底物和通過包括磷腈基團的系留化合物結合于底物的化合物的制作方法

專利名稱：底物和通過包括磷腈基團的系留化合物結合于底物的化合物的制作方法
技術領域：
本發明涉及包括具有固定于底物的系留基團的底物的制品，和涉及用于將包含親核體的材料固定到底物的方法。
背景技術：
生物學活性分子對底物表面的共價連接可用于多種應用，如用于診斷設備、親合性分離、高通量DNA測序應用、聚合酶鏈反應(PCR)的提純等。例如固定化生物胺可用于疾病或遺傳缺陷的醫療診斷或用于檢測多種生物分子。
通過引入用于固定任何多種配體的活性官能團對固體載體(如顆粒狀色譜法載體)進行改性是已知的。親核體(如NH2、SH、OH等)對底物的連接可以通過使用系留化合物(tethering compounds)實現。系留化合物具有至少兩個被連接基團分離的活性官能團。一個官能團提供通過與底物表面上的互補官能團反應而使系留化合物錨定于底物或載體的機構。第二個活性官能團可以選擇為與包含親核體的材料反應。包含羥基的載體(如纖維素、交聯右旋糖酐、羊毛、和聚乙烯醇)可用氰尿酰氯(三氯三嗪)處理，用于酶、抗原、和抗體的連接。包含羥基的載體如瓊脂糖凝膠(Sepharose)可與三氯三嗪(TCT)反應，然后其可以結合一個或多個親核體。用氰尿酰氯衍生化的固體尼龍小珠已經被用于基于寡核苷酸的雜交試驗。TCT涂層的紙和尼龍膜還顯示出在DNA、RNA、和蛋白質的轉移雜交實驗中的實用性。
已知的系留化合物通常為與包含親核體的材料(包括生物材料)具有高度反應活性。但是，當與親核體的反應在水溶液中進行時，系留化合物與包含親核體的材料的反應可以與其它反應如系留化合物的水解競爭。水解可以引起底物上的包含親核體的材料不完全或低效率的固定。
需要改善固定底物和與這種底物相容的系留化合物。因此，期望提供可用于多種應用中任一種的配體固定的載體和系留化合物。

發明內容
本發明提供制品和這種制品在固定包含親核體的材料方面的用法，所述包含親核體的材料如含胺的被分析物、氨基酸、肽、DNA、RNA、蛋白質、酶、細胞器、免疫球蛋白、其片段、以及前述兩種或多種的組合。包含親核體的材料可以包括含胺的材料，諸如例如，抗原(包括結合于抗體的抗原)、免疫球蛋白等。在一些實施方案中，含胺的材料可另外結合于細菌如金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)。
在一個方面，本發明提供制品，其包括具有第一表面和第二表面的底物；連接于底物第一表面的磷腈系留基團，磷腈系留基團包括底物第一表面上的官能團與磷腈系留化合物的反應產物。
在一些實施方案中，磷腈系留化合物包括式I所示的結構， 其中每個X可相同或不同，并且包括易受親核攻擊而與包含親核體的材料結合的反應基團。
在另一個方面，本發明提供將包含親核體的材料固定到底物的方法，該方法包括
提供磷腈系留化合物；提供具有能夠與磷腈系留化合物反應的官能團的底物；通過磷腈系留化合物與底物上的官能團反應產生離子鍵、共價鍵、或其組合制備連接于底物的磷腈系留基團；和使連接于底物的磷腈系留基團與包含親核體的材料反應從而固定包含親核體的材料。
用于發明說明書中的某些術語應被理解為具有以下含義如本文中使用的，術語“一”、 “一個”和“該”可與“至少一個”互換地使用，是指一個或多個所述元素。
如本文中使用的，術語“酰基”是指式-(CO)R的單價基團，其中R為烷基，并且其中用于本文中的(CO)表示通過雙鍵與氧連接的碳。
如本文中使用的，術語“酰氧基”是指式-O(CO)R的單價基團，其中R為烷基。
如本文中使用的，術語“酰氧基甲硅烷基”是指具有與Si連接的酰氧基的單價基團(即，Si-O(CO)R，其中R為烷基)。例如，酰氧基甲硅烷基可為式-Si[O(CO)R]3-nLn，其中n為0到2的整數，L為鹵素或烷氧基。具體的例子包括-Si[O(CO)CH3]3、-Si[O(CO)CH3]2Cl、或-Si[O(CO)CH3]Cl2-。
如本文中使用的，術語“烷氧基”是指式-OR的單價基團，其中R為烷基。
如本文中使用的，術語“烷氧羰基”是指式-(CO)OR的單價基團，其中R為烷基。
如本文中使用的，術語“烷氧基甲硅烷基”為具有與Si連接的烷氧基的基團(即，Si-OR，其中R為烷基)。例如，烷氧基甲硅烷基可為式-Si(OR)3-n(La)n，其中n為0到2的整數，La為鹵素或酰氧基。具體的例子包括-Si(OCH3)3、-Si(OCH3)2Cl、或-Si(OCH3)Cl2。
如本文中使用的，術語“烷基”是指烷烴的單價基團，其包括直鏈、支鏈、環狀的基團，或其組合。烷基通常具有1到30個碳原子。在一些實施方案中，烷基包含1到20個碳原子、1到10個碳原子、1到6個碳原子、或1到4個碳原子。烷基的例子包括甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、叔丁基、正戊基、正己基、正庚基、正辛基、和乙基己基。
如本文中使用的，術語“烷基二硫化物”是指式-SSR的單價基團，其中R為烷基。
如本文中使用的，術語“亞烷基”是指烷烴的二價基。亞烷基可為直鏈、支鏈、環狀的，或其組合。亞烷基通常具有1到200個碳原子。在一些實施方案中，亞烷基包含1到100個、1到80個、1到50個、1到30個、1到20個、1到10個、或1到4個碳原子。亞烷基的基團中心可在相同的碳原子上(即烷叉基)在不同的碳原子上。
如本文中使用的，“氨基硅烷”是指具有與Si連接的胺基的基團。例如，氨基硅烷可為式-Si(OR1)3-n[(R2)NH2]n，其中n為0到2的整數，R1為碳鏈長度小于5的烷基，R2為碳鏈長度至少為2的另一個烷基。其具體例子包括3-氨基丙基三乙氧基硅烷、3-氨基三甲氧基硅烷。
如本文中使用的，術語“芳烷基”是指化合物R-Ar的單價基團，其中Ar芳香族碳環基團，R為烷基。
如本文中使用的，術語“亞芳烷基”是指式-R-Ar-的二價基，其中Ar亞芳基，R為亞烷基。
如本文中使用的，術語“芳基”是指單價的芳香族碳環基團。芳基可具有一個芳香環，或者包括連接或稠合于芳香環的最多5個碳環結構。其它環狀結構可為芳香族的、非芳香族的、或其組合。芳基的例子包括但不限于苯基、聯苯基、三聯苯基、蒽基、萘基、苊基、蒽醌基、菲基、蒽基、芘基、苝基、和芴基。
如本文中使用的，術語“亞芳基”是指具有1到5個環(其可為連接的、稠合的、或其組合)的碳環芳香族化合物的二價基。在一些實施方案中，亞芳基具有最多5個環、最多4個環，最多3個環，最多2個環，或具有一個芳香環。例如，亞芳基可為亞苯基。
如本文中使用的，術語“疊氮基”是指式-N3的基團。
如本文中使用的，術語“氮丙啶基”是指下式的氮丙啶的環狀單價基團 其中Rd為氫或烷基。
如本文中使用的，術語“苯并三唑基”是指具有與三唑基稠合的苯基團的單價基團。苯并三唑基的結構式為C6H4N3-。
如本文中使用的，術語“羰基”是指式-(CO)-的二價基團。
如本文中使用的，術語“羰基亞氨基”是指式-(CO)NR4-的二價基團，其中R4為氫、烷基、或芳基。
如本文中使用的，術語“羰基氧基”是指式-(CO)O-的二價基團。
如本文中使用的，術語“羰基氧基羰基”是指式-(CO)O(CO)-的二價基團。這種基團為酸酐化合物的一部分。
如本文中使用的，術語“羰基硫基”是指式-(CO)S-的二價基團。
如本文中使用的，術語“羧基”是指式-(CO)OH的單價基團。
如本文中使用的，術語“氯代烷基”是指具有至少一個氫原子被氯原子代替的烷基。
如本文中使用的，術語“氰基”是指式-CN的基團。
如本文中使用的，術語“二硫化物”是指式-S-S-的二價基團。
如本文中使用的，術語“烯鍵不飽和”是指具有式-CY＝CH2的碳-碳雙鍵的單價基團，其中Y為氫、烷基、或芳基。
如本文中使用的，術語“氟代烷基”是指具有至少一個氫原子被氟原子代替的烷基。
如本文中使用的，術語“鹵代烷基”是指至少一個氫原子用選自F、Cl、Br、或I的鹵素代替的烷基。全氟烷基為鹵代烷基的子集。
如本文中使用的，術語“鹵代羰基氧基”是指式-O(CO)X的單價基團，其中X為選自F、Cl、Br、或I的鹵素原子。
如本文中使用的，術語“鹵代羰基”是指式-(CO)X的單價基團，其中X為選自F、Cl、Br、或I的鹵素原子。
如本文中使用的，術語“鹵代甲硅烷基”為具有連接于鹵素的Si的基團(即，Si-X，其中X為鹵素)。例如，鹵代甲硅烷基為-SiX3-n(Lb)n，其中n為0到2的整數，Lb選自烷氧基、或酰氧基。一些具體的例子包括基團-SiCl3、-SiCl2OCH3、和-SiCl(OCH3)2。
如本文中使用的，術語“雜亞烷基”是指具有一個或多個被硫、氧、或NRd代替的碳原子的二價亞烷基，其中Rd為氫或烷基。雜亞烷基可為直鏈、支鏈、環狀的、或其組合，并且可包括最多400個碳原子和最多30個雜原子。在一些實施方案中，雜亞烷基包括最多300個碳原子，最多200個碳原子，最多100個碳原子，最多50個碳原子，最多30個碳原子、最多20個碳原子，或最多10個碳原子。
如本文中使用的，術語“羥基”是指式-OH的基團。
如本文中使用的，術語“異氰酸根合”是指式-NCO的基團。
如本文中使用的，術語“巰基”是指式-SH的基團。
如本文中使用的，“親核體”或“包含親核體的材料”是指與含氧、硫和/或氮的基團如取代氨基有反應性的部分。包含親核體的材料的例子包括具有部分如氨基、烷基或芳基取代的氨基、烷基氨基、芳基氨基、氧基烷基、氧基芳基、硫基烷基、和硫基芳基的那些；含氨基的染料的殘基如硝基染料、偶氮染料，包括噻唑染料、吖啶染料、oxyazine染料、噻嗪染料、和吖嗪染料、靛藍類染料；氨基蒽醌、芳族二胺、氨基苯酚、氨基萘酚、和前述物質的N-和O-酸基(acidyl)或烷基、芳烷基或芳基衍生物；硝胺、苯硫酚、或氨基硫醇。示例性的包含親核體的材料包括以下殘基OCH2COOH、NHCH2COOH、SCH2COOH、NHC2H4SO3H、OC4H8N(C2H5)3、NHC6H4SO3H、OC6H4COOH、SC6H4COOH、NHC2H4OH、OC2H4OH、和NHC3H6NH(C2H4OH)2。
如本文中使用的，術語“氧基”是指式-O-的二價基團。
如本文中使用的，術語“全氟烷基”是指其中所有的氫原子都被氟原子代替的烷基。全氟烷基為氟代烷基的子集。
如本文中使用的，術語“磷酸根合”是指式-OPO3H2的單價基團。
如本文中使用的，“磷腈部分”或“磷腈基團”是指以下通式的結構 如本文中使用的，“磷腈系留化合物”或“磷腈系留基團”是指具有至少一個磷腈部分或基團的系留化合物或系留基團。
如本文中使用的，術語“膦酰基”是指式-PO3H2的單價基團。
如本文中使用的，術語“磷酰胺基”是指式-NHPO3H2的單價基團。
如本文中使用的，術語“芳香族伯氨基”是指式-ArNH2的單價基團，其中Ar為芳基。
如本文中使用的，術語“芳香族伸氨基”是指式-ArNRhH的單價第基團，其中Ar為芳基，Rh為烷基或芳基。
如本文中使用的，術語“叔氨基”是指式-NR2的基團，其中R為烷基。
如本文中使用的，術語“系留化合物”是指具有至少兩個反應基團的化合物。一個反應基團(即底物-反應性官能團)可與底物表面上的互補官能團反應形成系留基團。另一個反應基團可與包含親核體的材料反應或與另一個系留化合物(或其衍生物或低聚物)或另一個能夠與包含親核體的材料結合的部分反應。系留化合物的兩個反應基團的反應引起在底物和固定在底物上的包含親核體的材料如含胺材料之間形成連接體基團。
如本文中使用的，術語“系留基團”是指通過系留化合物與底物表面上的與系留化合物為互補的官能團反應形成的連接于底物的基團。
前述內容并非意在包括本發明所有可能的實施方案。本領域技術人員應該在考慮公開的其余部分，包括優選實施方案的詳細說明、不同的實施例、和權利要求后更完全地理解本發明的特點和優點。
優選實施方案的詳細說明本發明提供用于將包含親核體的材料固定到底物的制品和方法。描述了具有活性官能團的磷腈化合物作為底物和至少一種包含親核體的材料之間的系留化合物。可用于本發明的系留化合物包括易受親核攻擊的反應基團。系留化合物上的至少一個活性官能團提供系留化合物連接于底物表面的機構。其余的官能團可各自與包含親核體的材料如胺官能的蛋白質、酶、其它生物分子等反應。另外，官能團可與包含親核體的基團反應，或可以提供對其它部分如其它類似的系留化合物或其它活性部分的另外連接，其它類似的系留化合物或活性部分在結構上可為簡單的或復合的(如支鏈、直鏈、等)并且通常包括也能夠與包含親核體的材料結合的另外的反應基團。
在本發明的實施方案中，用于將生物分子結合到底物表面的系留化合物包括磷腈基團，并且可具有式I所示的一般結構
其中其中每個X可相同或不同，并且包括易受親核攻擊以與包含親核體的材料結合的反應基團。通常為，X包括鹵素，并且最通常地，X為氯。
可用于本發明的磷腈系留化合物包括氯化磷腈三聚物(“PNC”)，其中式I中的每個X為氯。在將PNC系留到底物時，至少一個氯與底物表面上的部分反應，以將PNC部分結合于底物。當PNC部分結合于底物時，磷腈系留化合物包括另外的反應基團，各自能夠與包含親核體的材料如生物學活性物質反應，通過磷腈部分將生物學活性物質系留于底物。
在本發明的一些實施方案中，磷腈系留基團可唯一衍生自PNC分子。在一些實施方案中，磷腈系留基團可衍生自被認為是PNC的低聚物或衍生物的化合物。參考式I，唯一衍生自PNC的系留基團為其中每個X為氯的那些式I的化合物。
適用于本發明的磷腈三聚物的低聚物包括其中至少一個X基團為氯的式I的化合物。
適合于包括在本發明的磷腈系留基團中的PNC的衍生物包括其中至少一個X被取代基取代的式I的化合物，取代基可以包括單官能團、雙官能團、或其它多官能團，其中官能團通常為親核體。這種官能團可完全或部分地為脂肪族(直鏈或支鏈的)或芳香族的有機部分。在一些實施方案中，可以在將磷腈部分與底物連接之前使單官能、雙官能和/或多官能部分結合于磷腈部分。在一些實施方案中，可以在磷腈部分已經與底物連接(如結合)之后使單官能、雙官能和/或多官能部分結合于磷腈部分。
在其中磷腈部分衍生自PNC的實施方案中，氯(式I的X都是氯)的反應通常為順序進行的，并且每個氯的反應性根據保留在PNC分子上的氯的數目、與PNC反應的殘基的性質(如親核性、位阻)和反應條件(溫度、水的存在、化學計量或反應物等)而定。在例如式I的一個基團X與底物表面上部分反應以將磷腈部分與底物結合時，其余的未反應的X基團仍然能夠與包括單官能、雙官能和/或多官能部分的包含親核體的材料反應。
單官能團包括具有能夠與式I化合物的X基團之一反應的反應基團(如親核體)，但是通常不包括另外的反應基團。在一些實施方案中，單官能團可以包括具有在本發明的底物或系留基團中需要或期望的一種或多種期望性質的基團。適合的單官能團包括使反應產物為親水性或疏水性的基團、增強在某些溶劑中的溶解度的基團、增強分子間相互作用的基團、等等。其例子包括單官能的有機醇、胺和硫醇。
雙官能團可為連接基團，它們包括可與磷腈部分反應的第一反應基團，和還可與磷腈部分反應或可與包括式I的第二化合物諸如例如PNC的另一個化合物或部分反應的第二反應基團。在一些實施方案中，雙官能團包括可以將磷腈部分彼此連接以形成由至少兩個通過雙官能連接基團彼此連接的磷腈部分組成的系留基團。在這種結構中，磷腈部分包括能夠與其它包含親核體的材料諸如例如生物學活性分子結合的未反應的基團(如式I的未反應的X基團)。在一些實施方案中，未反應的基團可以在通過一個或多個雙官能連接基團系留或連接在一起的一個、兩個或多個磷腈部分上包括氯。在一些實施方案中，雙官能團可與同一磷腈部分上的兩個反應基團(式I的兩個X基團)反應。
適合的雙官能部分包括具有兩個反應基團如兩個親核基團的化合物。一些具體的雙官能部分包括例如4，7，10-三氧雜-1，13-十三烷二胺1，6-己二胺、甲基環氧乙烷、對苯二胺、2-氨基乙醇、4，4-硫基雙苯硫酚、二甲基-1，6-己二胺。其它雙官能部分為本領域技術人員已知的，本發明不在任何方面受前述具體部分的限制。
多官能部分也可包括連接基團，其中它們包括可與結合于底物的第一磷腈部分反應的第一反應基團，和可與同一磷腈部分或其它化合物或部分(包括其它磷腈部分或式I化合物(如TCT))反應的第二、第三和可能的其它另外的反應基團。在一些實施方案中，多官能團包括可以使兩個或多個磷腈部分彼此連接以形成由通過多官能連接基團連接在一起的兩個或多個磷腈部分組成的支鏈的系留基團的連接基團。在這種結構中，磷腈部分包括能夠與其它包含親核體的材料諸如例如一種或多種生物學活性分子結合的未反應的基團(如，式I的未反應的X基團)。在一些實施方案中，未反應的基團可以在通過一個或多個多官能連接基團系留或連接在一起的一個、兩個或多個磷腈部分上包括氯。在一些實施方案中，多官能連接基團可與第一磷腈基團上超過一個的反應基團反應，然后還可與其它磷腈基團或其它基團上的其它反應基團反應。
適合的多官能部分包括具有超過兩個反應基團(如，親核基團)的化合物。在一些實施方案中，多官能部分可為低聚物或聚合物部分。一些具體的多官能部分包括例如水解的2-乙基-4，5-二氫-唑均聚物、聚氮丙啶(包括直鏈和支鏈的結構)，以及本領域技術人員已知的其它部分。
應該理解，不應將前述說明解釋為是限于本文中所述的具體的單官能、雙官能或其它多官能的基團。本發明意在包括具有至少一個磷腈部分的系留化合物和系留基團。
本發明提供制品，其包括連接于底物的如本文中所述的磷腈系留基團。連接于底物的系留基團為底物表面上的互補官能團“G”與式I化合物的至少一個X基團的反應產物。連接于底物的系留基團具有至少一個、通常為兩個或多個可與另一種分子或材料(如包含親核體的材料)反應以捕獲該材料并且將其系留于底物的反應基團。
底物為可以連接磷腈系留化合物的固相材料。底物不溶于在使式I的化合物連接于底物表面時可能使用的溶液或溶劑中。通常，磷腈系留化合物只連接于底物的外部，而底物的其余部分在將磷腈系留基團連接于底物的過程中不被改變。如果底物具有遍及底物范圍分布的基團“G”，典型地只有外部(在表面上或接近表面)的那些基團通常能夠與式I化合物的X基團反應。
底物可為任何有用的形式，包括但不限于薄膜、片材、膜、過濾器、非織造或織造纖維、中空或固體小珠、瓶、板、管、棒、管道、或小圓片。底物可為多孔的或無孔的、剛性的或撓性的、透明的或不透明的、澄清的或彩色的、和反射性的或非反射性的。適合的底物材料包括例如聚合物材料、玻璃、陶瓷、金屬、金屬氧化物、水合金屬氧化物、或其組合。
底物可為單層或單一材料，并且可具有一種或多種材料的多個層。例如，底物可具有一個或多個內層或第一層，其為最外層提供支持，其中底物的外層包括能夠與式I化合物的X基團反應的互補官能團。在一些實施方案中，外層的表面可經過化學改性或涂有另一種材料，以提供包括能夠與磷腈基團(包括式I的基團)反應的互補官能團。
適合用作底物或底物的一部分的適當的聚合物材料包括但不限于聚烯烴、聚苯乙烯、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯腈、聚(乙酸乙烯酯)、聚乙烯醇、聚氯乙烯、聚甲醛、聚碳酸酯、聚酰胺、聚酰亞胺、聚氨酯、酚醛塑料、多胺、氨基環氧樹脂、聚酯、聚硅氧烷、纖維素基聚合物、多糖、或其組合。在一些實施方案中，聚合物材料是使用具有能夠與磷腈基團(包括式I化合物中的基團X)反應的互補官能團的共聚單體制備的共聚物。例如，共聚單體可包含羧基、巰基、羥基、氨基、或烷氧基甲硅烷基。
在一些實施方案中，適當的聚合物材料包括由熱致相分離(“TIPS”)產生的那些，熱致相分離為相轉化方法，其中澆鑄最初均一的聚合物溶液，然后使其暴露在較冷界面下(水浴或冷卻澆鑄輪)并通過降溫在溶液膜中誘導相分離。適合的TIPS薄膜或膜可具有廣泛的物理薄膜性質和細微孔徑。它們可為從任何多種聚合物制備的相對剛性的或非剛性的底物。根據美國專利4,539,256、5,120,594、和5,238,623的教導制備的TIPS膜都適合用于本發明中。TIPS膜可以包括例如高密度聚乙烯(HDPE)、聚丙烯、聚偏氟乙烯(PVDF)、聚乙烯-乙烯醇共聚物(如得自EVAL Company of America(EVALCA)，Houston，Texas)的商業名稱EVAL F101A下)。膜可以包括材料的組合如TIPS、HDPE或涂有親水性聚合物(聚乙烯-乙烯醇共聚物或EVAL)的聚丙烯膜、或涂有親水性的、強堿性的、帶正電的涂層如聚二烯丙基二甲基氯化銨或結合了季銨化的二甲氨基乙基丙烯酸酯的聚合物的TIPS聚丙烯載體。用于本發明的適合的TIPS膜的另一個例子為購自St.Paul，Minnesota的3MCompany的HDPE膜。這種膜的特征在于包括約0.09μm的孔徑大小和約0.9密耳(0.023mm)的厚度。通常，TIPS技術可以提供孔徑尺寸在微米和超濾范圍內的多種物理薄膜性質，如包括孔徑為約80nm到約0.5微米范圍內的那些。
可將材料的組合用作固體支撐件，并且前述說明應該被理解為包括單獨的上述材料和上述材料與其它材料的組合。
本發明的一些實施方案可利用具有施用于TIPS膜或另一種聚合物底物上的類金剛石玻璃(DLG)涂層的多層底物。DLG涂層可使用已知技術使用，諸如通過在EP 1 266 045 B1(David等人)中描述的等離子體沉積工藝。在使用TIPS底物的實施方案中，DLG涂層通常使用在TIPS膜的整個表面上，以便DLG延伸進入TIPS膜的孔中。如所述，其它材料可用于生產TIPS膜，并且可類似地將DLG涂層施用于這種其它材料，以提供用于本發明適合的底物。
適合的玻璃和陶瓷底物材料可以包括例如鈉、硅、鋁、鉛、硼、磷、鋯、鎂、鈣、砷、鎵、鈦、銅、或其組合。玻璃通常包括各種類型的含硅酸鹽材料。
在一些實施方案中，底物包括如國際專利申請WO 01/66820 A1中所述的類金剛石玻璃層，所述申請的公開被全文并入本文作為參考。類金剛石玻璃為無定形物質，其包括碳、硅、和選自氫、氧、氟、硫、鈦、或銅的一種或多種元素。一些類金剛石玻璃材料通過等離子體工藝由四甲基硅烷前體形成。可以生產疏水材料，將其進一步在氧等離子體中處理，以控制表面上的硅烷醇濃度。
類金剛石玻璃可為薄膜形式或為底物中另一層或另一種材料上的涂層形式。在一些應用中，類金剛石玻璃可為薄膜形式，其具有至少30重量％的碳、至少25重量％的硅、和最多45重量％的氧。這種薄膜可為撓性的和透明的。在一些實施方案中，類金剛石玻璃為多層底物的外層。在具體的實施例中，底物的第二層(如載體層)為聚合物材料，第一層為類金剛石玻璃的薄膜。系留基團連接于類金剛石玻璃的表面。
在某些多層底物中，類金剛石玻璃沉積在類金剛石碳層上。例如，第二層(如，載體層)為具有在表面上沉積的類金剛石碳層的聚合物薄膜。在類金剛石碳層上淀積類金剛石玻璃層。在一些實施方案中，類金剛石碳為多層底物中聚合物層與類金剛石玻璃層之間的粘結層或底漆層。例如，多層底物可以包括聚酰亞胺或聚酯層、淀積在聚酰亞胺或聚酯上的類金剛石碳層，和淀積在類金剛石碳上的類金剛石玻璃層。在另一個實施例中，多層底物可以包括按以下順序布置的層疊體類金剛玻璃、類金剛石碳、聚酰亞胺或聚酯層、類金剛石碳、和類金剛石玻璃。
類金剛石碳膜可以從例如乙炔在等離子體反應器中制備。制備這種薄膜的其它方法在美國專利5,888,594和5,948,166以及文章M.David等人，AlChE Journal，37(3)，367-376(March 1991)中描述，其公開被并入本文作為參考。
用于底物的適合的金屬、金屬氧化物、或水合金屬氧化物包括例如金、銀、鉑、鈀、鋁、銅、鉻、鐵、鈷、鎳、鋅、等等。含金屬的材料可為合金，如不銹鋼、氧化銦錫等。在一些實施方案中，含金屬的材料為多層底物的表層。例如，底物可具有聚合物型第二層和含金屬的第一層。在一個實施例中，第二層為聚合物薄膜層，第一層為金的薄膜。在其它實施例中，多層底物包括涂有含鈦層然后涂有含金層的聚合物薄膜。也就是說，鈦層可以起用于將金層粘附于聚合物膜的粘結層或底漆層的作用。
在多層底物的其它實施例中，硅載體層覆蓋有鉻層，然后是金層。鉻層可以改善金層對硅層的粘合。
底物的表面通常包括能夠與羧基、鹵素(如氯)、鹵代羰基、鹵代羰基氧基、氰基、羥基、巰基、異氰酸根合、鹵代甲硅烷基、烷氧基甲硅烷基、酰氧基甲硅烷基、疊氮基、鹵代烷基、叔氨基、芳香族伯氨基、芳香族仲氨基、二硫化物、烷基二硫化物、苯并三唑基、磷腈、膦酰基、磷酰胺基、磷酸根合、或烯鍵不飽和基團反應的基團。也就是說，底物包括能夠與式I化合物中的基團X反應的基團“G”(即，底物包括基團X的互補官能團)。底物可以包括經過處理為具有包括互補官能團的外層的載體材料。底物可以從已知具有能夠與X反應的基團或具有能夠與中間化合物反應的基團的任何固相材料制備，所述中間化合物通過與底物表面上的部分反應和與X反應以將底物和磷腈基團連接在一起可以起到連接基團的作用。
羧基或鹵代羰基可與具有羥基的底物反應以形成含羰基氧基的連接基團。具有羥基的底物材料的例子包括但不限于聚乙烯醇、電暈放電處理的聚乙烯、羥基取代的聚甲基丙烯酸酯、羥基取代的聚丙烯酸酯、和載體材料如玻璃或聚合物膜上的聚乙烯醇涂層。
羧基或鹵代羰基還可以與具有巰基的底物反應以形成含羰基硫基的連接基團。具有巰基的底物材料的例子包括但不限于巰基取代的聚丙烯酸酯、巰基取代的聚甲基丙烯酸酯、和用巰基烷基硅烷處理的玻璃。
另外，羧基或鹵代羰基可與芳香族伯氨基、芳香族仲氨基、或脂肪族仲氨基反應以形成含羰基亞氨基的連接基團。具有芳香族伯或仲氨基的底物材料的例子包括但不限于多胺、胺取代的聚甲基丙烯酸酯、胺取代的聚丙烯酸酯、聚氮丙啶、和用氨基烷基硅烷處理的玻璃。
鹵代羰基氧基可與具有羥基的底物反應以形成含氧基羰基氧基的連接基團。具有羥基的底物材料的例子包括但不限于聚乙烯醇、電暈放電處理的聚乙烯、羥基取代的聚甲基丙烯酸酯、羥基取代的聚丙烯酸酯、和載體材料如玻璃或聚合物膜上的聚乙烯醇涂層。
鹵代羰基氧基還可以與具有巰基的底物反應以形成含氧基羰基硫基的連接基團。具有巰基的底物材料的例子包括但不限于巰基取代的聚甲基丙烯酸酯、巰基取代的聚丙烯酸酯、和用巰基烷基硅烷處理的玻璃。
另外，鹵代羰基氧基可與具有芳香族伯氨基、芳香族仲氨基、或脂肪族仲氨基的底物反應以形成含氧基羰基亞氨基的連接基團。具有芳香族伯或仲氨基的底物材料的例子包括但不限于多胺、胺取代的聚甲基丙烯酸酯、胺取代的聚丙烯酸酯、聚氮丙啶、和用氨基烷基硅烷處理的玻璃。
羥基可與具有異氰酸酯基的底物反應以形成含氧基羰基亞胺基的連接基團。具有異氰酸酯基的適合的底物包括但不限于載體材料上的2-異氰酸根合乙基甲基丙烯酸酯聚合物涂層。適合的載體材料包括玻璃和聚合物材料如聚酯、聚酰亞胺等。
羥基還可以與具有羧基、羰基氧基羰基、或鹵代羰基的底物反應，以形成含羰基氧基的連接基團。適合的底物包括但不限于載體材料上的丙烯酸聚合物或共聚物涂層、或載體材料上的甲基丙烯酸聚合物或共聚物涂層。適合的載體材料包括玻璃和聚合物材料如聚酯、聚酰亞胺等。其它適合的底物包括聚乙烯與聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸的共聚物、或其組合。
巰基可與具有異氰酸酯基的底物反應。巰基與異氰酸酯基之間的反應形成含硫基羰基亞氨基的連接基團。具有異氰酸酯基的適合的底物包括但不限于載體材料上的2-異氰酸根合乙基甲基丙烯酸酯共聚物涂層。適合的載體材料包括玻璃和聚合物材料如聚酯、聚酰亞胺等。
巰基還可以與具有鹵代羰基的底物反應以形成含羰基硫基的連接基團。具有鹵代羰基的底物包括例如氯代羰基取代的聚乙烯。
巰基還可以與具有鹵代羰基氧基的底物反應以形成含氧基羰基硫基的連接基團。具有鹵代羰基的底物包括聚乙烯醇的氯甲酰基酯。
另外，巰基可以與具有烯鍵不飽和基團的底物反應以形成含硫醚的連接基團。具有烯鍵不飽和基團的適合的底物包括但不限于衍生自丁二烯的聚合物和共聚物。
磷腈部分如PNC可與含親核體的材料反應，包括具有親核體官能度的玻璃、類金剛石玻璃、金屬、金屬氧化物、和聚合物底物。可將DLG表面處理以包括為與PNC部分反應提供必要官能度的親核體如氨基硅烷(如3-氨基丙基三乙氧基硅烷、3-氨基三甲氧基硅烷)的表面。這種表面也可包括多孔性聚合物涂層(如，本文中所述的TIPS材料)。聚合物底物還可以包括例如氨接枝的燒結聚乙烯、氨化聚酯熔噴纖維膜、羥化聚丙烯、聚酯、和聚乙烯熔噴纖維膜、和氨基甲基化苯乙烯-二乙烯基苯。PNC材料也可與金屬或金屬氧化物材料反應。
異氰酸酯基可與具有羥基的底物反應以形成含氧基羰基亞氨基的連接基團。具有羥基的底物材料的例子包括但不限于聚乙烯醇、電暈放電處理的聚乙烯、羥基取代的聚甲基丙烯酸酯或聚丙烯酸酯、和玻璃或聚合物膜上的聚乙烯醇涂層。
異氰酸酯基還可與巰基反應以形成含硫基羰基亞氨基的連接基團。具有巰基的底物材料的例子包括但不限于巰基取代的聚甲基丙烯酸酯或聚丙烯酸酯、和用巰基硅烷處理的玻璃。
另外，異氰酸酯基可與芳香族伯氨基、芳香族仲氨基、或脂肪族仲氨基反應以形成含脲的連接基團。具有芳香族伯或仲氨基的適合的底物包括但不限于多胺、聚氮丙啶、和載體材料如玻璃上或聚合物材料如聚酯或聚酰亞胺上的氨基烷基硅烷涂層。
異氰酸酯基還可以與羧基反應以形成含O-酰基氨甲酰基的連接基團。具有羧酸基團的適合的底物包括但不限于玻璃或聚合物載體上的丙烯酸聚合物或共聚物的涂層、或甲基丙烯酸聚合物或共聚物的涂層。共聚物包括但不限于包含聚乙烯和聚丙烯酸或聚甲基丙烯酸的共聚物。適合的聚合物載體材料包括聚酯、聚酰亞胺等。
鹵代甲硅烷基、烷氧基甲硅烷基、或酰氧基甲硅烷基可以與具有硅烷醇基的底物反應以形成含二甲硅醚(disiloxane)的連接基團。適合的底物包括從多種玻璃、陶瓷材料、或聚合物材料制備的那些。這些基團還可以與在表面上具有金屬氫氧化物基團的多種材料反應以形成含硅烷的連接。適合的金屬包括但不限于銀、鋁、銅、鉻、鐵、鈷、鎳、鋅、等等。在一些實施方案中，金屬為不銹鋼或另一種合金。聚合物材料可以制備為具有硅烷醇基。例如，市售的具有硅烷醇基的單體包括得自Aldrich Chemical Co.，Milwaukee，WI的3-(三甲氧基硅烷基)丙基甲基丙烯酸酯和3-氨基丙基三甲氧基硅烷。
疊氮基可以與例如具有碳-碳三鍵的底物反應以形成含三唑二基(triazolediyl)的連接基團。疊氮基還可以與具有腈基團的底物反應以形成含四氮烯二基(tetrazenediyl)的連接基團。具有腈基團的底物包括但不限于載體材料如玻璃或聚合物材料上的聚丙烯腈涂層。適合的聚合物載體材料包括例如聚酯和聚酰亞胺等。具有腈基團的其它適合的底物包括丙烯腈聚合物或共聚物和2-氰基丙烯酸酯聚合物或共聚物。
疊氮基還可以與應變烯基團反應以形成含三唑二基的連接基團。具有應變烯基團的適合的底物包括具有側基降冰片烯基官能團的涂層。適合的載體材料包括玻璃和聚合物材料如聚酯和聚酰亞胺。
氮丙啶基還可與巰基反應以形成含β-氨基烷基硫醚的連接基團。具有巰基的底物材料的例子包括但不限于巰基取代的聚甲基丙烯酸酯或聚丙烯酸酯、和用巰基烷基硅烷處理的玻璃。
另外，氮丙啶基還可與羧基反應以形成含β-氨基烷基羰基的連接基團。具有羧基的適合的底物包括但不限于玻璃或聚合物載體上的丙烯酸聚合物或共聚物的涂層、或甲基丙烯酸聚合物或共聚物的涂層。共聚物包括但不限于包含聚乙烯和聚丙烯酸或聚甲基丙烯酸的共聚物。適合的聚合物載體材料包括聚酯、聚酰亞胺等。
鹵代烷基可以與例如具有叔氨基的底物反應以形成含季銨的連接基團。適合的具有叔氨基的底物包括但不限于聚二甲氨基苯乙烯或聚二甲氨基乙基甲基丙烯酸酯。
同樣地，叔氨基可以與例如具有鹵代烷基的底物反應以形成含季銨的連接基團。適合的具有鹵代烷基的底物包括但不限于載體材料上的鹵代烷基硅烷的涂層。載體材料可包括但不限于玻璃和聚合物材料如聚酯和聚酰亞胺。
芳香族伯氨基或芳香族仲氨基可與例如具有異氰酸酯基的底物反應以形成含氧基羰基亞氨基的連接基團。適合的具有異氰酸酯基的底物包括但不限于玻璃或聚合物載體上的2-異氰酸根合乙基甲基丙烯酸酯聚合物或共聚物的涂層。適合的聚合物載體材料包括聚酯、聚酰亞胺等。
芳香族伯氨基或芳香族仲氨基還可與包含羧基或鹵代羰基的底物反應以形成含羰基亞氨基的連接基團。適合的底物包括但不限于載體材料上的丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物涂層。載體材料可為例如玻璃或聚合物材料如聚酯或聚酰亞胺。其它適合的底物包括聚乙烯和聚甲基丙烯酸或聚丙烯酸的共聚物。
二硫化物或烷基二硫化物基團可以與例如金屬表面反應以形成含金屬硫化物的連接基團。適合的金屬包括但不限于金、鉑、鈀、鎳、銅、和鉻。底物還可以為合金如氧化銦錫或介電材料。
苯并三唑基可與例如具有金屬或金屬氧化物表面的底物反應。適合的金屬或金屬氧化物包括例如銀、鋁、銅、鉻、鐵、鈷、鎳、鋅、等等。金屬或金屬氧化物可包括合金，如不銹鋼、氧化銦錫等。
磷腈可與具有結合于底物表面的氨基官能度的底物反應。用氨基硅烷處理的玻璃表面和類金剛石玻璃表面適合于與磷腈部分反應并且與其連接。在這種DLG底物中，氨基官能度提供能夠通過親核攻擊與磷腈部分上的X基團(如氯)反應的互補官能團“G”。在得到的系統中，X基團被氨基官能度代替，從而將磷腈部分系留于底物。
膦酰基、磷酰胺基、或磷酸根合可與例如具有金屬或金屬氧化物表面的底物反應。適合的金屬或金屬氧化物包括例如銀、鋁、銅、鉻、鐵、鈷、鎳、鋅、等等。金屬或金屬氧化物可包括合金，如不銹鋼、氧化銦錫等。
烯鍵不飽和基團可以與例如具有被巰基取代的烷基的底物反應。反應形成含雜亞烷基的連接基團。適合的底物包括例如巰基取代的聚丙烯酸或聚甲基丙烯酸烷基酯。
烯鍵不飽和基團還可以與具有硅表面的底物反應，如與使用化學氣相淀積法形成的硅底物反應。這種硅表面可以包含可在鉑催化劑的存在下與烯鍵不飽和基團反應的-SiH基團，以形成硅結合于亞烷基的連接基團。
另外，烯鍵不飽和基團可以與具有碳-碳雙鍵的底物反應以形成含亞烷基的連接基團。這種底物包括例如衍生自丁二烯的聚合物。
本發明的制品通常包括底物和連接于底物的系留基團，所述系留基團包括底物表面上互補的底物官能團與式I的磷腈化合物(PNC)的反應產物，其中連接于底物的官能團為能夠與X反應形成離子鍵、共價鍵、或其組合的基團。在一些實施方案中，單個的互補的底物官能團可以與單個磷腈化合物反應以形成超過一個的鍵。連接于底物的官能團上的未反應基團(未反應的氯)可用于進一步與包含親核體的材料反應。
如果在底物上具有超過一個的反應基團，通常有超過一個的磷腈系留基團連接于底物。另外，底物可在底物表面上具有沒有與磷腈系留化合物反應的過量的反應基團。
底物上能夠與磷腈系留化合物反應的基團包括但不限于羥基、巰基、芳香族伯氨基、芳香族仲氨基、脂肪族仲氨基、氨基硅烷、疊氮基、羧基、羰基氧基羰基、異氰酸酯、鹵代羰基、鹵代羰基氧基、硅烷醇、和腈。
系留化合物對底物表面的連接(即，形成)可以使用多種技術檢測，諸如例如，在連接磷腈系留化合物之前和之后的底物上液體的接觸角測定法(如在系留基團連接于底物表面時接觸角改變)、橢圓光度法(如可以測量連接的層的厚度)、飛行時間質譜學(如在系留基團連接于底物時表面濃度改變)、和傅里葉變換紅外光譜學(如在系留基團連接于底物時反射率和吸光度改變)。
在本發明的制品的一些實施方案中，磷腈系留基團中的含鹵素部分與含胺材料反應，引起含胺材料固定于底物。在一些實施方案中，含胺材料為生物分子，諸如例如氨基酸、肽、DNA、RNA、蛋白質、酶、細胞器、免疫球蛋白、或其片段。在其它實施方案中，含胺材料為非生物胺，如含胺的被分析物。固定化胺的存在可以使用例如質譜學、接觸角測定法、紅外光譜學、和橢圓光度法測定。另外，如果含胺材料為生物學活性物質，可使用多種免疫測定法和光學顯微技術。
可以將其它材料結合于含胺材料。例如，可以將互補RNA或DNA片段與固定化RNA或DNA片段雜交。在另一個例子中，抗原可以結合于固定化抗體，或者抗體可以結合于固定化抗原。在更具體的例子中，可以將細菌如金黃色葡萄球菌結合于固定化生物分子。
本發明的另一個方面提供將包含親核體的材料固定于底物的方法。該方法涉及通過使底物表面上的互補官能團與磷腈部分(如使式I化合物中至少一個的反應基團X反應)反應制備連接于底物的系留基團；和使磷腈部分的至少一個反應基團(如式I的一個或多個剩余的反應基團X)與包含親核體的材料反應，在底物和包含親核體的材料之間形成磷腈連接體基團。在一個實施方案中，包含親核體的材料為含胺的材料，并且使含胺的材料固定的方法由反應圖解A表示反應圖解A 其中U1是由式I化合物中一個X基團與底物表面上的互補官能團G反應形成的連接基團；T為含胺材料的其余部分(如基團T表示含胺材料除掉胺基之外的所有部分)。H2N-T為任何適合的含胺材料。在一些實施方案中，H2N-T為生物分子。
前述反應圖解A的變體也在本發明的范圍內。在其中將單官能部分結合于磷腈部分的實施方案中，方法涉及通過以下過程制備連接于底物的系留基團使底物表面上的互補官能團與磷腈基團(如式I化合物中至少一個反應基團X)反應，和使磷腈基團(如式I中剩余的另一個反應基團X)與一個或多個單官能部分反應以形成系留基團，系留基團包括結合于底物的磷腈部分，并且還有單官能部分結合于磷腈部分。含親核體的材料可結合于磷腈部分，用于使含親核體的材料系留于底物。
在具有雙官能部分的實施方案中，雙官能部分結合于已經系留于底物表面的第一磷腈部分。雙官能部分也可結合于第二磷腈部分，并且第二磷腈部分可結合于包含親核體的材料以將包含親核體的材料系留于底物。在包括多官能部分的實施方案中，多官能部分可結合于已經系留于底物表面的第一磷腈部分，并且多官能部分也可結合于第二、第三、或其它另外的磷腈部分。隨后，第一、第二、第三或其它磷腈部分上的反應基團可與包含親核體的材料反應并結合，以將包含親核體的材料系留于底物。另外，多官能部分可與單個磷腈基團上的多個反應基團反應。
因此，本發明提供將包含親核體的材料固定于底物的方法，該方法涉及提供磷腈系留化合物(如，式I的化合物)；提供具有能夠與磷腈系留化合物反應的互補官能團的底物；通過磷腈系留化合物與底物上的互補官能團反應產生離子鍵、共價鍵、或其組合制備連接于底物的磷腈系留基團；和使連接于底物的磷腈系留基團與包含親核體的材料反應，從而固定包含親核體的材料。
本發明的化合物可用于例如固定包含親核體的材料如含胺的材料。在一些實施方案中，含胺的材料為含胺的被分析物。在其它實施方案中，含胺材料為生物分子，諸如例如氨基酸、肽、DNA、RNA、蛋白質、酶、細胞器、免疫球蛋白、或其片段。固定化的含生物胺的材料可用于疾病或遺傳缺陷的醫療診斷。固定化的含胺材料還可用于生物學分離或用于檢測多種生物分子的存在。另外，固定化的含胺材料可用于生物反應器或作為制備其它材料的生物催化劑。連接于底物的系留基團可用于檢測含胺的被分析物。
含生物胺的材料經常可在連接于底物之后保持活性，使得固定化抗體可以與抗原結合或使得固定化抗原可以與抗體結合。含胺的材料可以結合于細菌。在更具體的例子中，固定化的含胺材料可以結合于金黃色葡萄球菌(如固定化的含胺材料可以是具有可以特異性地結合于細菌的部分的生物分子)。
本發明的實施方案在以下非限制性實施例中進一步描述。
實施例實施例1制備涂有類金剛石玻璃(DLG)的官能化多孔膜。使用EP 1 266 045B1(David等人)中所述的等離子體工藝，用類金剛石玻璃(DLG)涂布5cm2高密度聚乙烯熱致相分離(HDPE TIPS)膜(孔徑大小約0.09μm，厚度約23微米，得自3M Company，St.Paul，MN)，使得DLG涂層延伸進入TIPS膜的孔中。將涂有DLG的TIPS膜置于包含2體積％的3-氨基丙基三乙氧基硅烷(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)、1ml水和幾滴0.1N乙酸的50ml乙醇中。在10分鐘后，將膜從溶液中取出，用乙醇洗并干燥。
通過將膜置于包含0.2g經過升華純化的PNC(Sigma Aldrich，St.Louis，MO)的20ml甲苯溶液中在官能化膜上系留連接PNC三聚物。氨基硅烷的氨基通過置換氯與磷腈環反應，剩余的氯用于連接到生物學活性分子如蛋白質分子。將膜置于包含10mg葡萄糖氧化酶的葡萄糖氧化酶在PBS緩沖溶液中的溶液中3小時。將膜取出并用水和緩沖溶液洗，隨后用十二烷基硫酸鈉洗，以除去任何離子性結合的蛋白質。
使用市售的試驗試劑盒和操作規程(Pierce Chemicals，Rockford，IL)在得自實施例1的膜上進行Bicinchonic acid analysis(BCA)以測定已經固定在表面上的蛋白質總量。測定固定在1cm2TIPS多孔膜中的蛋白質總量為212μg/1.5mg膜。
進行葡萄糖氧化酶試驗以測定在膜中具有活性的酶的量。試驗使用葡萄糖氧化酶試驗試劑盒，使用得自Sigma-Aldrich的操作規程。最初測定的活性酶的量為25.5μg/1.5mg膜。在五(5)天之后，活性酶的量為23.3μg/1.5mg膜。
進行實驗以證明酶活性是由于酶對膜表面上的系留基團的共價連接而不是來自于溶液中的未連接的酶。將如上所述制備的1cm2底物置于葡萄糖氧化酶試驗溶液中30秒，并測量在450nm的吸光度。然后將膜從溶液中取出，保持約30秒并再次檢查吸光度。在將膜從溶液取出之后，吸光度沒有增加，從而表明不含自由漂浮的酶。將膜放回到溶液中以允許溶液中的酶與底物表面上的系留基團之間發生進一步的反應。收集另外的吸光度測量數據，持續60分鐘，數據總結在表1中。
表1在450nm的吸光度

實施例2使用以下條件用DLG處理載玻片。將每個載玻片在氧等離子體中蝕刻10秒并暴露于四甲基硅烷和氧等離子體的混合物中20秒，隨后暴露于氧等離子體中另外10秒。然后將涂有DLG的載玻片置于3-氨基丙基三乙氧基硅烷的1％乙醇溶液中10分鐘。其后，將載玻片取出并用乙醇洗，在氮氣流下干燥。將干燥的載玻片與氯化磷腈在甲苯(Sigma Aldrich，St.Louis，MO)中反應。反應時間從幾分鐘到最多一小時不等。進行接觸角測定法以監控和證實PNC對連接于DLG底物的氨基丙基三乙氧基硅烷的連接。胺具有20度的低接觸角，其在與PNC反應后增加到45度，并且在約10分鐘內穩定。PNC連接的接觸角數據在表2中提供。
表2

通過將樣品暴露于1mM的賴氨酸(Sigma Aldrich)溶液中使反應時間為10分鐘的樣品進一步與賴氨酸反應。賴氨酸的氨基與PNC的反應使接觸角降低，其在涂有DLG的載玻片與賴氨酸接觸之后的約10分鐘內穩定。接觸角數據在表3中表示。
表3

實施例3首先將約20cm×30cm的聚酰亞胺薄膜(得自E.I.du Pont deNemours & Co.，Wilmington，DE，商業名稱“KAPTON E”)用類金剛石碳(DLC)涂布，隨后用類金剛石玻璃(DLG)涂布。使用3M 811膠帶(3M Company，St.Paul，MN)將聚酰亞胺薄膜固定于2480型平行板電容偶合活性離子刻蝕機(PlasmaTherm，St.Petersburg，FL)的動力電極。使用乙炔等離子體將DLC淀積在聚酰亞胺膜上。將離子刻蝕機室關閉并將室泵送到0.67Pa(0.005Torr)的壓力。將氧氣以每分鐘500標準cm3的流速引入到室中，并維持室的壓力在6.7Pa(0.050Torr)。將等離子體點火并在2000W的功率維持15秒。然后終止氧氣流并將室泵送到0.67Pa(0.005Torr)的壓力。將乙炔氣以每分鐘200標準cm3的流速引入到室中，并維持室的壓力在2Pa(0.015Torr)。將等離子體點火并在1600W的功率維持10秒。然后終止乙炔氣流并將室泵送到0.67Pa(0.005Torr)的壓力。
然后使用四甲基硅烷等離子體將類金剛石玻璃(DLG)淀積在DLC/聚酰亞胺底物上，首先將氧氣以每分鐘500標準cm3的流速引入到室中。維持室的壓力在20Pa(0.15Torr)。將等離子體點火并在300W的功率維持10秒。維持氧氣流速在每分鐘500標準cm3，將四甲基硅烷氣體以每分鐘150標準cm3的流速引入到室中。維持室的壓力在20Pa(0.15Torr)。將等離子體點火并在300W的功率維持12秒。終止四甲基硅烷氣流。在1分鐘后，維持氧氣流和20Pa(0.15Torr)的室壓力，將等離子體點火并在300W的功率維持20秒。然后終止氧氣流并將室壓力泵送到0.67Pa(0.005Torr)的壓力。然后將室對環境開放并將聚酰亞胺/DLC/DLG底物重新定位，使得DLG涂層面對電極。重復前述等離子體處理順序，以提供在兩側具有DLC/DLG涂層的具有聚酰亞胺的底物。
從根據前述工藝制備的20cm×30cm的聚酰亞胺/DLC/DLG底物切取每個約1cm2的兩個試驗底物。將一個底物指定為對照。另一個底物指定為實驗底物，并將實驗底物進一步如實施例1中所述用3-氨基丙基三乙氧基硅烷(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)和PNC三聚體處理。對照底物不經處理并保持不含硅烷以及PNC。
通過將每個底物置于無菌培養管中并使底物暴露于1ml的pH被調節到9并且包含50μg的mIgG(購自Jackson Immuno Researchlaboratories Inc West Grove，PA，目錄編號#209-005-082)的100mMCHES 2-{N-環己基氨基乙烷}磺酸緩沖劑(購自Sigma，St.Louis，MO，目錄編號C-2885)而使抗人類的小鼠IgG(mIgG)固定在對照底物的DLG表面上和實驗底物的用PNC處理的表面上。對于一般試驗的固定時間設置為兩(2)小時同時置于在室溫下以120動作/分鐘的振動器(IKA HS260 basic)中。通過Pasteur移液管將溶液從培養管中取出并將如此處理的對照和實驗底物用包含0.05％Tween 20的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)緩沖劑洗滌三次。將兩個底物再次置于無菌培養管中并向每個培養管加入1.5ml的封閉緩沖液、包含2％脫脂奶粉的PBS緩沖劑，并使其在振動器上反應一(1)小時。使用Pasteur移液管將溶液從管取出并將每個底物再次用前述的洗滌緩沖劑洗滌三次。
mIgG抗體與生物素結合的人IgG(hIgG-BT)反應。hIgG-BT在PBS緩沖劑中的濃度為4μg/ml(得自Jackson Immuno Research laboratoriesInc West Grove，PA，目錄編號#009-060-003)。將1ml的溶液置于包含底物的培養管中并在振動器中培養一小時，然后如前所述將底物用緩沖劑洗滌3次。在這個反應之后是與鏈霉親和素辣根過氧化物(SA-HRP)(該物質是特異性結合于生物素的檢測酶)的反應。將1ml的0.5μg/ml SA-HRP(購自Jackson Immuno Research laboratories Inc WestGrove，PA，目錄編號#023-060-021，在pH 7.4的緩沖劑中)加入到培養管中并使其在振動器上反應30分鐘。將樣品再次用洗滌緩沖劑洗滌3次，并將1ml的濃度為0.3mg/ml的著色劑2，2-連氮基-二(3-乙基苯并噻唑啉)磺酸(ABTS)加入到培養管中以促進可在分光光度計上在405nm測量的酶促變色。在暴露于ABTS下5分鐘之后，加入1ml的1％十二烷基硫酸鈉(SDS)溶液以終止反應。
使用UV-Vis分光光度計在405nm測量處理的對照底物和對處理的實驗底物的吸光度。對照樣品的吸光度為0.1。實驗底物上樣品的吸光度為0.2。
實施例4制備1cm2的底物(聚酰亞胺/DLC/DLG)樣品并如實施例3所述用硅烷和PNC官能化。使用未經硅烷或PNC處理的聚酰亞胺/DLC/DLG底物作為“對照”底物。將對金黃色葡萄球菌特異性的兔IgG(購自Accurate Chemical and Scientific，Westbury，New York)的4.52mg/ml溶液固定在底物的表面上，包括對照底物的表面上。然后將底物固定(通過輕敲)在玻璃板上并通過移液管加入包含濃度為5×108cfu/ml的金黃色葡萄球菌的50μl PBS緩沖劑，使其靜置約30分鐘。將樣品洗滌，然后通過將每個樣品暴露于吖啶橙下10分鐘進行染色。在使用之前將濃度10mg/ml的吖啶橙(得自Molecular probes，名稱A3568)用蒸餾水稀釋到0.1mg/ml。
將每個經如此染色的底物通過Olympus Model FV-300共焦顯微鏡(Leeds Precision，Inc，Minnesota)觀察。觀察到PNC官能化的底物包括與未官能化的對照底物相比更高水平的被染色細菌，表明PNC官能化的底物與未官能化的對照樣品相比結合更多的金黃色葡萄球菌。
權利要求
1.制品，其包括具有第一表面和第二表面的底物；連接于底物第一表面的磷腈系留基團，磷腈系留基團包括底物第一表面上的官能團與磷腈系留化合物的反應產物。
2.權利要求1的制品，其中底物的第一表面包括類金剛石玻璃。
3.權利要求2的制品，其中類金剛石玻璃包括至少30重量％的碳、至少25重量％的硅、和最多45重量％的氧。
4.權利要求1的制品，其中底物為包括第一層和第二層的多層結構，第一層包括聚合物，第二層包括類金剛石玻璃。
5.權利要求4的制品，其中聚合物包括微孔結構，該微孔結構包括孔徑為約80納米到約0.5微米的孔。
6.權利要求4的制品，其中聚合物包括熱致相分離膜，該熱致相分離膜包括選自以下的材料高密度聚乙烯、聚丙烯、聚偏氟乙烯、聚乙烯-乙烯醇共聚物、以及前述兩種或多種的組合。
7.權利要求6的制品，其中熱致相分離膜包括高密度聚乙烯，該高密度聚乙烯包括多個孔徑大小為約0.5微米到0.0229毫米的孔。
8.權利要求7的制品，其中類金剛石玻璃被涂布到熱致相分離膜上，類金剛石玻璃延伸進入熱致相分離膜的孔中。
9.權利要求1的制品，其中底物為包括第一層、第二層和第三層的多層結構，第一層包括聚合物，第二層包括類金剛石碳，第三層包括固定于類金剛石碳的類金剛石玻璃。
10.權利要求9的制品，其中聚合物為聚酰亞胺。
11.權利要求1的制品，其中底物為包括第一層和第二層的多層結構，第一層包括玻璃，第二層包括固定于玻璃的類金剛石玻璃。
12.權利要求1的制品，其中底物包括金屬或金屬氧化物。
13.權利要求1的制品，其中底物包括選自以下的金屬或金屬氧化物金、銀、鈦、鉑、鈀、鋁、銅、鉻、鐵、鈷、鎳、鋅、不銹鋼、氧化銦錫、以及前述兩種或多種的組合。
14.權利要求12的制品，其中底物另外包括支持金屬的載體層。
15.權利要求14的制品，其中載體層包括聚合物。
16.權利要求1的制品，其中磷腈系留化合物包括下式I的結構， 其中每個X可相同或不同，并且包括易受親核攻擊而與包含親核體的材料結合的反應基團。
17.權利要求16的制品，其中底物的第一表面包括具有能夠與式I的X基團反應的互補官能團的類金剛石玻璃。
18.權利要求17的制品，其中互補官能團為式-Si(OR1)3-n[(R2)NH2]n的氨基硅烷，其中n為0到2的整數，R1為碳鏈長度小于5的烷基，R2為碳鏈長度至少為2的另一個烷基。
19.權利要求17的制品，其中互補官能團為選自3-氨基丙基三乙氧基硅烷、3-氨基三甲氧基硅烷、及其組合的氨基硅烷。
20.權利要求16的制品，其中每個X為氯。
21.權利要求1的制品，其另外包括固定于磷腈系留基團的單官能、雙官能、或多官能部分。
22.將包含親核體的材料固定于底物的方法，該方法包括提供磷腈系留化合物；提供具有能夠與磷腈系留化合物反應的官能團的底物；通過磷腈系留化合物與底物上的官能團反應產生離子鍵、共價鍵、或其組合制備連接于底物的磷腈系留基團；和使連接于底物的磷腈系留基團與包含親核體的材料反應從而固定包含親核體的材料。
23.權利要求22的方法，其中提供磷腈系留化合物包括提供下式I的化合物， 其中每個X可相同或不同，并且包括易受親核攻擊而與包含親核體的材料結合的反應基團。
24.權利要求23的方法，其中每個X為氯。
25.權利要求22的方法，其中提供具有能夠與磷腈系留化合物反應的官能團的底物包括提供具有第一表面和第二表面的底物，第一表面由類金剛石玻璃組成。
26.權利要求25的方法，其中類金剛石玻璃包括至少30重量％的碳、至少25重量％的硅、和最多45重量％的氧。
27.權利要求22的方法，其中底物為包括第一層和第二層的多層結構，第一層包括聚合物，第二層包括固定于聚合物的類金剛石玻璃。
28.權利要求27的方法，其中聚合物包括熱致相分離膜，該熱致相分離膜包括選自以下的材料高密度聚乙烯、聚丙烯、聚偏氟乙烯、聚乙烯-乙烯醇共聚物、以及前述兩種或多種的組合。
29.權利要求28的方法，其中熱致相分離膜包括高密度聚乙烯，該高密度聚乙烯具有大量孔徑大小為約0.5微米到0.0229毫米的孔。
30.權利要求22的方法，其中底物為包括第一層、第二層和第三層的多層結構，第一層包括聚合物，第二層包括類金剛石碳，第三層包括類金剛石玻璃。
31.權利要求30的方法，其中聚合物為聚酰亞胺。
32.權利要求22的方法，其中底物為包括第一層和第二層的多層結構，第一層包括玻璃，第二層包括固定于玻璃的類金剛石玻璃。
33.權利要求22的方法，其中提供具有能夠與磷腈系留化合物反應的互補官能團的底物包括提供具有第一表面和第二表面的底物，第一表面由金屬或金屬氧化物組成。
34.權利要求22的方法，其中底物包括選自以下的金屬或金屬氧化物金、銀、鈦、鉑、鈀、鋁、銅、鉻、鐵、鈷、鎳、鋅、不銹鋼、氧化銦錫、以及前述兩種或多種的組合。
35.權利要求34的方法，其中底物另外包括支持金屬的載體層。
36.權利要求35的方法，其中載體層包括聚合物。
37.權利要求22的方法，其中使連接于底物的磷腈系留基團與包含親核體的材料反應從而固定包含親核體的材料包括使磷腈系留基團與選自以下的包含親核體的材料反應含胺的被分析物、氨基酸、肽、DNA、RNA、蛋白質、酶、細胞器、免疫球蛋白、其片段，以及前述兩種或多種的組合。
38.權利要求22的方法，其中使連接于底物的磷腈系留基團與包含親核體的材料反應從而固定包含親核體的材料包括使磷腈系留基團與含胺材料反應。
39.權利要求38的方法，其中含胺材料為抗原，并且抗原另外結合于抗體。
40.權利要求39的方法，其中含胺材料為免疫球蛋白。
41.權利要求38的方法，其中含胺材料另外結合于細菌。
42.權利要求41的方法，其中細菌為金黃色葡萄球菌。
43.權利要求22的方法，其中連接于底物的磷腈系留基團另外包括固定于磷腈系留基團的單官能、雙官能、或多官能部分。
44.權利要求22的方法，其中連接于底物的磷腈系留基團另外包括固定于底物的第一磷腈，固定于第一磷腈基團的雙官能團或多官能團以及固定于雙官能團或多官能團的第二磷腈基團，雙官能團或多官能團在第一和第二磷腈基團之間形成連接基團。
45.權利要求44的方法，其中使連接于底物的磷腈系留基團與包含親核體的材料反應從而固定包含親核體的材料包括使第二磷腈系留基團與包含親核體的材料反應。
46.權利要求45的方法，其中包含親核體的材料選自含胺的被分析物、氨基酸、肽、DNA、RNA、蛋白質、酶、細胞器、免疫球蛋白、其片段、以及前述兩種或多種的組合。
47.權利要求45的方法，其中使連接于底物的磷腈系留基團與包含親核體的材料反應從而固定包含親核體的材料包括使磷腈系留基團與含胺材料反應。
48.權利要求47的方法，其中含胺材料為抗原，并且抗原另外結合于抗體。
49.權利要求47的方法，其中含胺材料為免疫球蛋白。
50.權利要求47的方法，其中含胺材料另外結合于細菌。
51.權利要求49的方法，其中細菌為金黃色葡萄球菌。
全文摘要
本發明描述了用于固定包含親核體的材料的制品和這種制品的使用方法。在一個方面，本發明提供制品，其包括具有第一表面和第二表面的底物；固定于底物第一表面的磷腈系留基團，磷腈系留基團包括底物第一表面上的官能團與磷腈系留化合物的反應產物。還描述了將包含親核體的材料固定于底物的方法，該方法包括提供磷腈系留化合物；提供具有能夠與磷腈系留化合物反應的互補官能團的底物；通過磷腈系留化合物與底物上的官能團反應產生離子鍵、共價鍵、或其組合制備連接于底物的磷腈系留基團；和將連接于底物的磷腈系留基團與包含親核體的材料反應，以固定包含親核體的材料。
文檔編號G01N33/544GK1902493SQ200480039407
公開日2007年1月24日 申請日期2004年12月17日 優先權日2003年12月30日
發明者布林達·B·拉克希米 申請人:3M創新有限公司