不對稱支化的聚合物綴合物和微陣列檢測的制作方法

專利名稱：不對稱支化的聚合物綴合物和微陣列檢測的制作方法
技術領域：
本發明涉及在復合材料，例如綴合物，以及其它材料，特別是具有生物活性和目標識別能力的那些中使用不對稱支化的聚合物，所述綴合物可以用于與在農業、環境研究、診斷學、藥物監測、藥物目標篩選、先導化合物優化和治療學中的應用相關的檢測應用中。
背景技術：
不對稱支化的聚合物 近年來，開發了稱為樹枝形聚合物(dendritic polymer)的一類新聚合物，其包括星爆樹形分子(starburst dendrimer)(或致密星形聚合物)和梳爆樹形接枝分子(combburst dendrigrafts)(或超梳形支化聚合物)兩者，并在工業和學術實驗室中得到廣泛研究(Dendritic Molecules，edited by GR Newkome et al.，VCH，Weinheim，1996，和Dendrimers and Other Dendritic Polymers，editedby JMJ Frechet and DA Tomalia，John Wiley&Sons，Ltd.，2001)。這些聚合物通常展示出如下特點(a)良好限定的中心核分子，(b)帶有對稱(等同)支鏈結合點的至少兩個同心的樹枝形層(代)，和(c)外部表面基團，如同在Tomalia的美國專利4435548；4507466；4568737；4587329；5338532；5527524；和5714166中以及專利的參考文獻中所描述的那樣。
這些對稱支化的樹形分子也明顯不同于先前制備的不對稱支化的樹形分子(Denkewalter的美國專利4289872；4360646；和4410688)。后者具有不對稱(不等同)的支鏈結合點(junctures)。
兩種類型的樹形分子(dendrimers)都可以經由發散或收斂合成路徑通過重復保護和去保護過程制備。由于對稱和不對稱樹形分子都使用小分子作為核心和支鏈的分子構建單元，所以這些樹形分子的分子量通常可以精確限定。在低代數的情況下，通常得到單分子量樹形分子。
與樹形分子類似，梳爆樹形接枝分子也通過逐步合成方法由中心核分子和具有對稱支鏈的同心層構建。與樹形分子相反，梳爆樹形接枝分子或聚合物是用單分散線形聚合物構建單元制造的(Tomalia的美國專利5773527和Yin的美國專利5631329和5919442)。此外，支化方式也十分不同于樹形分子的支化方式。例如，梳爆樹形接枝分子沿著聚合物骨架形成支鏈結合點(鏈支化)，而星爆樹形分子通常在末端支化(末端支化)。由于活性聚合技術的使用，這些聚合物構建單元(中心核和支鏈)的分子量分布(Mw/Mn)通常非常窄。結果，通過接枝-接枝(graft-upon-graft)方法制備的梳爆樹形接枝分子在分子量分布方面(Mw/Mn)控制的相當好，通常小于1.2。
雖然具有控制良好的分子結構，例如良好限定的尺寸、形狀和表面官能團，但是樹形分子和樹形接枝分子(dendrigrafts)都只能通過大量的重復步驟制備，這使得它們只能用于小范圍的學術研究，不能用于大規模的商業應用。
樹形分子和樹形接枝分子已經顯示出對于生物活性分子具有獨特的載體性能，如在Tomalia的關于致密星形聚合物的美國專利5338532、5527524和5714166以及Yin的關于超梳形支化聚合物的美國專利5919442中所描述的那樣。這些獨特的性能(即表面官能團和內部空隙空間)主要歸因于具有可預測支化方式(對稱末端或聚合物鏈支化)的良好控制的、對稱的樹枝形結構和分子量。
根據這些教導，無規和有規不對稱支化的聚合物(無規-ABP和有規-ABP)長期以來被認為是差的載體材料。例如，無規-ABP具有a)無中心核，b)官能團在外部和內部都存在，c)變化的支鏈長度和方式(即末端和鏈支鏈)，和d)分布不均勻的內部空隙空間。雖然有規-ABP具有中心核，但是官能團卻在外部和內部都存在。因此，無規-ABP和有規-ABP通常都被認為不適合于運載生物活性分子。
已經對由聚賴氨酸制備的有規-ABP的制備進行了描述，如在美國專利4289872、4360646和4410688中所說明的。
已經對例如由聚乙烯亞胺(PEI)制備的無規-ABP的合成和機理進行了的大量研究(參見GD Jones et al.，J.Org.Chem.9，125(1944)，GD Jones et al.，J.Org.Chem.30，1994(1965)，和CR Dicket al.，J.Macromol.Sci.Chem.，A4(6)，1301-1314，(1970))。
Litt(J.Macromol.Sci.Chem.A9(5)，pp.703-727(1975))和Warakomski(J.Polym.Sci.Polym.Chem.28，3551(1990))已經對例如由聚唑啉即聚(2-甲基唑啉)和/或聚(2-乙基唑啉)制備的無規不對稱支化的聚合物的合成和表征進行了大量研究。
大多數現有技術都涉及利用聚乙烯亞胺聚合物作為涂覆材料來改變固體表面的特性(即改變電荷、電荷密度和疏水性)。聚乙烯亞胺聚合物的涂覆方面描述于J Ness的美國專利6150103和KMoynihan的美國專利6365349中。聚乙烯亞胺也已經被測試以運載DNA分子用于基因轉染研究。但是，發現該聚合物是細胞毒性的。
也已經使用無規支化的聚(2-乙基唑啉)來物理地包裹蛋白質分子(美國專利6716450)。但是，這樣的路徑并不是設計用于直接共價連接ABP與生物活性材料以用于生物檢測和藥物遞送應用。
目前為止，沒有現有技術利用改性的無規-ABP和有規-ABP來運載生物活性材料以用于藥物遞送和目標識別目的，特別是用于與檢測和微陣列相關的應用，其中從溶液輸送、錨定和定向生物活性材料全部在同一時間進行。
檢測和微陣列
自從完成人類基因組工程以后，越來越多的研究者已經認識到在蛋白質水平闡明生物路徑和機理實際上遠比在基因水平上重要。這是因為前者與不同疾病和疾病階段的聯系更密切。在這種強烈需求推動下，對于工業和理論研究者來說，稱為蛋白質組學的新的論壇最近已經成為主要的研究焦點。
目前，在蛋白質組學研究領域中使用三種主要的研究工具，主要用于發現、高處理量篩選和確認新蛋白質目標和藥物先導化合物。這些工具包括二維(2-D)凝膠電泳、質譜和最近出現的蛋白質微陣列。與冗長的2-D凝膠方法和質譜分析中乏味的樣品制備(主要是分離)不同，蛋白質微陣列提供了篩選大量蛋白質以及它們的功能的快速、簡單和低成本的方法。因此，蛋白質組學研究者是高度希望使用微陣列的。
然而，基于蛋白質的微陣列技術的發展遠落后于基因微陣列的發展。蛋白質/抗體芯片的構建帶來了在經典免疫陣列或DNA芯片的發展中沒有遇到過的艱難挑戰。概括來說，與核酸相比蛋白質對于它們的環境更加敏感。很多膜、玻璃和塑料表面的疏水性可以導致蛋白質變性，造成捕獲分子失活和導致低靈敏度和高噪信比。換句話說，為了構建蛋白質微陣列，必須能夠克服至少三個主要問題，蛋白質變性、固定和定向。
例如，在溶液中蛋白質分子通常折疊成三維結構為了以及以便保持生物活性。在與不同固體表面相互作用時，例如在將蛋白質固定到膜、載玻片或微米/納米顆粒上期間，蛋白質分子的三維結構通常會坍塌，從而喪失生物活性。此外，蛋白質通常不具有粘附到不同表面上的能力。
為了將蛋白質分子固定到表面上，通常必須使用直接共價連接反應或靜電相互作用(物理吸附)。多相化學反應通常是不完全的，產生不希望的副產物(即未完全改性的表面)，并且在一些情況下，在不同的反應階段期間還產生部分變性的蛋白質。
靜電相互作用極大的依賴于蛋白質的等電點以及緩沖溶液的pH。
由于在這些過程中所涉及的復雜性，兩種方法都傾向于產生不能重現的結果。因此，批對批的重現性非常差。結果，非常希望改性固體基質，而不是蛋白質本身。各種聚合物，包括聚乙烯亞胺聚合物，已經被用作涂覆材料來改變用于構建蛋白質陣列的固體表面的特性，如P Wagner等人在美國專利6406921中所描述的那樣。
目前為止，沒有現有技術利用改性無規和有規不對稱支化的聚合物作為生物活性材料的載體，特別是用于檢測和微陣列的構建。
發明概述
一個方面，本發明涉及聚合物綴合物材料，該綴合物材料包括與期望的材料結合的不對稱支化的聚合物(ABP)(此后稱為ABP綴合物)，制備這些聚合物和綴合物的方法，含有所述綴合物的組合物，和使用這些綴合物和組合物的方法。
本發明還包括與多個單元的被運載材料(各自具有不同性能和活性)結合的不對稱支化的聚合物。這些綴合物可以與可接受的載體、稀釋劑和添加劑配制在一起以用于例如生物檢測、診斷學、農業和藥品中。
所述不對稱支化的聚合物綴合物適合用于各種其中希望進行生物材料的特定遞送的應用中。在本發明的一個優選實施方案中，所述無規不對稱支化的聚合物綴合物由與一種或多種生物活性材料結合的一種或多種不對稱支化的聚合物組成。
在本發明的另一個方面，所述不對稱支化的聚合物具有無規或有規的不對稱的支鏈結合點以及混合的末端和鏈支化方式。
在本發明的另一個方面，所述不對稱支化的聚合物在外部和內部都具有官能團。
在本發明的另一個方面，所述不對稱支化的聚合物具有分布不均勻的空隙空間。
在本發明的另一個方面，所述不對稱支化的聚合物在給定時間用至少一種能夠形成額外支鏈的單體進行改性，從而能夠得到新的材料性質，其中所述經改性的聚合物定義為經改性的不對稱支化聚合物。
所述經改性的不對稱支化的聚合物可以通過在有規不對稱支化的聚賴氨酸上的化學連接官能團或者通過在無規不對稱支化的聚乙烯亞胺(可從Aldrich，Polysciences或者以商品名LuposalTM從BASF商購)上的化學連接官能團得到。
可以根據M Litt(J.Macromol.Sci.Chem.A9(5)，pp.703-727(1975))描述的方法制備所述無規不對稱支化的聚唑啉聚合物。
在本發明的另一個方面，所述不對稱支化的聚合物進一步用官能團改性，所述官能團例如但不限于-NH2、-NHR、-NR2、-NR3+、-COOR、-COOH、-COO-、-OH、-C(O)R、-C(O)NH2、-C(O)NHR或-C(O)NR2基團，脂族基團(其可以是支鏈的，含有一個或多個雙鍵和/或三鍵和/或可以是被取代的)，芳族基團(其可以含有多個環，其可以是稠合的或分開的，所述環可以具有各種尺寸和/或可以含有取代基)，全氟碳鏈，糖類(其可以具有不同的環尺寸，所述環可以含有雜原子例如硫或氮原子，和/或可以是被取代的)，多糖(含有兩個或多個單體，可以是支鏈的和/或可以是被取代的)，和聚乙二醇，其中R可以是本文定義的任何脂族或芳香族基團，或它們的組合。
這些未改性的和改性的不對稱支化的聚合物的分子量可以是約500-超過5000000；優選約500-約1000000；更優選約1000-約500000；和最優選約2000-約100000。
本發明的優選綴合物包括其中不對稱支化的聚合物綴合物包含與至少一種生物活性(生物活性)材料的至少一個單元結合的至少一個未改性的和/或改性的不對稱支化的聚合物的那些。生物活性材料的一些例子是白細胞介素、干擾素、T-輔助細胞CD4分子、Fc受體、乙酰膽堿受體(AChR)、用于抗原的T細胞受體、胰島素受體、腫瘤壞死因子、粒細胞集落刺激因子、激素受體、抗體、抗體片斷、IgG分子、結合抗原的Fab和其它抗體衍生物、重組蛋白質、多肽、噬菌體、噬菌體片段、DNA片段、RNA片段、激素，例如胰島素和hCG、酶、唾液酸、卟啉、核苷酸、病毒、病毒片段等。
本發明還涉及包含包裹至少一種生物活性分子的多種感興趣聚合物的組合物。單獨一種感興趣的聚合物或者多種聚合物可以用于形成包裹層。
在本發明的一個方面，所述未改性的和/或改性的不對稱支化的聚合物-生物活性材料綴合物可以用于例如感興趣目標分子的快速檢測例如環境污染物、化學和生物戰爭試劑，用于篩選藥物目標和先導化合物以及用于治療藥物和治療效果監測。
在本發明的另一個方面，所述未改性的和/或改性的不對稱支化的聚合物-生物活性材料綴合物可以用于例如不同癌癥、腫瘤、病理狀態和疾病的快速診斷，以及用于在臨床試驗和治療處理期間監控生物標記物變化和蛋白質曲線。
在本發明的另一個方面，所述未改性的和/或改性的不對稱支化的聚合物-生物活性材料綴合物可以用于例如構建直接夾層(directsandwich)、間接夾層(indirect sandwich)、順序和競爭生物檢測。
在本發明的另一個方面中，至少一種未改性的和/或改性的不對稱支化的聚合物可以用于運載至少一種蛋白質分子到各種固體表面，幾乎不產生所述至少一種蛋白質分子的變性。這些表面可以包括硝化纖維素、紙、其它膜、玻璃、金屬、塑料等，可以以各種形式呈現，例如平坦表面，例如片材、條帶等，球，例如顆粒和珠子，以及其它形式，并且可以用于例如基于空間排列的平板微陣列的形成，用于珠，微米或納米陣列和檢測的制造。所述珠微米/納米陣列可以通過在相同微米/納米顆粒上連接多種蛋白質構建，或者簡單地通過混合多種珠子構建，其中每種珠子帶有一種特定種類的蛋白質分子。除了探測以外，所述珠微米/納米陣列也可以用于在用蛋白質平板微陣列、2D凝膠或質譜儀分析之前，快速、大規模、高處理量的分離生物活性材料。這種蛋白質陣列對于蛋白質目標的發現、確認、藥物先導化合物篩選以及在治療處理期間監控生物標記物和蛋白質曲線是理想的工具。
所述不對稱支化的聚合物綴合物可以進一步用于與農業、食品安全保證以及體外和體內診斷學、治療劑遞送和靶定相關的應用中。因此，所述聚合物綴合物可以用作藥物遞送工具，其可以提供彈丸劑遞送、延遲釋放、定時釋放、腸溶衣以及具有期望特性的各種其它藥理學制劑。這些綴合物也可以用作各種傳感器平臺中的關鍵傳感部件，包括但不限于光、電、壓電裝置，以及微流體和微米機電系統(MEMS)和納米機電系統(NEMS)。
附圖簡述
下列附圖和相應圖表的描述是說明例證本發明的各種實施方案的非限定性實例。


圖1描述具有不對稱支鏈結合點和方式的無規(A)和有規(B)不對稱支化的聚合物。
圖2描述無規不對稱支化的聚乙烯亞胺聚合物的化學結構。
圖3描述無規不對稱支化的聚乙烯亞胺聚合物的化學改性反應。
圖4描述用不對稱支化的聚合物構建的蛋白質微陣列用于同時探測和定量多種抗原。
圖5描述基于橫向流動的免疫檢測構造。圖5A。沒有塑料蓋的免疫檢測條的構造(a)吸附劑墊，(b)綴合物釋放墊，(c)膜，(d)含有捕獲抗體的區域，(e)含有對照抗體的區域，和(f)接收墊。圖5B。在橫向流動檢測格式中在加入樣品溶液時陽性和陰性免疫檢測條的示意。所述纖維素試紙檢測以類似的方式工作。(S)樣品池，(T)測試線和(C)對照線。
圖6描述用于檢測蓖麻毒蛋白類毒素的基于改性無規不對稱支化的PEI聚合物-抗體的檢測與基于抗體的橫向流動測試的檢測性能的對比。
圖7描述采用以及不采用無規不對稱支化聚合物構建的間接檢測的對比。使用基于ABP的檢測得到高得多的靈敏度。
發明詳述
具有不對稱支鏈的不對稱支化的聚合物描述于圖1中，其中一些感興趣的聚合物不具有中心核并且在整個聚合物中展示出由鏈支鏈和末端支鏈二者組成的不對稱支鏈結合點。官能團既存在于外部，也存在于內部。
這樣的聚合物展示出一些獨特的優點。首先，可以使用多種已知起始材料。這樣的單體和聚合物是低成本的并且非常容易大量制造。例如可以用于合成感興趣的聚合物的此類前體聚合物中的一種是聚乙烯亞胺(PEI)。無規不對稱支化的聚乙烯亞胺的合成早在60多年前就已被發現(GD Jones et al.，J.Org.Chem.9，125(1944))，并且這些前體聚合物的合成方法已經建立。具有不同分子量的聚乙烯亞胺可從不同來源例如Aldrich，Polysciences和BASF(以商品名LuposalTM)商購。所述無規不對稱支化的聚乙烯亞胺主要通過具有環張力的環狀亞胺單體的陽離子開環聚合制備，所述單體例如氮丙啶(亞乙基亞胺)和氮雜環丁烷(亞丙基亞胺)，使用Lewis或Bronsted酸作為引發劑。(OC Dermer et al.，“Ethylenediamine and OtherAziridines”，Academic Press，New York，(1969)，和AS Pell，J.Chem.Soc.71(1959))。由于這是一鍋法，所以可以容易地制造大量無規不對稱支化的聚合物。(圖2)。
所述無規支化的聚(2-取代的唑啉)聚合物可以根據MLitt(J.Macromol.Sci.Chem.A9(5)，pp.703-727(1975))描述的方法制備。
其次，現有技術合成方法通常在大分子內產生各種支鏈結合點。換句話說，末端和鏈支鏈結合點混合分布于整個分子結構中。與樹形分子和樹形接枝分子相比較，這些無規不對稱支化的聚合物的支化密度較低，并且分子結構更加開放。雖然支化方式是無規的，但是伯胺、仲胺和叔胺基團的平均比例是相對一致的，比例為約1∶2∶1，如CR Dick et al.，J.Macromol.Sci.Chem.，A4(6)，1301-1314(1970)和GM Lukovkin，Eur.Polym.J.9，559(1973)所述。
由于這些支鏈結合點的存在，所述無規不對稱支化的聚乙烯亞胺仍舊被認為是球形大分子。在球狀結構內，在所述大分子的內部，存在各種尺寸的由不完美的支鏈結合點形成的口袋(pocket)。不同于其中內部口袋總是位于分子的中心核周圍的樹形分子和樹形接枝分子，無規不對稱支化的聚合物的口袋不均勻的分布在整個分子中。結果，無規不對稱支化的聚合物具有外部官能團和不均勻分布的內部官能團，所述官能團可以進一步與各種分子反應，從而形成新的大分子結構，定義為改性的無規不對稱支化的聚合物(圖3)。
雖然具有中心核，但是所述有規不對稱支化的聚合物的官能團也分布在外部和內部，這與無規ABP非常相似。同樣，多種前體聚合物可以用于構建這類感興趣的聚合物。這類前體聚合物的一種是聚賴氨酸。制造此類聚合物的最佳例子是有規不對稱支化的聚賴氨酸聚合物，如美國專利4289872、4360646和4410688所述。結果，這類聚合物也可以以和無規ABP類似的方式進行改性。
在本發明的一個實施方式中，所述不對稱支化的聚合物(例如，無規不對稱支化的聚乙烯亞胺(PEI)或有規不對稱支化的聚賴氨酸)用不同種類的伯胺基團通過例如Michael加成或丙烯酸酯向聚合物的胺的加成進行改性。因此，例如，通過Michael加成反應，可以將丙烯酸甲酯引入到聚乙烯亞胺和聚賴氨酸聚合物的伯和/或仲氨基上。然后所述酯基團可以進一步衍生化，例如通過酰胺化反應。因此，例如，與例如乙二胺的酰胺化反應可以產生在新形成支鏈末端的氨基的加成。對所述聚合物的其它改性可以使用已知的化學知識進行，例如如在Handbook of Polymer Synthesis(Part A)Edited by HRKricheldorf，New York，Marcel Dekker，1994中的“Poly(amines)and Poly(ammonium salts)”中提供的那樣。
一旦進行此類加成，就將形成改性的不對稱支化的聚合物，例如改性PEI或聚賴氨酸聚合物。作為不對稱支化聚合物例如PEI和聚賴氨酸的延伸，所得到的改性ABP也是不對稱支化的。取決于溶劑環境(即pH或極性)，表面官能團可以帶有不同的電荷和電荷密度。基于這些特征性質，從而可以進一步調節分子形狀和官能團位置(即官能團反折疊)。
在本發明的另一個實施方案中，所述改性的不對稱支化的聚合物可以使用各種合成方案中的任何一種制備，所述合成方案例如已知滿足與聚合物上的合適位點反應。此外，各種反應試劑中的任何一種都可以用于所選擇的合成方案中，以得到各種改性中的任何一種，或加成到聚合物骨架。因此，例如，在上述到胺的Michael加成反應的情況下，在與C1-C22丙烯酸酯的烷基化反應階段可以使用各種單體的任何一種進行加成。優選的反應物包括丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯、丙烯酸丙酯、丙烯酸丁酯、丙烯酸戊酯、丙烯酸己酯、丙烯酸庚酯、丙烯酸辛酯、丙烯酸壬酯、丙烯酸癸酯、丙烯酸十一烷基酯、丙烯酸十二烷基酯和其混合物。類似地，在上述舉例說明的實例的酰胺化階段，可以使用各種胺中的任何一種。例如，可以使用乙二胺，單乙醇胺，三(羥甲基)氨基甲烷，烷基胺，烯丙基胺，或任何氨基改性的聚合物，包括聚乙二醇(PEG)，全氟聚合物，聚苯乙烯，聚乙烯，聚二甲基硅氧烷、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸甲酯等，以及它們的混合物。
這種合成策略將不但實現所述分子的不對稱增長(其中可以容易地引入更多口袋)，而且實現多種官能團在所述結構內部和外部的加入。顯而易見，可以使用相同的或不同的合成方法連續改性前體聚合物，直到得到具有適當分子量和官能團的所期望的不對稱支化的聚合物。此外，此類聚合物的疏水和親水性能以及電荷密度，可以容易地通過使用構建該聚合物的合適單體和適當的改性反應進行修飾以適合特定的應用需要。
在本發明的另一個實施方案中，無規不對稱支化的聚唑啉的鏈端可以被另一種小分子封端或與其反應，以在聚合物鏈端產生各種官能團，包括伯胺、仲胺或叔胺和羧酸酯、羥基、烷基、氟代烷基、芳基、PEG、乙酸酯、酰胺和/或酯基團。或者，也可以使用各種起始物，從而在鏈端引入相同類型的官能團(J.Macromol.Sci.Chem.A9(5)，pp.703-727(1975))。因此，可以使用上述M litt的方法制備具有伯胺鏈端的烷基改性的、無規不對稱支化的聚(2-乙基唑啉)。
在本發明的另一個實施方案中，不對稱支化的聚合物可以用于運載生物活性材料以用于體外和體內相關應用中。所述生物活性材料包括各種分子，特別是能夠結合另一種分子的那些，例如生物聚合物，例如多肽，多聚核苷酸，脂質，多糖，酶，受體，抗體，維生素，外源凝集素等。所述目標可以是病原體，例如寄生蟲，細菌，病毒，或毒素，例如毒液。所述生物活性材料可以用于各種用途，包括作為診斷劑、治療劑等。“診斷劑”是指可以用作特定疾病、生理狀態或階段、病理狀態或階段等的標記物的分子。白蛋白、礦物水平、微生物、特定抗體、特定抗原、毒素等是診斷劑的例子。治療劑是給予有益效果的那些，例如藥物，營養物，蛋白質等。對于特定目標來說，既是診斷劑又是治療劑并不稀奇。
由于產生不均勻分布的口袋大小和在內部或在外部產生各種官能團的能力，這些不對稱支化的聚合物當進行適當改性后，能夠運載各種材料，所述材料的范圍從小分子例如金屬離子和藥物到其它大生物活性材料例如蛋白質和DNA。
感興趣的聚合物可以用于包裹生物活性分子，特別是藥品。
所述微膠囊可以按本文的教導以及按本領域的已知技術制備，參見例如Microencapsulation，Methods and IndustrialApplications，Benita，ed.，Dekker，1996。所述微膠囊可以在干燥狀態混合物或反應中制備，或可以在液體狀態混合物或反應中制備。
如在本領域中已知的，微膠囊可以以多種方式給予宿主，包括口服、IM、SC、IV、直腸、局部等等。
本發明的微膠囊可以用于局部應用中，例如乳膏、軟膏、洗劑、油膏、其它化妝品等等。可以包裹藥品和其它生物活性或惰性化合物，例如軟化劑、漂白劑、止汗藥、藥品、潤濕劑、香味劑、著色劑、顏料、染料、抗氧化劑、油類、脂肪酸、脂質、無機鹽、有機分子、遮光劑、維生素、藥物、角質層分離劑、UV阻斷劑、皮膚增黑加速劑、脫色劑、除臭劑、香料、驅昆蟲劑等等。
可以通過感興趣的聚合物運載的金屬包括，但不限于，過渡金屬以及其它金屬，例如Sc，Y，Ti，Zr，Hf，V，Nb，Ta，Cr，Mo，W，Mn，Tc，Re，Fe，Ru，Os，Co，Rh，Ir，Ni，Pd，Pt，Cu，Ag，Au，Zn，Cd和Hg，堿金屬，堿土金屬，鑭系元素例如Ce，Pr，Nd，Pm，Sm，Eu，Gd，Tb，Dy，Ho，Er，Yb和Lu，以及錒系元素例如Th，Pa，U，Np，Pu，Am，Cm，Bk，Cf，Es，Fm，Md，No和Lr。
可以通過感興趣的聚合物運載的藥物包括，但不限于，麻醉劑、抗生素、抗真菌劑、抗病毒劑、止痛劑、抗高血壓藥、消炎藥、解毒劑、抗組胺劑、化學治療劑、激素、抗抑郁劑、鎮靜劑、興奮劑、安定藥、泌尿抗感染劑、血管收縮劑、維生素、心臟藥、免疫抑制劑、營養補充物等等。具體的例子是利多卡因、布比卡因、氫化可的松、氯苯那敏、曲普利啶、右美沙芬、可待因、methidizine、trimeprizine、阿托品、2-PAM氯化物、后馬托品、左旋多巴、賽克利嗪、氯苯甲嗪、東莨菪堿、對乙酰氨基酚、兩性霉素B、安非他明、甲基安非他明、右旋安非他明、普萘洛爾、普魯卡因、disopyraminide、奎尼丁、恩卡尼、米力農、氨立農、多巴酚丁胺、依那普利、colnidine、肼苯噠嗪、胍那決爾、環丙沙星、諾氟沙星、四環素、紅霉素和喹諾酮藥物。
可被感興趣的聚合物運載的大生物活性材料可以包括，但不限于，蛋白質、重組蛋白質、抗體、Fab抗體片段、結合抗原的其它抗體片段、酶、DNA、重組DNA、DNA片段、RNA、RNAi、重組RNA、RNA片段、核苷酸、病毒、病毒片段等。
在本發明的另一個實施方案中，這些不對稱支化的聚合物可以用于在納米尺度操縱生物傳感事件。本發明的優選綴合物包括其中不對稱支化的聚合物綴合物包含與至少一種生物活性材料或生物響應指示劑的至少一個單元結合的至少一個不對稱支化的聚合物的那些。
所述生物活性材料、生物響應指示劑或治療分子通常是具有識別或結合能力的那些。對于本發明的目的，具有識別或結合能力的感興趣的那些分子將被認定為結合對，或單獨地被認定為結合對之一或一個成員。因此，結合對的例子包括，抗體和抗原；抗體的抗原結合部分和抗原；抗體的Fc部分和Fc受體；抗生物素蛋白、抗生物素蛋白鏈菌素、中性抗生物素蛋白、NeutraLite avidin或其它抗生物素蛋白衍生物和類似物和生物素；激素受體和激素；核酸結合部分例如蛋白質和目標核酸例如限制酶；酶和底物；酶和輔因子；核酸的一條鏈和核酸的互補鏈；酶和核酸識別部位，如和限制酶；外源凝集素和同源糖類；等等。展示出特異結合反應的任何一組分子，其中它們之間的結合可以用于探測一個或另一個的存在，可以被用于本發明的實踐中。
這些生物活性材料的一些例子是白細胞介素、干擾素、T-輔助細胞CD4分子、Fc受體、乙酰膽堿受體(AChR)、用于抗原的T細胞受體、胰島素受體、腫瘤壞死因子、粒細胞集落刺激因子、激素受體、抗體、抗體片斷、IgG分子、Fab抗體片段分子、重組蛋白質、多肽、噬菌體、噬菌體片段、DNA片段、RNA片段、激素，例如胰島素和hCG、酶、唾液酸、卟啉、核苷酸、病毒、病毒片段等。
通常，配體分子包括抗原(即細菌、病毒和毒素)、抗體(即IgG和IgE分子)、抗體片斷、Fab片段、多肽、激素(即胰島素和hCG)、神經遞質(即乙酰膽堿)、DNA片段、RNA片段、酶(即有機磷酸anhydrolase(OPAA)和有機磷酸酯水解酶(OPH))、小分子(例如唾液酸、卟啉和核苷酸)、或其它本領域技術人員公知的受體分子。在本發明中優選的配體是IgG、Fab和免疫球蛋白的其它抗原結合部分，不論是否得自天然免疫球蛋白或重組制備的蛋白質。
受體是通常存在于細胞表面的生物分子(即蛋白質或多糖)，并且通常部分嵌入或橫穿細胞質膜。所述受體能夠識別病毒、抗原、神經遞質、激素等等。例如，T輔助細胞CD4分子是HIV的病毒特異受體，而T細胞受體識別特異抗原。乙酰膽堿受體(AChR)結合神經遞質，乙酰膽堿，而激素受體例如腎上腺素能或胰島素受體分別識別腎上腺素和胰島素。其它可以包括巨噬細胞上的Fc受體，其是免疫球蛋白的受體。這些受體或受體部分可以從生物體系分離或者通過生物或非生物途徑合成。因此，這些新發展的受體分子或部分也可以用作配體用于納米操作應用中。
雖然通過使用來自于其抗原結合活性的抗體和其片段示例說明了上述檢測格式，然而所述感興趣的聚合物可以與其它具有抗原結合能力的分子一起使用。這些其它分子的例子包括核酸例如脫氧核糖核酸和核糖核酸，和受體例如從細胞分離的激素受體或重組制備的激素受體。
感興趣的聚合物和感興趣的其它分子的結合，使用已知的方法進行，例如利用所述聚合物或改性聚合物的化學特性以及將要結合到其上的所述分子的化學特性的化學合成方法，其中所述感興趣的其它分子例如是生物活性分子，例如蛋白質，例如抗體或抗原，核酸，生物素，抗生物素蛋白鏈菌素，膠體金等等。因此，所述聚合物可以進行改性以含有例如可以用作反應性位點的胺基團，通過共價鍵合可以向所述反應性位點結合感興趣的分子。或者，可以僅僅通過混合所述聚合物和將要結合的分子經由它們之間的非共價鍵合實現結合。另一種實體向感興趣的聚合物的結合也可以通過這兩種情況的組合實現。例如，感興趣的聚合物可以共價連接到配體，然后通過非共價鍵合物理吸附報告劑顆粒以形成配體-聚合物-報告劑顆粒綴合物，其可以容易地用于生物檢測。
當制備基于蛋白質的檢測或基于這些免疫檢測格式的探測系統時，通常遇到三個主要困難蛋白質的變性、粘附/固定和定向。在溶液中蛋白質或抗體分子通常折疊成三維結構以保持生物活性。在與不同固體表面相互作用時，例如在固定到膜、載玻片或微米/納米顆粒上期間，蛋白質分子的三維結構通常會坍塌，從而喪失生物活性。
而且，一些蛋白質僅僅是不適于固定到固體相上。為了將某些蛋白質固定到固體相上，通常需要使用化學反應或靜電相互作用干預。但是，如以上討論的，這些反應可能影響感興趣的生物分子的二級和三級結構。此外，多相化學反應通常可能是不完全的或者本質上不具有高度有利于希望的產物的反應動力學。這可以產生包括不希望的反應物和副產物的混合物。
在一些情況下，不注意的話這些反應可能會部分或全部使要結合到固體表面的蛋白質變性。
靜電反應取決于感興趣蛋白質的等電點和偶極距。此外，這些特性取決于蛋白質的環境，例如取決于pH和緩沖劑的組成。
因此，這些路徑可以并經常導致不希望的結果，例如差的期望產物產率和，一般來說，重現性。從商業的觀點看，結果是導致差的批對批一致性。
因此，物理沉積策略，雖然成本低，但是得到的是結合配體的完全無規的定向。另一方面，多步化學連接路線提供了改進的定向。但是，后者通常太過昂貴，并且由于不完全的化學反應也容易導致不可重現的結果。
所述感興趣的聚合物可以用于改進生物檢測。存在多種檢測格式并且任何一種都可以用感興趣的聚合物進行改進。這些已知檢測格式的例子在以下給出。
基于抗體的“夾層”檢測由三個組分組成捕獲抗體、抗原和與報告劑(即酶，熒光團，著色顆粒，染色顆粒或含有染料的顆粒，有色顆粒，放射性標記，量子點，納米晶體，上轉換磷光顆粒、熒光團或含有染料的聚合物，或視覺和/或在機械的幫助下可探測的乳膠珠等)連接的檢測劑抗體。這樣的檢測通常需要三個分開的實驗步驟。第一步驟包括將所述捕獲抗體固定到固體表面上，然后加入抗原溶液以形成抗體-抗原復合物。最后一個步驟是加入包含報告劑基團的標記的檢測劑抗體以產生捕獲抗體-抗原-檢測劑抗體復合物。這種“夾層”檢測的結果是，可以確認未知的抗原，以及該抗原的數量和濃度，其可以例如使用光閱讀機定量。如果在樣品溶液中不存在抗原，將不形成“夾層”復合物，并因此將觀察不到信號。
“夾層”復合物的實際結構高度依賴于結合試劑和報告劑部分。可以使用膠體金作為報告劑分子來示例各種檢測格式。在本領域中公知捕獲抗體-抗原-檢測劑抗體-金顆粒復合物的形成產生陽性測試。但是，在現實中，在合成金標記的檢測劑抗體期間，發現由于例如不同蛋白質偶極距和等電點的變化導致所述抗體通常無規定向在金表面上。結果，即使在不存在抗原的情況下，也形成只由檢測劑-金抗體聚集體組成的預交聯的產物。這種預交聯的產物非常顯著的增加噪音和背景水平，并且在一些情況下，產生非常嚴重的錯誤陽性讀數。
另一方面，基于不對稱支化的聚合物的檢測，產生清潔的但非常不同的免疫復合物捕獲抗體-抗原-檢測劑抗體-ABP-顆粒。在這種情況下，只形成清潔的免疫復合物并且完全消除預交聯的產物。結果，檢測敏感性被顯著增強，錯誤陽性讀數被顯著減少。此外，當與不使用感興趣的聚合物的基于抗體的標準檢測相比較時，試劑的使用量少的多。而且，使用類似的固定策略，所述捕獲抗體也可以通過ABP被連接到不同的固體表面上。這種路徑不依賴于蛋白質的偶極距和等電點，從而在保持感興趣的蛋白質處于天然構型或處于至少保持特定結合位點以及感興趣的表位的構型的同時，極大的簡化檢測構建方法。
第二檢測構型基于用于檢測未知樣品中的抗體的順序檢測格式。在這種情況下，將帶有表位的抗原或其片段施加到固體表面。在測試期間，所述抗原將與靶定的抗體結合，其接著與用膠體金標記的另一種一般抗物種(anti-species)抗體反應。因此，特征性紅色表示陽性測試，沒有顏色變化表示陰性測試。感興趣的聚合物可以用于將抗原固定到固體相，以及如上所述用于標記感興趣的抗體。
第三檢測構型是間接夾層檢測格式。在這種情況下，將捕獲抗體施加到膜表面。在測試期間，所述捕獲抗體將與靶定抗原結合，所述靶定抗原預先與中間連接體分子例如生物素或熒光素連接，其接著與用膠體金標記的抗生物素蛋白鏈菌素或抗熒光素抗體反應。因此，紅色表示陽性測試，沒有顏色變化表示陰性測試。同樣，感興趣的聚合物被用于將感興趣的蛋白質連接到固體相以及介導使用標記物標記蛋白質，所述標記物例如額外的反應物，例如生物素或抗生物素蛋白鏈菌素等。
此外，一種或多種生物素或連接有熒光素的酶分子，例如HRP，也可以連接到抗生物素蛋白鏈菌素或抗熒光素抗體標記的膠體金顆粒。一旦加入底物分子，由于多種報告劑分子所以信號可以進一步增強。
或者，所述捕獲抗體可以結合一種復合物，該復合物由預先與中間連接體分子例如生物素或熒光素連接的抗原-檢測劑抗體組成，接著與用膠體金標記的抗生物素蛋白鏈菌素或抗熒光素抗體反應。同樣，紅色表示陽性測試，沒有顏色變化表示陰性測試。
本發明的另一個方面是通過生物素-抗生物素蛋白鏈菌素-ABP或熒光素-抗熒光素-ABP鍵合將檢測劑抗體連接到膠體金顆粒上。這將可以實現快速構建各種基于夾層的檢測和微陣列。
本發明的另一個方面是首先用中間連接體例如生物素或熒光素標記抗原或抗原的混合物。所述捕獲抗體可以結合抗原上的報告劑分子，例如綴合到抗原上的生物素/熒光素，或者抗原的表位，然后利用例如用抗生物素蛋白鏈菌素或抗熒光素標記的報告劑檢測結合的抗原。陰性測試表現為沒有顏色變化，而陽性測試通過顏色的變化表示。同樣，感興趣的聚合物被用于將抗生物素蛋白鏈菌素或抗熒光素-抗體連接到報告劑，即膠體金顆粒。
第四檢測構型是基于競爭格式。捕獲抗體被固定到固體相上，抗原用例如膠體金顆粒標記。在沒有靶定抗原的情況下，所述金標記的抗原將直接與所述捕獲抗體反應，從而產生特征紅色，這解釋為陰性測試。與此相反，在靶定抗原存在的情況下，由于空間效應，所述靶定抗原將比所述金標記的抗原更快并且更牢固地結合所述捕獲抗體，從而不產生顏色變化，這解釋為陽性測試。與此顛倒，也可以使用相反的抗原/抗體構型。
第五檢測構型是使用上述四種檢測格式的任何一種，或者使用直接或間接檢測和/或定量感興趣的目標的任何其它檢測格式，來構建使用例如光閱讀機來定量的用于檢測和量化多種抗原的蛋白質微陣列(圖4)。
各種檢測格式中的任何一種都可以本發明的實踐中。本領域技術人員能夠使用能夠完成感興趣的目標化合物確認的試劑來很好地配置檢測。
本發明的檢測可以配置為定性檢測，例如可商購的懷孕檢測試劑盒，其產生“是/否”可見反應。通過提供分級數量的反應物、合適的對照物和一系列使用已知試劑的對照反應來提供用作對比的“標準曲線”，本發明的檢測也可以產生定量結果。在可以從各種文本和出版物的任一種中得到的教導的指導下，配置提供定量結果的檢測在本領域中是公知的。
在本發明的一個方面，所述不對稱支化的聚合物與生物活性分子(即IgG抗體、抗生物素蛋白或抗生物素蛋白鏈菌素)共價連接。所得到的綴合物與膠體金顆粒反應。所得到的抗體-ABP-金綴合物可以被加入如圖5A和5B所述的橫向流動免疫檢測中。
所述不對稱支化的聚合物提供三種獨特的特征。第一，所述不對稱支化的聚合物用作抗體和固體表面或顆粒表面之間的間隔物分子。第二，所述不對稱支化的聚合物作為載體以運送生物活性分子以及作為固定物將這些分子從溶液粘合到固體表面，其中只有所述綴合物的該不對稱支化的聚合物部分接觸所述表面。第三，在該錨定過程期間，所述不對稱支化聚合物-生物活性分子綴合物還在固體表面對復合物進行自我定向。
圖6說明了使用橫向流動檢測格式的改性無規不對稱支化的PEI聚合物-抗體綴合物的檢測性能對比結果。如前面所解釋的，當抗體直接吸附到固體表面(即膠體金表面)上時，由于變性，抗體分子非常快的喪失活性。此外，抗體和膠體金之間的連接很大程度上依賴于抗體的等電點。在大多數情況下，抗體和金顆粒之間的靜電相互作用并不足夠強，從而產生各種由解離造成的不希望的副產物，其通常導致嚴重的錯誤陽性反應和穩定性問題。因此，在靈敏性、穩定性和重現性方面，不對稱支化的聚合物-抗體綴合物提供了好得多的檢測結果。
如圖6所示，光密度測量(掃描器單位)表示的定量檢測結果證明信號的增加正相關于抗原(蓖麻毒蛋白類毒素)濃度的增加。當將基于改性ABP-抗蓖麻毒蛋白綴合物的檢測與只基于抗體的檢測條進行對比時，發現存在非常顯著的靈敏度差異。如果30掃描器單位(未經訓練的個人可以容易地確認測試線)被設定為陽性測試的最小值，那么基于ABP的檢測的靈敏度是相應的基于抗體的檢測的至少60倍。在更高的濃度，結果甚至更加顯著，在基于ABP-Ab的檢測中隨著濃度增加光密度快速增加，而基于Ab的測試線最終形成平臺，即使在濃度增加的情況下。
這些數據再次證明，不使用ABP，大部分抗體分子或者變性或者在固體相表面較差地定向。所述ABP不僅是作為載體，而且更重要的是當從溶液固定到固體表面上時作為抗體分子的錨定間隔物，從而完全消除了蛋白質變性問題。在各個濃度光密度響應的巨大差異也提供了測定未知樣品濃度的定量方法。與此相反，在相同的濃度范圍，基于抗體的檢測對濃度變化的響應要低得多，因此不適合定量測量。
除了靈敏度顯著增強以外，所述基于ABP-Ab的橫向流動檢測也更加適合用于醫療診斷學、目標發現以及在臨床試驗和治療處理期間監控生物標記物變化和蛋白質曲線。
還以微陣列格式構建了“間接”夾層檢測用于檢測肉毒桿菌類毒素。如圖7所示，當使用ABP將抗生物素蛋白鏈菌素連接到膠體金時，與非ABP檢測比較，反應的強度得到顯著改進，因此極大地增加了檢測靈敏度。結果是增強陽性信號。使用相同的原理，可以容易地制造基于夾層、競爭或順序檢測格式的檢測和微陣列。
包括結合對中的一個、感興趣的無規不對稱支化的聚合物和報告劑分子的感興趣的綴合物可以被配置成很多不同的檢測格式，其中可以同時監控一種、兩種、三種、四種或更多種目標。這種同時檢測可以使用一個或多個裝置進行，所述裝置在本文描述的和本領域公知的合適的固體相上載有綴合物，所述合適的固體相例如塑料，例如微滴定板，或者膜，例如硝化纖維素。一個單獨的裝置可以包含多種綴合物以檢測多種目標。這種多重裝置可以檢測兩種、三種、四種或更多種目標。
一旦連接到膠體金納米顆粒(5-100nm)或乳膠珠(0.2-1μm)上，所述ABP-Ab綴合物也可以用于制造基于微珠的納米陣列或微米陣列。在兩種情況下，每個微珠一種抗體或每個微珠多種抗體都可以合成。所述微珠納米/微米陣列被發現對于從生物流體例如血清、血漿、全血、唾液和尿液分離和檢測靶定蛋白質非常有效。
一旦包括上述檢測構型，可以看出在檢測中或在裝置上被檢測的分子或標記物的數目可以是單獨一種或多種。因此，也可以構建芯片微陣列(圖4)。使用相同的原理，也可以發展高密度微陣列用于同時確認多種目標，所述目標包括蛋白質、毒素、病毒、細菌、細菌芽孢、藥物、化學試劑、污染物和/或任何其它感興趣的目標。可以使用橫向流動檢測格式構建所產生的微陣列。另一種檢測格式是珠陣列(如BD Illumina and Luminex所提供的)、平板微陣列、微珠微陣列或它們的組合。
這種檢測可以被配置成含有多種生物標記物，所述生物標記物是期望目的的診斷劑。因此，此類多重裝置(其可以是納米陣列或微米陣列)，可以是病理狀態的診斷工具，展示對刺激物例如食品或藥物等的反應。使用的生物標記物的數目將取決于終點，并且通常是證明所述終點是否存在所需的標記物的最小數目。因此，如本領域已知的那樣，確定宿主暴露于病原體可以依賴于結合所述病原體的單一診斷抗體。對藥物的反應性可能需要更大數量的生物標記物，因為藥物對宿主的影響可能引發很多細胞功能中的反應。此外，所使用的所述生物標記物可能需要被優化從而對大多數隨機繁殖的群體都是可操作的，或者可能需要多個檢測并且在每個檢測中使用不同系列的生物標記物。
本發明的優選綴合物包括其中不對稱支化的聚合物綴合物包含與至少一種生物活性材料或生物響應指示劑的至少一個單元結合的至少一個不對稱支化的聚合物的那些。感興趣的聚合物可以包括不含中心核的那些或含有中心核的那些，例如公開于Denkewalter等人的專利中的那些。本發明的優選不對稱支化的聚合物包括其中不對稱支化的聚合物含有至少一種通過至少一類能夠形成額外支鏈的單體構建的無規或有規不對稱支化聚合物的那些。如在本文中所述的，一些感興趣的聚合物不含有中心核。無規和有規不對稱支化的聚合物的一些例子是無規支化的聚乙烯亞胺、聚丙烯亞胺、聚酰胺胺，和有規支化的聚賴氨酸。
所述不對稱支化的聚合物綴合物可以結合的表面可以變化，并且可以包括玻璃、硝酸纖維素、紙、石英、塑料、金屬、膠體顆粒(包括膠體金、膠體銀河膠體鉑)、聚合物或乳膠珠、無機顆粒、硅片、著色的乳膠顆粒、含有熒光或有色材料的顆粒、粘土、陶瓷、基于硅的或陶瓷的半導體顆粒、硅或陶瓷半導體芯片、納米晶體、量子點和上轉換(up-converting)磷光顆粒。量子點是無機納米顆粒(直徑通常小于5納米)，通過控制包含在所述顆粒中的材料的組成和大小能夠發出不同顏色的光。上轉換磷光體是亞微米陶瓷微顆粒，當其用近紅外光激發時發出可見光。此類顆粒的大小為100nm-500nm，包含稀土例子例如鐿，其能夠吸收紅外光的兩個光子。由于在背景中沒有自發熒光，所以這些微顆粒通常用作生物檢測的標記部分。
包含感興趣的不對稱支化的聚合物和具有藥物結合能力的部分的所述檢測可以用于在藥物接受者中監控藥物存在和水平。所述部分可以是例如抗體、抗體的抗原結合部分或配體。被監控的藥物可以是任何藥物，包括在本文中提及的那些，并進一步包括cox-2抑制劑、NSAIDs、抗有絲分裂藥、抗生素、抗病毒藥等，例如華法林、苯妥英、地高辛、卡馬西平、甲氨蝶呤、苯巴比妥、普魯卡因胺、丙戊酸鈉、茶堿、環孢霉素、他克莫司、慶大霉素、妥布霉素、阿米卡星和萬古霉素。
本發明包括含有可存儲、存儲穩定的試劑的試劑盒，其包括檢測，例如上面所述的那些。存儲穩定性可以通過在室溫、冰箱溫度等溫度下的存儲時間衡量。所述試劑盒可以包括多個小瓶，所述小瓶含有液體試劑或將用合適的稀釋劑例如無菌水或緩沖溶液重新構建的干燥試劑。所述試劑盒可以包含容納各種試劑的裝置，例如已知的懷孕測試試劑盒、橫向流動免疫測試試劑盒等等。因此，所述試劑盒的檢測格式可以是纖維素試紙(dipstick)、讀數棒(wand)、載玻片等的形式或形狀。通常此類裝置包括具有適當固體相的塑料托架，所述固體相例如塑料、膜、紙等等。
本發明檢測的結果可以以定性的方式確定，例如在具有可視讀數的纖維素試紙檢測中。此類檢測是已知的并且可由各種免疫檢測作為例子，例如懷孕測試試劑盒等等。
本發明檢測的結果可以通過機械方式確定。所述機械方式可以是任何傳感或探測報告劑分子或報告劑分子的產物的特定物理特征的物理裝置。所述機械裝置可以是位于實驗室環境中的裝置，或者可以是位于用于應用地點的可移動環境中的裝置，例如手持式裝置。所述裝置可以制成更小的便攜式格式以用于更多指定的應用地點，例如在醫院的房間中、在醫生辦公室、在田野中等等。可以用于檢測分光光度、發光、化學發光、熒光或比色報告劑分子的便攜式裝置和手持式裝置的例子在例如美國專利5083868、H1563、6480115、6394952、5900379、6663833、6656745、6267722、6706539、5646735、6346984、6002488、5962838、4917495、6575368和6583880中提供。
此類機械裝置是具有用于確定特別是報告劑分子的檢測或傳感設備的那些裝置。檢測設備是適合于判定特定報告劑分子的存在的設備。放射性報告劑分子使用例如閃爍計數器或Geiger-Muller計數器是可檢測的。光發射、熒光或發光報告劑分子使用例如包括例如光電倍增管、掃描器、電荷耦合器件(CCD)圖像傳感器、互補金屬氧化物半導體(CMOS)圖像傳感器等的比色計、折射計、反射計、光感測裝置是可檢測的。
所述裝置還可以包括數據處理設備，從而處理檢測到的信號并數字化。該處理設備通常稱為中央處理器，CPU，或微處理器，例如半導體芯片，在其中進行數據處理和分析。數字化的信息或者存儲在自帶的數據存儲裝置中(例如磁帶、磁盤、硬盤驅動器等)，或者通過數據傳輸設備傳輸到遠程數據存儲設備或其中對信息進行分析的數據處理設備，所述數據傳輸設備例如是有線計算機傳輸設備或者是使用恰當的設備例如紅外、無線電波、微波等的無線設備。
所述裝置可以包括數據輸入設備。例如，所述裝置可以包括鍵盤、掃描器等以提供命令供所述裝置執行或將確認信息與數據聯系起來。所述掃描器可以是獲取并存儲圖像的掃描器，或可以是翻譯代碼例如條形碼的掃描器，參見例如美國專利5885530和6099469。
因此，遠程檢測裝置可以包括具有軟件以控制該裝置操作的數據處理設備，例如在其上具有集成電路的電路板，參見例如美國專利5494798和6480115。該遠程裝置可以包含數據存儲設備，該數據存儲設備可以是可移動的，例如磁盤、“記憶棒”和其它數據存儲形式。如果是不可移動的，存儲的數據可以通過數據傳輸設備存取。此類傳輸設備可以是硬線以直接下載數據，或者此類傳輸可以采取本領域已知的可選擇的方式，例如無線信號，例如短波信號，例如射頻，微波和紅外。此類無線信號可以通過天線或通過衛星發送。
例如，可以分析所述信息以比較實驗測試和對照測試。或者，實驗測試，作為原始數字或作為經過對照校正過的數字，與群體平均值進行對比。數據還原和分析可以使用各種可用算法中的任何一種進行，或者可以對所述算法進行開發以得到軟件工具以得到對數據的適當分析和結果的合適輸出。
所述裝置可以含有顯示設備，例如CRT或液晶顯示器，其中所檢測和/或所分析的數據被適當地處理(例如與對照數據(和預先得到的群體數據相關)進行比較)并且所述數據被提供給裝置操作者。所述數據可以按照要求提供，例如如上面所述的那樣提供原始數據、用對照值校正過的相對數據或者兩種數據都提供，數據可以顯示在遠程裝置上，對于使用點的結果參見例如美國專利5885530。
或者，數字化的信息可以傳輸到數據存儲設備，所述數據存儲設備包含在該裝置內或與該裝置是分開的。數字化的信息可以使用已知的傳輸手段傳輸到外部存儲設備。包含在存儲設備中的數據然后可以與CPU進行傳送以進行適當的數據分析。
具有數據處理界面和設備的此類裝置的例子包括美國專利5543920、5589932和6362886。
感興趣的綴合物可以載有治療生物活性分子并且可以加入到適合于給藥的藥物組合物中。例如感興趣的聚合物可以被用于涂覆或包裹生物活性分子，例如藥理活性分子，例如藥物，例如胰島素。此類組合物典型地包含活性成分組合物和藥學可接受的載體。如在本文中所使用的，術語“藥學可接受的載體”包括任何以及所有的和藥物給藥相容的溶劑、分散介質、涂料、抗細菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等。對于藥物活性物質使用此類介質和試劑是本領域公知的。到目前為止，例外情況是與活性化合物不相容的任何常規介質或試劑，人們也期望在組合物中使用它們。補充性活性化合物也可以加入到組合物中。
按照本發明的公開使用的本發明的藥物組合物被配制成與目標給藥途徑相容。給藥途徑的實例包括腸胃外給藥，例如靜脈內、皮內、皮下、口服(例如吸入)、經皮(局部)、經粘膜和直腸給藥。用于腸胃外、皮內或皮下應用的溶液或懸浮液可以包括下面的組分無菌稀釋劑例如注射用水、鹽水溶液、不揮發性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶劑；抗菌劑例如芐醇或對羥基苯甲酸甲酯；抗氧化劑例如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑例如EDTA；緩沖劑例如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽，以及用于張力調節的試劑例如氯化鈉或葡萄糖。pH可以用酸或堿調節，例如HCl或NaOH。所述腸胃外制劑可以封裝并存儲在由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多劑量藥瓶中。
適合于注射使用的藥物組合物包括無菌水溶液(在可水溶的情況下)或分散體和用于以后制備無菌可注射溶液或分散體的無菌粉末。對于靜脈內給藥，合適的載體包括生理鹽水、抑菌水、CremophorEL(BASF；Parsippany，NJ)或磷酸鹽緩沖的鹽水(PBS)。在所有情況下，所述組合物必須是無菌的并且應該是達到存在注射性這種流動程度的流體。所述組合物在制造和存儲條件下必須是穩定的并且必須防止微生物例如細菌和真菌的污染作用。載體可以是溶劑或分散介質，含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等)以及它們的適當混合物。適當的流動性可以例如通過使用涂層例如卵磷脂(在分散體的情況下通過保持所需的顆粒尺寸)和通過使用增稠劑或表面活性劑來保持。防止微生物的作用可以通過各種抗細菌劑和抗真菌劑來實現，例如對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗壞血酸、硫柳汞等等。在很多情況下，優選在組合物中包括等滲劑，例如糖類，多元醇如甘露糖醇、山梨糖醇，或氯化鈉。可注射組合物的延長的吸收可以通過在組合物中包括能延遲吸收的試劑例如單硬脂酸鋁或明膠來產生。
無菌可注射溶液可以按照需要通過將所需量活性化合物以及上述列舉成分中的一種或其組合加入合適的溶劑中，然后過濾滅菌來制備。通常，分散體通過將活性化合物加入包含基礎分散介質和其它所需的來自上述所列那些的成分的無菌賦形劑中制備。對于用于制備無菌可注射溶液的無菌粉末，優選的制備方法是真空干燥和冷凍干燥，從而從其預先滅菌過濾的溶液產生活性成分和任何額外期望成分的粉末。
口服組合物通常包括惰性稀釋劑或可食用的載體。對于口服治療給藥目的，活性化合物可以與賦形劑結合并以片劑、錠劑或膠囊的形式使用。口服組合物也可以使用流體載體制備，得到糖漿劑或液體制劑，或者對于用作漱口藥，其中流體載體中的化合物口服施加并沖洗以及被吐出或吞掉。
可以包括藥物相容的粘合劑和/或輔助材料作為組合物的一部分。片劑、丸劑、膠囊、錠劑等可以含有任意下述具有類似性質的成分或化合物粘合劑例如微晶纖維素、黃蓍樹膠或明膠；賦形劑例如淀粉或乳糖；崩解劑例如海藻酸、Primogel或玉米淀粉；潤滑劑例如硬脂酸鎂或Sterotes；助流劑例如膠體二氧化硅；甜味劑例如蔗糖或糖精；或者矯味劑例如薄荷、水楊酸甲酯或橙調味品。
對于吸入給藥，化合物以例如氣溶膠或煙霧的形式遞送，所述氣溶膠從含有合適推進劑的加壓容器或分配器噴射或從噴霧器噴射，所述合適的推進劑例如是氣體，例如二氧化碳。
全身給藥也可以通過經粘膜或經皮方式進行。對于經粘膜或經皮給藥，在制劑中使用適合用于待穿透的屏障的滲透劑。此類滲透劑通常在本領域是已知的，包括例如，對于經粘膜給藥，清潔劑、膽汁鹽和梭鏈孢酸衍生物。經粘膜給藥可以通過使用鼻噴霧劑或栓劑完成。對于經皮給藥，如本領域通常已知的，活性化合物可以配制成軟膏、油膏、凝膠或乳膏。另一種已知的滲透劑是二甲基亞砜。
化合物也可以以栓劑(例如與常規栓劑基料例如可可脂和其它甘油酯)或用于直腸遞送的滯留灌腸劑的形式制備。
在一個實施方案中，活性化合物用將會保護該化合物防止從身體快速排出的載體制備，例如控制釋放制劑，包括植入物、貯庫、泵和微膠囊化的遞送體系。可以使用生物可降解的生物相容的聚合物，例如乙烯醋酸乙烯酯共聚物、聚酐、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯和聚乳酸。例如制劑可以是腸溶包衣的。
制備這些制劑的方法對于本領域的技術人員來說是顯而易見的。所述材料也可以從Alza Corporation和NovaPharmaceuticals，Inc商購。
脂質體和cochleate懸浮液(包括用抗體或其它靶定部分靶定到被感染細胞的脂質體)也可以用作藥學可接受的載體。這些可根據本領域技術人員已知的方法制備，例如如美國專利4522811中所述的那樣。
特別有利的是以便于給藥和劑量均勻的劑量單位形式配制口服或腸胃外組合物。本文使用的劑量單位形式是指適合作為單元劑量用于被治療的受試者的物理離散的單位；每個單位含有經計算產生期望的治療效果的預定數量的活性化合物以及所需的藥物載體。所述劑量，例如優選的給藥途徑和數量，是可以利用本領域已知的方法、基于從臨床前和臨床研究獲得的經驗數據得到的。對于在幾天時間或更長時間內重復給藥，取決于病情，維持治療直到產生所期望的對疾病癥狀的抑制。但是，其它劑量方案也是有用的。通過常規技術和檢測可以容易的監控治療的進展。一個示例性的劑量方案公開于WO94/04188中。本發明劑量單位形式的規格直接依賴于并由活性化合物的獨特特性和將要取得的特定治療效果以及本領域中復合這種活性化合物用于個體治療的固有限制決定。
所述藥物組合物可以和使用說明一起包含在容器、包裝物或分配器中。
給藥的另一種方法包括作為食物補充物或添加劑，或者作為與維生素類似的基于預防的劑型，將感興趣的化合物加入食物或飲料或者與食物和飲料混合。感興趣的綴合物可以被包裹成可以承受通過胃環境的劑型。此類劑型通常稱為腸溶包衣的劑型。或者，如本領域中已知的那樣，可以對感興趣的綴合物進行改性(例如肽鍵的化學改性)以增加半衰期，以保證口服給藥的穩定性。
本發明提供治療有癌癥風險(或易患癌癥)的對象的預防性和治療性方法。特定的劑量，即每一劑的數量和給藥模式，基于從單獨使用活性劑、臨床前研究、適應癥、臨床研究等得到的經驗知識，結合已知的藥理和藥物范例，如本領域中已知的那樣進行確定。
現在將在下面的非限定性實施例中例證本發明。
實施例
材料無規不對稱支化的聚乙烯亞胺從Aldrich andPolysciences購買。有規不對稱支化的聚合物根據美國專利4289872中提供的方法制備。根據公開于文獻(G.Frens et al.，Nature PhysicalScience，Vol.241，Jan.1，1973，20)中的方法制備膠體金顆粒。所有的抗體都從Sigma-Aldrich，Biodesign或Fitzgerald購買。
具有氨基官能團的改性無規不對稱支化的PEI(m-無規-AB-PEI-NH2-1.0)的合成
在該合成中使用如下包括無規不對稱支化的聚乙烯亞胺(無規-AB-PEI，MW2000、25000和75000)、丙烯酸甲酯(MA，FW＝86.09)、乙二胺(EDA，FW＝60.10)和甲醇的試劑。
向圓底燒瓶中加入1.0g PEI(MW 2000)和20ml甲醇(溶液A)。向單獨的圓底燒瓶中加入3.0g丙烯酸甲酯(MA)和10ml甲醇(溶液B)。然后在室溫在攪拌下將溶液A緩慢滴加進溶液B中。得到的溶液在40℃反應2小時。一旦反應完成，旋轉蒸發除去溶劑和未反應的MA單體，然后將產物，MA官能化的PEI，重新溶于20ml甲醇中。
向圓底燒瓶中加入80g EDA和50ml甲醇，然后在0℃緩慢加入MA官能化的PEI(1g MA溶于20ml甲醇)。然后將溶液在4℃反應48小時。通過旋轉蒸發除去溶劑和過量的EDA。然后從乙醚溶液沉淀出粗產物，并通過滲析進一步純化，得到約3.0g伯胺官能化的無規不對稱支化的PEI(m-無規-AB-PEI-NH2-1.0)，分子量為約7300。通過1H和13C核磁共振(NMR)和尺寸排阻色譜(SEC)對產物進行表征。
以類似方式制備具有不同分子量的其它MA或伯胺改性的無規不對稱支化的PEI和有規不對稱支化的聚賴氨酸聚合物。
具有混合的羥基和氨基官能團的改性無規不對稱支化的PEI(m-無規-AB-PEI-NH2/OH-2)的合成
在該合成中使用如下包括氨基官能化的無規不對稱支化的聚乙烯亞胺(m-無規-AB-PEI-NH2-1.0)、MA、EDA、單乙醇胺(MEA，FW＝61.08)和甲醇的試劑。
向圓底燒瓶中加入1.0g由前述步驟制備的氨基改性的PEI或m-無規-AB-PEI-NH2-1.0和20ml甲醇(溶液A)。向單獨的圓底燒瓶中加入3.0g MA和10ml甲醇(溶液B)。然后在室溫在攪拌下將溶液A緩慢滴加進溶液B中。得到的溶液在40℃反應2小時。一旦反應完成，旋轉蒸發除去溶劑和未反應的MA單體，然后將產物，MA官能化的m-無規-AB-PEI-MA-1.5，重新溶于20ml甲醇中。
向圓底燒瓶中加入60g EDA、240g MEA和100ml甲醇(EDA∶MEA的摩爾比是20∶80)，然后在0℃緩慢加入m-無規-AB-PEI-MA-1.5(1g MA溶于20ml甲醇)。然后將溶液在4℃反應48小時。通過旋轉蒸發除去溶劑和過量的EDA。然后從乙醚溶液沉淀出粗產物，并通過滲析進一步純化，得到約3.0g混合的羥基和氨基官能化的無規ABP(m-無規-AB-PEI-NH2/OH-2.0，平均具有20％NH2和80％OH基團，分子量是約18000)。
以類似方式制備具有不同羥基和氨基比例以及不同分子量的其它改性的無規AB-PEI和有規AB聚賴氨酸聚合物。
具有伯胺鏈端基團的烷基改性的無規不對稱支化的聚(2-乙基唑啉)(PEOX)的合成
CH3-(CH2)178-PEOXABP100(ABP100是表示在起始反應中單體對引發劑比例的任意名稱)的合成是作為用于合成核-殼納米膠囊的一般步驟提供的。在500ml甲苯中的CH3(CH2)178CH2-Br(3.36g)混合物在N2下用蒸餾頭共沸蒸餾約15分鐘以除去水。通入加料漏斗滴加2-乙基唑啉(100g)，將混合物回流24-48小時。一旦聚合完成，向反應性聚合物溶液(A)中加入12.12g EDA以引入胺官能團。聚唑啉鏈端與EDA的摩爾比是1∶20。
也可以加入嗎啉來終止反應。因此，向反應性聚合物溶液(A)中加入嗎啉來終止反應。粗產品重新溶于甲醇中，然后從大量過量的乙醚中沉淀出來。底層重新溶于甲醇中并通過旋轉蒸發和真空干燥，得到不對稱無規核-殼超支化的PEOX聚合物，為白色固體(101g)。以類似方式制備其它不對稱超無規支化的聚合物例如C12-PEOXABP20、50、100、200、300、500、C18-PEOX ABP20、50、200、300、500、C22-PEOX ABP20、50、100、200、300、500和聚苯乙烯-PEOX等，以及未改性的和改性的聚(2-取代的唑啉)例如聚(2-甲基唑啉)聚合物。所有的產物都通過SEC和NMR分析。
IgG-不對稱無規支化的聚合物綴合物的制備
無規支化的混合表面(OH/NH2混合)m-無規-AB-PEI-NH2/OH-2-IgG綴合物的制備是作為用于制備聚合物-抗體和聚合物-抗生物素蛋白鏈菌素的一般步驟提供的。其它綴合物例如PEI-IgG，m-無規-AB-PEI-NH2-1-IgG，m-無規-AB-PEI-NH2-2-IgG，m-無規-AB-PEI-NH2-3-IgG，m-無規-AB-PEI-NH2-4-IgG以及m-無規-AB-PEI-NH2/OH-1(OH/NH2混合)-IgG，m-無規-AB-PEI-NH2/OH-2(OH/NH2混合)-IgG，m-無規-AB-PEI-NH2/OH-3(OH/NH2混合)-IgG，有規聚賴氨酸聚合物，具有伯胺鏈端的烷基改性的無規支化的聚(2-乙基唑啉)都以類似的方式合成。也以類似的方式進行與不對稱無規支化的PEOX聚合物形成的各種蛋白質綴合物的合成。按照BioconjugateTechniques(G.Hermanson，Academic Press，1996)中提供的方法合成生物素化-IgG綴合物。
LC-SPDP-混合表面m-無規-AB-PEI-NH2/OH-2向在400ml磷酸鹽緩沖溶液(20mM磷酸鹽和0.1M NaCl，pH7.5)中的混合表面無規支化的m-無規-AB-PEI-NH2/OH-2(400×10-9mol)中加入在400ml水中的4.0×10-6mol磺基-LC-SPDP(Pierce，IL)。漩渦混合并在30℃培養30分鐘。通過凝膠過濾色譜純化LC-SPDP-m-無規-AB-PEI-NH2/OH-2并用緩沖溶液A(0.1M磷酸鹽，0.1M NaCl和5mMEDTA，pH6.8)平衡。進一步濃縮得到465ml溶液，濃度約為0.77nmol/μmol。
從LC-SPDP m-無規-AB-PEI-NH2/OH-2制備硫醇化(thiolated)的m-無規-AB-PEI-NH2/OH-2將LC-SPDP m-無規-AB-PEI-NH2/OH-2(50nmol，在65ml緩沖溶液A中)與100ml二硫蘇糖醇(DTT)(在緩沖溶液A中，50mM)混合，并在室溫培養15分鐘。通過用緩沖溶液A凝膠過濾除去過量的DTT和副產物。在10KCentricon Concentrator中濃縮，得到390ml硫醇化的m-無規-AB-PEI-NH2/OH-2，其用于與活化的抗體綴合。
馬來酰亞胺R(MAL-R)活化的抗體向在PBS中的抗體(310μL，5.1mg或34nmol)加入20.4ml MAL-R-NHS(N-羥基琥珀酰亞胺)溶液(10mM，在水中)。混合物漩渦混合并在30℃培養15分鐘。用緩沖溶液A通過凝膠過濾純化。該馬來酰亞胺-R活化的抗體被用于與硫醇化的m-無規-AB-PEI-NH2/OH-2綴合。
m-無規-AB-PEI-NH2/OH-2-抗體綴合物向硫醇化的m-無規-AB-PEI-NH2/OH-2(310ml或35.7nmol)中加入MAL-R-活化的抗體(4.8mL或34nmol)。將反應混合物濃縮到約800ml，在4℃培養過夜，并在室溫培養約l小時。一旦完成，用100μL乙基馬來酰亞胺(50毫摩爾濃度的溶液)淬滅反應，然后綴合物在羧甲基纖維素柱(5ml)上使用在pH6的20mM磷酸鹽緩沖溶液中的氯化鈉階段梯度進行分級。綴合物用氯化鈉梯度洗脫，并通過陽離子交換色譜、UV光譜和聚丙烯酰胺凝膠電泳表征。
通過還原偶聯綴合
抗體的還原向在160μL緩沖溶液B(含有0.1M磷酸鈉、5mM EDTA和0.1M NaCl，pH6.0)中的2.1mg或14nmol抗體中加入40μL DTT(50mM，在緩沖溶液B中)。將溶液在室溫靜置30分鐘。在用緩沖溶液B平衡的Sephadex G-25柱中通過凝膠過濾純化。將還原的抗體濃縮至220μL并用于下面的綴合之中。
MAL-R-混合表面ABP向在pH7.4的400μL(400×10- 9mol)中的混合表面ABP中加入400μL的MAL-R-NHS(10mM，在水中)。混合并在30℃培養15分鐘。一旦終止，在用緩沖溶液B平衡的Sephadex G-25柱中純化。收集MAL-R-混合表面ABP并在-40℃在相同的緩沖溶液中等分存儲。
混合表面ABP-抗體綴合物在攪拌下向還原的抗體(14nmol，220μL)中加入MAL-R-混合表面m-無規-AB-PEI-NH2/OH-2(154μL，16.6nmol)。向該混合物中加入12.5μL碳酸鈉溶液(1.0M溶液)以將pH調節到～6.8。在室溫下繼續反應1小時。通過加入100μL的半胱胺溶液(0.4mM溶液)終止反應。綴合混合物在CM纖維素柱上純化，用氯化鈉梯度洗脫。
基于膠體金的免疫檢測金-Ab綴合物的制備
向125ml燒瓶中加入60ml膠體金溶液(20-80nm直徑，通過TEM測量，O.D.1.078，通過UV光譜法測量)(Frens et al.，如前面所述)。通過加入0.2M的碳酸鉀溶液將所述溶液的pH調節到8-11。在攪拌下向該溶液中加入600ml綴合的抗體溶液(O.D.0.1-1.5，在硼酸鈉緩沖溶液中)，接著加入600ml牛血清白蛋白(20％，帶有疊氮化鈉穩定劑)。混合物進一步在20℃攪拌20-60分鐘。溶液保持顏色為紫色，并觀察到一定程度的起泡。完成之后，移去攪拌棒，將反應混合物轉移到兩個50ml的錐形試管中。對所述材料進行離心直到在上清液中觀察到非常少的顏色。除去上清液并在每個試管中加入400ml的25mM硼酸鈉緩沖溶液。充分混合內容物，合并兩個試管的材料并通過UV-Vis表征。
以類似方式制備金-ABP-抗生物素蛋白鏈菌素綴合物。通過接著向金-ABP-抗生物素蛋白鏈菌素綴合物中加入生物素化Ab，制備金-ABP-抗生物素蛋白鏈菌素-生物素-Ab綴合物。可以用作報告劑的其它生物活性分子，例如辣根過氧化物酶(HRP)或抗生物素蛋白以及其衍生物和類似物，也可以以類似方式連接到金上。但是，在測試期間，必須加入額外的底物以實現信號增強。
橫向流動或纖維素試紙(dipstick)免疫檢測條實驗
免疫檢測裝置或“檢測條”可以由在膜保持裝置中的纖維素條帶或其它膜(c)(通常由惰性塑料組成)、在所述膜末端的吸附劑墊(a)和接收墊(b)組成(圖5A)。在約4mm的距離內將兩種不同的抗體(捕獲抗體(d)和對照抗體(e))噴在膜上。捕獲抗體用于捕獲分析物分子，而對照抗體用于驗證檢測劑抗體的活性。檢測劑抗體(標記有報告劑，例如預先綴合到膠體金顆粒上)存儲在綴合物釋放墊(b)上，并被放置在吸收劑墊下面。然后將條帶/墊復合物放置于保持裝置中(圖5B)，主要目的是便于在田野或家庭環境中操作。該檢測條的全重可以是大約4.5g，尺寸可以是大約2cm(寬度)×7cm(長度)×0.5cm(厚度)。
一旦樣品溶液被通過樣品池或使用纖維素試紙施加到吸收劑墊(a)上，抗原將原位與檢測劑抗體-ABP-金綴合物混合，并且所產生的抗原-檢測劑抗體-ABP-金復合物將被預先噴在膜上的捕獲抗體捕獲。結果，形成由捕獲抗體-抗原-檢測劑抗體-ABP-金復合物組成的復合物，出現紅色(T)(圖5B)。
該復合物顯著不同于現有技術(即基于“夾層”的橫向流動免疫檢測)，其中現有技術包括只由捕獲抗體-抗原-檢測劑抗體-金復合物組成的不同的復合物或產物。在這些復合物中，檢測劑抗體直接與膠體金顆粒發生相互作用，從而造成此類抗體在金表面的無規定向。這種無規定向造成不希望的預交聯的產物(即檢測劑抗體-膠體金顆粒簇)，顯著增加背景噪音或錯誤陽性水平。與此相反，本發明的基于ABP的檢測完全消除預交聯的副產物。這種組成上的差異的結果就是，基于ABP的檢測使用10-20分之一的試劑顯示出增強至100倍的靈敏度(圖6)。
如圖5B中所示，當施加未知溶液到樣品池(S)時，如果捕獲線(T)和對照線(C)都變紅，那么納米測試結果是陽性。如果只有對照線變紅，那么測試是陰性。
檢測可以配置為是定性的，也就是說，對于該檢測準備提供的用視覺可分辨的結果，將以產生陽性或陰性結果的確定形式和方式呈現。另一方面，檢測格式是適合于產生可定量結果的。從而，可以用提供反應水平測量的裝置掃描檢測條(ticket)。
制備抗原(即類毒素)濃度為1-250ng/ml(總體積100ml)的一系列樣品用于測試。一旦樣品溶液在5秒內被滴加到吸收劑墊(記錄該時間)，基于流體相的毛細運動該溶液將橫向流動。一旦該溶液通過綴合物釋放墊，金-Ab或金-ABP-Ab綴合物就將被釋放。如果測試是陽性的，由于形成免疫復合物，那么對照線和測試線都將變紅，紅色來自膠體金顆粒。如果測試是陰性的，由于在測試線/捕獲Ab位置沒有“夾層”免疫復合物，所以只有對照線變紅，在測試線上將不出現顏色。檢測所需的時間大約是15分鐘。
根據相同的檢測設計，基于微陣列的檢測可以以類似方式構建。在這種情況下，通過可商購的微陣列自動機器，捕獲抗體被點在固體表面上，在那里檢測劑抗體-金綴合物混合在一起。一旦以直接、間接或順序夾層檢測格式加入未知樣品，陽性測試在表面上預先確定的相應的捕獲抗體位置顯示出紅色變化，而陰性測試不顯示顏色變化。或者，在競爭檢測格式中，正好相反。同樣，感興趣的聚合物被用于將抗體或抗原固定到固體表面上。
所有本文引用的參考文獻，包括要求優先權的兩個臨時申請，2003年11月21日提交的美國臨時申請60/523692和2004年6月21日提交的60/580728，都全部引入本文作為參考。
對本領域的技術人員來說，根據上述教導，是可以對本發明進行各種改變、改動和調整的。因此，可以理解，雖然說明書中已經利用一些具體實例描述了本發明，但是本發明并不限于本文中提供的具體實施方案。相反，本發明包括本發明的精神和范圍內所有的備選方式、改動和等價方案。
權利要求
1.一種不對稱支化的聚合物綴合物，其包括與至少一種生物活性劑結合的至少一種不對稱支化的聚合物。
2.權利要求1的綴合物，其中所述不對稱支化的聚合物是未改性的或改性的不對稱支化的聚合物。
3.權利要求1的綴合物，其中所述生物活性劑是診斷劑、治療劑或診斷劑和治療劑的組合。
4.權利要求1的綴合物，其中所述不對稱支化的聚合物通過共價或非共價鍵與另一種生物活性劑連接。
5.權利要求2的綴合物，其中所述不對稱支化的聚合物是無規或有規不對稱支化的聚合物。
6.權利要求5的綴合物，其中所述無規不對稱支化的聚合物是聚乙烯亞胺或改性的聚乙烯亞胺。
7.權利要求5的綴合物，其中所述無規不對稱支化的聚合物是聚唑啉或改性的聚唑啉。
8.權利要求7的綴合物，其中所述無規不對稱支化的聚唑啉是聚(2-甲基唑啉)或聚(2-乙基唑啉)。
9.權利要求8的綴合物，其中所述改性的無規不對稱支化的聚唑啉是改性的聚(2-甲基唑啉)或改性的聚(2-乙基唑啉)。
10.權利要求5的綴合物，其中所述有規不對稱支化的聚合物是聚賴氨酸或改性的聚賴氨酸。
11.權利要求1的綴合物，其中所述生物活性劑是金屬。
12.權利要求11的綴合物，其中所述金屬是過渡金屬、堿金屬、堿土金屬、鑭系元素或錒系元素。
13.包含權利要求1的綴合物和報告劑分子的檢測試劑盒。
14.權利要求13的試劑盒，其中所述生物活性劑是結合對的成員。
15.權利要求14的試劑盒，其中所述結合對包括抗體、其抗原結合部分、抗原或其含表位的部分。
16.權利要求13的試劑盒，其中所述報告劑分子包括著色、發光或熒光顆粒或部分，酶，或它們的組合。
17.權利要求16的試劑盒，其中所述熒光或發光顆粒或部分包括量子點、納米晶體、上轉換磷光顆粒或含熒光團的乳膠珠。
18.權利要求16的試劑盒，其中所述著色顆粒包括包含金或銀的膠體金屬、著色乳膠珠或著色染料。
19.權利要求13的試劑盒，其中所述試劑盒包括含有所述綴合物和所述報告劑分子的固體相。
20.權利要求19的試劑盒，其中所述固體相包含平坦表面或膜。
21.權利要求20的試劑盒，其中所述平坦表面包括硅片、石英、玻璃、金屬或塑料。
22.權利要求20的試劑盒，其中所述膜包括紙、塑料膜、尼龍膜或硝化纖維素。
23.權利要求19的試劑盒，其中所述固體相和所述綴合物包括微陣列或珠陣列。
24.權利要求13的試劑盒，其中所述報告劑分子生成可以通過顏色或者通過光檢測的產物。
25.權利要求13的試劑盒，其中所述生物活性劑結合到生物聚合物、激素、神經遞質、病原體、毒素或藥物上。
26.權利要求25的試劑盒，其中所述病原體是細菌、孢子、寄生蟲或病毒。
27.權利要求25的試劑盒，其中所述生物聚合物是多肽、多糖或多聚核苷酸。
28.權利要求27的試劑盒，其中所述多肽是酶。
29.權利要求27的試劑盒，其中所述多肽是抗體、其抗原結合部分、抗原或其含表位的部分。
30.權利要求19的試劑盒，其中所述固體相包括纖維素試紙、橫向流動免疫檢測或微陣列。
31.一種檢測目標分子的方法，包括，得到懷疑含有所述目標分子的樣品，將所述樣品暴露于權利要求1的綴合物，其中所述生物活性劑特異地結合所述目標分子，和確定是否形成所述綴合物和所述目標分子的復合物。
32.權利要求31的方法，其中所述確定步驟包括報告劑分子。
33.權利要求31的方法，其中所述報告劑分子的存在是通過視覺確定的。
34.權利要求31的方法，其中所述報告劑分子的存在是使用機械設備檢測的。
35.權利要求34的方法，其中所述機械設備包括檢測設備。
36.權利要求34的方法，其中所述機械設備包括數字化數據的傳感設備和數據存儲設備。
37.權利要求34的方法，其中所述機械設備包括顯示設備。
38.權利要求34的方法，其中所述機械設備是手持式裝置。
39.權利要求34的方法，進一步包括數據傳輸設備。
40.權利要求34的方法，其中所述機械設備是便攜式的。
41.權利要求34的方法，其中所述機械設備包括檢測信號定量設備。
42.權利要求39的方法，其中所述傳輸設備是無線設備。
43.權利要求1的綴合物，其中所述生物活性劑是藥物。
44.權利要求43的綴合物，其中所述藥物是麻醉劑、抗生素、抗真菌劑、抗病毒劑、止痛劑、抗高血壓藥、消炎藥、解毒劑、抗組胺劑、化學治療劑、抗抑郁劑、鎮靜劑、興奮劑、安定藥、泌尿抗感染劑、血管收縮劑、維生素、心臟藥、免疫抑制劑或營養補充物。
45.權利要求43的綴合物，其中所述藥物是生物聚合物。
46.權利要求43的綴合物，其中所述藥物是激素。
47.權利要求43的綴合物，其中所述藥物是被所述聚合物包裹的。
48.權利要求45的綴合物，其中所述生物聚合物是多肽或多聚核苷酸。
49.權利要求48的綴合物，其中所述多聚核苷酸是DNA或RNA。
50.權利要求48的綴合物，其中所述多肽是配體或抗原結合的。
51.權利要求50的綴合物，其中所述抗原結合多肽是免疫球蛋白或其抗原結合部分。
52.權利要求49的綴合物，其中所述RNA是RNAi。
全文摘要
不對稱支化的聚合物與生物活性劑結合以用于各種目的，包括藥物遞送以及與結合對的成員之一綴合用于檢測。
文檔編號G01N33/551GK1930304SQ200480040816
公開日2007年3月14日 申請日期2004年11月22日 優先權日2003年11月21日
發明者R·殷, D·秦, J·潘 申請人:Anp技術公司