專利名稱：用于識別改變內在膜蛋白表面表達的試劑的高通量測定系統和方法
技術領域：
本發明涉及用于識別改變哺乳動物細胞中如心臟離子通道這樣的內在膜蛋白的表面表達水平的試劑的高通量測定系統和方法。本發明還涉及使用由這種方法識別的試劑的治療方法。
背景技術：
A.測定人乙醚舞蹈樣運動紊亂的相關基因(human-Ether-a-go-goRelated Gene)(hERG)是產生心臟再極化電流IKr的孔狀鉀通道亞基，并且由6個跨膜片段(S1-S6)和細胞質的氨基末端和羧基末端構成。已經將hERG與先天的和藥物誘導的長QT綜合征聯系起來，這是一種嚴重的并且可能致命的心臟病。
hERG的突變產生功能缺損的通道和/或運輸缺陷型通道，它們都減小IKr電流。在不同的長QT家族中由突變產生的大多數分子已經被識別。這表明hERG在心臟生理中扮演著重要角色。
大多數與長QT綜合征(藥物誘導的)相關的藥物是hERG阻斷劑。參見Vandenberg et al.，Trends Pharmacol.Sci.22240-246(2001)。由于在1996年將非鎮靜的抗組胺特非那定(Seldane)的心臟毒性與hERG阻斷聯系起來(參見Roy et al.，Crculation94817-823(1996))，包括抗心律失常藥、抗生素、抗精神病藥物以及抗組胺在內的具有不同結構的多種藥物都顯示出是有效的hERG阻斷劑。
因此，hERG成為用于新的治療藥物的心臟安全測試的一個重要靶標。美國食品與藥品管理局現在要求為新的治療化合物尋求批準的制藥公司要對這些藥物進行篩選用以確認是否有潛在的hERG阻斷作用。
目前，hERG心臟安全測試涉及電生理并且包括在穩定過表達hERG的HEK 293細胞中記錄hERG電流的膜片鉗(patch clamp)。然而，這種測定費用昂貴、耗時，并且需要相當的技能。因此，這項工作通常在藥物研發過程的較晚階段進行。不幸的是，在這時發現一種新的治療化合物是有效的hERG阻斷劑這將可能損害該化合物被批準并應用于治療的前景。因此，制藥企業對于更廉價、更快速并且可以在藥物研發過程的早期使用的hERG阻斷劑的測定相當感興趣。
膜片鉗測定的局限性導致了用于臨床前篩選潛在的hERG作用藥物的替代方法的出現。已經描述了幾種方法，但是受限于如靈敏度、通量能力和/或假陽性率(參見Xu et al.，Drug Discovery Today61278-1287(2001))。
例如，一種類型的測定方法使用膜電位敏感性熒光染料，如DiBAC4或FMP。由于這些測定是測量膜電位的改變而沒有hERG活性，因此假陽性的風險(即，改變膜電位但不阻斷hERG的藥物)很大。一個該測定方法的最新評估(Tang et al.，J. Biomol.Sceen.6325-331(2001))表明將假陽性和假陰性降到最小程度有很大問題。另外，靈敏度降低了約100倍。而且，用膜電位測定方法與膜片鉗測量的hERG阻斷劑效應的排序是不同的，這限制了不用提供作為其效應的有用信息而對潛在的hERG通道阻斷劑識別的熒光測定法的使用。最后，在該測試方法中染料/藥物的相互作用也引起了問題。
建議作為一種用于hERG相互作用的潛在的高通量臨床前篩選方法的第二種測試方法，它是結合到用于hERG轉染細胞的膜上的[3H]-多非利特(參見Finlayson et al.，Eur.J. Pharm 430147-148(2001))。這種結合測定是非功能性的，并且依賴于藥物與[3H]-多非利特競爭結合于hERG通道的能力。但是，在早期試驗中，通過膜片鉗方法識別的hERG阻斷劑的排序不能被[3H]-多非利特結合測定印證。同時，對于用作結合底物的純化的細胞膜和放射性標記的多非利特的需要限制了這種測定方法的使用。
建議的第三種測定方法涉及測量表達hERG細胞的銣(Rb)的流量(參見Terstappen，Anal.Biochem.272149-155(1999))。這些細胞用Rb通道裝載，并用高水平的鉀激活，從而測定釋放到培養基中的Rb。然而，通過這種方法得到的效應的排序與膜片鉗數據不對應(參見Tang et al.，J. Biomol.Sceen.，6325-331(2001)。另外，通量受到限制并且靈敏度降低了10倍。
因此，仍然需要識別包括如hERG這樣的心臟離子通道的內在膜蛋白阻斷劑的測定系統。
B.心律失常藥心房撲動和/或心房顫動(AF)是臨床上最常見的心律失常，并且其流行主要在年長人群中增長。現在，AF每年影響超過1百萬美國人，占所有心血管疾病的5％以上，并且每年在美國引起超過80,000起中風。而AF極少是致命性的心律失常，它主要導致頑固性疾病并且可能導致并發癥，如充血性心力衰竭或血栓栓塞的發生。目前可以使用的I類和III類抗心律失常藥物減少了AF再次出現的機率，但是由于包括心室致心律失常作用在內的各種潛在的副作用，其使用受到了限制。因為目前的治療是不充分的并且具有副作用，因此顯然需要開發新的治療方法。
心室纖顫(VF)是與急性心肌梗塞、缺血性冠狀動脈疾病和充血性心力衰竭相關的最常見的原因。同AF一樣，目前的治療也是不充分的并且需要開發新的治療方法。
盡管現在在市場上有各種抗心律失常藥物，但是具有滿意療效和高安全系數的藥物還沒有出現。例如，根據Vaughan-Williams分類體系的I類抗心律失常藥物(“Classification of antiarrhythmicdrug”，Cardiac Arrhythmias，edited byE.Sandoe，E，Flensted-Jensen，K.Olesen；Sweden，Astra，Sodettalje，pp 449-472(1981))，其選擇性抑制動作電位的上行支的最大速率(Vmax)，由于它們縮短了心臟動作電位的波長因而不能充分抑制心室纖顫，因此容易復發。另外，它們還有安全問題，即這些藥物引起心肌收縮的衰減，并且具有由于搏動傳導抑制而誘發心律失常的傾向。由于I類拮抗劑比對照安慰劑具有更高的死亡率，因此進行中的CAST(冠狀動脈抑制測試)研究被中止。分別屬于II類和IV類的β-腎上腺素受體阻斷劑和鈣通道(ICa)拮抗劑具有缺陷，由于在某些有心血管疾病的病人中它們有心臟抑制作用，因此它們的作用局限于特定類型的心律失常或不適于推薦。然而，它們的安全性比I類抗心律失常藥物高。
III類抗心律失常藥物引起動作電位時程(APD)的選擇性延長，并且不對最大的上行支速率(Vmax)造成強烈抑制。因此，它們延長了提高不應可能的心肌動作電位的保留長度，從而阻止復發。可用的該類藥物屈指可數。如甲磺胺心定和胺碘酮的實例已經顯示出具有令人感興趣的III類的性能(Singh B.N.，Vaughan Williams E.M.，“A third class of anti-arrhythmic actioneffects on atrial andventricular intracellular potentials and other pharmacological actions oncardiac muscle of MJ 1999and AH 3747”，Br.J.Pharmacol 39675-689(1970)，和Singh B.N.，Vaughan Williams E.M.，“The effectof amiodarone，a new anti-anginal drug，on cardiac muscle”，Br.J.Pharmacol 39657-667(1970))，但是這些不是選擇性III類藥物。
甲磺胺心定也具有II類(β-腎上腺素阻斷)效應，它可以引起心力衰竭，并且在某些敏感病人中不建議使用。
胺碘酮也不是一種選擇性III類抗心律失常藥物，因為它具有多種電生理作用，并且由于副作用而受到嚴格限制(Nademanee，K.，“The Amiodarone Odyssey”，J.Am.Coll.Cardiol.201063-1065(1992))。預期這類藥物在阻止心室纖顫方面有效。通過定義可知，選擇性III類藥物被認為是不能引起與I類抗心律失常藥物類似的由于動作電位傳導的抑制造成的心肌衰竭或引起心律失常。
III類藥物通過延長心臟動作電位時程(APD)增加了心肌不應。理論上說，延長心臟動作電位可以通過增強內向電流(即Na+或Ca2+電流，在下文中分別稱為INa和ICa)或通過減少外向再極化鉀K+電流來實現。該延遲的校正(IK)K+電流是動作電位平臺期與整個再極化過程相關的主要的外向電流，而瞬時外向(ITO)和內向校正(IKI)K+電流分別負責再極化的快速引發和中止階段。
細胞電生理研究發現IK包括兩個藥理學和動力學不同的K+電流亞類，IKr(快速活化和失活)和IKs(慢速活化和失活)。(Sanguinettiand Jurkiewicz，“Two components of cardiac delayed rectifier K+current.Differential sensitivity to block by Class III anti-arrhythmicagent”，J Gen Physiol 96195-215(1990))。IKr也是人乙醚舞蹈樣運動紊亂基因(hERG)的產物。細胞系中hERG cDNA的表達導致產生hERG電流，它們與IKr幾乎相同(Curran et al.，“A molecular basisfor cardiac arrhythmiahERG mutations cause long QT syndrome，”Cell 80(5)795-803(1995))。
目前在開發的III類抗心律失常藥物，如果不窮舉的話主要包括右旋-索他洛爾、多非利特(UK-68，798)、阿莫蘭特(H234/09)、E-4031和甲磺氨-N[1’-6-氰基-1，2，3，4-四氫-2-萘基]-3，4-二氫-4-羥螺[2H-1-苯并吡喃-2，4’-哌啶]-6基]，(+)-，一氯化物(MK-499)，它們阻斷IKr。盡管胺碘酮是IKs的阻斷劑(Balser J.R.Bennett，P.B.，Hondeghern，L.M.and Roden，D.M.“Suppression of time-dependentoutward current in guinea pig ventricular myocytesActions ofquinidine and aminodarone”，Cirt.Res.69519-529(1991))，它也阻斷INa和ICa，影響甲狀腺功能，也是一種非特異性的腎上腺素阻斷劑，作為磷脂酶的抑制劑，并且引起肺纖維化(Nademanee，K.“TheAmiodarone Odessey”.J. Am.Coll.Cardiol.201063-1065(1992))。
已經發現折返激動(折返性)是造成人室上性心律失常的主要機制。折返激動需要在慢傳導速率和足夠短暫的不應期之間的一個重要平衡，從而保證多種折返電流的引發和保持，用以同時共存并且維持AF。通過延長的APD增加心肌不應，防止和/或中止了折返性心律失常。目前正在開發的III類抗心律失常藥物，如果不窮舉的話主要是右旋-索他洛爾和多非利特，它們更具選擇性地阻斷在人心房和心室中發現的IK的快速活化部分IKr。
因為這些IKr阻斷劑增加心房和心室中的APD和不應，并且不影響傳導本身，因此理論上講，它們代表治療如AF和VF這樣的心律失常的潛在有用的藥物。由于增加慢心律前心律失常的風險，因此這些藥物具有缺陷。例如，當使用這些化合物時，可以觀察到一種獨特類型的多態性心室心動過速，torsade de pointes，它通常與心電圖QT間隔的過分延長相關，因此被稱為“獲得性長QT綜合征”(Roden，D.M.“Current status of Class III Antiarrhythmic DrugTherapy”，Am J.Cardiol，7244B-49B(1993))。這種慢心律時的突出作用被稱為“逆頻率依賴性”，并且與頻率獨立或頻率依賴作用形成對比。(Hondeghem，L. M.，“Development of Class IIIAntiarrhythmic Agents”，J.Cardiovasc.Cardiol.20(Suppl.2)S17-S22)。當右旋-索他洛爾比對照的安慰劑具有更高的死亡率時，這種前心律失常趨勢導致SWORD測試的中止。
延遲校正電流的慢速活化部分(IKs)潛在地克服了與心室心律失常相關的一些IKr阻斷劑的限制。然而，因為其的慢速活化動力學，IKs在心房再極化中的作用可能是有限的，這是由于心房的APD相對短。因而，盡管IKs阻斷劑可能對心室心律失常提供獨特的好處，但是認為它們影響上心室心動過速(SVT)的能力是很小的。
大多數目前可用的III類抗心律失常藥物的另一個主要的缺陷或局限是在心搏徐緩或慢心律時或期間，它們的作用增加或變得更加明顯，并且這導致它們可能造成前心律失常。另一方面，在心動過速或預期和最需要這些藥劑或藥物的疾病狀態時，它們失去了主要的療效。在快心律時這種療效的喪失或消失被稱作“逆使用依賴性”(Hondeghem and Snyders，“Class III antiarrhythmic agents havea lot of potential but a long way to goReduced effectiveness anddangers of reverse use dependence”，Circulation，81686-690(1990)；Sadanaga et al.，“Clinical evaluation of the use-dependent QRSprolongation and the reverse use-dependent QT prolongation of class IIIanti-arrhythmic agents and their value in predicting efficacy”A mer.Heart Journal 126114-121(1993))，或“逆速率依賴性”(Bretano，“Rate dependence of class III actions in the heart”，Fundam.Clin.Pharmacol.751-59(1993)；Jurkiewicz and Sanguinetti，“Rate-dependent prolongation of cardiac action potentials by amethanesulfonanilide class III anti-arrhythmic agentSpecific block ofrapidly activating delayed rectifier K+current by dofetilide”，Circ.Res.7275-83(1993))。因此，具有使用依賴性或速率依賴性圖形的藥物與大多數現用的III類抗心律失常藥物不同，它們不僅可以提供更高的安全性而且具有更好的療效。
針對與目前III類抗心律失常藥物相關的問題而言，需要一種對哺乳動物心律失常的有效治療。
發明內容
相應地，本發明的一個目的是提供用于識別改變如心臟離子通道這樣的內在膜蛋白的表面表達水平的藥物的測定和方法。本發明的另一個目的是提供阻止或治療心律失常的方法。
根據這些和其它的目的，本發明的第一具體實施方式
涉及一種用于識別改變哺乳動物細胞中內在膜蛋白的表面表達水平藥物的方法，包括a)制備含有表達目的膜蛋白的第一突變型的哺乳動物細胞的第一培養液，其中該第一突變型在所述細胞表面的表達水平低于野生型；b)加入有效量的候選試劑；c)在活性試劑存在下孵育細胞足夠的時間；d)加入有效量的至少一種抗體，該抗體與突變型的至少一個細胞外抗原決定部位結合；以及e)測定結合水平，其中所述結合水平的變化表明該候選試劑改變了所述表面表達的水平。
本發明的第二具體實施方式
涉及一種用于阻止或治療心律失常的方法，包括向需要的哺乳動物給予有效量的活性試劑，該試劑增加哺乳動物細胞中hERG第一突變型的表面表達水平并且不增加通過如下方法測定的哺乳動物細胞中的hERG第二突變型的表面表達水平，包括a)制備含有表達hERG的第一突變型的哺乳動物細胞的第一培養液，其中它在細胞表面上的表達水平低于hERG的野生型；b)加入有效量的活性試劑；c)在活性試劑存在下孵育細胞足夠時間；d)加入有效量的至少一種抗體，該抗體與hERG的該突變型的至少一個細胞外抗原決定部位結合；e)測定該抗體的結合水平；f)制備含有表達hERG的第二突變型的哺乳動物細胞的第二培養液，該突變型與第一突變型不同，并且在哺乳動物細胞表面的表達水平低于hERG的野生型；g)向該第二培養液中加入有效量的活性試劑；h)在活性試劑存在下孵育細胞足夠的時間；i)加入有效量的至少一種抗體，該抗體與該第二突變型的至少一個細胞外抗原決定部位結合；以及j)測定該抗體的結合水平。
本發明另外的優點、目的和特性一部分將在后面的描述部分給出，而另一部分通過隨后的舉例或通過本發明實踐的教導對于本領域普通人員將變得顯而易見。在所附的權利要求中特別指出的本發明的這些目標和優點可以被認識和實現。
具體實施例方式
I.應用的測定和方法本發明的優選實施方式包括一種用于識別結合如膜離子通道這樣的內在膜蛋白，并且由此增加或減少了哺乳動物細胞中的表面表達的試劑的測定系統和方法。在一些特定的優選實施例中，該測定和系統測定了試劑結合到內在膜蛋白突變型的特定位點的能力，并從而改變了其表面表達。這種表面表達的改變可以來自于試劑阻斷的在相對于野生型膜蛋白活性位點的突變型上的一個位點和/或通過阻斷細胞內運輸和/或突變膜蛋白的加工。可選替換的，表面表達的改變可以來自于試劑改善了突變膜蛋白的細胞內運輸。
適當的結合測定對于本領域技術人員有很多已知的和可行的形式。根據本發明的一些具體實施方式
，可以在適當的液體培養基中提供一種或多種表達膜蛋白的目的細胞，并且暴露于一種或多種待測化合物，而在另一個具體實施方式
中該細胞可以是固定在表面上的。類似地，根據本發明的其它具體實施方式
，一種或多種待測化合物可以被固定在表面上，并且暴露于含有一種或多種表達目的膜蛋白的細胞的液體培養基中，或者該待測化合物可以包括在合適的液體培養基中并向其中加入一種或多種表達目的膜蛋白的細胞。
在至少一種待測化合物和目的膜蛋白被標記的系統中的結合通常很容易檢測(例如用熒光、放射性、酶、抗體等、或其組合，這對于本領域技術人員是已知的)。在將待測化合物暴露于表達膜蛋白的細胞并洗掉或除去未結合的試劑之后，測量存在的標記部分(即，結合于測試系統的未標記部分)。
各種用于進行結合測試的方法都是本領域已知的，包括但不限于如PCT申請US98/18368中所描述的那些測定系統。各種參考文獻提供了用于蛋白結合測定的各種形式的一般描述，包括競爭結合測定和直接結合測定，(參見Stites and Terr，Basic and ClinicalImmunology，7thed.(1991)；Maggio，Enzyme Immunoassay，CRC Press，Boca Raton，FL(1980)；and Tijssen，Practice and TheoLy of EnzymeImmunoassays，in Laboratory Teelmiques in Biochemistry andMolecular Biology，Elsevier Science Publishers，B.V. Amsterdam，(1985))。
本發明特別優選的具體實施方式
涉及這樣的測定系統和方法，其識別通過阻斷膜蛋白活性和/或阻斷其細胞內運輸和/或其加工從而增加或減少目的膜蛋白的表面表達的化合物。
因此，根據一些特別優選的具體實施方式
，提供了免疫測定，其中一種或多種表達目的膜蛋白的細胞通常結合到適宜的固體支撐物上(例如微量滴定板的孔、微型卡、或對于本領域技術人員已知的任何其它類似的形式)并與候選試劑結合，從而觀察目的膜蛋白的表面表達水平的變化。因此，在這些優選具體實施方式
中，一種或多種測定成分結合到固體表面。
在一些
具體實施例方式
中，一種測定系統可以用于(本領域已知的)檢測由于候選試劑結合的膜蛋白表面表達的變化。例如，如果目的膜蛋白是膜離子通道，則可以使用膜片鉗來測定檢測離子通過膜的流量的變化，從而證明離子通道的表面表達水平的增加。
在另一可選的具體實施方式
中，使用一種間接免疫測定系統，其中在細胞表面上的膜蛋白通過加入一種或多種直接對抗膜蛋白的細胞外抗原決定部位的抗體來檢測，如本領域所已知的。
當使用本發明的方法中的固體支撐物時，實際上任何固體表面都是適合的，只要該固體表面與測定試劑相容并能夠將該成分結合到表面上而且不過度改變測定成分的反應性。本領域技術人員知道一些成分在固相測定中活性減少，但是只要活性足夠進行檢測和/或定量，這一般是可以接受的。
合適的固體支撐物包括但不限于材料或細胞可以黏附的任何固體表面，如玻璃珠、平板玻璃、可控孔玻璃、塑性多孔塑性金屬、或樹脂等。本領域技術人員知道在一些具體實施方式
中，在本發明的方法中使用的固體支撐物可以是由官能團衍生而來的(例如羥基、氨基、羰基、酯和巰基)，該官能團為連接部分(連接子)的結合提供反應部位或直接結合于候選試劑或其它測定成分。
將測定成分結合到固體支撐物上可以是直接的(即，該成分直接與固體表面接觸)或間接的(即，試劑和/或成分(如抗體)結合到支撐物上，而其它測定成分結合到該試劑或成分上而不是結合到該固體支撐物上)。在一些具體實施方式
中，該試劑或成分是共價固定的(例如利用半胱氨酸單獨的反應巰基基團固定蛋白質成分(參見Bioconjug.Chem.，4528-536(1993))，或非共價、但是特異性地(例如通過固定的抗體或其它特異性結合蛋白(參見Adv.Mater.，3388-391(1991)；Anal.Chem.，6783-87(1995)))，生物素/鏈霉抗生物素蛋白系統(參見如Biophys.Biochem.Res.Commun.，23076-80(1997))，或金屬鰲合Langmuir-Blodgett膜(參見如Langmuir 114048-4055(1995)；Angew.Chem.Int.Ed.Engl.，35317-320(1996)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA 934937-4941(1996)；and J.Struct.Biol.，113117-123(1994))，和金屬鰲合自組裝單層(參見如Anal.Chem.，68490-497(1996))，用于聚組氨酸融合蛋白的結合。
在一些特別優選的具體實施方式
中，使用本領域普遍公知的標準的直接或間接ELISA、IFA或RIA方法來檢測候選試劑與目的膜蛋白的結合。在一些具體實施方式
中，在樣品中檢測到膜蛋白的表面表達水平增加，而在另一些具體實施方式
中檢測到表面表達水平的減少。因此，本發明的方法適合于檢測、識別和表征多個要素。
相應地，在本發明方法的一些特別優選的具體實施方式
中，可以使用由用于捕獲的單抗或多抗(“捕獲抗體”)和用于檢測抗體-抗原復合物(例如hERG結合到抗hERG抗體或hERG突變體結合到相應的抗體)結合的二抗(“報道抗體”)構成的夾層結構ELISA(酶聯免疫吸收測定)。
在一些優選的ELISA具體實施方式
中，使用堿性磷酸酶結合的方法，而在另外一些優選的具體實施方式
中，使用辣根過氧化物酶結合的方法。此外，還使用抗生物素蛋白/生物素系統，尤其適用于信號增加的測定系統中。在優選具體實施方式
中，適宜使用的酶包括但不限于過氧化物酶、熒光素酶、堿性磷酸酶、葡糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、以及其兩種或多種混合物。
因此，在本發明的一個例舉的方法中，在阻斷緩沖液中將適當稀釋的100μl生物素化的抗體(例如直接對抗hERG或其突變體)加入到預涂的抗生物素蛋白的ELISA板的每個孔中(如可從Pierce商購的中性抗生物素蛋白(neutravidin)板)。2小時后，用清洗緩沖液清洗板子(如0.1％的TBS/Tween 20，含有或不含有阻斷試劑)。通過加入阻斷緩沖液可以抑制進一步的非特異性結合(如根據制造商的推薦加入300μl SuperBlock(Pierce)兩次)。接著孵育一段時間以使生物素化的抗體與孔表面結合，之后根據本領域已知的方法清洗板子(如3次)，以除去孔板中任何未結合的抗體。
如標準樣品和對照一樣，表達目的膜蛋白的細胞樣本可以用適當的緩沖液稀釋，并加入到ELISA板的孔中。稀釋的標準樣、對照和樣品可以加入到ELISA板的孔中(如100μl/孔)。標準樣、對照和樣品通常進行雙孔檢測。通常，在一個密閉保濕的容器或類似物中在5RPM的搖床或其它適當的振動裝置上，將孔板孵育例如過夜或持續其它適當長的時間。用本領域已知的清洗緩沖液清洗孔板(如3次左右)。然后可以加入100μl的適當稀釋的單抗或多抗報道抗體(優選用涂孔板的抗體預先吸收)，并且在室溫下孵育優選過夜(如18-20小時)或其它適當的孵育時間。
可以再次清洗孔板，優選如上所述，并且可以加入在適當的阻斷緩沖液中(如在TBS中的BSA阻斷劑)適當稀釋的如堿性磷酸酶結合的抗兔Ig(可由Pierce商購)這樣的100μl酶標記的抗體，并且在搖床或如上所述的類似的攪動下孵育足夠的時間(如2小時)。
然后該孔板可以優選用如上所述的方法再次清洗。可以將酶底物加入到孔中并使反應持續進行適當長的時間，最后用本領域已知的適當方法結束反應，并用本領域已知的方法測定孔中溶液的光密度。
因為背景信號通常是擴增測定的限制因素，因此在本發明的一些具體實施方式
中，可以通過采用減少這些測試中的背景信號的方法來進行測定。
除了使用固體支撐物的測定系統之外，本發明的還提供了將測定成分懸浮在溶液中的方法。
根據本發明的第一特別優選的具體實施方式
，提供了一種用于識別試劑的方法，該試劑如肽、蛋白、抗體或化學試劑改變哺乳動物細胞中如hERG這樣的內在膜蛋白的表面表達水平。這種方法包括a)制備含有表達目的膜蛋白第一突變型的哺乳動物細胞的第一培養液，其中這種第一突變型在細胞表面的表達水平低于該蛋白的野性型；b)加入有效量的候選試劑；c)在候選試劑存在下孵育細胞足夠的時間；d)加入有效量的至少一種抗體，該抗體與突變型的至少一個細胞外抗原決定部位結合；以及e)在將細胞用候選試劑孵育之后，測定抗體對蛋白的細胞外抗原決定部位的結合水平。
相對于對照，在候選試劑存在下結合水平的任何變化，如增加或減少，都表明候選試劑改變了膜蛋白的第一突變型的表面表達水平。
根據本發明的第二特別優選的具體實施方式
，上述方法進一步包括f)制備含有表達目的膜蛋白的第二突變型的哺乳動物細胞的第二培養液，其中該第二突變型與第一突變型不同，并且在所述哺乳動物細胞表面的表達水平低于該膜蛋白的野生型；g)加入有效量的候選試劑；h)在所述候選試劑存在下將所述細胞孵育足夠的時間；i)加入有效量的至少一種抗體，該抗體與第二突變型的至少一個細胞外抗原決定部位結合；以及j)測定抗體與細胞外抗原決定部位的結合水平。與候選試劑孵育之后，結合水平的任何變化都表明候選試劑改變了目的膜蛋白的第二突變型的表面表達水平。
根據本發明優選的具體實施方式
，上述步驟(d)包括加入有效量的至少一種一抗和有效量的至少一種二抗。根據該具體實施方式
，該一抗優選結合到目的膜蛋白的第一突變型的至少一個細胞外抗原決定部位上。根據該具體實施方式
，更優選的是二抗結合到一抗上。
根據本發明的其它優選具體實施方式
，上述步驟(i)還包括加入有效量的至少一種一抗和有效量的至少一種二抗。根據這些具體實施方式
，該一抗優選與目的膜蛋白的第二突變型的至少一個細胞外抗原決定部位結合。根據這些具體實施方式
更優選的是二抗與一抗結合。
優選地，二抗偶聯到酶上，以有利于檢驗和測定結合水平。在本發明的方法中，適合使用的酶是本領域技術人員已知的和可以得到的。合適的酶的例子包括但不限于過氧化物酶、熒光素酶、堿性磷酸酶、葡糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、以及其兩種或多種混合物。
可以用本領域技術人員已知的和可行的任何方法和技術來測定目的內在膜蛋白的表面表達水平。優選通過熒光、發光、放射性、吸收、或其兩種或多種的組合來測定結合水平。
根據本發明的一些特別優選的具體實施方式
，該內在膜蛋白是膜離子通道。適當的膜離子通道的示例性例子包括但不限于鈉通道、鉀通道、鈣通道或氯通道。
根據本發明優選的具體實施方式
，抗體結合的膜蛋白的第一突變型的細胞外抗原決定部位優選與野生型抗原決定部位一樣，即與在目的膜蛋白的天然存在形式上發現的細胞外抗原決定部位一樣。不希望受到任何操作性或類似理論的限制，這樣的安排可以潛在地減少由于蛋白質結構的不同而產生的錯誤，例如一種或多種蛋白功能性質的改變。
根據本發明其它優選的具體實施方式
，抗體結合的膜蛋白的第二突變型的細胞外抗原決定部位優選與野生型抗原決定部位一樣。
根據本發明特別優選的具體實施方式
，在膜蛋白的第一和/或第二突變型上的該細胞外抗原決定部位含有一個標記物。適當的標記物是本領域技術人員已知的并且可以得到的。本發明方法中使用的一個特別優選的標記物是血凝素(HA)標記物。該標記物可以插入到膜蛋白的第一和/或第二突變型的細胞外結構域中、或者可以取代其一部分細胞外結構域。
根據本發明的方法，膜蛋白的第一和第二突變型優選與膜蛋白的野生型的氨基酸序列至少有一個氨基酸殘基不同。而且，第一和第二突變型優選彼此的氨基酸序列至少也有一個氨基酸殘基不同。
根據一些優選的具體實施方式
，膜蛋白的第一突變型可以是運輸缺陷型突變體，并且其在哺乳動物細胞表面上的表達水平低于相應的野生型。根據其它優選的具體實施方式
，第二突變型可以是運輸缺陷型突變體，而根據另外的優選具體實施方式
，第一和第二突變型可以都是運輸缺陷型突變體。
根據本發明的某些特別優選的具體實施方式
，目的膜蛋白是心臟離子通道，更優選的是鉀離子通道。這些離子通道對于本領域技術人員是已知的。這樣的鉀離子通道的一個例子是hERG。
本發明的方法中使用的適當的hERG第一突變型是本領域技術人員已知的。根據本發明的優選具體實施方式
，當在細胞表面表達時，這樣的突變型應具有功能，但在細胞表面的表達水平應低于任意的野生型，更優選的是由于運輸缺陷。適當的突變型的示例性例子包括但不限于G601S(其識別于長QT綜合征家族中)和N470D。G601S是運輸缺陷型，其產生很小的但動力學沒有改變的電流的部分缺失性(hypomorphic)通道(參見Furatani et al.，Circulation 992290-2294(1999))而N470D是減效的錯義突變體。增加如G601S和N470D這樣突變體的表面表達的試劑也結合于hERG離子傳導通路中的高親和性位點，從而成為有效的hERG阻斷劑。
出于舉例說明的目的但不受此限制，在本發明優選的具體實施方式
中，在位于跨膜結構域S1和S2之間的連接部分上基因工程化如hERG-G601S這樣的離子通道的突變型以表達如HA標記物這樣的細胞外標記物(這樣的標記物優選不改變通道的功能性質)。將穩定表達該標記物的突變體(如hERG-G601S-HA)的如HEK 293細胞的細胞鋪于如96孔微量滴定板這樣的適當的容器中，并且用一種或多種候選試劑孵育足夠的時間，如過夜。然后細胞優選用如甲醛進行固定，但是優選不進行滲透并且加入識別HA標記物的抗體。使用優選結合到如辣根過氧化物酶這樣的酶上的二抗與結合到固定細胞表面上的抗HA抗體結合。接著可以用如化學發光的反應混合物這些任何適當的方法得到細胞表面信號，并且在例如微量滴定板光度計中測定表達水平。對照細胞通常用水和/或其它用于與候選試劑結合的任意液態載體如DMSO孵育。增加第一突變型的表面表達的試劑是潛在的hERG(或類似的這種離子通道)的阻斷劑。
在本發明的方法中使用的hERG的適當的第二突變型也是本領域技術人員已知的。根據本發明優選的具體實施方式
，表達在表面上的這種突變型的水平低于任意的野生型，更優選的是由于運輸缺陷，但是當表達于細胞表面上時應當不具有功能。適當的hERG突變型的示例形例子包括但不限于G601S/F656C和N470D/F656C。不增加如G601S/F656C和N470D/F656C這樣的突變體的表面表達的試劑是潛在的hERG阻斷劑。
同樣，出于舉例說明的目的且不限于此的是，在本發明的優選具體實施方式
中，在跨膜結構域S1和S2之間的連接部分中基因工程化如hERG-G601S/F656C這樣的離子通道的第二突變型，用以表達如HA標記物這樣的細胞外標記物(同樣，這樣的標記物優選應當不改變通道的功能性質)。將穩定表達該標記的突變體(如hERG-G601S/F656C-HA)的(如HEK293細胞這樣的)細胞鋪于(如96孔微量滴定板這樣的)適當的容器中，并且與候選試劑孵育足夠的時間，優選為增加第一突變型的表面表達的候選試劑。將細胞優選接著進行固定并不進行滲透，并且加入識別HA標記物的一抗。將優選結合到酶上的二抗然后用于與結合到固定細胞表面的抗HA抗體結合。接著可以用如化學發光反應混合物這樣的任意適當的方法得到細胞表面信號，并且在如微量滴定板光度計中測定表達水平。對照細胞通常用水和/或任意用于與候選試劑結合的液態載體，如DMSO進行孵育。那些不增加第二突變型的表面表達水平的試劑可能是有效的hERG阻斷劑。增加第一突變型的表面表達水平而不增加第二突變型的表面表達水平的試劑更有可能是有效的hERG阻斷劑。
根據上述方法的更特別優選的具體實施方式
，hERG表面表達通過從培養箱中移出微量滴定板并除去浸泡細胞的培養液來進行測量。用PBS(100μl)將孔漂洗三次接著用多聚甲醛(如4％在PBS中、pH為7.2、100μl)固定細胞，再用PBS漂洗。優選阻斷在細胞表面上的非特異性結合位點，例如用在PBS中的1％羊血清(“阻斷緩沖液”)孵育細胞。在除去阻斷緩沖液之后，將細胞在阻斷緩沖液中與例如鼠抗HA這樣的一抗孵育。然后去除一抗，清洗細胞(如用阻斷緩沖液清洗3次)。加入如在阻斷緩沖液中的辣根過氧化物酶結合的抗鼠羊抗體這樣的二抗。然后除去二抗，并且優選對細胞進行清洗。
根據該
具體實施例方式
，用任何適當的技術可以開發出化學發光信號，如SuperSignal ELISA Femto Maximum Sensitivity Substrate(Pierce Chemical Co.)。加入適量的試劑，如微量滴定板每孔50μl，并且用GloRunner luminometer(Turner Designs)獲得數據。
可選地加入熒光反應用以監測每孔的細胞數量。
II.治療組合物和方法本發明優選的具體實施方式
還是通過向需要其的哺乳動物(如需要其的人)給予有效量的用上述測定方法識別的試劑來阻止或治療心律失常的方法。優選地，該阻止或治療心律失常的發明的方法是通過向需要其的哺乳動物如需要其的人給予增加hERG的第一突變型的表面表達水平的有效量的試劑，如G601S或N470D。更優選地，該試劑不增加如G610S/F656C或N470D/F656C這樣的hERG的第二突變型的表達水平。
本發明的優選具體實施方式
還包括用于在哺乳動物如人體內阻止或治療心律失常的組合物，包括有效量的這樣的試劑以及藥學可接受的載體。
適用于本發明的治療方法和組合物的特別優選的試劑的示例性例子是伐諾司林(也稱作GBR-12909)。伐諾司林，其制造和/或其一些藥物用途描述于美國專利第4,202,896號、第4,476,129號和第4,874,765號以及歐洲專利第243,903號和PCT國際專利申請第WO91/01732號。
伐諾司林的藥學可接受的鹽也可以用于本發明的方法中。可用于本發明的方法中的伐諾司林的藥學可接受的鹽包括但不限于由無毒性的無機酸或有機酸生成的伐諾司林的鹽類。例如，藥學可接受的鹽包括但不限于如下的鹽類由無機酸衍生的鹽類，如鹽酸、氫溴酸、硫酸、氨基磺酸、磷酸、硝酸和類似物；由有機酸衍生的鹽類，如乙酸、丙酸、琥珀酸、乙醇酸、硬脂酸、乳酸、蘋果酸、酒石酸、檸檬酸、抗壞血酸、撲酸、馬來酸、羥基馬來酸、苯乙酸、安息香酸、水楊酸、對氨基苯磺酸、2-乙酸基-安息香酸、富馬酸、甲苯磺酸、甲磺酸、乙烷二磺酸、草酸、羥乙磺酸、三氟乙酸和類似物；以及由氨基酸衍生的鹽，如谷氨酸或天冬氨酸。參見美國專利第6,187,802號和WO91/01732。
在本發明的方法中，有用的伐諾司林的藥學可接受的鹽類可以通過常規的化學方法由伐諾司林合成。通常，通過離子交換層析法或在適當的溶劑或溶劑各種組合中通過將游離的堿與化學計量的或超量的形成鹽所需的無機酸或有機酸進行反應來制備該鹽。
當給予哺乳動物如人時，只要它們提供所需要的藥物學反應和適宜于本發明方法中其它適當的用途時，如呈現可接受的毒理學特征，在使用條件下相對穩定等，伐諾司林的藥學可接受的代謝物可以用于本發明的方法中。可以應用于本發明方法中的適宜的代謝物的示例性例子包括但不限于如下1-[2-(二苯基甲氧基)乙基]-4-(3-苯丙基)哌嗪(其也稱作GBR 12935并且是伐諾司林在人體中主要的代謝物)和藥學可接受的鹽、類似物和其衍生物。
當給予哺乳動物如人時，只要它們具有所需的藥物學反應，和適宜于本發明方法的其它適當的用途如呈現可以接受的毒理學特性，在使用條件下相對穩定等，伐諾司林的藥學可接受的衍生物也可以用于本發明的方法中。用于本發明方法中的適宜的衍生物的示例性例子包括但不限于如下GBR13069和GBR12783，它們分別與伐諾司林和GBR12935的結構類似，除了3-苯丙基部分已經被3-苯丙烯-2-基部分取代。
其它適宜的衍生物包括伐諾司林的酚衍生物，即其中伐諾司林的未取代的苯基基團被一個或多個羥基以及其甲氧基同系物基團取代的伐諾司林的衍生物。(參見Rice et al.，“Oxygenated analoguesof 1-(2-(diphenylmethoxy)ethyl)-and 1-(2-(bis(4-fluorophenyl)methoxy)ethyl)-4-(3-phenylpropyl)piperazines(GBR 12935andGBR 12909)as Potential Extended-Action Cocaine-Abuse TherapeuticAgents，”J.Med.Chem.42(23)5029-5042(2001)；和Dutta et al.，“Positional Importance of the Nitrogen Atom in Novel PiperidineAnalogs of GBR 12909Affnity and Selectivity for the DopamineTransporter，”Med.Chem.Res.3(4)209-222(1993))。
可以用于本發明方法中的適宜的衍生物的另外的例子包括4-[2-雙(鹵苯基)甲氧基]-乙基]-α-(取代苯基)-1-哌嗪烷醇衍生物。參見如美國專利第4,476,129號。
當用于本方法時，可以用任何能夠將藥物活性試劑引入所需要的作用部位的方法，包括但不限于口腔、舌下、鼻、口、局部、直腸和胃腸外給藥的方法，來給予伐諾司林、或藥學上可接受的鹽、衍生物或其代謝物。化合物的輸送也可以利用皮下植入物或透皮貼劑這樣的可控釋放的劑型。
對于口服給藥，含有伐諾司林、或藥學上可接受的鹽、衍生物或其代謝物的適宜組合物可以制成片劑、糖衣丸、膠囊、糖漿和水性或油性混懸劑的形式。用于制備這些組合物的惰性成分是本領域已知的。例如片劑可以通過將活性化合物在如馬鈴薯淀粉或微晶纖維素這樣的崩解劑、和如硬脂酸鎂或滑石粉這樣的潤滑劑存在下與如乳糖或磷酸鈣這樣的惰性稀釋液混合來制備，然后用已知的方法將該混合物制成片劑。
片劑也可以用本領域已知的方法制成伐諾司林、或藥學上可接受的鹽、衍生物或其代謝物的持續釋放劑型。如果需要，該片劑可以通過已知的方法提供腸衣，例如通過使用醋酸鄰苯二甲酸纖維素。適當的粘合劑或成粒劑包括但不限于明膠、羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮或糊精。滑石、膠態硅酸、硬脂酸甘油以及硬脂酸鈣和硬脂酸鎂或類似物可以用作抗粘劑及滑動劑。
片劑也可以通過濕法造粒及隨后的壓制法制備。含有伐諾司林、或藥學上可接受的鹽、衍生物或其代謝產物的混合物與至少一種稀釋劑，以及可選的一部分崩解劑與粘合劑水、乙醇或水-乙醇溶液在適當的裝置中一起成粒，然后將顆粒干燥。之后，向干燥的顆粒中混入其它的防腐劑、表面活性劑、分散劑、崩解劑、滑動劑和抗粘添加劑，并且將該混合物壓制成片劑或膠囊。
片劑也可以通過將含有活性成分的混合物與所需的添加劑直接壓制在一起來制備。如果需要該片劑可以通過加入制藥工業中通常使用的如蔗糖、纖維素衍生物(甲基-或乙基纖維素或羧甲基纖維素鈉)、聚乙烯吡咯烷酮、磷酸鈣、碳酸鈣、食品染料、香味劑、氧化鐵色素和類似物的保護劑、調味劑和染色劑變為糖衣丸。
為了制備膠囊或囊片，將伐諾司林、或其藥學上可接受的鹽、衍生物或代謝物，以及所需的添加劑的混合物填充到如硬質或軟質明膠的膠囊中。用已知的方法配制膠囊和/或囊片的內容物，從而得到持續釋放的活性化合物。
液態口服劑型的伐諾司林、或其藥學上可接受的鹽、衍生物或代謝物，可以是酏劑、混懸劑和/或糖漿，其中將該化合物與無毒的懸浮劑混合。液態口服劑型也可以包括一種或多種甜味劑、調味劑、防腐劑和/或其混合物。
對于直腸給藥，含有伐諾司林、或其藥學上可接受的鹽、衍生物或代謝物的合適的組合物可以制成栓劑形式。除了活性成分外，該栓劑可以含有藥物生產中常用的栓劑物質，如可可豆油、甘油明膠或高分子量的聚乙二醇。
為了胃腸外給藥，伐諾司林、或其藥學上可接受的鹽、衍生物或代謝物的合適的組合物可以制成注射液或混懸劑形式。對于活性成分可以溶于水性或非水性等滲滅菌注射液或混懸液中，如乙二醇醚、或可選地在如聚氧乙烯脫水山梨糖醇單月桂酸鹽、單油酸鹽或單硬脂酸鹽這樣的增溶劑存在下制備注射液或混懸劑。這些溶液或混懸劑可以由上文提到的在用于口服給藥劑型中使用的含有一種或多種載體或稀釋劑的滅菌粉末或顆粒制備。腸胃外給藥可以通過靜脈內、皮內、肌肉內或皮下注射。
含有伐諾司林、或其藥學上可接受的鹽、衍生物或代謝物的組合物也可以經鼻給藥，例如通過噴霧、氣溶膠、霧化溶液和/或粉末的形式。也可以使用本領域已知的計量的劑量系統。
伐諾司林、或其藥學上可接受的鹽、衍生物或代謝物的藥物組合物也可以以這種給藥方式將已知的藥物形式給予口腔(例如舌下)，如緩慢溶解的片劑、口嚼劑、藥片、糖錠劑、錠劑、凝膠、軟膏、嗽口水、洗劑和/或粉劑。
用于局部給藥的含有伐諾司林、或其藥學上可接受的鹽、衍生物或代謝物的組合物可以包括一種基質，其中藥物活性化合物被分散到該基質中從而保持與皮膚接觸以便透皮給予該化合物。合適的透皮組合物可以通過將伐諾司林、或其藥學上可接受的鹽、衍生物或代謝物與局部用載體如礦物油、礦脂和/或蠟，例如石蠟或蜂蠟，以及潛在的透皮促進劑，如二甲基亞砜或丙二醇一起混合來制備。另外一種可替換的方法是，可以將伐諾司林、或其藥學上可接受的鹽、衍生物或代謝物分散到藥學可接受的乳劑或油膏基底中。包含在局部用劑型中的伐諾司林、或其藥學上可接受的鹽、衍生物或代謝物的量應當是在皮上使用的局部用配方的時間段內遞送的有效治療量。
伐諾司林、或其藥學上可接受的鹽、衍生物或代謝物也可以通過外源的連續灌輸如通過靜脈內灌輸或通過置于體內的化合物源來給藥。內源包括植入的伐諾司林、或其藥學上可接受的鹽、衍生物或代謝物的儲庫，為了例如通過滲透能夠連續釋放的灌輸，該植入物可以是(a)該化合物的藥學上可接受的油的形式如混懸劑或溶液這樣的液體，例如以非常少量的水溶性衍生物如十二烷酸鹽的形式灌輸，或(b)用于灌輸化合物的植入載體形式的固體，例如合成樹脂或蠟質材料。該載體可以是含有所有化合物的單體或一系列的幾個個體，其每一個含有部分待遞送的化合物。在內源中存在的伐諾司林、或其藥學上可接受的鹽、衍生物或代謝物的量應當是保證在長時間內遞送有效治療量的量。
另外，伐諾司林、或其藥學上可接受的鹽、衍生物或代謝物的注射液可以含有各種添加劑如防腐劑，如苯甲醇、4-羥基安息香酸甲基或丙基酯、苯扎氯銨、硼酸苯汞及類似物；以及抗氧化劑，如抗壞血酸、生育酚、焦硫酸鈉和可選的絡合物形成試劑，如用于結合痕量金屬的乙二胺四乙酸鹽，以及用于調節pH值的緩沖液和可選的局部麻醉劑，如利多卡因。含有伐諾司林、或其藥學上可接受的鹽、衍生物或代謝物的注射液在裝入安瓿前要過濾，而注入后要滅菌。
用于本發明的這樣的治療方法的其它試劑包括任意已知的hERG阻斷劑，如阿司咪唑、特非那丁、E-4031、西沙必利、氯喹和類似物。
實施例實施例1-用阿司咪唑援救hERG-G601S表面表達將穩定表達hERG-G601S-HA的HEK-293細胞置于帶有透明底的BIOCOAT聚-D-賴氨酸細胞培養皿(cellware)的96孔黑色平板中(BD Discovery Labware)。將細胞鋪于(8×104細胞/孔)含有10％FBS加上青霉素-鏈霉素和遺傳霉素(geneticin)(G418；0.5mg/ml)的DMEM/F12的完全培養液中，加藥前在37℃/5％CO2下孵育8小時。制備藥物(阿司咪唑、去甲阿司咪唑、非索非那定)的儲液(200μM、1mM和5mM)。就加入前在含有10％FBS的DMEM/F 12中制備工作稀釋液(200nM、1μM和5μM)。載體由在含有10％FBS的DMEM/F12中的0.1％DMSO構成。除去浸泡細胞的培養液，并且用含有藥物或載體的對照培養液(100μl/孔)替代。對于每一種藥物每個濃度有3個測試孔和3個對照孔。在表面表達的測試開始之前，將孔板在37℃/5％CO2下孵育過夜(約16小時)。
在室溫下，在工作臺上進行表面表達測定。將細胞用100μl的PBS清洗3次，隨后用新制備的冰冷的溶于PBS的4％多聚甲醛(pH為7.2、100μl、20min)固定。去除固定液，并用100μl的PBS清洗細胞。通過在PBS中與1％的羊血清(阻斷緩沖液、100μl持續30min)孵育阻斷了細胞表面上的非特異性結合位點。除去阻斷緩沖液并用在阻斷緩沖液中稀釋的鼠抗HA(1∶500稀釋、100μl，Roche)孵育細胞3小時。移去一抗之后，用1％的羊血清PBS溶液(100μl和10min/洗)清洗細胞3次。將HRP-結合的羊抗鼠抗體(1∶2000；Jackson Labs)用阻斷緩沖液稀釋并且與細胞孵育1小時(100ul/孔)。在孵育后，將細胞用100μl的1％羊血清PBS溶液清洗(10min)，然后用100μl的PBS(10min/洗)清洗3次。
用SuperSignal ELISA Femto Maximum Sensitivity Substrate(Pierce Chemical Co.)測定化學發光信號。從孔中除去PBS并且用每孔100μl的檢測試劑取代。用GloRunner luminometer(TurnerDesigns)立即捕獲信號。
得到的數據顯示藥物援救hERG-G601S-HA表面表達的能力與其阻斷hERG的能力直接相關。因此，阿司咪唑比更弱的阻斷劑去甲阿司咪唑更多地增加了表面表達。類似地，根本不阻斷hERG的非索非那定不增加hERG-G601S-HA的表面表達。
實施例2-去除在hERG中結合位點的藥物去除用阿司咪唑的救援將在35mm培養皿中的HEK-293細胞用編碼hERG-G601S-HA或hERG-G601S/F656C-HA的cDNA短暫轉染。在轉染24小時之后在一些平板中加入阿司咪唑(1μM)，而另一些平板中加入載體對照(DMSO)，將這些平板孵育過夜。
在孵育后，將細胞用多聚甲醛固定，并且如上所述加工用于表面表達的HA標記物(除了成比例的增大試劑體積)。用TD20/20光度計(Turner Biosystems)測量化學發光信號。
得到的數據顯示阿司咪唑不能援救雙突變體hERG-G601S/F656C的表達，但是確實可以援救hERG-G601S的表達，表明它是一個有效的hERG阻斷劑。
現在已經完全描述了本發明，對于本領域普通技術人員很容易理解本發明的方法可以用于更寬泛和等同范圍內的病癥、劑型和其它參數而不背離本發明的保護范圍或其任何具體實施方式
。
在本文中所引用的所有專利和出版物以引用的方式將其全部內容合并于本文中。任何出版物的引用是因其披露先于本申請提交日，并不應當認為承認這些出版物是本發明的現有技術或本發明不享有憑借已有發明的公開所具有的更早的申請日。
權利要求
1.一種識別改變哺乳動物細胞中內在膜蛋白的表面表達水平的試劑的方法，所述方法包括a)制備含有表達所述膜蛋白的哺乳動物細胞的第一培養液；b)向含有哺乳動物細胞的所述第一培養液中加入有效量的候選試劑；c)在存在所述候選試劑的情況下將所述細胞孵育足夠的時間；d)向所述含有哺乳動物細胞的第一培養液中加入有效量的至少一種抗體，所述抗體與所述膜蛋白的至少一個細胞外抗原決定部位結合；以及e)在用所述候選試劑孵育后，測定所述至少一種抗體對所述細胞外抗原決定部位的結合水平，其中所述結合水平相對于對照的變化表明所述候選試劑改變了所述膜蛋白的表面表達水平。
2.根據權利要求40的方法，進一步包括如下步驟f)制備含有表達所述膜蛋白的第二突變型的哺乳動物細胞的第二培養液，所述第二突變型與所述第一突變型不同，并且在所述哺乳動物細胞表面的表達水平低于所述膜蛋白的野生型；g)向所述含有哺乳動物細胞的第二培養液中加入有效量的所述候選試劑；h)在存在所述候選試劑的情況下，將所述細胞孵育足夠的時間；i)向所述含有哺乳動物細胞的第二培養液中加入有效量的至少一種抗體，所述抗體結合于所述膜蛋白的第二突變型的至少一個細胞外抗原決定部位；以及j)在用所述候選試劑孵育后，測定所述至少一個抗體與所述膜蛋白的所述第二突變型的細胞外抗原決定部位的結合水平，其中所述結合水平相對于對照的變化表明所述候選試劑改變了所述膜蛋白的第二突變型的表面表達水平。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其中步驟(d)包括加入有效量的至少一種一抗和有效量的至少一種二抗，其中，所述一抗結合于所述膜蛋白的第一突變型的至少一個細胞外抗原決定部位，而所述二抗結合于所述一抗。
4.根據權利要求1或2所述的方法，其中所述結合水平是通過熒光、發光、放射性、吸光度或它們兩種或多種的結合測定的。
5.根據權利要求1或2所述的方法，其中所述內在膜蛋白是一種膜離子通道。
6.根據權利要求5所述的方法，其中所述膜離子通道是鈉通道、鉀通道、鈣通道或氯通道。
7.根據權利要求1或2所述的方法，其中所述至少一個細胞外抗原決定部位包括野生型抗原決定部位。
8.根據權利要求1或2所述的方法，其中所述至少一個細胞外抗原決定部位包括標記物。
9.根據權利要求8所述的方法，其中所述細胞外標記物取代所述內在膜蛋白的至少一部分的細胞外結構域。
10.根據權利要求8所述的方法，其中所述細胞外標記物插入到所述膜蛋白的細胞外結構域中。
11.根據權利要求8所述的方法，其中所述細胞外標記物包括血凝素(HA)標記物。
12.根據權利要求3所述的方法，其中所述一抗和/或所述二抗偶聯到一種酶上。
13.根據權利要求12所述的方法，其中所述酶選自由過氧化物酶、熒光素酶、堿性磷酸酶、葡糖氧化酶、β-半乳糖苷酶以及其兩種或多種混合物構成的組。
14.根據權利要求1或2所述的方法，其中所述第一突變型包括一個與所述膜蛋白的野生型氨基酸序列至少有一個氨基酸殘基不同的氨基酸序列。
15.根據權利要求2所述的方法，其中所述第二突變型包括一個與所述膜蛋白的野生型氨基酸序列至少有一個氨基酸殘基不同的氨基酸序列。
16.根據權利要求1或2所述的方法，其中所述第一突變型是一運輸缺陷型突變體。
17.根據權利要求2所述的方法，其中所述第二突變型是一運輸缺陷型突變體。
18.根據權利要求1或2所述的方法，其中所述膜蛋白是一種鉀離子通道。
19.根據權利要求18所述的方法，其中所述鉀離子通道是hERG。
20.根據權利要求19所述的方法，其中所述hERG的第一突變型是G601S。
21.根據權利要求19所述的方法，其中所述hERG的第一突變型是N470D。
22.根據權利要求19所述的方法，其中所述hERG的第二突變型是G601S/F656C。
23.根據權利要求19所述的方法，其中所述hERG的第二突變型是N470D/F656C。
24.一種用于阻止或治療心律失常的方法，包括向需要的哺乳動物給予有效量的活性試劑，其中所述活性試劑當用如下方法測定時提高哺乳細胞中hERG的第一突變型的表面表達水平，而不提高哺乳動物細胞中hERG的第二突變型的表面表達水平a)制備含有表達hERG的所述第一突變型的哺乳動物細胞的第一培養液，其中所述第一突變型以低于hERG野生型的水平表達于所述哺乳動物細胞的表面；b)向所述第一培養液中加入有效量的所述活性試劑；c)在所述活性試劑存在下，將所述細胞孵育足夠的時間；和d)向所述含有哺乳動物細胞的第一培養液中加入有效量的至少一種抗體，該抗體與hERG的所述突變型的至少一個細胞外抗原決定部位結合，e)測定所述至少一種抗體與所述細胞外抗原決定部位的結合水平，f)制備含有表達hERG的第二突變型的哺乳動物細胞的第二培養液，其中所述第二突變型與所述第一突變型不同，并且在所述哺乳動物細胞表面的表達水平低于hERG的野生型；g)向所述含有哺乳動物細胞的第二培養液中加入有效量的所述活性試劑；h)在存在所述活性試劑的情況下，將所述細胞孵育足夠的時間；i)向含有哺乳動物細胞的所述第二培養液中加入有效量的至少一種抗體，該抗體與hERG的所述第二突變型的至少一個細胞外抗原決定部位結合；以及j)測定所述至少一種抗體對hERG的所述第二突變型的所述細胞外抗原決定部位的結合水平。
25.根據權利要求24所述的方法，其中所述活性試劑是伐諾司林或其藥學可接受的鹽。
26.根據權利要求24所述的方法，其中步驟d)包括加入有效量的至少一種一抗和有效的量至少一種二抗，其中所述一抗與hERG的所述第一突變型的至少一個細胞外抗原決定部位結合，并且所述二抗與所述一抗結合。
27.根據權利要求24所述的方法，其中所述結合水平是通過熒光、發光、放射性、吸光度或它們兩種或多種的結合測定的。
28.根據權利要求24所述的方法，其中所述至少一個細胞外抗原決定部位含有一個標記物。
29.根據權利要求28所述的方法，其中所述細胞外標記物取代了hERG的至少一部分細胞外結構域。
30.根據權利要求28所述的方法，其中所述細胞外標記物插入到hERG的細胞外結構域中。
31.根據權利要求28所述的方法，其中所述細胞外標記物包括血凝素(HA)標記物。
32.根據權利要求26所述的方法，其中所述一抗和/或所述二抗偶聯到一種酶上。
33.根據權利要求32所述的方法，其中所述酶選自由過氧化物酶、熒光素酶、堿性磷酸酶、葡糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、以及其兩種或多種混合物構成的組。
34.根據權利要求24所述的方法，其中所述第一突變型是一運輸缺陷型突變體。
35.根據權利要求24所述的方法，其中hERG的所述第一突變型是G601S。
36.根據權利要求24所述的方法，其中hERG的所述第一突變型是N470D。
37.根據權利要求24所述的方法，其中hERG的所述第二突變型是G601S/F656C。
38.根據權利要求24所述的方法，其中hERG的所述第二突變型是N470D/F656C。
39.根據權利要求24所述的方法，其中步驟i)包括加入有效量的至少一種一抗和有效量的至少一種二抗，其中所述一抗與hERG的所述第二突變型的至少一個細胞外抗原決定部位結合，并且所述二抗與所述一抗結合。
40.根據權利要求1所述的方法，其中所述膜蛋白是一突變型，該突變型在所述細胞表面的表達水平低于所述蛋白的野生型。
全文摘要
本發明披露了用于識別改變哺乳動物細胞中如心臟離子通道這樣的內在膜蛋白的表面表達水平的試劑的高通量測定系統和方法。本發明還披露了使用由該方法識別的試劑的治療方法。
文檔編號G01N33/53GK1878553SQ200480026304
公開日2006年12月13日 申請日期2004年7月15日 優先權日2003年7月15日
發明者阿瑟·M·布朗, 埃克哈德·菲克爾, 芭芭拉·A·威布爾 申請人:錢克斯普瑞斯公司