圍的分子。凝膠的平均孔徑由凝膠中的固體百分比決定，對于聚丙烯酰胺來說，也由交聯劑的數量決定。
盡管對于瓊脂糖和聚丙烯酰胺可能的凝膠密度范圍有實踐限制，但這兩種基質能夠通過電泳分離DNA鏈，長度由僅幾個堿基對的寡核苷酸至大至幾百萬堿基對長的染色體或染色體片段。產生小孔凝膠的聚丙烯酰胺被用于分離尺寸從少于5個堿基至約2,000個堿基對的多核苷酸。具有大的孔徑的瓊脂糖凝膠可以被用于分離從50至30,000個堿基對的核酸，而且使用脈沖場技術，可以分離長度大于5×106個堿基的染色體尺寸和類似尺寸的片段。
本發明凝膠和它們的使用方法的一個重要的特征是無需將分析物從凝膠中移出，就可以檢測分離的分析物，即分離的含蛋白質的分析物。通過用本領域已知的任何SERS技術照射凝膠中分離的分析物，可以完成檢測。此外，由于SERS分析優異的靈敏性，生物樣品中微量的分離的感興趣的分析物可以被檢測和定量測定。
在還有另一實施方案中，本發明提供了包括本發明的凝膠基質的系統，其可以被用于進行本發明的凝膠分離和檢測方法。這樣的系統還可以包括含有至少一個分析物的樣品；和適合于檢測來自納米顆粒的SERS信號的光學檢測系統。使用本發明的凝膠基質的本發明系統還可以包括計算機，該計算機包括用于分析獲自樣品的SERS信號的算法。
在還有另一實施方案中，本發明提供了樣品中的分析物的多重檢測方法，該方法通過將樣品中的分析物在適于形成復合體的條件下與一組探針構建物接觸。每一探針構建物包括連接有光學活性多核苷酸條形碼的非核酸探針，所述條形碼含有至少一個SERS活性核苷酸，如本文中所述，以提供獨特的光學特征。獨特的光學特征可以是獨特的SERS特征。此外，組中的每一個探針構建物是特異性設計的，以在選擇的電泳介質中具有獨特的遷移率。如此形成的復合體通過電泳分離。分離之后，以多重的方式用合適的檢測裝置，檢測獨特的光學特征，或者在分離凝膠中或者在從分離介質中移出之后檢測。合適的檢測裝置將取決于光學活性條形碼的光學特性。因為每一特異性結合探針與發射可區分的光學特征諸如SERS信號的已知條形碼連接，由構建物檢測到的各光學特征因此與樣品中已知分析物的身份相關。
因為多核苷酸的電泳遷移率至少部分地取決于該多核苷酸中的核酸的數量，通過在組的各個成員的條形碼中使用變化數量的核苷酸，可以獲得在該組中各個探針構建物的獨特遷移率。類似地，通過對多核苷酸條形碼中的核酸進行選擇，可以獲得該組中成員間凈電荷的多樣性。因為在電泳中復合體的遷移率由整個復合體的電荷密度決定，由于所使用的該組探針構建物的成員的獨特的遷移率特征，當結合到該組探針構建物的不同成員時，可以從單個樣品中分離許多類似的分析物，然后同時檢測它們。
此外，游離目標和/或未結合的探針構建物的電泳特性將不同于結合的復合體的電泳特性，通過電泳將游離目標和/或未結合的探針構建物從復合體中去除是簡單的事情，這例如在檢測結合的復合體之前進行。在一個方面，該組探針構建物中的非核酸探針可以是特異性結合在生物樣品中已知的含蛋白質目標的一組抗體。在該情況下，目標分析物將是含蛋白質的分析物，如本文中描述。可選擇地，探針構建物中的非核酸探針可以是被檢測的真正的分析物，這是因為非核酸探針(例如抗體、受體和類似物)與患者樣品中的含蛋白質分子或復合體的結合偏好性可以是分析的目的。
本發明該實施方案中的分離的復合體可以一維地分離(例如層析或電泳)或可以二維地分離(例如首先進行層析或等電聚焦，然后進行電泳)。因為在探針復合體形成之后，目標分子的尺寸、表面特性和電荷密度可以發生變化，所以使用兩種不同的分離原理將有助于復合體與未結合組分的分離。
將被使用的光學檢測程序或光學檢測程序的組合將取決于分析物的屬性、分離裝置或基質以及探針構建物的結構和特性。使用本文中描述的和本領域已知的技術，分離的復合體可以用一種光學技術或光學技術的組合進行檢測，所述光學技術選自吸收、反射、偏振、折射、熒光、拉曼光譜、SERS、共振光散射、光柵耦合(grating-coupled)表面等離子體共振。
在還有另一實施方案中，本發明提供了制備一組活性拉曼分子碼的方法，所述活性拉曼分子碼被設計成，可以利用完善建立的DNA/肽化學術合成，以構建分子復合體。活性拉曼分子代碼展示出多或寡核苷酸主架的特征，其本身具有拉曼活性，或其具有通過內置的基團以化學方法附著到主架的各個位置上的拉曼標簽，以獲得不同的拉曼特征，而不改變化學組成。待被用作拉曼活性分子碼的每一個分子復合體具有活性基團(例如探針)，其直接而特異性地結合生物分析物的氨基酸中固有的功能基團，或結合含蛋白質的目標。
本發明活性拉曼分子碼通過下述方法產生獲得一組分子主架，每一分子主架在沿著主架的不同位置包含攜帶兩個或更多個化學反應活性部分的有機聚合物；將兩個或更多個小分子拉曼活性標簽連接到該組中的每一主架上，連接位置是在化學反應活性部分，其中，該組的成員的主架上的拉曼活性標簽的類型、數量和相對位置以不同的方式組合，從而該組的每一成員產生獨特的拉曼信號。
活性基團也與該組中的主架連接，其中每一活性基團特異性結合含蛋白質分析物中的不同類型的功能基團。例如，活性基團可以是對生物學含蛋白質分子的氨基酸中固有的化學部分具有反應活性的化學功能基團。可選擇地，活性基團可以是探針，如本文中描述，其可以特異性地結合已知的含蛋白質的分子。
分子主架可以包括可以用已知的化學技術合成的任何有機聚合物。其可以是具有生物聚合物特性的結構，諸如天然存在的或合成的多糖、蛋白質、氨基酸或它們的組合。主架也可以是拉曼活性單鏈或雙鏈多核苷酸片段，它們容易用標準的亞磷酰胺化學術合成。主架包括核苷酸類似物，其已進行化學修飾以適應拉曼活性標簽的化學附著。化學修飾的核苷酸類似物在聚合物主架中的位置可以變化，以改變拉曼活性標簽的定位。可以被引入主架以實現該目的的核苷酸類似物的例子包括2-氨基嘌呤。在不同的方面，主架可以包括2至約1000個核苷酸，約50至約400，或約10至約100個核苷酸。取決于結構和化學組成，主架可具有多達3個功能拉曼活性標簽的支持物，拉曼信號的來源和拉曼活性標簽的增強物。
當除了用作拉曼活性標簽的附著點的化學修飾的核苷酸類似物的位置外，該組的成員具有共同的寡核苷酸主架時，主架的合成特別方便。在這種情況下，依然可能產生一組活性分子拉曼代碼，每一代碼具有獨特的拉曼特征，其將可以用于鑒定體液中成千上萬不同的分析物。
整合入本發明活性分子拉曼代碼的拉曼活性標簽是小分子，其在產生拉曼信號方面具有高度的活性，并通常具有小于1kDa的分子量。滿足這些要求的拉曼活性標簽包括染料(例如R6G、Tamra、Rox)、氨基酸(例如精氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸)、核酸堿基(例如腺嘌呤或鳥嘌呤)或它們的任何組合。也可以使用具有上述特征諸如合適的分子量和拉曼特征的天然存在的或合成的化合物。拉曼活性標簽可以被置于分子主鏈的任何位置，單個主鏈可以具有一個以上的此類標簽。通過在合成分子拉曼代碼期間，改變主鏈上拉曼活性標簽的類型、數量和相對位置，可以調整該組的成員的拉曼特征。
在一個方面，本發明活性分子拉曼代碼中的活性基團是對特定的氨基酸殘基中發現的其他功能基團(例如胺、羧基、硫醇、醛或羥基基團)具有反應活性的功能基團(例如acrydite3、胺或硫醇基團)，如在本文圖8A-8I中所示。例如，當氨基基團用作該活性基團時，它將以化學的方式與分析物中的Lys結合并鑒定之；用作活性基團的巰基基團將結合并鑒定含有硫醇基團的氨基酸或Cys；羧酸活性基團將結合并鑒定Asp或Glu；醛活性基團將結合并鑒定糖蛋白中的糖殘基，它們使用在圖8A-8I中示出的化學方法。可以與蛋白質功能基團特異性反應的其他試劑可以用于本發明的制備活性分子拉曼代碼的方法。在使用中，當活性基團是這種類型的功能基團時，單個的蛋白質或蛋白質片段可以是多個活性分子拉曼代碼的目標并與它們復合，每一活性分子拉曼代碼產生不同的拉曼信號。在這種情況下，結合單個分析物的分子拉曼代碼的組合提供關于分析物的氨基酸組成方面的信息。
在本發明的活性分子拉曼代碼中使用的第二類活性基團是探針，諸如抗體、受體、凝集素或噬菌體展示的肽，它們特異性地結合已知的含蛋白質的分析物或其片段。可以附著到聚合物主架的探針分子的其它例子可以包括但是不限于寡核苷酸、核酸、抗體、抗體片段、結合蛋白質、受體蛋白質、肽、凝集素、底物、抑制劑、激活劑、配體、激素、細胞因子和類似物。使用已知的化學術，例如DNA/蛋白質化學術，將這類活性基團與主架連接，這樣，探針可以被用來標記或識別它的目標分子(例如，避免對結合產生位阻)。
用于本發明的活性分子拉曼代碼的拉曼活性標簽選自拉曼活性染料、氨基酸、核苷酸或它們的組合。適于整合入拉曼活性標簽的拉曼活性氨基酸的例子包括精氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸和其組合。適于整合入拉曼活性標簽的拉曼活性核苷酸的例子包括腺嘌呤、鳥嘌呤和其衍生物。
本發明一組活性分子拉曼代碼中的至少一個成員還可以包括結合到拉曼活性主架或標簽的增強子部分，它們強化了獨特的拉曼光譜的強度。例如，多聚(dT)主架不但充當主架而且充當dA標簽的增強子，附著到多聚(G)拉曼標簽上的胺基基團充當該標簽的增強子部分。
在另一實施方案中，本發明提供了用上述方法制備的活性分子拉曼代碼和活性分子拉曼代碼組。在若干的本文上述方法中，本發明的活性分子拉曼代碼可用于分析生物學樣品。
在還有其他實施方案中，本發明提供了通過使用本發明的活性分子拉曼代碼來分析生物學樣品的方法，如本文中所述。為了使用本發明的活性分子拉曼代碼來構建蛋白質譜圖，可以遵照下面的示范性程序。利用本文中提供的詳細指導，通過利用活性基團、分子主架和拉曼標簽的不同組合，本領域技術人員可以設計出各種變化形式。在該實施方案中，蛋白質樣品首先可以可選地被消化，例如用胰蛋白酶，或各種本領域已知的序列特異性蛋白酶。不同的蛋白酶消化和不同的連接化學術的組合可以由原始的樣品產生大量的子樣品(sub-samples)。
盡管可以使用本發明的任何活性分子拉曼代碼組，在該示范性方法中，使用包含3種代碼的一組代碼，每一代碼包括三種活性基團中的其中一種(即氨基、羧基和硫醇基團)，并被附著到不同的拉曼活性主架，例如選自聚(dA)、聚(dG)和聚(AG)的主架(圖9)。將整個或消化的蛋白質的樣品(或分離的子樣品)與三種拉曼代碼接觸，以進行結合。然后使用任何合適的分離機制分離結合的復合體，諸如電泳(例如在凝膠基質中)、尺寸排阻層析、親和結合、離子交換、等電聚焦和類似方法。當使用電泳時，復合體(不存在SDS)的遷移率取決于總體尺寸和凈負電荷。毛細管電泳是用于檢測少量的各分析物優選的分離方法。每一樣品或子樣品在它各自的通道或凝膠基質泳道中分離。在SERS檢測之前，或者在基質中，或者轉移出基質，拉曼代碼/蛋白質復合體的分離的復合體的拉曼(SERS)信號被檢測。在SERS檢測之后，將SERS光譜與拉曼代碼信息關聯起來，可以編輯關于樣品的蛋白質內容物的大量信息，這對于蛋白質作圖(proteinprofiling)是重要的。
在還有另一實施方案中，本發明提供了測定樣品中分析物存在與否的方法，其中級聯結合與拉曼活性探針構建物聯合，用于進行SERS檢測。由于生物學和化學系統的復雜性，非完美的(簡并的(degenerated))反應或結合并不是少見的。研究簡并的結合事件可以幫助鑒定有用的藥物或疾病標志物。目前，針對許多試劑和生物分子的成百上千的抗體可以利用，并可以是用于藥物篩選、疾病標志物鑒定等等的極其有價值的工具。因此，在該實施方案中，本發明方法包括將含分析物的樣品與附著到固體支持物不連續位置上的第一組探針，諸如抗體或受體接觸，以在所述不連續的位置上形成探針/分析物復合體。然后將探針/分析物復合體與至少一組另外組的本發明活性分子拉曼代碼接觸，其中第一組的探針(例如抗體和受體)中的部分探針被用作第二組探針構建物(即，本發明活性分子拉曼代碼的探針構建物)中的活性試劑。
本發明方法基于下面的假設1)存在這樣的受體庫，庫中的受體濃度基本上相同，并且當允許非完美的(簡并的)結合時，庫中的每一受體具有較高的可能性結合樣品中的兩個或更多個分析物。2)存在著含有不同豐度的配體的樣品。對于每一配體，當允許簡并的結合時，可能具有兩個或更多個可利用的受體。當受體是抗體，配體是蛋白質時，這些假設在生物學系統中通常是真實的。
由于簡并結合，由第一結合形成的復合體中的一些有可能將被探針構建物結合(即，分析物被相同的抗體或被結合分析物或含分析物的復合體上的兩個表位的兩個不同的抗體識別兩次)。只有那些“陽性結果”會被拉曼活性代碼標記。陽性鑒定的分析物可以是樣品中低豐度的分析物，這是因為就第二結合事件而言，在第一結合事件中被結合的蛋白質可以被相對地富集(相比它在樣品中的濃度)。
然后，將包含拉曼活性代碼的結合的復合體用金屬薄層在原位覆蓋，如本文中所述，以增強拉曼活性探針構建物的拉曼信號。緊緊靠近分析物的金屬層，將產生SERS信號，并且整個固體支持物可以用單一光源照射，同時從在固體支持物的不連續位置上結合的含拉曼代碼的復合體收集SERS信號，例如利用SERS掃描收集SERS信號。獲自不連續的位點的一個或多個SERS光譜將探針部分與特定分析物在樣品中的存在聯系起來，或者將該探針部分鑒定為與樣品中的分子或復合體具有親和性(例如，至今未知的)。
在一個方面，其中拉曼活性探針構建物包括寡核苷酸主架，尤其是拉曼活性寡核苷酸主架，該方法還可以包括在沉積金屬層之前，擴增固體支持物上的結合的含拉曼代碼的復合體中的主架。例如，使用本領域已知的技術，PCR3或末端轉移酶反應擴增可以被用于擴增拉曼活性主架。在末端轉移酶反應中，使用的dNTP混合物可選地含有一種或多種拉曼標記的核苷酸或拉曼活性核苷酸，如本文中所述。
金屬薄層在擴增的拉曼代碼上的沉積可以以金屬納米顆粒的形式在原位形成，以整合擴增的拉曼代碼。參考圖10A-B進行描述，固體支持物110涂覆以連接層(linker layer)120，以連接一抗130。一旦與樣品接觸，一抗130將目標140固定化。連接有拉曼代碼的二次抗體150特異性地結合攜帶固定化抗原140的一抗130，并使用任何上述技術擴增該拉曼代碼。通過與還原劑接觸，金屬陽離子從膠體溶液沉淀出來，從而形成金屬納米顆粒170，所述金屬納米顆粒合并了擴增的拉曼代碼160。
為了檢測結果，對各個分子結合事件的SERS信號，或從基質上每一不連續的位置(例如“抗體點”)發出的信號點進行計數。如圖11所示，基質210具有許多不連續的位置，“即，抗體點”，其中，一抗被固定在基質上。單個抗體點的放大圖顯示出了信號點230，在那里，由于至少一個活性分子拉曼代碼與通過一抗固定在不連續位置220的分析物結合，SERS信號被檢測到。通過該程序獲得的結果的多重分析涉及根據拉曼代碼設計對SERS特征進行分類。通過實施微米級SERS掃描和信號特征分析，可以辨別各個信號點，如圖12的流程圖所示。
抗體和受體是附著到固體支持物上的不連續位置的、并入第二組拉曼活性探針構建物的探針的非限制性例子。噬菌體展示的肽、核酸、適體、配體、凝集素和它們的組合也可以在本發明的方法中用作探針。盡管樣品可以是體液，樣品也不必一定是體液，而是可以包括任何的分析物混合庫，包括蛋白質、糖蛋白、脂蛋白、核酸、病毒顆粒、多糖、類固醇和其組合。在一個方面，樣品包括已知患有或懷疑患有特定的疾病的患者的體液庫。
為了使用本發明方法來檢測疾病標志物，該方法被重復，不同的是，取代代表疾病的患者樣品，分析物庫由獲自正常的對照患者的相應樣品(例如，同樣的類型的體液)構成。該方法然后還包括將獲自患者樣品的SERS光譜與獲自正常對照患者樣品的SERS光譜進行比較，以鑒定差異，其中該差異表明在已知或懷疑患有疾病的患者的樣品中存在疾病標志物(圖12)。
在一個方面，第一組探針(例如整組抗體)被隨機劃分，以獲得多個亞組的探針，它們在其中一個第二組中使用(例如用作活性分子拉曼代碼中的探針)。可選擇地，第一組的探針可以被分成含有等量探針的亞組。在后一種情況中，在原始探針組的亞組中的每一個探針被用作單個第二組活性分子拉曼代碼中的活性試劑，并且在單個亞組中的每一拉曼代碼對于該單個亞組的成員是獨特的，但是每一個第二組含有相同組的拉曼代碼。
本發明的分析生物學樣品的方法的另一實施方案中，使用本文中描述的或本領域已知的任何方法，將樣品的分析物在固體支持物上分離，并且將分離開的分析物與初級組的活性拉曼分子代碼接觸，以便允許活性拉曼分子代碼與樣品中的一個或多個含蛋白質的分析物特異性結合，形成復合體。然后將如此形成的復合體與次級拉曼代碼復合體接觸，以便擴增由復合體中的活性拉曼分子代碼產生的拉曼信號。檢測由次級拉曼代碼產生的擴增的拉曼信號，并與樣品中分析物的存在聯系起來，其中，活性拉曼分子代碼的活性試劑特異性地結合分析物。
在一個方面，與次級拉曼復合體的接觸涉及在活性拉曼分子代碼組的被結合的成員與次級拉曼代碼中的多核苷酸或寡核苷酸之間的締合，以擴增拉曼信號。例如，在這種情況下，其中活性拉曼分子代碼組的成員包括寡核苷酸主架，可選地，具有拉曼活性，并且次級拉曼復合體包括互補的寡核苷酸，這兩者之間選擇性雜交之后進行擴增反應，以擴增拉曼信號。在另一方面，在選擇性雜交之后，引入適于導致雜交的雙鏈片段連接的條件，以便形成擴增拉曼信號的線性或分支拉曼活性復合體(圖7C)。
在另一方面，其中活性拉曼分子代碼組的被結合的成員包括在其3′端具有自由羥基的拉曼活性多核苷酸主架，該方法還包括在適于形成長度為幾百個或數千個核苷酸的單鏈拉曼活性分子的條件下，將被結合的復合體在存在末端轉移酶的情況下暴露于dNTPs，以擴增主架的拉曼信號。此技術通常稱為“滾環擴增”。為了進一步改變被擴增的拉曼信號，用于擴增各種被結合的復合體的單鏈DNA主架的dNTPs組成可以發生變化。可選地，拉曼標記的核苷酸可以被添加到使用的dNTP中(圖7D)。
在還有另一方面，次級拉曼復合體可以包括使用本文中描述的方法被附著到金屬納米顆粒上的寡核苷酸或多核苷酸(圖7A)。次級拉曼序列中的核酸序列被選擇，以與活性分子拉曼代碼中的至少一部分的主架多核苷酸互補。互補核酸序列與拉曼活性分子主架的選擇性雜交將放大因照射而產生的拉曼信號。在這種情況下，由于納米顆粒靠近分析物，放大的拉曼信號是SERS信號。在還有另一方面，其中次級拉曼復合體包括附著有拉曼活性標簽的互補的寡核苷酸或多核苷酸，次級拉曼復合體是由互補的寡核苷酸產生的樹枝狀大分子，如本文中所述和本領域已知的(圖7B)。在一個或多個樹枝狀大分子中的互補寡核苷酸選擇性地與各種活性拉曼分子代碼中的多核苷酸主架雜交，以放大拉曼信號。
已知，DNA可以被擴增1×104倍(滾環擴增)直至達1×106倍(PCR3)。因此，DNA擴增和SERS放大的組合可以產生1×1014倍的增強因子。此增強因子使得檢測單個分子成為可能。典型地，蛋白質分子或DNA片段具有10-100nm的尺寸。如果，擴增之后，信號從1μm2的面積產生，1cm2的芯片將能夠容納1×108個蛋白質或DNA片段分析物。因為激光束點可以小至1μm，或更小，血清中大多數細胞因子的濃度在1×105至1×1010分子/μl范圍內(Nature Biotechnology，April 200220359-356)，所以微小數量的樣品對于本文中描述的許多定量分析是足夠的。
在還有另一實施方案中，本發明提供了測定分析物庫中的分析物存在的方法，該方法包括將分析物庫與附著到固體支持物的不連續位點上的、具有已知的結合特異性的第一組探針接觸，以在不連續位點上形成探針/分析物復合體。然后，將如此形成的探針/分析物復合體連續地與多組第二組本發明活性拉曼分子代碼接觸，以形成含拉曼代碼的復合體，其中每一第二組利用第一組探針的亞組探針作為活性試劑。然后，將含有結合的拉曼代碼的復合體在原位與金屬離子接觸，以用金屬薄層覆蓋含拉曼代碼的復合體，如本文中描述，從而在照射復合體時產生SERS信號。通過同時照射固體支持物的不連續位點上結合的含拉曼代碼的復合體而產生的SERS信號被檢測，并將檢測到的一個或多個SERS光譜與不連續位點上是否存在來自樣品的特定分析物聯系起來。可選地，在形成金屬層以增強SERS信號之前，可以擴增被結合的含有拉曼代碼的復合體中的多核苷酸主架，例如通過本文中描述的PCR3或滾環擴增來實現。在一個方面，SERS信號可以使用SERS掃描技術并通過根據拉曼代碼設計對SERS光譜分類進行多重分析來檢測。在該實施方案中，可以使用的示范性的探針包括抗體、噬菌體展示的肽、受體、核酸、配體、凝集素和類似物，可以被檢測的示范性的分析物包括蛋白質、糖蛋白、脂蛋白、核酸、病毒顆粒、多糖、類固醇和類似物。優選地，分析物庫包括已知或懷疑患有疾病的患者的體液樣品。在一個方面，該方法被重復，不同的是，分析物庫包括正常的對照患者的相應樣品，并且該方法還包括將獲自患者分析物庫的SERS光譜與獲自正常對照患者分析物庫的SERS光譜進行比較，以鑒定差異，其中該差異表明在已知或懷疑患有疾病的患者的樣品中存在疾病標志物。
本文中描述的本發明各種方法可以被用于編輯拉曼或SERS光譜的文庫，所述拉曼或SERS光譜與健康個體以及鑒定具有特定疾病狀態的個體的特定類型的生物學樣品相關。對于各種生物學樣品和各種疾病狀態，可以構建類似的文庫。然后可以將這樣的文庫中的拉曼或SERS光譜與使用本發明方法和裝置由任何個體獲得的結果比較，以幫助基于他們的各自光譜來診斷個體是否具有或可能具有特定的生物學表型或疾病(參見圖12)。盡管本文中描述的任何生物學樣品可以用于此目的，但特別合適的生物學樣品是血，例如血清。
下面的段落討論了對于理解本發明各種實施方案有幫助的各種概念和術語。
廣泛用于本文中的術語“多核苷酸”指通過磷酸二酯鍵連接起來的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸序列。方便起見，用于本文中的術語“寡核苷酸”指用作引物或探針的多核苷酸。一般而言，可用作選擇性地與選擇的核苷酸序列雜交的探針或引物的寡核苷酸的長度為至少約10個核苷酸、通常至少約15個核苷酸，例如約15至約50個核苷酸之間。
多核苷酸可以是RNA或可以是DNA，其可以是基因或其一部分，cDNA、合成的多脫氧核糖核酸序列或類似物，并且可以是單鏈的或雙鏈的，以及DNA/RNA雜合物。在各種實施方案中，多核苷酸，包括寡核苷酸(例如探針或引物)可以含有核苷或核苷類似物，或除了磷酸二酯鍵之外的主架鍵。一般而言，核苷酸，包括多核苷酸，是天然存在的脫氧核糖核苷酸，諸如連接到2′-脫氧核糖的腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤或胸腺嘧啶，或核糖核苷酸，諸如連接到核糖的腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤或尿嘧啶。然而，多核苷酸或寡核苷酸也可以含有核苷酸類似物，包括非天然存在的合成的核苷酸或修飾的天然存在的核苷酸。這樣的核苷酸類似物是本領域熟知的并且可以通過商業渠道獲得的，含有這樣的核苷酸類似物的多核苷酸也是如此(Lin等，Nucl.Acids Res.225220-5234(1994)；Jellinek等，Biochemistry3411363-11372(1995)；Pagratis等，Nature Biotechnol.1568-73(1997)。
連接多核苷酸的核苷酸的共價鍵一般是磷酸二酯鍵。然而，共價鍵也可以是大量的其他鍵中的任何一種，包括硫代二酯鍵、硫代磷酸酯鍵、肽-樣鍵或本領域技術人員知道的用作連接核苷酸以產生合成的多核苷酸的任何其他鍵(參見例如Tam等，Nucl.Acids Res.22977-986(1994)；Ecker和Crooke，BioTechnology13351360(1995))。當多核苷酸要被暴露于可能含有核苷酸降解活性的環境，包括例如組織培養基，或被施用給活對象時，整合非天然存在的核苷酸類似物或連接核苷酸或類似物的鍵可能非常有用，這是因為修飾的多核苷酸對降解較不敏感。
如本文中使用地，術語“選擇性雜交作用”或“選擇性雜交”指在中等嚴緊性或高度嚴緊性條件下的雜交，這樣，相比無關的核苷酸序列，核苷酸序列優先與選擇的核苷酸序列結合至足以可用于鑒定選擇的核苷酸序列的程度。將被認識到的是，一些數量的非特異性雜交是不可避免的但是可以接受的，只要與目標核苷酸序列的雜交具有足夠的選擇性，以便它可以與非特異性交叉雜交區分開來，例如，與不同于目標分子的核酸分子相比較，特別是與不同于目標核酸分子的基本上類似的(即，同源的)核酸分子相比較，具有至少約2倍的選擇性，一般至少約3倍的選擇性，通常至少約5倍的選擇性，特別地至少約10倍的選擇性，這例如通過與目標核酸分子結合的標記寡核苷酸的數量來測定。允許進行選擇性雜交的條件可以經驗性地確定，或可以基于例如雜交寡核苷酸和它要與之雜交的序列的相對GCAT含量、雜交寡核苷酸的長度、寡核苷酸和它要與之雜交的序列之間的錯配(如果有的話)的數量來估計(參見例如Sambrook等，“Molecular CloningAlaboratory manual”(Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989))。
逐漸增高的嚴緊性條件的例子如下2×SSC/0.1％SDS，大約室溫中(雜交條件)；0.2×SSC/0.1％SDS，大約室溫中(低嚴緊性條件)；0.2×SSC/0.1％SDS，約42EC中(中等嚴緊性條件)；0.1×SSC，約68EC中(高嚴緊性條件)。可以使用這些條件中的僅僅一種，例如高嚴緊性條件進行洗滌，或可以使用這些條件中的每一種條件，例如各10-15分鐘，以上面列出的順序，重復任何或所有列出的步驟。然而，如上文所提及，最佳條件將會變化，這取決于涉及的特定的雜交反應條件，并可以經驗性地確定。
本文中使用的術語“樹枝狀大分子”是合成的3維分子，其從簡單的分支單體單元以逐步的方式制備而得，其特征和功能可以容易地控制。樹枝狀大分子的形成描述在萬維網上，網址是almaden.ibm.com/st/projects/dendrimers。
公開的方法和組合物并不限制所使用的探針的類型，本領域已知的任何類型的探針部分都可以連接到條碼或分子主架上，并用于公開的方法中。因此，本文中使用的“探針部分”或“探針”指作為分析物或一類分析物的特異性結合伴侶的分子或構建物。這樣的探針包括但是不限于抗體片段、親和體(affibodies)、嵌合抗體、單鏈抗體、配體、結合蛋白質、受體、抑制劑、底物等。
在一些實施方案中，用于本發明方法的拉曼活性或SERS活性構建物包括抗體探針。如本文中使用地，術語“抗體”以最廣義的方式使用，以包括多克隆抗體和單克隆抗體，以及這樣的抗體的抗原結合片段。用于本發明方法的抗體或其抗原結合片段的特征是例如對分析物的表位具有特異性結合活性。可選擇地，如下面所解釋的，分析物可以是探針抗體，特別是在用作探針(例如活性試劑)的抗體被暴露于體液以篩選一組可用作藥物候選物的抗體的本發明實施方案中。
抗體，例如包括天然存在的抗體以及非天然存在的抗體，包括例如單鏈抗體、嵌合抗體、雙功能抗體和人源化的抗體，以及它們的抗原結合片段。這樣的非天然存在的抗體可以用固相肽合成方法構建，可以重組產生或可以例如通過篩選組合文庫而獲得，所述組合文庫由可變重鏈和可變輕鏈組成(參見Huse等，Science 2461275-1281(1989))。制備例如嵌合抗體、人源化抗體、CDR接枝抗體、單鏈抗體和雙功能抗體的這些和其他方法是本領域技術人員熟知的(Winter和Harris，Immunol.Today 14243-246，1993；Ward等，Nature 341544-546，1989；Harlow和Lane，AmibodiesA laboratory manual(Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1988)；Hilyard等.，Protein EngineeringA practical approach(IRL Press1992)；Borrabeck，Antubody Engineering，第二版(Oxford University Press 1995))。適合用作探針的單克隆抗體也可以從許多商業來源獲得。對于許多不同的目標，都可以獲得這樣的商業抗體。抗體探針可以用下面討論的標準化學方法與分子主架連接。
當涉及抗體時，術語“特異性結合”或“特異性結合活性”指抗體和特定表位的相互作用具有至少約1×10-6、一般至少約1×10-7、通常至少約1×10-8，特別地至少約1×10-9或1×10-10或更小的解離常數。因此，對抗原的表位保持特異性結合活性的抗體的Fab、F(ab′)2、Fd和Fv片段包括在抗體的定義之中。
在本發明的上下文中，術語“配體”指受體的天然存在的特異性結合伴侶、受體的合成的特異性結合伴侶以及天然和合成配體的合適衍生物。配體的測定和分離是本領域已知的(Lemer，Trends Neurosci.17142-146，1994)。如本領域技術人員認識到的，分子(或大分子復合體)可以是受體或配體。一般而言，具有較小分子量的結合伴侶稱為配體，而具有較大分子量的結合伴侶稱為受體。
在某些方面，本發明屬于用于檢測樣品中的分析物的方法。“分析物”指針對它可以找到探針的任何分子或化合物。分析物可以是固相、液相、氣相或汽相。“氣相或汽相分析物”是指存在于例如液體頂部空間、環境空氣、呼吸樣品、氣體中的分子或化合物，或在任何前述中作為污染物存在的分子或化合物。將被認識到的是，通過壓力、溫度以及由于鹽的存在或加入鹽等影響液體的表明張力，氣相或汽相的物理狀態可以被改變。
如上所示，在某些方面，本發明的方法檢測分析物與拉曼活性探針的結合。分析物可以由特異性的結合對(sbp)的成員構成，可以是配體，其是單價的(單個表位)或多價的(多個表位)，通常是抗原性的或半抗原性的，為單個化合物或共有至少一個共同的表位或決定簇位點的多個化合物。分析物可以是細胞的一部分，細胞諸如細菌或攜帶血型抗原如A、B、D等或HLA抗原的細胞，或者微生物，例如細菌、真菌、原生動物或病毒。在本發明的某些方面，分析物是帶電荷的。
特異性結合對的一個成員(“sbp成員”)是兩個不同分子中的其中一種，其在表面或腔中具有一區域，該區域特異性地結合另一分子的特定空間和極性結構，因此被定義為與該特定空間和極性結構互補。特異性結合對的成員被稱為配體和受體(抗配體)或分析物和探針。因此，探針是特異性結合分析物的分子。這些通常是免疫對諸如抗原-抗體的成員，盡管其他特異性結合對諸如生物素-抗生物素蛋白、激素-激素受體、核酸雙鏈體、IgG-蛋白A、多核苷酸對諸如DNA-DNA、DNA-RNA和類似物不是免疫對，但是也包括在本發明和sbp成員的定義中。
特異性結合是兩個不同的分子中的其中一個對于另一個分子的特異性識別，這是相比與其他分子弱得多的識別而言的。一般而言，這些分子在它們的表面或腔中具有引起兩分子之間特異性識別的區域。示例性的特異性結合是抗體-抗原相互作用、酶-底物相互作用、多核苷酸相互作用等等。
非特異性結合是分子間相對獨立于特定表面結構的非共價結合。非特異性結合可以由若干因素包括分子間的疏水相互作用引起。
描述在本文中的用于本發明方法的拉曼活性探針構建物可以被用于檢測特定的目標分析物例如核酸、寡核苷酸、蛋白質、酶、抗體或抗原的存在。納米顆粒也可以被用于篩選生物活性試劑，即藥物候選物，用于結合特定的目標或檢測諸如污染物的物質。如上討論，通過將探針整合入公開的拉曼活性構建物中，在本發明的方法中可以檢測任何分析物，對于該分析物，探針部分諸如肽、蛋白質、寡核苷酸或適體可以被設計。
多價配體分析物通常是聚(氨基酸)，即多肽和蛋白質、多糖、核酸和其組合。這樣的組合包括細菌、病毒、染色體、基因、線粒體、核、細胞膜和類似物的組分。
就大部分而言，本發明可以應用的多表位配體分析物將具有至少約5,000的分子量，更常見地具有至少約10,000的分子量。在聚(氨基酸)類型中，感興趣的聚(氨基酸)通常將具有約5,000至5,000,000的分子量，更通常約20,000至1,000,000的分子量；在感興趣的激素中，分子量將通常在約5,000至60,000的分子量范圍內。
單表位配體分析物通常分子量將為約100至2,000，更通常地分子量為125至1,000。分析物包括藥物、代謝物、殺蟲劑、污染物和類似物。包括在感興趣的藥物中的是生物堿。在生物堿中有嗎啡生物堿，其包括嗎啡、可待因、海洛因、右甲嗎喃、它們的衍生物和代謝物；可卡因生物堿，其包括可卡因和芐基芽子堿、它們的衍生物和代謝物；麥角堿生物堿，其包括麥角酸的二乙酰胺；類固醇生物堿；咪唑基生物堿；喹唑啉生物堿；異喹啉生物堿；喹啉生物堿，其包括奎寧和奎納丁；二萜生物堿，它們的衍生物和代謝物。
術語分析物還可以包括多核苷酸分析物，諸如下面定義的那些多核苷酸。這些包括m-RNA、r-RNA、t-RNA、DNA、DNA-RNA雙鏈體等。術語分析物也包括作為多核苷酸結合試劑的受體，諸如限制性酶、激活劑、阻遏物、核酸酶、聚合酶、組蛋白、修復酶、化學治療劑和類似物。
分析物可以是直接在樣品諸如宿主體液中發現的分子。樣品可以直接檢查，或可以預先處理，以使得分析物更容易被檢測。還有，可以通過檢測感興趣的分析物的鑒定性試劑，諸如與感興趣的分析物互補的特異性結合對成員來測定感興趣的分析物，僅僅當感興趣的分析物存在于樣品中時，才檢測到該鑒定性試劑的存在。因此，分析物的該鑒定性試劑變成在分析中被檢測的分析物。體液可以是例如尿、血液、血漿、血清、唾液、精液、糞便、唾沫、腦脊髓液、淚液、粘液和類似物。
如本文中所使用地，術語“膠體”是懸浮在液體通常是水中的金屬離子。考慮應用于本發明金屬膠體并形成納米顆粒的典型的金屬包括透明性金屬，例如銀、金、鉑、鋁和類似物。
為了增強由拉曼活性探針產生的拉曼光譜，在本發明方法的某些實施方案中，考慮在拉曼活性探針與分析物或含分析物的復合體結合之后，在原位將拉曼活性探針轉變為SERS活性探針。為了實現該目的，將具有粗糙表面的透明金屬薄層沉積在基質和/或被結合的復合體的頂層上。粗糙特征在數十納米級別；并且相對于入射激發輻射的波長是較小的。該小尺寸的顆粒允許金屬顆粒的表面等離子體的激發在顆粒上局部化。可以用許多方法產生在金屬表面的金屬粗糙特征；例如，金屬顆粒的汽相沉積，或將金屬膠體涂覆在生物傳感器的上層。因為金屬的表面電子受到顆粒的限制，顆粒的尺寸又小，所以等離子體激發也受到該粗糙特征的限制。所得的等離子體的電磁場非常強，相比拉曼信號，大大增強了SERS信號。
估計，只有1/10的分析物分子在拉曼光譜術中非彈性地散射。然而，在本發明方法的實施方案中，其中散射分子的拉曼信號的強度在SERS條件下被大大增強，低至皮摩爾和飛摩爾濃度的拉曼活性分析物也能被檢測到。在一些情況中，通過沉積透明金屬薄層，以便與含有拉曼標記的被結合的復合體接觸，本發明方法可以被用于檢測復雜生物學樣品諸如血清中單個分析物分子的存在。金、銀、銅和鋁是該技術最有用的透明金屬。
使用若干方法中的其中一種方法可以產生粗糙的金屬表面。用于本文中的術語“薄金屬層”指通過化學氣相沉積沉積在含有拉曼標記的結合的復合體上的金屬層。可選擇地，薄金屬層指通過將金屬陽離子的膠體溶液施以還原條件以在原位上形成金屬納米顆粒而形成的納米顆粒層。在一些實施方案中，納米顆粒將含有結合的復合體。可選擇地，種源顆粒(seed particles)，例如附著到拉曼代碼上的種源顆粒，可以由金屬膠體溶液沉淀形成納米顆粒。通過使用附著到探針構建物上，例如附著到探針構建物中的分子主架或條碼上的酶標簽催化還原金屬陽離子溶液，金屬原子也可以沉積在活性分子拉曼代碼上。在該上下文中，“薄”指厚度約為照射光源(通常是激光)的波長的一半，以獲得SERS的益處，例如約15nm至約500nm，諸如約100nm至約200nm。
在其他實施方案中，用于本發明某些方法中的光學探針構建物或拉曼活性探針構建物被描述成含有“主架”，探針和光學活性標簽附著到該主架上。在一個方面，拉曼代碼主架可以由包括有機結構的聚合物鏈構成，包括核酸、肽、多糖和/或化學衍生的聚合物序列的任何組合。在某些實施方案中，主架可以包括單鏈或雙鏈核酸。在一些實施方案中，主架可以附著到探針部分，諸如寡核苷酸、抗體或適體。可以摻入寡核苷酸模擬物，以產生有機主架。糖和核苷間鍵接，即核苷酸單元的主架，都可以用新的基團取代。
在另一方面，分子探針可以被用于與合適的核酸目標化合物雜交。已被顯示具有優異的雜交特性的寡聚化合物或寡核苷酸模擬物的一個例子被稱為肽核酸(PNA)。在PNA化合物中，寡核苷酸的糖-主架用含酰胺的主架，例如氨基乙基甘氨酸主架取代。在該實例中，核苷堿基(nucleobases)被保留，直接或間接地結合到主架的酰胺部分的氮雜氮原子上。公開PNA化合物的制備的若干美國專利包括例如美國專利5,539,082；5,714,331和5,719,262。此外，PNA化合物公開在Nielsen等(Science，1991，254，1497-15)。
為了將一種活性分子拉曼代碼與其它的活性分子拉曼代碼區分開來，標簽可以直接添加到主架。標簽可以通過成像方法來讀取，成像方法例如熒光顯微術、FTIR(傅立葉轉換紅外)光譜術、拉曼光譜術、電子顯微術和表面等離子體共振。已知不同變化形式的成像可以檢測標簽的形態學、拓撲學、化學和/或電特性，包括但是不限于導電率、隧穿電流、電容電流等。使用的成像方法將取決于標簽部分的屬性和所產生的信號。利用它們的拓撲學、化學、光學和/或電特性，不同類型的已知標簽，包括但不限于熒光、拉曼、納米顆粒、納米管、富勒烯和量子點標簽可以被用于鑒定拉曼代碼。這些特性將作為所使用的標簽部分的類型和標簽在主架上的相對位置的函數而變化，從而對于每一條碼產生可區分的信號。
標簽可以包括例如拉曼活性標簽或熒光標簽，如本文中所述。因為例如通過熒光共振能量轉移(FRET)或其他機制，相鄰的標簽可以相互作用，由同一組標簽部分獲得的信號可以取決于標簽之間的位置和距離而變化。因此，具有相似或相同的主架的活性分子拉曼代碼可以可區別地被標記。在本發明的某些實施方案中，活性分子拉曼代碼的主架可以由磷酸二酯鍵、肽鍵和/或糖苷鍵形成。例如，標準亞磷酰胺化學術可以被用于制備包括DNA鏈的主架。制備磷酸二酯鍵連接的主架的其他方法是已知的，諸如聚合酶鏈式反應(PCRTM)擴增。主架的末端可以具有不同的功能基團，例如生物素、氨基基團、醛基團或硫醇基團。功能基團可以被用來結合探針部分或用于連接標簽。標簽可以被進一步修飾以獲得不同的尺寸、電或化學特性以幫助檢測。例如，抗體可以被用來結合地高辛或熒光標簽。鏈霉抗生物素蛋白可以被用來結合生物素標簽。
當主架包括肽部分時，或標簽包括一個或多個氨基酸部分時，該肽可以被磷酸化，以便進行標簽的修飾或用于與標簽的化學反應。
在本發明的某些實施方案中，產生聚合物主架，拉曼活性標簽通過化學的方式附著在該聚合物主架上。主架部分可以由適合于聚合的任何類型的單體構成，包括但是不限于核苷酸、氨基酸、單糖或各種已知塑料單體的任何單體，諸如乙烯基、苯乙烯、碳酸酯/鹽、乙酸酯/鹽、乙烯、丙烯酰胺等。聚合物主架可以連接到探針部分，諸如寡核苷酸、抗體、凝集素或適體探針。當聚合物主架由核苷酸單體構成時，與抗體探針的連接將使探針和主架這兩組分與不同的目標分子結合的可能性最小化。可選擇地，在使用核苷酸單體作為主架的本發明某些方面，因為基于核苷酸的主架本身將產生拉曼發射光譜，其會潛在地干擾對連接的拉曼活性標簽的檢測，所以產生極少或不產生拉曼發射信號的主架可以被用來優化信號檢測并使信噪比最小化。
目前用于探針標記和檢測的方法具有各種缺點。例如，附著到有機熒光標簽上的探針提供了高的檢測靈敏性但是具有低的多重檢測能力。熒光標簽展示了寬的發射峰，且熒光共振能量轉移(FRET)限制了可以被附著到單個探針分子的不同熒光標簽的數量，同時自淬滅降低了熒光信號的量子產率。如果探針含有一種以上類型的發色團，熒光標簽需要多個激發源。它們也由于光漂白而不穩定。另一類型的潛在的探針標簽是量子點。量子點標簽是多層的相對較大的結構。除了制備復雜之外，量子點上的涂層干擾熒光發射，使用量子點標簽可以產生的可區分信號的數量也有限制。第三類探針標記由注入染料的珠子組成。這些往往具有非常大的尺寸，常常大于探針分子的尺寸范圍。對注入染料的珠子的檢測是定性的，而不是定量的。
相反，“拉曼活性標簽”提供了產生尖的光譜峰、允許較大數量的可區分標記附著到探針上的這樣的優點。表面增強的拉曼光譜術(SERS)或類似技術的使用使得可以產生可與熒光標簽媲美的檢測靈敏性。在本發明的各種實施方案中，將一個或多個拉曼活性標簽部分附著到探針構建物(例如附著到其中的分子主架)，以幫助檢測和/或鑒定。使用的拉曼活性標簽的非限制性例子包括TRIT(四甲基羅丹明異硫醇)、NBD(7-硝基苯并-2--1，3-二唑)、德克薩斯紅染料、鄰苯二甲酸、對苯二甲酸、間苯二甲酸、甲酚固紫、甲酚藍紫、亮甲酚藍、對氨基苯甲酸、赤蘚紅、生物素、地高辛、5-羧基-4′，5′-二氯-2′，7′-二甲氧基熒光素、TET(6-羧基-2′，4，7，7′-四氯熒光素)、HEX(6-羧基-2′，4，4′，5′，7，7′-六氯熒光素)、Joe(6-羧基-4′，5′-二氯-2′，7′-二甲氧基熒光素)5-羧基-2′，4′，5′，7′-四氯熒光素、5-羧基熒光素、5-羧基羅丹明、Tamra(四甲基羅丹明)、6-羧基羅丹明、Rox(羧基-X-羅丹明)、R6G(羅丹明6G)、酞菁、偶氮甲堿(azomethine)、花青(例如Cy3、Cy3.5、Cy5)、黃嘌呤、琥珀酰熒光素、N，N-二乙基-4-(5′-偶氮苯并三唑)-苯基胺以及氨基吖啶。這些和其他拉曼活性標簽可以從商業來源獲得(例如，Molecular Probes，Eugene，OR)。
一般而言，可以考慮，拉曼活性標簽可以包括一個或多個雙鍵，例如碳氮雙鍵。也可以考慮，拉曼活性標簽包括環結構，該環結構具有連接到該環結構的側基，通常環結構諸如多環芳香化合物。增加拉曼強度的具有側基的化合物包括具有共軛環結構的化合物，諸如嘌呤、吖啶、羅丹明染料和花菁染料。聚合物活性分子拉曼代碼的整體極性可以考慮是親水性的，但是疏水性的側基可以被包括在其中。可以使用的其他標簽包括氰化物、硫醇、氯、溴、甲基、磷和硫。
在某些實施方案中，用于本發明方法和構建物的拉曼活性標簽可以獨立地選自核酸、核苷酸、核苷酸類似物、堿基類似物、熒光染料、肽、氨基酸、修飾的氨基酸、有機部分、量子點、碳納米管、富勒烯、金屬納米顆粒、電子致密顆粒和晶體顆粒，或其任何兩種或更多種的組合。
拉曼活性標簽可以直接連接到用于制備本發明拉曼活性探針構建物的分子主架或其他有機部分，或可以通過各種連接化合物進行連接。共價連接到拉曼活性標簽的核苷酸可以從標準的商業渠道獲得(例如Roche Molecular Biochemicals，Indianapolis，IN；Promega Corp.，Madison，WI；Ambion，Inc.，Austin，TX；AmershamPharmacia Biotech，Piscataway，NJ)。含有設計用于與其他分子諸如核苷酸或氨基酸共價反應的活性基團的拉曼活性標簽可從商業渠道獲得(例如，MolecularProbes，Eugene，OR)。
在一個方面，本領域技術人員將認識到使用的拉曼活性標簽不限于在本文中公開的那些，而是可以包括任何已知的拉曼活性標簽，它們附著到主架或探針構建物并被檢測。許多這樣的拉曼活性標簽是本領域已知的。
產生聚合物拉曼標簽的示例性方法涉及將生長著的聚合物拉曼標簽錨定在固體支持物上，諸如多孔玻璃珠、塑料(包括但不限于丙烯酸類塑料、聚苯乙烯、苯乙烯和其他材料的共聚物、聚丙烯、聚乙烯、聚丁烯、聚氨酯、TeflonJ等)、多糖、尼龍、硝化纖維、復合材料、陶瓷、塑料樹脂、硅石、基于硅石的材料、硅、改性硅、碳、金屬、無機玻璃、光學纖維束或任何其他類型的已知固體支持物。一個或多個連接分子(諸如碳原子鏈)可以附著到支持物上。連接分子的長度可以變化。例如，連接子的長度可以是2-50個原子。化學合成聚合物的方法是本領域已知的，可以包括例如寡核苷酸的亞磷酰胺合成和/或肽的固相合成。功能基團的保護和去保護方法也是本領域熟知的，如同在寡核苷酸或肽合成技術中的情況。
附著到單個聚合物主架上的各個拉曼活性標簽可以相互不同。可選擇地，聚合物拉曼標記可以含有兩個或更多個拷貝的同樣的拉曼活性標簽。為了使可區分的活性分子拉曼代碼的數量最大化，可以考慮的是，當多個拉曼活性標簽整合在單個聚合物主架中時，它們通常是不同的，或它們位于聚合物主架的不同位置。使用附著到單個聚合物主架上的多個拉曼活性標簽，能夠產生非常大數量的可區分的活性分子拉曼代碼。4-mer拉曼標記的平均分子量大小為約4000道爾頓。因此，聚合物拉曼標記將能產生幾乎沒有位阻的探針-標記結合。
聚合物主架可以由有機結構構成，例如由核酸、肽、多糖和/或化學衍生聚合物的任何組合構成。聚合物拉曼標記的主架可以由磷酸二酯鍵、肽鍵和/或糖苷鍵形成。例如，標準亞磷酰胺化學術可以被用于制備包括DNA鏈的主架。制備磷酸二酯鍵連接的主架的其他方法是已知的，諸如聚合酶鏈式反應(PCRTM)擴增。主架的末端可以具有不同的功能基團，例如生物素、氨基基團、醛基團或硫醇基團。這些功能化基團可以被用于將兩個或更多個亞聚合物單元連接在一起。一旦聚合物主架被合成至期望的長度，可以將兩個或更多個不同的拉曼活性標簽順序地或同時引入，以與包含在修飾的殘基中的活性功能基團結合。使用本領域已知的和本文中描述的方法，其他標簽，例如熒光標簽、納米顆粒、納米管、富勒烯或量子點標簽可以附著到主架上的一個或多個位置，以進一步使由一組活性分子拉曼代碼產生的拉曼信號多樣化。
將分子與納米顆粒交聯的各種方法是本領域已知的，可以使用任何的此類已知方法。例如，在EDAC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺)存在下，通過將羧基基團與胺基團交聯，可以將一個以上的多核苷酸連接到單個納米顆粒上。
待被測序的核酸分子可以用任何標準技術制備。在一個實施方案中，核酸可以是天然存在的DNA或RNA分子。當使用RNA時，將RNA轉變為互補的cDNA可能是有利的。事實上，任何天然存在的核酸都可以用本發明的方法制備并測序，包括但是不限于染色體DNA、線粒體DNA或葉綠體DNA或信使RNA、不均一核RNA、核糖體RNA或轉運RNA。用于制備和分離各種形式的細胞核酸的方法是已知的。(見，例如，Guide to Molecular Clonine Techniques，eds.Bereer andKimmel，Academic Press，New York，NY，1987；Molecular ClonineA LaboratoryManual，2nd Ed.，eds.Sambrook，Fritsch and Maniatis，Cold Spring Harbor Press，ColdSpring Harbor，NY，1989)。非天然存在的核酸也可以用公開的方法和組合物測序。例如，用標準擴增技術諸如聚合酶鏈式反應(PCRTM)擴增制備的核酸可以在本發明范圍內測序。核酸擴增的方法是本領域熟知的。
核酸可以從許多來源分離得到，包括但是不限于病毒、細菌、真核細胞、哺乳動物和人、質粒、M13、λ噬菌體、P1人工染色體(PACs)、細菌人工染色體(BACs)、酵母人工染色體(YACs)和其他克隆載體。
蛋白質或肽可以用本領域技術人員知道的任何技術制備，包括通過標準的分子生物學技術表達蛋白質、多肽或肽，從天然來源中分離蛋白質或肽，或化學合成蛋白質或肽。對應于各種基因的核苷酸和蛋白質、多肽和肽序列之前已被公開，并可以在本領域普通技術人員知道的計算機化數據庫中找到。一個這樣的數據庫是美國國家生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information)的Genbank和GenPept數據庫，其可以在萬維網上獲得。已知基因的編碼區域可以用本文中公開的技術或本領域技術人員將知道的技術擴增和/或表達。可選擇地，蛋白質、多肽和肽的各種商業制備物是本領域技術人員知道的。
制備本發明的多肽的另一技術是使用肽模擬物，用于產生單克隆抗體。模擬物是模擬蛋白質二級結構的要素的含肽分子。參見例如Johnson等，″PeptideTurn Mimetics″inBiotechnology And Pharmacy，Pezzuto等，Eds.，Chapman and Hall，New York (1993)。使用肽模擬物的基本原理是，蛋白質的肽主架主要以使得氨基酸側鏈的方向有助于諸如抗體和抗原之間的分子相互作用的方式存在。肽模擬物被預期允許類似于天然分子的分子相互作用。這些原理可以被用來工程改造第二代分子，所述分子具有本文中公開的靶向肽的許多天然特性但也具有改變的甚至改進的特征。
本發明的其他實施方案可以使用融合蛋白。這些分子一般具有靶向肽的所有部分或實質部分，它們的N-或C-末端連接到第二多肽或蛋白質的所有部分或一部分。例如，融合可以使用來自其他種的前導序列，以允許在異源宿主中重組表達蛋白質。另一種有用的融合包括加入免疫學活性結構域，諸如抗體表位，以幫助純化融合蛋白。在融合連接點處或附近包含切割位點將有助于在純化之后移除外來多肽。其他有用的融合包括連接功能結構域，諸如酶的活性位點、糖基化結構域、細胞靶向信號或跨膜區域。可以在本發明范圍內考慮的是，事實上任何蛋白質或多肽都可以被整合入包括探針肽的融合蛋白。產生融合蛋白的方法對于本領域技術人員來說是熟知的。這樣的蛋白質可以例如通過使用雙功能交聯試劑進行化學連接來產生，通過完整融合蛋白的從頭合成來產生，或者通過將編碼靶向肽的DNA序列與編碼第二肽或蛋白質的DNA序列連接，再表達整個融合蛋白來產生。
用于本發明方法和構建物的肽和多核苷酸可以合成產生。各種自動合成儀可以從商業渠道獲得并可以根據已知的實驗方案使用。參見例如Stewart和Young，(1984)；Tam等(1983)；Merrifield，(1986)；以及Barany和Merrifield(1979)。短肽序列，通常約6直至約35至50個氨基酸，可以容易地用這樣的方法合成。可選擇地，可以使用重組DNA技術，其中編碼本發明肽的核苷酸序列被插入表達載體，轉化或轉染入合適的宿主細胞，并在適于表達的條件下培養。
如本文中使用的術語“分析物”包括核酸、蛋白質、肽、脂類、碳水化合物、糖脂、糖蛋白或任何其他潛在的目標，針對該目標可以制備出特異性探針。如上討論，抗體或適體探針可以被整合入本發明的活性分子拉曼代碼，并被用來鑒定任何目標，針對該目標，可以制備出適體或抗體。可以同時分析樣品中多個分析物的存在，因為組中的每一成員可以可區分地標記并檢測。對分析物的量化可以用光譜分析領域熟知的標準技術進行。例如，可以通過測量產生的信號強度，并與由已知數量的類似的拉曼探針構建物標準品制訂的校正曲線比較，來測定結合到本發明拉曼探針構建物上的分析物的數量。這樣的量化方法完全在本領域的常規技術范圍內。
“基質”或“固體支持物”指可以被修飾以含有適合于連接或結合分析物的不連續的各個點并適用于至少一種檢測方法的任何材料。一般而言，選擇基質以允許在基質上進行考慮使用的光學檢測方法或增強光學檢測方法，且不會明顯干擾信號發射。
如本文中使用的術語“基質”，包括熟知的裝置諸如芯片或微量滴定板，它們可以包括有圖案的表面，該表面含有可以如本文中描述的那樣處理以結合各個分析物或各類分析物的各個不連續位點。可選擇地，在探針拉曼構建物被附著到基質上的實施方案中，各個位點在陣列上的位置與位于該特定位點的拉曼代碼或探針之間建立起關聯。
陣列組合物可以包括具有許多不連續的基質位點的至少一個表面。陣列的尺寸將取決于陣列的最終用途。可以制備含有約2個至幾百萬個不同的不連續基質位點的陣列。一般而言，取決于表面的尺寸，陣列將包括2個至多達十億個或更多這樣的位點。因此，可以制備極高密度的、高密度的、中等密度的、低密度的或極低密度的陣列。極高密度的陣列的一些范圍為每個陣列約10,000,000至約2,000,000,000個位點。高密度的陣列的范圍為約100,000至約10,000,000個位點。中等密度的陣列的范圍為約10,000至約50,000個位點。低密度的陣列通常少于10,000個位點。極低密度的陣列少于1,000個位點。
位點構成圖案，即，規則的設計或構造，或可以隨機分布。可以使用規則圖案的位點，這樣，位點可以被定址于X-Y坐標平面上。基質的表面可以進行修飾以允許將分析物附著在各個位點。因此，基質的表面可以進行修飾，以形成不連續的位點。在一個實施方案中，基質的表面可以進行修飾，以含有孔，即，在基質表面上的凹陷。這可以用各種已知的技術來完成，包括但不限于照相平版術、沖壓技術、模塑技術和微蝕刻技術。如本領域技術人員將認識到的，使用的技術將取決于基質的組成和形狀。可選擇地，基質的表面可以進行修飾以含有化學衍生的位點，化學衍生的位點可以被用來將分析物或探針附著到基質上的不連續位置。加入具有一定型式的化學功能基團，諸如氨基基團、羧基基團、氧基團和硫醇基團，可以被用來共價連接含有相應的反應活性功能基團的分子或連接分子。
生物學“分析物”可以含有天然存在的蛋白質或天然存在的蛋白質的片段。因此，例如，可以使用含有蛋白質的細胞提取物，或蛋白質細胞提取物的隨機或定向的消化物。這樣，可以建立原核和真核細胞蛋白質的文庫，用于篩選本文中描述的系統。例如，可以產生細菌、真菌、病毒和哺乳動物蛋白質的文庫用于篩選目的。
生物學分析物可以是約5至約30個氨基酸或約5至約15個氨基酸的肽。肽可以是天然存在的蛋白質的消化物或隨機肽。因為通常隨機肽(或隨機核酸)是化學合成的，它們可以在任何位置整合任何核苷酸或氨基酸。可以設計合成過程以產生隨機的蛋白質或核酸，以允許在該序列的長度范圍內形成所有或大部分可能的組合，因此形成隨機生物學分析物的文庫，用于使用本發明的方法和構建物進行篩選。
可選擇地，生物學分析物可以是核酸。核酸可以單鏈或雙鏈的，或其混合物。核酸可以是DNA、基因組DNA、cDNA、RNA或雜合物，其中核酸含有脫氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的任何組合，和堿基的任何組合，所述堿基包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鳥嘌呤、肌苷、黃嘌呤、次黃嘌呤、異胞嘧啶、異鳥嘌呤，和堿基對類似物諸如硝基吡咯和硝基吲哚等。
寡核苷酸合成的方法是本領域熟知的，并且可以使用任何此類已知的方法。例如，寡核苷酸可以使用商業上可獲得的寡核苷酸合成儀(例如AppliedBiosystems，Foster City，CA)合成。連接到各種標簽的核苷酸前體可以從商業渠道獲得(例如Molecular Probes，Eugene，OR)，并整合入寡核苷酸或多核苷酸中。可選擇地，可以購得含有各種反應活性基團諸如生物素、地辛高、巰基、氨基或羧基基團的核苷酸前體。寡核苷酸合成之后，標簽可以用標準化學方法連接。具有任何期望序列的寡核苷酸——其具有或沒有用于連接標簽的活性基團——也可以從各種來源購得(例如Midland Certified Reagents，Midland，TX)。
適體探針
“適體”是通過稱為SELEX的體外進化方法衍生而得的寡核苷酸(例如Brody和Gold，Molecular Biotechnology 745-13，2000)。SELEX方法涉及反復將潛在的適體(核酸配體)暴露于目標，使得能夠發生結合，將結合的核酸配體與自由的核酸配體分離，擴增結合的配體并重復結合過程。一定數量的循環之后，可以事實上針對任何類型的生物學目標制備顯示出高親和力和特異性的適體。因為它們小的尺寸、相對的穩定性以及制備的容易性，適體能夠特別適合于用作探針。因為適體由寡核苷酸組成，它們能容易地被整合入核酸類型的主架。產生適體的方法是熟知的(例如美國專利5,270,163；5,567,588；5,670,637；5,696,249；5,843,653)。可選擇地，針對特異性目標的各種適體可以從商業來源獲得(例如Somalogic，Boulder，CO)。適體是相對小的分子，在7至50kDa的級別。
如本文中使用的術語“COIN”指SERS活性納米顆粒，其被摻入本發明凝膠基質中，并被用于本文中描述的某些其他分析物分離技術。COIN是復合有機-無機納米顆粒。這些SERS活性探針構建物包括核心和表面，其中所述核心包括金屬膠體，所述金屬膠體包括第一金屬和拉曼活性有機化合物。COIN還可以包括不同于第一金屬的第二金屬，其中所述第二金屬形成覆蓋納米顆粒的表面的層。COIN還可以包括覆蓋金屬層的有機層，該有機層包括探針。用于附著到SERS活性納米顆粒的表面的合適探針包括但是不限于抗體、抗原、多核苷酸、寡核苷酸、受體、配體和類似物。
獲得合適的SERS信號所需要的金屬是COIN所固有的，并且各種拉曼活性有機化合物可以被摻入顆粒中。事實上，通過利用含有不同結構、混合物和比率的拉曼活性有機化合物的納米顆粒，可以產生大量獨特的拉曼特征。因此，描述在本文中的利用COIN的方法可用于同時檢測樣品中的許多分析物，從而快速地定性分析體液的“譜型”內容。此外，因為許多COIN可以被整合入單個納米顆粒中，來自單個COIN顆粒的SERS信號相對強于由不含有在本文中描述為COIN的納米顆粒的拉曼活性材料獲得的SERS信號。該情形導致，相比不利用COIN的拉曼技術，靈敏性增加。
使用標準的金屬膠體化學術，可以容易地制備COIN以用于本發明方法。COIN的制備也利用金屬吸附有機化合物的能力。事實上，因為在金屬膠體形成期間，拉曼活性有機化合物被吸附在金屬上，所以無需特別的連接化學方法，許多拉曼活性有機化合物就可以被整合入COIN中。
大體上，用于本發明方法的COIN如下地制備。制備含有合適的金屬陽離子、還原劑和至少一種合適的拉曼活性有機化合物的含水溶液。然后使溶液的組分經受將金屬陽離子還原形成中性的膠體金屬顆粒的條件。因為金屬膠體在合適的拉曼活性有機化合物存在下形成，在膠體形成期間，拉曼活性有機化合物容易被吸附到金屬上。該簡單類型的COIN被稱為I類COIN。典型地，I類COIN可以通過膜過濾分離。此外，不同尺寸的COIN可以通過離心富集。
在可選擇的實施方案中，COIN可以包括不同于第一金屬的第二金屬，其中第二金屬形成覆蓋納米顆粒表面的層。為了制備這類SERS活性納米顆粒，將I類COIN置于含有合適的第二金屬陽離子和還原劑的含水溶液中。然后使溶液的組分經受將第二金屬陽離子還原以便形成覆蓋納米顆粒表面的金屬層的條件。在某些實施方案中，第二金屬層包括金屬諸如銀、金、鉑、鋁和類似物。該類型的COIN被稱為II類COIN。II類COIN可以用與I類COIN同樣的方式分離或富集。典型地，I類和II類COIN基本上是球形的，尺寸范圍在約20nm至60nm。選擇納米顆粒的尺寸約為在檢測期間用來照射COIN的光波長的一半。
典型地，通過將有機化合物共價連接于金屬層的表面，有機化合物被附著到II類COIN中的第二金屬層。用本領域技術人員熟知的各種方法，諸如通過硫醇-金屬鍵，可將有機層共價連接到金屬層。在可選擇的實施方案中，附著到金屬層上的有機分子可以進行交聯以形成分子網絡。
用于本發明方法的COIN可以包括核心，該核心含有磁性物質諸如鐵氧化物和類似物。無需離心，使用常見的可利用的磁性顆粒處理系統便可以處理磁性COIN。事實上，磁性可以被用作分離生物目標的機制，所述生物目標被附著到用特定生物學探針標記的磁性COIN顆粒上。
如本文中所使用地，“拉曼活性有機化合物”指響應于激光的激發，產生獨特的SERS信號特征的有機分子。各種拉曼活性有機化合物被考慮用作COIN中的組分。在某些實施方案中，拉曼活性有機化合物是多環芳香化合物或多環雜芳化合物。典型地，拉曼活性有機化合物具有少于約300道爾頓的分子量。
此外，用于COIN中的拉曼活性有機化合物的非限制性例子包括TRIT(四甲基羅丹明異硫醇)、NBD(7-硝基苯并-2--1，3-二唑)、德克薩斯紅染料、鄰苯二甲酸、對苯二甲酸、間苯二甲酸、甲酚固紫、甲酚藍紫、亮甲酚藍、對氨基苯甲酸、赤蘚紅、生物素、地高辛、5-羧基-4′，5′-二氯-2′，7′-二甲氧基熒光素、5-羧基-2′，4′，5′，7′-四氯熒光素、5-羧基熒光素、5-羧基羅丹明、6-羧基羅丹明、6-羧基四甲基氨基酞菁、偶氮甲堿、菁、黃嘌呤、琥珀酰熒光素、氨基吖啶和類似物。這些和其他的拉曼活性有機化合物可以從商業來源獲得(如Molecular Probes，Eugene，OR)。
在某些實施方案中，拉曼活性化合物是腺嘌呤、腺嘌呤、4-氨基-吡唑并(3，4-d)嘧啶、2-氟腺嘌呤、N6-苯甲酰嘌呤(benzolyadenine)、激動素、二甲基-烯丙基-氨基-腺嘌呤、玉米素、溴-腺嘌呤、8-氮雜-腺嘌呤、8-氮雜-鳥嘌呤、6-巰基嘌呤、4-氨基-6-巰基吡唑并(3，4-d)嘧啶、8-巰基腺嘌呤或9-氨基-吖啶4-氨基-吡唑并(3，4-d)嘧啶或2-氟腺嘌呤。在一種實施方案中，拉曼活性化合物是腺嘌呤。
當“熒光化合物”被整合入COIN時，熒光化合物包括但是不限于染料、固有熒光蛋白質、鑭系元素、磷和類似物。可用于整合入COIN的染料包括例如羅丹明和衍生物，諸如德克薩斯紅染料、ROX(6-羧基-X-羅丹明)、羅丹明-NHS和TAMRA(5/6-羧基四甲基羅丹明NHS)；熒光素和衍生物，諸如5-溴甲基熒光素和FAM(5′-羧基熒光素NHS)、熒光黃、IAEDANS、7-Me2、N-香豆素-4-醋酸鹽、7-OH-4-CH3-香豆素-3-醋酸鹽、7-NH2-4CH3-香豆素-3-醋酸鹽(AMCA)、monobromobimane、三磺酸芘，諸如Cascade Blue和monobromotrimethyl-ammoniobimane。
下面的段落包括關于含拉曼活性探針的構建物(例如拉曼條碼、活性分子拉曼代碼和復合有機-無機納米顆粒(COIN))的示例性應用的進一步詳細細節。將被理解的是，大量其他的利用此類拉曼活性探針構建物的具體應用例子可以用本說明書的教導來鑒定。本領域技術人員將認識到，多肽和它們的目標分子之間的許多相互作用可以使用具有作為探針的多肽的某些公開的拉曼活性探針構建物來檢測。在一組示例性應用中，具有作為探針部分的抗體的這樣的拉曼活性構建物被用來檢測拉曼活性抗體標記的構建物與抗原在溶液中或者固體支持物上的相互作用。將被理解的是，利用拉曼活性探針構建物，這樣的免疫測定分析可以使用已知的方法，諸如用于例如ELISA分析、Western印跡或蛋白質陣列的方法進行，所述拉曼活性探針構建物具有作為探針的抗體，并充當一抗或二抗，代替用酶或放射性化合物標記的一抗或二抗。在另一例子中，拉曼活性探針構建物被連接到酶探針，用于檢測酶與底物的相互作用。
另一組示例性方法使用本文中描述的拉曼活性構建物來檢測目標核酸。此方法可用于例如檢測臨床樣品中的傳染性介質、檢測由基因組DNA或RNA或信息RNA產生的擴增產物，或檢測克隆中的基因(cDNA)插入子。對于旨在檢測目標多核苷酸的某些方法，使用本領域已知的方法合成寡核苷酸探針。寡核苷酸然后被用來對拉曼活性構建物進行功能化作用。對拉曼活性探針構建物中的特定拉曼標記的檢測，鑒定出寡核苷酸探針的核苷酸序列，其進而提供了有關目標多核苷酸的核苷酸序列的信息。
在本發明的實踐中，拉曼分光計可以是設計用來檢測和量化由拉曼光譜術產生的本發明拉曼信號的檢測裝置的一部分。用拉曼光譜術檢測拉曼標記的分析物例如核苷酸的方法是本領域已知的。(參見，例如美國專利5,306,403；6,002,471；6,174,677)。關于表面增強拉曼光譜術(SERS)、表面增強共振拉曼光譜術(SERRS)和相干反斯托克斯拉曼光譜術(CARS)的變化形式已經被公開。
拉曼檢測單元的一個非限制性例子公開在美國專利6,002,471。激發光束由倍頻釹釔鋁石榴石(NdYAG)激光器產生，波長為532nm；或者由倍頻鈦藍寶石(Tisapphire)激光器產生，波長為365nm。可以使用脈沖激光束或連續激光束。激發光束經過共聚焦光學元件和顯微物鏡，聚焦在流動通路和/或流通池上。來自拉曼標記的構建物的拉曼發射光由顯微物鏡和共聚焦光學元件收集，然后耦合到單色儀上進行光譜分離。共聚焦光學元件用于降低背景信號，包括雙色濾片、阻擋濾光片、共聚焦孔、透鏡和平面鏡的組合。標準的全視場光學元件可以同共聚焦光學元件一起使用。拉曼發射信號由拉曼檢測器檢測，該檢測器包括與用于信號計數和數字化的計算機相連接的雪崩光電二極管。
拉曼檢測單元的另一個例子公開在美國專利5,306,403，其包括SpexModel 1403雙柵分光光度計，并配有砷化鎵光電倍增管(RCA Model C31034或Burle Industries Model C3103402)，它以單光子計數模式運作。激發源包括來自SpectraPhysics的514.5nm線氬離子激光器，Model 166和氪離子激光器(Innova 70，Coherent)的647.1nm線。
可選擇的激發源包括337nm的氮激光器(Laser Science Inc.)和325nm的氦-鎘激光器(Liconox)(美國專利6,174,677)、發光二極管、NdYLF激光器和/或各種離子激光器和/或染料激光器。激發光束可以用帶通濾波器(Corion)進行光譜純化，并可以用6×物鏡(Newport，Model L6X)聚焦到流動通路和/或流通池上。可以用物鏡來激發拉曼活性探針構建物和收集拉曼信號，其中使用全息光束分離器(Kaiser Optical Systems，Inc.，Model HB 647-26N18)，以產生激發光束和發射的拉曼信號的直角幾何關系。可以使用全息陷波濾波器(Kaiser OpticalSystems，Inc.)來減少瑞利散射輻射。可選擇的拉曼檢測器包括ISA HR-320攝譜儀，其配有紅增強放大電荷耦合器件(RE-ICCD)檢測系統(Princeton Instruments)。可以使用其他類型的檢測器，如傅立葉變換攝譜儀(基于Michaelson干涉儀)、電荷注入儀、光電二極管陣列、InGaAs檢測器、電子倍增CCD、增強CCD和/或光電晶體管陣列。
本領域已知的任何適當形式或構型的拉曼光譜術或相關技術都可以用來檢測本發明的拉曼活性探針構建物，包括但不限于常規拉曼散射、共振拉曼散射、表面增強拉曼散射、表面增強共振拉曼散射、相干反斯托克斯拉曼光譜術(CARS)、受激拉曼散射、反拉曼光譜術、受激增益拉曼光譜術、超拉曼散射、分子光學激光檢測器(MOLE)或拉曼顯微探針或拉曼顯微鏡或共聚焦拉曼微光譜測定法、三維或掃描拉曼、拉曼飽和光譜術、時間分辨共振拉曼、拉曼退耦光譜術或紫外-拉曼顯微術。
在本發明的某些方面，檢測本發明的拉曼活性探針構建物的系統可以包含信息處理系統。一個示例性的信息處理系統可以整合有計算機，其包括用于信息交流的總線和用于信息處理的處理器。在本發明的一個實施方案中，處理器選自Pentium系列處理器，包括但不限于Pentium II系列、Pentium III系列和Pentium 4系列處理器，它們可以從Intel Corp.(Santa Clara，Calif.)獲得。在本發明的可選實施方案中，處理器可以是Celeron、Itanium或Pentium Xeon處理器(Intel Corp.，Santa Clara，Calif.)。在本發明的各種其他實施方式中，處理器可以基于Intel結構，如Intel IA-32或Intel IA-64結構。作為選擇，可以使用其他處理器。信息處理和控制系統可以進一步包括本領域已知的任何外圍設備，例如存儲器、顯示器、鍵盤和/或其它設備。
在本發明的特定例子中，檢測單元可以在操作上連接到信息處理系統。來自檢測單元的數據可由處理器處理，然后數據儲存在存儲器中。關于各種拉曼標記或代碼的發射譜圖的數據也可儲存在存儲器中。處理器可以比較流動通路和/或流通池中拉曼活性探針構建物的發射光譜，以鑒定探針構建物中的拉曼活性部分。處理器可以分析來自檢測單元的數據，以確定例如本發明的拉曼活性探針構建物的探針結合的多肽的序列。信息處理系統也可以實施標準程序，諸如減去背景信號或比較由不同的樣品產生的信號。
雖然本發明的某些方法可在程控處理器的控制下進行，但在本發明的可選實施方式中，這些方法可以完全或部分地由任何可編程的或硬編碼的邏輯來實施，例如現場可編程門陣列(FPGAs)、TTL邏輯或專用集成電路(ASICs)。另外，可以通過程序控制的通用目的計算機組件和/或客戶硬件組件的任意組合來實施所公開的方法。
在數據采集操作之后，數據通常會被報告給數據分析操作。為了方便分析操作，由檢測單元獲得的數據通常是使用數字計算機來分析，如上所述的計算機。典型地，計算機被恰當地編程以接受和存儲由檢測單元獲得的數據，以及分析和報告收集到的數據。
在本發明的某些實施方式中，可以使用客戶定制軟件包來分析由檢測單元獲得的數據。在本發明的可選實施方式中，可以使用信息處理系統及公開可利用的軟件包，進行數據分析。
下面的實施例旨在舉例說明本發明而不是限制本發明。
實施例1
為了鑒定癌癥相關的生物標志物，收集患者樣品和對照樣品。為了增加篩選效率，將多個患者樣品匯集起來，使差異歸一化。將類似的程序應用于對照樣品。1000個單克隆抗體的庫(pool)被獲得，并被分為共200群的第一組(每一群具有5個成員)。5個抗體陣列被制備，每一陣列具有200個不連續的位置，這些位置被處理以固定抗體。然后同樣的1000個抗體以隨機的次序進行分群，以形成共40個亞組的第二組(每一亞組25個成員)，用于活性分子拉曼代碼的合成。使用總共40種拉曼代碼，將這40個亞組中的每一亞組的所有25個成員連接到相同的分子拉曼代碼，以完成活性分子拉曼代碼的合成。之后，基于抗體，25群40個成員為一群的活性分子拉曼代碼被形成，40個成員中的每一個具有不同拉曼代碼。
然后這25群活性分子拉曼代碼被用于檢測分析物，所述分析物已被捕獲并固定在第一結合中的不連續位置。在移除自由的拉曼代碼之后，被結合在陣列上的拉曼代碼被擴增，SERS掃描被用于收集抗體陣列的每一不連續位置(位點)內的所有信號點的拉曼特征。測定具有相同特征的信號點的數量。重復相同的程序，直到所有25個拉曼代碼群都被測試。最后，分析患者樣品和對照樣品之間的差異，以檢測患者樣品中的差異。這樣的檢測產生了癌癥標志物的初步候選者。
盡管本發明已經參考上述實施例而被描述，將被理解的是，對其所作的修飾和變化包含在本發明的精神和范圍之內。因此，本發明僅僅由權利要求書限定。
權利要求
1.固體凝膠基質，其包括固體凝膠和一個或多個SERS增強性納米顆粒，所述納米顆粒攜帶有連接著的探針，所述探針特異性地與分析物結合。
2.權利要求1的凝膠基質，其包括許多納米顆粒以提供許多獨特的光學特征。
3.權利要求2的凝膠基質，其中所述SERS增強性納米顆粒包括一個或多個拉曼活性標簽，所述標簽獨立地選自核酸、核苷酸、核苷酸類似物、堿基類似物、熒光染料、肽、氨基酸、修飾的氨基酸、有機部分、量子點、碳納米管、富勒烯、金屬納米顆粒、電子致密顆粒和晶體顆粒。
4.權利要求1的凝膠基質，其中至少一個納米顆粒具有凈電荷。
5.權利要求1的凝膠基質，其中所述納米顆粒每一個提供獨特的SERS信號，所述信號與所述納米顆粒的探針的結合特異性關聯。
6.權利要求1的凝膠基質，其中所述拉曼活性標簽包括腺嘌呤或其類似物。
7.權利要求1的凝膠基質，其中所述納米顆粒是復合有機-無機納米顆粒(COIN)，其包括核心和表面，其中所述核心包括金屬膠體，所述金屬膠體包括第一金屬和拉曼活性有機化合物。
8.權利要求7的凝膠基質，其中所述COIN還包括不同于所述第一金屬的第二金屬，其形成覆蓋于所述納米顆粒的表面的層。
9.權利要求8的凝膠基質，其中所述COIN還包括覆蓋金屬層的有機層，該有機層包括探針。
10.權利要求1的凝膠基質，其中所述探針選自抗體、抗原、多核苷酸、寡核苷酸、受體和配體。
11.權利要求10的凝膠基質，其中所述探針包括多核苷酸。
12.權利要求1的凝膠基質，其中至少一些納米顆粒還包括產生光學特征的熒光標記。
13.產生凝膠基質的方法，該方法包括a)通過將下列物質混合在一起形成液體組合物形成凝膠的液體，其包括處于合適的液體中的形成凝膠的顆粒；和許多拉曼增強納米顆粒，其具有許多獨特的光學特征，和連接的用于結合分析物的探針；和b)由所述液體組合物獲得固體凝膠基質。
14.權利要求13的方法，其中所述凝膠基質包括許多SERS增強納米顆粒，每一顆粒具有連接的探針，所述探針與已知的分析物特異性結合，以形成復合體。
15.權利要求14的方法，其中所述SERS增強納米顆粒是COIN。
16.檢測樣品中的分析物的方法，包括將含有分析物的樣品與權利要求1的凝膠基質在允許所述探針與所述分析物結合以形成復合體的條件下接觸；通過電泳或磁泳將所述復合體與其他的樣品內含物分離開；和檢測由在凝膠內的不同位置處分離的復合體發出的SERS信號，其中由特定復合體發出的SERS信號與特定分析物的存在建立關聯。
17.權利要求16的方法，其中所述凝膠基質包括兩個或更多個所述復合體，由所述兩個或更多個復合體產生的信號表明存在兩個或更多個不同的分析物。
18.權利要求16的方法，其中來自特定復合體的SERS信號提供了關于分析物的化學結構的信息。
19.權利要求18的方法，其中所述凝膠基質是聚丙烯酰胺凝膠，所述分析物選自抗原、多肽、蛋白質、糖蛋白、脂蛋白和它們的組合。
20.權利要求16的方法，其中至少兩個所述納米顆粒是含有金屬的SERS增強納米顆粒，其具有不同的凈電荷。
21.權利要求20的方法，其中所述SERS增強納米顆粒是COIN。
22.權利要求16的方法，其中所述分析物被包含在生物學樣品中。
23.權利要求16的方法，其中所述建立關聯包括測定由探針結合分析物而引起的遷移率變化。
24.權利要求16的方法，其中所述分離包括電泳。
25.權利要求16的方法，其中所述方法還包括在檢測之前或之后，對所述分析物進行層析或等電聚焦。
26.權利要求24的方法，其中所述電泳是在非變性條件下進行的一維或二維電泳。
27.權利要求16的方法，其中所述方法還包括在檢測之前將所述凝膠浸在化學增強物溶液中，并將所述凝膠干燥以濃縮所述樣品。
28.權利要求16的方法，其中所述樣品包括一種或多種具有基本上相同尺寸和/或相同電荷密度的額外的分析物，并且所述方法包括基于復合體在凝膠中改變的遷移率，將光學信號與所述至少一種分析物的身份關聯起來，所述改變的遷移率是與所述樣品中具有基本上相同尺寸和/或相同電荷密度的額外的分析物的遷移率相比較而言的。
29.權利要求28的方法，其中所述信號是SERS光譜，并將所述光譜與含有許多分析物的SERS光譜的SERS數據庫比較，以鑒定結合的分析物。
30.權利要求29的方法，其中將樣品中的一種或多種分析物的SERS光譜與SERS光譜的集合進行比較，以測定差異，其中所述差異與已知的生物學表型或疾病相關。
31.權利要求16的方法，其中所述樣品是體液。
32.權利要求31的方法，其中所述樣品是血清。
33.檢測樣品中分析物的系統，包括權利要求1的凝膠基質；含有至少一種分析物的樣品；和適合于檢測來自納米顆粒的SERS信號的光學檢測系統。
34.權利要求33的系統，還包括計算機，該計算機包括用于分析由所述樣品獲得的SERS信號的算法。
35.對樣品中的目標分子進行多重檢測的方法，所述方法包括將樣品中的目標分子在適合于允許樣品中的分析物形成復合體的條件下與一組探針構建物接觸，每一構建物包括與光學活性核酸條碼結合的非核酸探針，所述條碼包括至少一個SERS活性核苷酸，并在電泳中具有獨特的遷移率和獨特的光學特征；通過電泳分離所述復合體；用合適的檢測裝置，以多重的方式檢測獨特的光學特征；和將來自所述構建物的各光學特征與樣品中相應的分析物的身份關聯起來。
36.權利要求35的方法，其中所述獨特的遷移率是因所述組中的構建物在所述條碼中具有變化數量的核苷酸而產生。
37.權利要求35的方法，其中至少一些構建物具有凈電荷。
38.權利要求35的方法，還包括通過電泳將自由的目標和/或自由的未結合的探針構建物與所述復合體分離開。
39.權利要求35的方法，其中所述非核酸探針是抗體，其特異性地與含有已知蛋白質的目標結合。
40.權利要求35的方法，其中所述分離的復合體通過光學技術檢測，所述光學技術選自吸收、反射、偏振、折射、熒光、拉曼光譜、SERS、共振光散射、光柵耦合表面等離子體共振和它們的組合。
41.制備一組用于檢測非拉曼活性分析物的活性拉曼分子代碼的方法，所述方法包括獲得一組分子主架，每一分子主架包括有機聚合物，所述有機聚合物沿該主架含有兩個或更多個化學反應活性位置；在所述化學反應活性位置，將至少一個小分子拉曼活性標簽連接到所述組中的每一主架，其中，將在所述組的成員的主架上的拉曼活性標簽的類型、數量和相對位置進行不同的組合，從而使所述組的每一成員產生獨特的拉曼信號；和將活性基團與所述組中的所述主架連接，其中每一活性基團與已知的分析物特異性結合。
42.權利要求41的方法，其中所述分子主架包括天然存在的或合成的多糖、蛋白質、氨基酸或它們的組合。
43.權利要求42的方法，其中所述主架是單鏈或雙鏈多核苷酸片段，其包括至少一個已被修飾以用于化學連接拉曼活性標簽的殘基。
44.權利要求43的方法，其中所述修飾的殘基是2-氨基嘌呤。
45.權利要求43的方法，其中所述主架通過標準亞磷酰胺化學術合成。
46.權利要求41的方法，其中所述拉曼活性標簽選自染料或天然存在的拉曼活性氨基酸或核酸。
47.權利要求的41方法，其中所述拉曼活性標簽是一系列連續的核酸，并且通過標準亞磷酰胺化學術將標簽合成在主架上，所述標簽被線性地連接到聚合物主架上。
48.權利要求45的方法，其中所述主架包括2至1000個核苷酸。
49.權利要求41的方法，其中所述組中的成員具有共同的主架。
50.權利要求49的方法，其中所述拉曼活性標簽選自拉曼活性染料、氨基酸、核苷酸或它們的組合。
51.權利要求50的方法，其中所述拉曼活性氨基酸選自精氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸和它們的組合。
52.權利要求50的方法，其中所述拉曼活性核苷酸選自腺嘌呤、鳥嘌呤和它們的衍生物。
53.權利要求41的方法，其中所述組的至少一個成員還包括結合到拉曼活性標簽或拉曼活性主架上的增強物部分，以增加所述獨特的拉曼信號的強度。
54.權利要求41的方法，其中所述拉曼活性標簽是多聚G，所述增強物是胺基團或AmC6。
55.權利要求41的方法，其中所述活性基團是反應活性功能基團，選自acryditeTM、胺和硫醇基團。
56.權利要求41的方法，其中所述活性基團與已知的目標特異性結合，且選自抗體、受體、凝集素或噬菌體展示肽。
57.權利要求41的方法，其中所述生物學分析物是含蛋白質的分析物。
58.權利要求57的方法，其中所述含蛋白質的分析物選自抗原、肽、多肽、蛋白質和含有含蛋白質分析物的復合物。
59.權利要求41的方法，其中所述主架是多核苷酸，所述標簽是拉曼活性核苷酸，并且所述方法還包括通過標準亞磷酰胺化學術，將所述標簽線性地連接到主架上。
60.區分樣品中的生物學分析物的方法，所述方法包括將包含許多生物學分析物的樣品與一組活性拉曼分子代碼接觸，所述接觸在適合于允許其中的探針與所述樣品中存在的分析物特異性結合以形成復合體的條件下進行；分離結合的復合體；檢測所述結合的復合體中的所述活性拉曼分子代碼發出的拉曼信號，其中所述拉曼信號表示所述樣品中存在已知的生物學分析物。
61.權利要求60的方法，其中期望的生物學分析物是許多不同的含蛋白質的分析物，所述組中的探針是抗體，其中每一抗體與不同的已知生物學分析物特異性結合。
62.權利要求60的方法，其中，收集所述拉曼信號以提供樣品的蛋白質譜型。
63.分析生物學樣品的方法，包括在固體支持物上分離樣品中的分析物；將分離的分析物與權利要求41的初級組的活性拉曼分子代碼接觸，以便允許活性拉曼分子代碼與樣品中的一個或多個含蛋白質的分析物特異性結合以形成復合體；將所述復合體與次級拉曼代碼復合體接觸，以便擴增由所述復合體中的所述活性拉曼分子代碼產生的拉曼信號；檢測由所述次級拉曼代碼產生的放大的拉曼信號；和將檢測到的放大的拉曼信號與分析物在所述樣品的存在關聯起來，所述活性拉曼分子代碼中的活性試劑與所述分析物特異性結合。
64.權利要求63的方法，還包括收集來自分離的復合體的放大的拉曼光譜，以構成所述樣品的蛋白質譜型。
65.權利要求63的方法，其中所述與次級拉曼復合體的接觸，涉及所述組的活性拉曼分子代碼中的結合的成員與次級拉曼代碼中的多核苷酸或寡核苷酸之間的化學結合，以放大所述拉曼信號。
66.權利要求65的方法，其中所述組的活性拉曼分子代碼中的成員包括拉曼活性寡核苷酸主架，所述次級拉曼復合體包括與所述主架雜交的互補寡核苷酸，其中所述方法還包括擴增所述拉曼活性寡核苷酸主架。
67.權利要求66的方法，其中所述雜交伴隨以所述雜交的互補寡核苷酸的連接，從而形成放大所述拉曼信號的線性或分支的拉曼活性復合體。
68.權利要求65的方法，其中所述組的活性拉曼分子代碼中的結合的成員包括在其3′端具有自由羥基的拉曼活性多核苷酸主架，并且所述方法還包括將結合的復合體在末端轉移酶存在下暴露于dNTP，以形成長度為上百個核苷酸的單鏈拉曼活性分子，其放大所述主架的拉曼信號。
69.權利要求65的方法，其中所述組的活性拉曼分子代碼中的結合的成員包括帶有線性拉曼活性核酸標簽以及在其3′端具有自由羥基的多核苷酸主架，并且所述方法還包括將結合的復合體在末端轉移酶存在下暴露于dNTP，以形成長度為上百個核苷酸的單鏈拉曼活性分子，其放大所述主架的拉曼信號。
70.權利要求68的方法，其中所述方法包括改變用于擴增各種結合的復合體的單鏈拉曼活性分子的dNTP，以進一步改變放大的拉曼信號。
71.權利要求69或70的方法，其中所述擴增技術是滾環擴增。
72.權利要求65的方法，其中所述次級拉曼復合體包括連接到金屬納米顆粒的互補多核苷酸，所述互補多核苷酸與所述多核苷酸雜交，其中所述放大的拉曼信號是SERS信號。
73.權利要求72的方法，其中所述金屬納米顆粒選自銀、金、銅和鋁。
74.權利要求65的方法，其中所述次級拉曼復合體包括具有連接的拉曼活性標簽的互補多核苷酸，并且所述方法還包括由所述次級拉曼復合體產生樹枝狀大分子，以及將所述樹枝狀大分子與所述多核苷酸主架雜交，以放大拉曼信號。
75.權利要求63的方法，其中所述生物學樣品包括體液。
76.權利要求75的方法，還包括收集來自放大的拉曼信號的放大的拉曼光譜，以獲得所述生物學樣品的蛋白質譜型。
77.測定分析物庫中的分析物的存在的方法，該方法包括a)將分析物庫與附著到固體支持物上的不連續位點的第一組探針接觸，以在所述不連續位點形成探針/分析物復合體；b)將所述探針/分析物復合體與多個另外組活性拉曼分子代碼接觸，其中所述另外組中的每一組利用所述第一組的探針的亞組作為活性試劑，以形成含拉曼代碼的復合體；c)將結合的含拉曼代碼的復合體在原位與金屬離子接觸，以用金屬薄層覆蓋所述含拉曼代碼的復合體；d)檢測SERS信號，所述SERS信號通過用光源同時照射在所述固體支持物的不連續位點的結合的含拉曼代碼的復合體而產生，和e)將一個或多個SERS光譜與所述樣品中特定分析物的存在關聯起來。
78.權利要求77的方法，其中所述金屬層通過使金屬陽離子的膠體溶液經受還原條件以在原位形成含有結合的復合體的金屬納米顆粒而形成。
79.權利要求77的方法，還包括在c)之前，擴增在所述固體支持物上的結合的含拉曼代碼的復合體中的多核苷酸主架。
80.權利要求78的方法，其中所述擴增是PCR3或滾環擴增。
81.權利要求77的方法，其中所述關聯包括對所述不連續位點中的每一信號點產生的SERS信號計數，以測定具有同樣的特征的信號點的數量。
82.權利要求81的方法，其中所述關聯還包括進行多重分析，以根據拉曼代碼設計對SERS光譜分類。
83.權利要求77的方法，其中結合物選自抗體、噬菌體展示肽、受體、核酸、配體、凝集素和其組合。
84.權利要求77的方法，其中所述分析物選自蛋白質、糖蛋白、脂蛋白、核酸、病毒顆粒、多糖、類固醇和其組合。
85.權利要求77的方法，其中所述分析物庫包括已知或懷疑患有疾病的患者的體液的樣品。
86.權利要求85的方法，其中，所述方法被重復進行，例外的是，分析物庫包括正常的對照患者的相應樣品，并且該方法還包括將獲自患者分析物的SERS光譜與獲自正常對照患者分析物的SERS光譜進行比較，以鑒定差異，其中所述差異表明在已知或懷疑患有所述疾病的患者的樣品中疾病標志物的存在。
87.權利要求77的方法，其中所述第一組的探針被隨機分開，以獲得所述多個另外組中的活性試劑，其中在單個另外組中的每一拉曼代碼對于該單個另外組的成員是獨特的，且所述另外組的每一組含有相同組的拉曼代碼。
88.分析生物學樣品中的蛋白質內含物的方法，所述方法包括a)獲得一組活性分子拉曼代碼，其含有作為活性試劑的功能基團；b)將樣品與該組拉曼活性分子代碼接觸，以便允許所述組中的成員與樣品中含蛋白質的分析物中的蛋白質功能基團化學連接，以形成代碼/蛋白質復合體；c)分離所述代碼/蛋白質復合體；d)檢測由分離的代碼/蛋白質復合體產生的SERS信號；和e)將所述SERS信號與所述樣品中特定的含蛋白質的分析物關聯起來。
89.權利要求88的方法，其中所述組是由三種拉曼活性分子代碼組成的組，所述組的每一成員具有選自氨基基團、羧基基團和硫醇基團的三種活性基團中的一種，并且具有提供對于所述組獨特的拉曼特征的寡核苷酸主架。
90.權利要求89的方法，其中所述組的每一成員包括選自多聚dA、多聚dG和多聚AG的三種拉曼活性分子代碼中的一種。
91.權利要求88的方法，其中所述方法還包括在b)之前將所述樣品分為子樣品，對每一子樣品重復b)、c)和d)，并在e)之前，對所有所述子樣品中的每一信號點的拉曼信號進行計數。
92.權利要求88的方法，其中在與活性分子拉曼代碼接觸之前，將所述樣品消化。
93.權利要求92的方法，還包括使用獲自拉曼光譜的信息來編輯所述樣品的蛋白質譜型。
全文摘要
提供了使用拉曼活性或SERS活性探針構建物檢測生物學樣品中的分析物諸如體液中含蛋白質的分析物的各種方法。拉曼活性構建物中的探針部分被選擇，以結合和鑒定生物學樣品中特定的已知分析物，或者探針部分被設計成可以與在某些氨基酸中常見的功能基團發生化學相互作用，以便本發明方法提供關于樣品中含蛋白質的分析物或片段的氨基酸組成的信息。在一些情況中，當被用于本發明方法時，拉曼活性或SERS活性探針構建物可以鑒定特定的含蛋白質的分析物或特定類型的此類分析物，以便可以獲得患者樣品的蛋白質譜型。當與正常樣品的拉曼或SERS光譜的數據庫比較時，使用所公開的方法可以鑒定患者的疾病狀態。
文檔編號G01J3/44GK1938430SQ200480041168
公開日2007年3月28日 申請日期2004年12月28日 優先權日2003年12月30日
發明者A·伯林, X·蘇, S·陳, T-W·丘, L·孫 申請人:英特爾公司