專利名稱：根據拉曼和背景熒光譜多峰檢測組織異常的制作方法
技術領域：
本發明涉及組織異常的檢測。本方面例如可以應用于篩選腫瘤或其他癌變對象。本發明可以用于篩選皮膚組織或其他組織。
背景技術：
皮膚癌是北美洲最常見的癌癥。每年診斷出550,000以上的皮膚癌新個案。七個加拿大人中有一個將在其生命期間發生皮膚癌。如果檢測得早，皮膚癌可以通過較小的手術移除而治愈。但是，如果檢測晚，就需要更大面積和毀容性的手術。特別重要的是早期診斷惡性黑素瘤。如果惡性黑素瘤的治療開始得太晚，則會發生全身性轉移和死亡。
目前，皮膚癌主要由醫生通過視覺檢查來檢測。但是，視覺診斷的臨床準確率最多為75％。因此確診依賴于皮膚活組織的組織學檢查。切除的活組織目前仍是早期診斷皮膚癌的最可靠診斷方法，但是對于篩選可能具有多處疑似病變的高危患者來說這種方法是侵入性的，并且不切實際。對健康護理系統以相當高的成本進行了許多不必要的活組織檢查。此外，一些需要的活組織檢查由于不能識別癌癥而不能進行。
在皮膚癌治療期間，也依賴于視覺評價來確定腫瘤程度，從而確定待切除或照射的組織量。如果腫瘤具有不明確的邊緣，可能需要在稱作莫氏顯微手術(mohsmicrographic surgery)的耗時、昂貴而繁雜的程序中進行多個部位的重復活組織檢查程序。
在皮膚癌治療后，需要通過視覺檢查和周期性顯微檢查的進行性患者監測，以檢測復發的腫瘤或其他部位新生的皮膚癌。提供準確診斷信息而不需要多次昂貴且可能毀容的皮膚活組織檢查的技術將有助于皮膚癌治療的所有階段。
已經使用光學或非光學方法建立了非侵入性診斷皮膚的多種方法。非光學方法包括超聲和MRI，而皮膚反射、自體熒光和熱紅外成像涉及測量疾病狀態中改變的皮膚光學特征。世界上的許多研究小組都在致力于開發反射皮膚成像方法(與數碼照像類似)，以使用數碼處理來改進皮膚癌的早期診斷。該方法已經改進了皮膚病變的登記、記錄和文檔編制，但尚未顯著改善非侵入性診斷的準確性。
已提出將拉曼光譜和熒光光譜用作診斷癌癥的工具。拉曼光譜測量來自分子系統非彈性散射的光的波長和強度。拉曼散射光具有相對于入射光偏移的波長，偏移的量對應于分子系統中的激發能量。激發通常是振動。
拉曼散射光通常較弱。當單色光打到樣品上時，幾乎所有觀察到的光被彈性散射(瑞利散射)，同時能量(或波長)不變。只有非常小部分的散射光，通常約為1/108，被非彈性散射(拉曼散射)。拉曼峰通常很窄，許多情況下可以歸因于分子中特定化學鍵的振動(或由官能團的振動決定的正常模式)。因此，拉曼光譜提供多種分子種存在的“指紋”。拉曼光譜分析可以用于分子種的定性表征和定量測定。
已經從包括皮膚的多種生物組織觀察了拉曼光譜。組織中表征到的拉曼散射物包括彈性蛋白、膠原、血液、脂質、色氨酸、酪氨酸、類胡羅卜素、肌球蛋白、核酸等。拉曼光譜分析也已經用于監測皮膚疾病治療過程中的經皮藥物遞送和藥物代謝動力學。它已經用于監測血液樣品中的血液分析物，如葡萄糖、乳酸和尿素。
研究組織拉曼光譜的多數研究已經使用傅立葉變換(FT)拉曼光譜儀研究了體外組織樣品。FT-Raman系統需要1/2小時來獲得光譜，其體積大且不易攜帶，因此臨床應用有限。最近開發的色散型拉曼系統基于光纖學光傳輸和收集、小型二極管激光器和高效的光譜圖檢測儀組合，將獲得拉曼光譜所需的時間縮短至幾分鐘或亞分鐘(sub-minute)。
除了散射和反射光外，組織還可以吸收光并以熒光的形式發射吸收的能量，所述熒光具有比入射光更長的波長。這種“自體熒光”信號微弱，但是可以被檢測到。組織的熒光激發和發射研究通常在紫外和可見光波長范圍內進行。
最近，在較長的紅至近紅外(NIR)波長處進行了一些組織自體熒光研究。一些例子是Zhang G，et al.，Far-red and NIR Spectral Wing Emission from Tissue under 532and 632 nm Photo-excitation Laser in Life Science 91-16，1999和Demos S G，et al.，Tissue imaging from cancer detection using NIR autofluorescence，Proceedings SPIE461331-34，2002。
通過反射或可見熒光技術評價包括黑素瘤及其前體的色素病變的問題在于整個紫外和可見光譜中黑色素是強的光吸收劑。該波長范圍內的入射和反射或再發射(熒光)光子大部分都被黑色素吸收。這導致弱的光譜和“黑洞”圖像，提供的臨床有用信息很少。
Richards-Kortum等的美國專利6,095,982公開了熒光和拉曼譜的組合用于檢測組織中癌前期(pre-cancer)和其他異常的用途。熒光測量在紫外范圍內進行，而拉曼光譜的測量在紅外范圍內進行。Richards-Kortum等人的美國專利No.5,991,653、5,697,373、5,612,540和6,258,576公開了類似的方法。
Verma的美國專利4,832,483公開了使用拉曼光譜檢測癌癥的方法。Georgakoudi等的US 6,697,652公開了利用包括熒光、反射和光散射光譜的多種光譜技術評價組織的方法。Nordstrom等人的US 6,385,484公開了熒光光譜和反射光譜用于對組織樣本進行分類的用途。Tumer等的US 6,135,965公開了神經網絡用于表征與異常組織對應的光譜的用途。
Alfano等的US 5,293,872涉及一些方法，包括拉曼光譜用于區分鈣化動脈粥樣硬化組織和光纖性動脈粥樣硬化組織的用途。Alfano等的US 5,131,398公開了使用自生熒光區分癌變組織和良性腫瘤組織的方法。Alfano等的US 5,261,410公開了使用拉曼光譜檢測組織是惡性腫瘤組織、良性腫瘤組織還是正常組織的方法。Alfano等的US 5,369,496公開了背散射光用于評價組織樣品的用途。
Puppels等的WO 2004/051242公開了高波數拉曼光譜用于檢測組織異常的用途。Haaland等的US 5,596,992公開了多變量分類技術應用于細胞和組織樣品的紅外光譜的用途。Gellermann等的US 6,205,354公開了拉曼光譜用于檢測類胡蘿卜素的用途。Lin等的US 6,377,841公開了熒光和漫反射光譜用于檢測腦瘤邊界的用途。Garfield等的US 5,450,857公開了熒光光譜用于測量宮頸擴張的用途。Boppart等的US 6485413公開了可以用來收集包括熒光光譜和拉曼光譜在內的多種光譜的儀器。
已經在文獻中描述了基于所測定的組織光譜的峰強度、寬度和/或峰比的經驗性確定的診斷算法，以評價具有組織病理的組織光譜的變化。一些例子是Mahadevan-Jansen A，and Richards-Kortum R.Raman spectroscopy for the detectionof cancers and precancers，J Biomed Opt 1996；1，31-70；Mahadevan-Jansen A，et al.Near-infrared Raman spectroscopy for in vitro detection of cervical precancersPhotochem Photobiol 1998；68123-132；和Huang Z，et al.，Near-infrared Ramanspectroscopy for optical diagnosis of lung cancer，Int J Cancer，2003；1071047-1052。
多變量統計技術已經應用于相似目的。例子包括Bakker Schut TC et al.In vivodetection of dysplastic tissue by Raman spectroscopy Anal Chem 2000；726010-6018；Mahadevan-Jansen A，et al.Near-infrared Raman spectroscopy for in vitro detection ofcervical precancers Photochem Photobiol 1998；68123-132；Stone N，et al.Near-infrared Raman spectroscopyfor the classification of epithelialpre-cancers andcancers，J Raman Spectrosc 2002；33564-573；Deinum G，et al.，Histologicalclassification of Raman spectra of human coronary artery atherosclerosis usingprincipalcomponent analysis，Appl Spectrosc 1999；53938-942；和Silveira L Jr et al.，Correlation between near-infrared Raman spectroscopy and histopathological analysis ofatherosclerosis in human coronary arteries，Lasers Surg Med 2002；30290-7。
至今為止，上述公開出版物中描述的診斷方法中尚沒有廣泛適用于組織篩選。
雖然本領域中已經進行了大量研究，但仍然需要能夠篩選腫瘤或其他癌性病變的快速、準確、有成本效益的方法和裝置。
發明內容
本發明的一個方面提供表征組織的方法。該方法可以提供組織區域是否可能異常的指標。該方法包括在第一波長范圍內獲得組織拉曼光譜的特征；在與第一波長范圍重疊的第二波長范圍內獲得背景熒光光譜的特征；和至少根據拉曼譜特征和背景熒光光譜特征來表征組織。例如表征可以通過對神經網絡應用分類函數或提供拉曼和背景自體熒光的特征來進行。合適的分類函數例如可以來源于對參照數據進行PCA(主成分分析)和LDA(線性判別分析)。
本發明的另一個方面提供測定組織黑色素含量的方法。該方法包括獲得組織的NIR光譜，所述光譜包括約1368cm-1和1572cm-1波數的第一峰和第二峰；減去光譜的背景以產生拉曼光譜；和根據拉曼光譜中第一和第二峰中至少之一的強度計算組織的黑色素含量。
下面描述本發明的其他方面和本發明具體實施方案的特征。
在說明本發明非限制性實施方案的附圖中，圖1是可以用于獲得拉曼和背景熒光光譜的裝置的框圖。
圖1A是圖1的裝置的探頭的示意性框圖。
圖2A顯示光譜儀輸出端的光譜曲線；圖2B顯示光譜儀輸出端的線，已對其修飾以矯正線曲率；圖3顯示用于幾種組合(binning)模式的人皮膚的拉曼光譜；圖4是說明本發明方法的流程圖；圖5是用作受試者的小鼠中腫瘤的顯微照片；圖6A、6B和6C分別是來自小鼠腫瘤組織的原光譜；圖6A原譜中的背景自體熒光成分和圖6A原譜中的拉曼成分；圖6D、6E和6F分別是個體小鼠中腫瘤和正常組織之間的平均差異，分別對應于圖6A、6B和6C中的原光譜和光譜成分；圖7A、7B和7C分別是拉曼、背景熒光和原光譜的主成分的圖。
圖8A、8B和8C分別是拉曼、背景熒光和原光譜的兩種最具診斷顯著性的主成分的散布圖；圖9A、9B、9C和9D是分別對拉曼、背景自體熒光、原光譜和組合的拉曼PC分值和NIR背景熒光PC分值計算得到的屬于正常和腫瘤組的事后機率的圖。
圖10是在不同閾水平處對拉曼、背景自體熒光、原光譜和組合的拉曼PC分值和NIR背景熒光PC分值產生的一組接受器操作的特征性曲線；圖11顯示癌變和非癌變的各皮膚區域的拉曼光譜；圖12是涉及兩個比率的脂質-蛋白質拉曼譜帶的散布圖，顯示在受試者身體的不同部位獲得的拉曼光譜的簇集行為(clustering behavior)；圖13顯示在許多不同受試者的相同身體部位所取皮膚的拉曼光譜之間的差異；圖14顯示黑色素的拉曼數據；圖15比較正常和痣組織的NIR背景熒光光譜；圖16比較正常和痣組織的可見熒光光譜；圖17顯示幾種黑色素樣品的NIR光譜；
圖18比較黑發和白發的NIR光譜。
具體實施例方式
在下面的所有描述中，給出具體的細節以提供對本發明的更充分理解。但是，本發明可以不通過這些具體細節而實施。在其他情況下，沒有詳細給出或描述公知的要素，以避免不必要地使本發明不清楚。因此，說明書和附圖都是說明性的，而非限制性的。
本發明提供檢測組織異常的方法。根據本發明的方法照射待研究的組織區域，獲得一定波長范圍內的光譜，其包括拉曼特征和背景熒光。拉曼特征和背景熒光都可用作評價待研究的組織區域是否可能異常的基礎。本發明的具體實施方案可以用于篩選皮膚或其他組織的癌癥，所述組織如肺組織、上皮組織如消化道的襯層、內部器官組織或其他組織。本發明的方法可以用于體內組織。該方法還可以體外應用。
組織區域例如可以是·受試者皮膚區域；·從活組織檢查或手術獲得的組織塊的區域；·肺組織或可以使用內窺鏡設備從中獲得光譜的其他組織的區域；或·手術過程中暴露的組織的區域。
在本發明的一些實施方案中，波長范圍覆蓋近紅外(NIR)的部分光譜。在本發明的一些實施方案中，波長范圍跨度至少為約800nm-約1000nm。
來自待研究組織區域的光譜是否指示組織可能異常的確定涉及將測定的光譜與參照數據進行統計學分析比較。參照數據可以包括或基于取自已知正常和/或異常的組織的參照光譜。參照數據可以取自基于可靠的診斷技術如組織病理學診斷而已知正常或異常的組織。測定光譜與參照數據的比較可以涉及將主成分分析(PCA)和線性判別分析(LDA)應用于參照數據，如下面給出的實施例中所述。作為替代方案或附加方案，拉曼和背景熒光譜的特征可以提供至已經進行訓練的神經網絡，以至少部分基于拉曼和背景熒光光譜特征表征識別和/或表征異常組織樣品。
本發明人已經觀察到由785nm激光激發的體內組織NIR自體熒光表現出在正常和病變組織之間表現出與較短波長可見的組織自體熒光不同的趨勢。例如，受白癜風影響的皮膚與周圍正常皮膚相比具有較低的NIR熒光和較高的可見熒光，而受復合痔影響的皮膚與周圍正常皮膚相比具有較高的NIR熒光和較低的可見熒光(見圖15和16)。白癜風和正常皮膚之間以及復合痔與正常皮膚之間的主要差異是黑色素的量。受黑素瘤影響的皮膚與周圍正常皮膚相比也表現出NIR自體熒光增加。本發明人還發現人皮膚鱗狀細胞癌中NIR自體熒光發射增加。相反，皮膚基底細胞癌與其周圍正常皮膚相比表現出更低的NIR自體熒光發射。正常和異常組織之間NIR光譜的這些差異可以與組織的拉曼光譜特征組合，用于表征皮膚和其他組織。
其他峰特征可以任選地與拉曼和背景熒光譜的特征組合，以提高單獨使用拉曼和背景熒光譜所獲得結果的準確性(如特異性和/或靈敏性)。例如，組織區域的黑色素含量可以用作附加特征。拉曼光譜可以用于測定組織的黑色素含量，如下所述。更多的峰特征可以包括一個或多個峰特征，如·UV或可見光熒光光譜；·漫反射光譜；·光散射光譜，其測定組織的散射特性，作為波長的函數；和·同一患者的待研究組織的光譜中一個或多個拉曼和/或NIR背景自體熒光特征和正常組織的相應特征之間的差異。
本發明人已經發現對于NIR的拉曼和熒光譜來說，當組織區域是皮膚時，正常組織的光譜取決于組織區域在受試者身體的部位。例如，手的正常組織傾向于在不同受試者中表現出類似的光譜特征。相比之下，手、頭、臂、軀干和股的正常組織的NIR/拉曼譜特征傾向于彼此不同，即使對于相同的患者也不同。在本發明的一些實施方案中，分類函數來源于與待研究組織區域所處身體區域相同的身體區域的參照光譜。本發明的一些實施方案提供多個分類函數，各自來源于不同的參照數據集合，各自與不同的身體區域相關。例如，對于手、頭、臂和軀干以及股中兩種或多種的每一種提供一個參照數據集合。
裝置任意合適的裝置可以用于獲得所期望波長范圍內的組織的拉曼和背景熒光譜。當本發明的方法用于體內篩選時，通常期望所述裝置能夠相當快地獲得拉曼和背景自體熒光譜，并且裝置不要太大。
圖1是可以用于獲得拉曼和背景熒光譜的裝置10的框圖。裝置10可以如以下文獻所述進行構建US patent No.6,486,948和Huang Z.et al.Rapid near-infraredRaman spectroscopy system for real-time in vivo skin measurements，Opt Lett 2001；vol.26pp.1782-1784，上述文獻通過引用并入本文。裝置10包括光源12，其典型的是單色光源，最典型的是激光。在本發明目前優選的實施方案中，光源12發射NIR(600nm-1200nm)內的光。在一個示例性的實施方案中，光源12是發射波長為785nm的光的激光二極管。在本發明的原型實施方案中，光源12是在785nm處發光的300mW激光二極管，此類光源得自SDL Inc of San Jose，California。
光源12的光通過光纖16傳輸到探頭14。在原型方案中，光纖16是具有0.22的數字孔徑(“NA”)的200μm芯直徑光纖。如圖1A所示，探頭14包括瞄準儀18和帶通濾波器19，確保作用在組織S上的光是基本單色的。在原型方案中，帶通濾波器19的通頻帶為785nm±2.5nm。透鏡20將單色光聚焦到組織S上。在原型方案中，透鏡20提供3.5mm的光點尺寸。可以在激光12的激光輸出端安裝遮光器(未示出)。遮光器可保持關閉，只有在獲得光譜數據期間打開，以確保受試者皮膚只根據獲取數據的需要暴露于激光。
已由組織S背散射的光通過透鏡22A和22B聚焦至光纖束24中。陷波濾波器28阻擋感興趣的波長范圍之外的光。在原型實施方案中，濾波器28是在785nm處光學密度(“OD”)＞6.0的全息濾波器。
光纖束24將背散射光傳輸至分光計26。為了增加檢測靈敏度，用于原型方案的光纖束24包括多至可以成像到分光計26的光傳感器上的光纖。在原型方案中，束24具有58個100μm的光纖，其輸入端以直徑為1.6mm的環形排列于探頭14處，其輸出端以通常為線性陣列排列在分光計26入口處。原型方案具有位于輸出線性陣列中央的50μm校準光纖27。已知波長的光可以通過校準光纖27傳輸至分光計26，用于分光計26的波長校準。
在原型方案中，分光計26是HoloSpecTMf/2.2 NIR分光計，配有HSG-785-LF型體積相技術(VPT)全息光柵，得自Kaiser Optical Systems，Inc.of Ann Arbor，Michigan USA。分光計26包括光檢測器，如CCD相機30。在原型方案中，相機30是1024×256像素的液氮冷卻、NIR-優化、背照射、深層空乏(deep-depletion)的CCD檢測器，其型號為No.LN/CCD-1024EHRB QE 75％at 900nm，得自PrincetonInstruments，of Trenton，NJ，USA。相機30向計算機系統32提供輸出。
拉曼光譜和相關的自體熒光背景可以實時顯示在計算機系統32的顯示器33上，可以保存以進行進一步分析。原型系統獲得800-1800cm-1波數范圍(838-914nm波長范圍)的光譜。
拉曼頻率可以使用在感興趣的光譜區具有已知拉曼峰的材料進行校準。例如原型系統使用環己烷、丙酮和硫酸鋇的光譜校準至2cm-1的精確度。原型系統的光譜分辨率是8cm-1。也使用標準燈對原型系統中所有波長校準過的光譜進行矯正，用于系統的波長依賴性響應(型號RS-10，得自EG & G Gamma Scientific，San Diego，California，USA)。
通過使用平面光柵的光譜儀的直縫圖像具有彎曲的拋物線形狀。該圖像失真是因為來自沿縫隙長度的不同位置的光線以不同的傾斜程度入射到光柵上。對于具有短聚焦長度的分光計來說，該傾斜度可以導致能夠影響檢測器測量性能的顯著失真。例如，圖2A示出當用Hg-Ar燈照射時，通過類似原型系統中所用的一個光譜儀的直100μm縫圖像像差。光譜線的曲率在圖2A中是明顯的。在原型系統中，該曲率可以通過下式描述x＝1.1904E-5y2+1.9455E-4y-0.98613(1)其中x是垂直位置y處線的水平位移。公式(1)中的系數對于原型系統是特定的。
該圖像像差表現出對CCD柱的硬件組合(hardware binning)的兩種妨礙(1)它降低光譜分辨率；(2)它降低可獲得的信噪比(“S/N”)。它還導致波長校準問題。“硬件組合”是在利用前置放大器讀出信號之前進行的對利用CCD像素所檢測強度的組合。對于限制讀出噪音的信號水平，如對于弱的拉曼信號測量值，硬件組合可以與組合在一起的像素數成線性地提高S/N。也可以在信號讀出之后使用軟件進行組合。但是“軟件組合”僅與加在一起的像素值的平方根成比例地提高S/N。因此，對于最大化S/N來說，整條線的完全硬件組合相對于軟件組合是優選的。也可以使用硬件和軟件組合的組合。
在原型方案中，上面討論的圖像像差通過沿光譜儀26出口處的彎曲線排列光纖束24的58個100μm光纖來矯正。所述彎曲線通過不銹鋼柱形件中的激光鉆孔形成。所述彎曲線的形狀對應于公式(1)中所示的水平位移，但是方向相反。圖2B示出了具有用Hg-Ar燈照射的光纖束的光譜儀26輸出的所得CCD圖像。圖2B的每條光譜線中的中央黑點對應于沒有受照射的校準光纖27。光譜線基本是直的，指示有效的圖像像差矯正。這允許每條完整的CCD垂直線(原型方案中為256像素)被硬件組合，而不損失分辨率或降低S/N。
使用原型系統，可以在少于1秒的時間內獲得體內皮膚拉曼光譜。照射功率密度為1.56W/cm2，其小于對于785nm激光的ANSI最大允許的皮膚暴露限1.63W/cm2。
圖3中的線100、101和102中的每一個示出了受試者掌的皮膚的拉曼光譜。線100是使用完全軟件組合所得的光譜。線101是用組合的硬件和軟件組合獲得的光譜。線102是使用硬件組合獲得的光譜，對于所有的線100、101和102，使用0.5秒的CCD積分時間。線102光譜的S/N可以觀察到明顯比線101好，比線100更好。1745cm-1處的拉曼峰(來自脂質酯羰基的C＝O伸縮帶)在線100中幾乎不可見，在線101中顯示為有干擾小峰，在線102中顯示為平滑明確的峰。
方法概述圖4示出根據本發明一個實施方案的方法50。方法50從在框52中獲得參照數據開始。參照數據可以是組織樣品的光譜。參照樣品可以包括已知正常的組織和/或已知癌變或其他異常的組織。使用合適的裝置例如上文所述的裝置來獲得參照光譜。在框54中，產生分類函數。分類函數表現為測試譜的輸入特征，產生指示對應于測試譜的組織可能正常還是異常的輸出信號。在所示的實施方案中，框54包括進行主成分分析(PCA)(框54A)和進行線性判別分析(LDA)(框54B)。
主成分分析PCA和LDA是已知的數據分析技術。PCA和LDA描述于多種參考資料中，這些參考資料包括Dillion RW，Goldstein M，Multivariate analysismethods and applications，John Wiley and Sons，New York，1984；和Devore JL，Probability and statistics for engineering and the science，Brooks/Cole，Pacific Grove.1992。
在框56中，獲得測試光譜。測試光譜可使用合適的裝置如上述裝置獲得。測試光譜是組織區域的譜。組織區域例如可以是已經表征為具有可能指示癌癥的外觀的皮膚區域。在框58中，將測試光譜與參照數據進行比較。在所示的實施方案中，該比較涉及將框54中產生的分類函數應用于框58A中測試光譜的特征。所述特征包括測試光譜中拉曼成分的特征和測試光譜中背景熒光成分的特征。術語背景熒光用在本文中指包括拉曼光譜峰的波長范圍內的熒光。
在框60中提供輸出值。輸出值指示組織區域正常或異常的可能性。輸出值可以包括任意合適的指示信號，包括下列一種或多種·指示組織區域正常或異常可能性的圖形或文字值；·警告指示信號，如警告燈；·指示組織區域所分入類別的圖形或文字信息；·其他合適的指示信號。
本發明的某些實施方案包括計算機處理器，其執行使處理器執行本發明方法的軟件指令。例如，計算機系統中的一個或多個處理器可以通過執行可進入處理器的程序存儲器中的軟件指令來執行圖4的方法。本發明還可提供為程序產品的形式。程序產品可以包括攜帶計算機可讀的信號集的任意介質，所述信號集包含數據處理器執行時使數據處理器執行本發明方法的指令。根據本發明的程序產品可以是廣泛的各種形式。程序產品例如可以包括物理介質，如磁性數據存儲介質，包括軟盤、硬盤驅動器；光學數據存儲介質，包括CD ROM、DVD；電子數據存儲介質，包括ROM、閃存(flash RAM)等，或傳輸型介質，如數字或模擬通訊接口。指令可以任選地為編碼的、加密的和/或壓縮的格式。
應用實施例#1使用涉及同基因的BALB/c小鼠的小鼠Meth-A光纖肉瘤模型作為模型，研究了NIR自體熒光、拉曼和復合拉曼與NIR自體熒光(原譜)譜用于體內組織分類的診斷性能。每個體重為18-28g的7-9周齡雌性BLAB/c小鼠在背下部皮下植入1×106Meth-A光纖肉瘤細胞。腫瘤誘導生長至接種后7天時直徑約為5-6mm，位于皮膚表面以下約200μm(圖5)。對于光譜研究，刮去小鼠背下部的毛，將小鼠固定在架子上，所述架子收集來暴露小鼠背部皮膚進行光譜測量。通過測量承瘤部位以配對方式從每只小鼠獲得光譜，看起來正常的皮膚距離腫瘤的側緣約為5cm。
從組織獲得的800-1800cm-1拉曼位移范圍內的原譜包括明顯的組織自體熒光成分和較弱的組織拉曼散射成分，如圖6A所示。通過相鄰的5-點平滑對原譜進行預處理，以減小噪音。將噪音平滑譜中的寬自體熒光背景(圖6B)擬合成五次多項式。將基本表現NIR自體熒光的該多項式從原譜中減去，以產生單獨的組織拉曼譜(圖6C)。產生下列三個數據集·拉曼(即減去背景的光譜)；·單獨的背景自體熒光(即5次多項式)；和·原光譜(復合拉曼和NIR背景自體熒光光譜)。
使用這些數據集中的每一個進行統計學分析。
使用全光譜范圍(800-1800cm-1拉曼位移)進行主成分分析(PCA)。每個光譜表示為497個強度的集合(PCA變量)。為了消除受試者間和/或內的光譜變化對PCA的影響，將全光譜標準化，從而使光譜的平均值為零，所有光譜強度的標準偏差為1。這種標準化確保主成分(PC)形成正交基礎。
標準化的數據集(即拉曼、自體熒光和原光譜)組合成具有波數(或波長)列和每個動物的行的矩陣。在三個標準化的譜數據矩陣上進行PCA，以產生包含更少數目正交變量的PC，所述正交變量占原始光譜總變量中的大部分。每個PC通過稱作PC分值的變量與原始光譜相關，所述PC分值表示特定成分相對于基礎譜的重量。
使用例如Devore JL，Probability and statistics for engineering and the sciences，Brooks/Cole，Pacific Grove，1992中所述的配對兩端(two-sided)學生t檢驗，利用α為5％表征每種情況的診斷學上顯著的PC分值。保留所有統計學顯著的PC分值，然后輸入到LDA模型中進行組織分類。
LDA確定判別函數線，該判別函數線使組間數據的差異最大化，同時使同一組中成員之間的差異最小化。LDA模型所得的分類函數的性能使用留一交叉確認法(Leave-one-out，Cross Validation)方法以無偏方式估計，該方法例如描述在DillionRW and Goldstein M，Multivariate analysismethods and applications，John Wiley andSons，New York，1984和Lachenbruch P and Mickey RM，Estimation of error rates indiscriminant analysis，Technometrics 1968；101-11中。在該方法中，從數據集中去除一個光譜，使用其余的組織光譜進行包括PCA和LDA的全部算法，以產生新的分類函數。然后使用新的分類函數對保留的光譜進行分類。重復該過程，直至所有保留的光譜都得以分類。該分析的結果指示基于每個模型光譜正確預測狀態(即腫瘤和正常)的相對能力。
為了比較PCA-LDA使用三種光譜數據集(拉曼、自體熒光和原光譜)進行組織分類的性能，通過連續改變閾值來生成接受器操作特征性(ROC)曲線，以確定對所有受試者的正確和不正確分類。
所有的多變量統計學分析都使用BMDP統計軟件包(Version 7.0，BMDPStatistical Software，Inc.，Los Angeles，CA)中的Factor Analysis and StepwiseDiscriminant Analysis模塊進行。
平均起來，原光譜和背景自體熒光光譜對于腫瘤比對于正常皮膚表現出更高的信號強度，而拉曼散射則相反(見圖6A、6B和6C)。與正常的周圍組織相比，腫瘤組織與自體熒光背景光譜的總體強度增加明顯相關(p＜0.0001；對正常和腫瘤組織之間800-1800cm-1范圍內逐點光譜強度的平均差進行配對學生t檢驗)(圖6A、6B)，而正常皮膚比腫瘤組織表現出更高的拉曼強度(p＜0.0001；配對學生t檢驗)(圖6C)。然而，不同動物之間的光譜差異則有明顯可變性，如反映在平均差光譜SD上(圖6D、6E和6F)。這些差異使得不能單獨使用總信號強度來區分正常和腫瘤組織。
可以看出圖6A的原光譜由疊加在相對強的自體熒光背景上的小貢獻的組織拉曼散射組成。腫瘤和正常皮膚的平均體內拉曼光譜(圖6C)顯示幾個顯著的拉曼峰為主的類似振動帶。例如，在1655cm-1、1445cm-1、1300cm-1、1265cm-1和1004cm-1的拉曼位移處觀察到的腫瘤和正常皮膚的拉曼帶可假設分別歸因于蛋白質酰胺I、CH2彎曲模式、CH2扭曲模式、蛋白質酰胺III和苯環呼吸模式。腫瘤和正常皮膚中觀察到的一些拉曼帶的試探性歸屬總結于表1。
表1-拉曼譜帶歸屬
v，伸縮模式；vs，對稱伸縮；vas，不對稱伸縮；δ，彎曲模式；r，搖擺模式；v，非常強；s，強；m，中等；w，弱；sh，肩峰可以看出800-1800cm-1(即838-914nm)范圍內背景自體熒光光譜的形狀在腫瘤和正常皮膚之間不同(圖6B)。正常和腫瘤組織的曲線比不是平坦的水平線，而是從800cm-1下降至1350cm-1，然后增加至接近1800cm-1(數據未示出)。雖然在正常和腫瘤組織之間的拉曼峰位置沒有觀察到明顯差異，注意到了譜線形狀的微小差異，尤其是在1200-1400cm-1和1500-1650cm-1處。PCA/LDA是采用這種譜線形狀進行組織分類的一種方式。
圖7A-7C分別示出了對于下列光譜從主成分分析(PCA)計算的前5個主成分(PC)載入·拉曼光譜；·背景自體熒光光譜；和·原光譜。
總之，三個光譜數據集的每一個的PC特征不同于其他光譜數據集的PC特征。一些PC特征(圖7A、7C)大致對應于拉曼光譜，在與皮膚組織中出現拉曼峰的位置類似的位置上有峰。第一PC說明了光譜數據集內的最大方差(如拉曼光譜為74.6％，自體熒光光譜為79.5％，原光譜為69.9％)，而連續的PC描述說明貢獻逐漸小的方差的特征。
對前五個PC分值進行的比較正常和承瘤皮膚的配對兩端學生t檢驗顯示只有三個PC(圖7A中的PC1、PC2、PC3)、兩個PC(圖7B中的PC1、PC4)和三個PC(圖7C中的PC1、PC3和PC4)對于區分正常和癌變組織來說具有診斷學上的顯著性(p＜0.0001)。圖8A、8B和8C示出了分別來自下述的正常和腫瘤組織最有診斷學顯著性的PC分值的散布圖例子·拉曼(PC1和PC2)；·背景熒光(PC1和PC4)；和·原譜(PC1和PC3)。
這些圖顯示可以使用代表潛在診斷性算法的虛線將所述譜加入正常和腫瘤組。在該情況下，虛線表示可以用作分類函數的兩個PC分值的線性組合集。
對于3組不同光譜數據集中的每一個，利用所有顯著的PC用LDA來生成分類函數。基于每個數據集中統計學上顯著的光譜特征，建立了使用以留一交叉確認法進行PCA-LDA基光譜分類的分類函數。通過利用LDA計算數據集中每組的百分比來確定事后概率。將正常皮膚錯分為腫瘤的代價選擇為0.50，以獲得最大數目的正確分類組織組。
圖9A、9B、9C和9D示出了對下述光譜所分別計算的屬于正常組和腫瘤組的事后可能性·拉曼；·背景自體熒光；
·原光譜；和·拉曼光譜PC分值和背景自體熒光光譜PC分值的組合。
分類結果顯示使用四種類型數據(即拉曼；NIR自體熒光；原光譜；和拉曼光譜PC分值和NIR自體熒光光譜PC分值組合)分別有81.3％(13/16)、93.8％(15/16)、93.8％(15/16)和93.8％(15/16)的腫瘤組織得以正確分類(診斷靈敏性)，同時事后概率小于0.50。診斷特異性為100％、87.5％、100％和100％。對于拉曼光譜、NIR背景自體熒光光譜、原光譜和拉曼光譜PC分值與NIR自體熒光譜光譜PC分值組合來說，總診斷準確率分別是90.6％、90.6％、96.9％和96.9％。值得注意的是包括拉曼和背景熒光成分的原光譜比單獨采用拉曼光譜或背景自體熒光光譜具有更好的總診斷準確率。
為了進一步評價和比較用于體內組織分類的來自四種類型數據的PCA/LDA基分類函數的性能，在不同閾值水平上，從圖9A-9D中的散布圖生成接收器操作特征(ROC)曲線(圖10)。圖10示出了使用拉曼光譜、NIR背景自體熒光光譜、原光譜和拉曼光譜PC分值與NIR自體熒光譜光譜PC分值組合的判別結果。ROC曲線的對比評價表明單獨的NIR自體熒光或拉曼都可以高診斷靈敏性和特異性地用于體內組織診斷。但是，來自四種類型數據的分類函數中，似乎來自原光譜(其為拉曼和NIR熒光光譜成分的復合物)的分類函數或來自組合的拉曼光譜PC分值與NIR自體熒光譜光譜PC分值的分類函數可以給出用于體內組織分類的最有效診斷能力。這通過特異性和靈敏性的提高來說明。ROC曲線下的積分面積對于NIR背景自體熒光光譜、拉曼光譜、原光譜和拉曼光譜PC分值與NIR自體熒光光譜PC分值組合的分類函數分別是0.951、0.963、0.994和1.0。結果表明含有拉曼特征和自體熒光特征的原光譜可以比單獨采用拉曼或NIR背景自體熒光特征峰產生更好的診斷準確率。
多變量統計分析允許通過僅保留描述組間差異的那些主成分來進行目標診斷。對于組織學診斷最有用的信息僅分布在幾個PC上。對于LDA模型，判別信息可以包含在前3-4個PC中。顯著PC分值的PCA圖(見圖8A-8C)表明組織NIR自體熒光和拉曼光譜的組合與病理分類良好相關。
描述光譜數據中大部分變化的PC沒必要提供最大的診斷有用性。例如，對于背景自體熒光數據集，最顯著PC之一(PC4)僅描述了總變化的0.33％。但是本發明人不希望受任何具體操作理論的約束，這表明組織化學中微小改變先于或伴隨組織的明顯病理學改變。在拉曼和原光譜數據集中也發現了僅解釋非常小量總變化但具有診斷學顯著性的其他PC。
PCA和LDA的組合對于提供基于背景自體熒光和拉曼光譜特征的、具有高診斷靈敏性和特異性的診斷性組織分類算法是有力的統計學工具。
雖然本發明人不希望拘泥于任何特定的操作理論，但是通過采用包含自體熒光和拉曼特征的原光譜獲得的有利判別結果可以解釋如下以前NIR自體熒光被認為是測量的原光譜中沒有用的背景信號，但是本發明人了解到，NIR自體熒光提高區分腫瘤和正常組織的能力，可以用于確認組織中NIR熒光團的化學身份。使用PCA/LDA將對組織內物質振動模式作出響應的拉曼光譜與自體熒光信號的組合可以是闡明組織的生化結構和組成的有力工具，因此可以提供用于組織診斷的有用診斷能力。
使用NIR拉曼和NIR背景熒光光譜作為診斷工具相對于需要用UV光線照射受試者的診斷工具來說具有優點。和UV激發光不同，NIR光是不致癌的，用于組織診斷是安全的。另外，所用入射光和測量的組織自體熒光和拉曼光都位于NIR波長處時，光可以比其他波長處的光更深地穿透組織(如最多約1mm)。因此，NIR自體熒光和拉曼光譜有潛力用于非侵入性體內檢測位于組織表面下的病變。例如，可以通過NIR自體熒光成像檢測病變，然后通過拉曼光譜表征。
應用實施例#2如圖11所示，一些拉曼光譜特征在正常至良性(復合痔)和惡性(黑素瘤)皮膚病之間不同。曲線104是非洲血統受試者掌側前臂正常皮膚的拉曼光譜。曲線105是良性復合色素痔的拉曼光譜。曲線106是惡性黑素瘤的拉曼光譜。曲線107是臨近曲線106黑素瘤的正常皮膚的拉曼光譜。可以看出這些曲線之間的明顯差異。1445cm-1峰在惡性黑素瘤光譜106中不可見，但是可以在正常黑色皮膚光譜104和良性復合痔光譜105中看到。1269cm-1峰存在于惡性黑素瘤光譜106和正常黑色皮膚光譜104中，但是不存在于良性復合痔光譜105中。這些曲線特征可以和形成原光譜中這些曲線背景的NIR自體熒光特征一起使用，這些曲線可以在根據本發明的分類方法中從所述原光譜提取。
應用實施例#3本發明的一些方法提供多個分類函數。這些方法涉及選擇最適合于分類所涉及的組織區域的一個分類函數。例如，分類函數可以包括適用于以下一種或多種情況的分類函數·多個不同的病狀(例如基底細胞癌(BCC)、鱗狀細胞癌(SCC)、黑色素瘤、光化性角化病、脂溢性角化病、皮脂腺增生、角化棘皮瘤、斑痣、黑色素痣、結構不良痣和藍痣中的兩種或多種)；·多種不同的組織類型(例如皮膚、肺組織、其他上皮組織如支氣管樹、耳、鼻和喉、胃腸道、子宮頸等中的兩種或多種)；·多種不同的皮膚類型(可以提供一個分類函數用于具有輕微色素沉積皮膚的受試者，提供另一個分類函數用于具有更深的黑色素沉積的受試者)；和·相同常見組織類型的身體上的多個不同部位(例如，如下所述，可以提供不同的分類函數為受試者身體的不同區域進行皮膚分類)。
在提供多個分類函數時，每一個分類函數可以來自分類函數所要應用的組織類型/病狀/組織部位的參照數據集。根據本發明的裝置可以包括允許用戶選擇多個分類函數中合適的一個的用戶界面。
本發明人已經了解到，在相同的受試者中，皮膚的拉曼光譜對于不同身體部位通常明顯不同。在本發明的一些實施方案中，分類函數根據待研究組織所處的身體部位來選擇。拉曼光譜測量在50個正常志愿者各自的25個身體部位的每一處進行。圖12示出拉曼光譜測量的脂質-蛋白質拉曼譜帶的比例。可以看出這些比例根據身體部位而簇集。如圖13所示，給定身體部位的皮膚拉曼信號的受試者間差異相當小，至少對于具有輕微色素沉積皮膚的患者相當小。
通過提供每個對應于不同身體部位的多個分類函數，該觀察結果可以應用于本發明的實踐。可以使用在相應身體部位獲得的參照拉曼和背景熒光光譜來產生各個不同的分類函數。合適的分類函數可以基于從中獲得測試光譜的身體部位進行選擇。舉例來說，可以對多個不同身體區域提供不同的分類函數，所述不同的身體區域例如包括手；頭；臂和軀干；和股。也可以提供從其他皮膚區域如足、腿和指甲的參照數據產生的分類函數。
應用實施例#4患者具有諸如結構不良痣的癥狀。該癥狀導致患者身體的各個部位有許多痔。患者看醫生時，醫生需要確定是否需要對痔進行活組織檢查，如果需要，對哪些進行。在所有的痔中，痔足夠多，使得對所有痣進行活組織檢查是不希望的或不實際的。
醫生獲得待研究的每個痔的NIR光譜。NIR光譜包括拉曼特征和NIR熒光特征。例如可以用上述裝置和圖1所示裝置獲得譜。例如可以將裝置的探頭依次放置到每個痔上，然后通過激活控制器來引發光譜的獲得。例如，醫生可以在探頭位于痔上時按按扭，然后使探頭保持在痔上，直至獲得光譜。當獲得光譜時，裝置可以產生信號，如可聽到的蜂鳴聲。如果裝置的設計考慮到待研究痔的光譜中一個或多個拉曼和/或NIR背景自體熒光特征和患者正常組織的相應特征之間的差異，那么醫生還從患者表現正常的一部分皮膚獲得光譜。
裝置包括或連接至能夠將分類函數應用于從患者各部位獲得的光譜的計算機系統。在將分類函數應用于獲得的光譜之前，醫生可以使用計算機系統提供的界面來選擇適合對患者的結構不良痔進行分類的分類函數。界面可促使醫生回答問題，以按照決策樹實現選擇合適的分類函數。作為替代方案，界面可以允許醫生直接選擇分類函數，或輸入數據，計算機可以基于該數據選擇最合適的分類函數。
計算機系統將分類函數應用于每個獲得的光譜。這可以在獲得一個光譜之后立即進行和獲得下一個光譜之前進行，或以間歇方式在獲得多個光譜后進行。對于每個光譜，計算機系統提供表明分類函數是否指示相應痔可能正常或可能異常的輸出信號。輸出信號可以包括可見的或可聽見的信號。輸出信號可以是簡單的輸出信號，其簡單地指示光譜是否指示正常組織或提示組織異常。作為替代方案，輸出信號可以包括數字和/或圖形信息，這些信息指示從中獲得光譜的組織是正常還是異常的可能性。
醫生可以使用輸出信號確定患者的痔，如果異常，則應該通過活組織檢查或其他程序進行更深入研究。
應用實施例#5懷疑患有肺癌的患者進行氣管鏡檢查。氣管鏡配有能夠獲得具有拉曼和背景熒光特征的光譜的內窺探頭。合適的探頭例如描述于Zeng的US10/761,703和PCTCA/04/00062中。醫生將氣管鏡的尖端靠近感興趣的組織部位附近，并且觸發裝置以獲得光譜。裝置將分類函數應用于光譜。分類函數適合于肺組織。分類函數可以產生自包括正常肺組織和已知癌變的肺組織的參照光譜集。裝置提供輸出信號。醫生可以將輸出信號和通過氣管鏡獲得的圖像一起用來選擇取活組織檢查樣品的位置。
應用實施例#6在有些情況下，測定組織的黑色素含量是有用的。發明人已經確定黑色素在大致1380-1400cm-1和1580-90cm-1的拉曼位移處具有寬的拉曼峰。這些峰可以在包含黑色素的人頭發的拉曼光譜中檢測到(見圖18)。這些峰可以用于測定組織的黑色素含量。
圖11的曲線104、105和106是體內所取組織的拉曼光譜。這些曲線表現出了這些峰。圖14示出了黑色素的拉曼數據。
富含皮膚黑色素的正常皮膚的光譜(曲線104)和色素性病變的光譜(曲線105和106)包括1368cm-1和1572cm-1處附近的兩個強而寬的譜帶，與圖14黑色素樣品中觀察到的拉曼模式非常相似。此外，體內皮膚拉曼光譜表現出蛋白質和脂質的振動帶，其在由于黑色素而顯得黑的各種皮膚中不同。例如，可能對應于脂頭基團的C＝O伸縮的1742cm-1處較弱振動模式存在于高度色素沉積的皮膚病變中，而其他譜帶明顯減弱如1654cm-1處的v(C＝O)酰胺I譜帶，1445cm-1處的剪式δ(CH3)和δ(CH2)，1301cm-1處的CH2形變，和1269cm-1處的v(CN)和δ(NH)酰胺II譜帶。1445cm-1峰在惡性黑素瘤譜中消失，但是在良性復合痔光譜中觀察到，而1269cm-1峰則相反。兩個黑色素拉曼譜帶的這些差異以及峰位和帶寬可以包括為特征，用于本發明實施方案中的非侵入性黑素瘤檢測。
在本發明的一些實施方案中，將1368cm-1和/或1572cm-1處黑色素峰直接或間接用做感興趣組織樣本中黑色素濃度的指示信號。除了拉曼和背景熒光光譜的其他特征之外，黑色素濃度可以用作組織分類的特征。這些峰的大小可以通過減去背景而確定。這可以通過擬合背景函數而實現。擬合函數應該是低次函數，如二次多項式，因為這些峰太寬，較高次的擬合函數將擬合峰本身。
黑色素濃度和NIR背景熒光有關系。雖然黑色素在可見譜帶范圍內僅非常弱地發熒光，但黑色素在NIR波長范圍內非常強地發熒光。對來自Sigma的合成和提取的黑色素產品的測量證實了強的NIR熒光發射(見圖17)。
1368cm-1和1572cm-1拉曼譜帶也可以獨立地用于測定組織的黑色素含量的方法。在這種方法中，這些峰之一或二者的強度得以測定。例如這可以通過如上所述從峰中減去背景來進行。
除非另外指明，當成分(如軟件模塊、處理器、組件、裝置、電路)如上稱呼時，所指成分(包括提到“裝置”)應理解為包括成分的等同物，執行所述成分功能的任意成分(即功能等同物)，包括執行本發明所示示例性實施方案功能但結構與所公開結構不等同的成分。
在前述公開內容的基礎上，可以在本發明的實踐中進行許多改變和改進，而不偏離其實質或范圍，這對于本領域技術人員是顯而易見的。例如·根據本發明的方法可以任選地考慮拉曼光譜特征和背景熒光光譜特征以外的特征。例如，漫反射特征、紫外或可見熒光特征也可以包括在分析中。
·任意合適的數學技術可以用于從參照數據衍生合適的分類函數。這些技術可以包括判別函數分析、邏輯回歸、多次回歸或其他合適的統計學分析技術。
·雖然上面給出的一些實施例涉及對皮膚進行分類，但是本發明不限于皮膚組織，而可以等同地用于其他組織，包括內表面器官的上皮組織，如支氣管樹，耳、鼻和喉，胃腸道，子宮頸等。光纖探頭可以和內窺鏡一起使用，以最方便地獲得內部組織的拉曼和NIR背景熒光光譜。適于通過內窺鏡獲得拉曼和NIR背景熒光光譜的小型光纖探頭例如描述于名稱為“In vivo Raman endoscopic prob and methods of use”的國際專利申請No.PCT/CA04/00062和相應的美國專利申請No.10/761,703中。
·不獲得含拉曼和背景熒光特征的基本連續光譜，本發明可以通過獲得多個離散的波長或多個波長范圍的光譜信息來實施。
因此，本發明的范圍應認為和權利要求中限定的內容一致。
權利要求
1.一種表征組織的方法，該方法包括在第一波長范圍內獲得組織的拉曼光譜的特征；在與第一波長范圍重疊的第二波長范圍內獲得組織的背景熒光光譜的特征，其中在第一波長范圍內，背景熒光光譜是拉曼光譜的背景；和至少基于拉曼光譜特征和背景熒光光譜特征來表征組織。
2.根據權利要求1的方法，其中第一和第二波長范圍包括近紅外波長。
3.根據權利要求1或2的方法，其中第一和第二波長范圍相同。
4.根據權利要求1-3中任意一項的方法，其中第一和第二波長范圍各自包括約800nm-約1000nm的波長。
5.根據權利要求1-4中任意一項的方法，其中獲得背景熒光光譜和拉曼光譜的特征包括用基本單色的入射光照射組織區域以及通過在多個紅外波長處檢測從組織背散射的光而獲得原光譜。
6.根據權利要求5的方法，其中所述拉曼特征包括相對于入射光波長的拉曼位移為1445cm-1處的峰。
7.根據權利要求5或6的方法，其中所述拉曼特征包括相對于入射光波長的拉曼位移為1269cm-1處的峰。
8.根據權利要求5-7中任意一項的方法，其中所述拉曼特征包括相對于入射光波長的拉曼位移為約1200cm-1-約1400cm-1的譜帶內的特征。
9.根據權利要求5-8中任意一項的方法，其中所述拉曼特征包括相對于入射光波長的拉曼位移為約1500cm-1-約1650cm-1的譜帶內的特征。
10.根據權利要求1的方法，其中獲得背景熒光光譜的特征包括用紅外光照射組織以及通過在多個紅外波長處檢測從組織背散射的光而獲得原光譜。
11.根據權利要求10的方法，其中獲得拉曼光譜特征包括從原光譜提取拉曼光譜特征。
12.根據權利要求11的方法，其中從原光譜提取拉曼光譜特征包括將背景擬合函數與原光譜擬合以產生擬合的背景函數，并從原光譜減去擬合的背景函數。
13.根據權利要求12的方法，其中所述擬合的背景函數包含多項式。
14.根據權利要求13的方法，其中所述擬合的背景函數包含五次多項式。
15.根據權利要求12的方法，其中獲得背景熒光光譜的特征包括獲得擬合的背景函數的特征。
16.根據權利要求10的方法，其中至少基于拉曼光譜特征和背景熒光光譜特征表征組織包括對原光譜應用來自主成分分析的分類函數。
17.根據權利要求1的方法，其中至少基于拉曼光譜特征和背景熒光光譜特征表征組織包括對一個或多個數據集應用來自主成分分析的分類函數，所述一個或多個數據集共同包括拉曼光譜特征和背景熒光光譜特征。
18.根據權利要求17的方法，其中所述一個或多個數據集包括一個或多個拉曼光譜PC分值和一個或多個背景熒光光譜PC分值。
19.根據權利要求17的方法，其中應用分類函數包括對一個或多個數據集的數據應用預定的主成分。
20.根據權利要求17的方法，其中所述組織是受試者部分身體的皮膚，該方法包括從各自對應不同身體區域的多個分類函數選擇對應于受試者身體部位的分類函數。
21.根據權利要求20的方法，其中所述多個分類函數包括對應于兩個或多個下列身體部位的分類函數頭、軀干、手和臂或股。
22.根據權利要求20的方法，其中所述多個分類函數包括對應于兩個或多個下列身體部位的分類函數頭、軀干、手、臂或股、足、腿或指甲。
23.根據權利要求1的方法，其中表征組織包括將拉曼光譜特征和背景熒光特征作為輸入信號應用于神經網絡。
24.根據權利要求1-23中任意一項的方法，其中組織區域是皮膚區域。
25.根據權利要求1-23中任意一項的方法，其中組織區域包括肺組織。
26.根據權利要求1-23中任意一項的方法，其中組織區域包括上皮組織。
27.根據權利要求26的方法，其中上皮組織包括受試者胃腸道的襯層組織。
28.根據權利要求26的方法，其中上皮組織包括受試者耳、鼻或喉的襯層。
29.根據權利要求1-23中任意一項的方法，其應用于篩選皮膚癌。
30.根據權利要求1-23中任意一項的方法，其應用于篩選選自下列疾病的一種或多種疾病基底細胞癌、鱗狀細胞癌、黑素瘤和光化性角化病。
31.根據權利要求1-23中任意一項的方法，其應用于篩選脂溢性角化病、皮脂腺增生、角化棘皮瘤、斑痣、黑色素痣、結構不良痣和藍痣中的一種或多種。
32.根據權利要求6和7之一的方法，其中表征組織包括指示組織是否可能受黑素瘤影響。
33.根據權利要求6、7和33中任意一項的方法，其中表征組織包括指示組織是否可能是復合痔組織。
34.根據權利要求1-33中任意一項的方法，其中拉曼和自體熒光光譜的特征是利用體內組織獲得的。
35.根據權利要求34的方法，其中所述組織位于組織表面的下方，并且獲得拉曼和自體熒光光譜的特征包括在光通過上面的組織后檢測來自組織的光。
36.根據權利要求1-35中任意一項的方法，除了基于拉曼光譜特征和背景熒光光譜特征之外，還包括基于紫外熒光光譜來表征組織。
37.根據權利要求1-36中任意一項的方法，除了基于拉曼光譜特征和背景熒光光譜特征之外，還包括基于可見熒光光譜來表征組織。
38.根據權利要求1-37中任意一項的方法，除了基于拉曼光譜特征和背景熒光光譜特征之外，還包括基于漫反射光譜表征組織。
39.根據權利要求1-38中任意一項的方法，除了基于拉曼光譜特征和背景熒光光譜特征之外，還包括基于光散射光譜來表征組織。
40.根據權利要求1-39中任意一項的方法，包括獲得受試者正常組織對照區的拉曼光譜和背景熒光光譜中至少其一的特征；其中表征組織部分地基于組織的拉曼與背景熒光光譜的一個或多個特征和對照區域的對應的拉曼與背景熒光光譜的一個或多個特征之間的差異。
41.測定組織黑色素含量的方法，該方法包括獲得組織的光譜，所述光譜包括拉曼位移為約1368cm-1和1572cm-1的第一峰和第二峰；減去光譜的背景以產生拉曼光譜；根據拉曼光譜中第一和第二寬峰的強度計算組織的黑色素含量。
42.根據權利要求41的方法，其中從拉曼光譜減去背景包括將函數與光譜擬合和從光譜減去擬合的函數。
43.根據權利要求41的方法，其中擬合的函數是二次多項式函數。
44.一種用于表征組織的裝置，該裝置包括光源，用于照射組織區域；光學系統，其設計用于收集來自組織區域的背散射光，并將之引導至分光計；數據處理器，其連接以接收來自分光計的背散射光的光譜信息；可進入數據處理器的至少一個分類函數，所述分類函數響應輸入信號而產生分類結果，所述輸入信號包括有關組織光譜中至少一個拉曼特征和至少一個背景自體熒光特征的信息；其中所述數據處理器設計用來將分類函數應用于光譜信息，以獲得相應的分類結果，并基于相應的分類結果產生輸出信號，所述輸出信號指示組織區域是否可能包括異常組織。
45.根據權利要求44的裝置，包括多個分類函數和允許用戶選擇合適的一個分類函數的機構。
46.包括本文所述任意新的、有用的和創造性步驟、操作、步驟和/或操作的組合，或步驟和/或操作組合的亞組合的方法。
47.包含本文所述任意新的、有用的和創造性特征、裝置、特征和/或裝置的組合，或特征和/或裝置的亞組合的裝置。
全文摘要
利用拉曼光譜和背景熒光光譜的特征對組織進行分類的方法和裝置。所述光譜可以在近紅外波長處獲得。參照光譜的主成分分析和線性判別分析可以用于獲得接受受試組織的拉曼和背景熒光光譜特征的分類函數，并產生與受試組織異常可能性相關的指示。所述方法和裝置可以用于篩選皮膚癌或其他疾病。
文檔編號G01N33/483GK1890557SQ200480035316
公開日2007年1月3日 申請日期2004年11月26日 優先權日2003年11月28日
發明者曾海山, 雷德慰, 黃志偉, 大衛·I·邁克林 申請人:Bc腫瘤研究所