控制流式細胞計型測量系統的一個或多個參數的方法

專利名稱：控制流式細胞計型測量系統的一個或多個參數的方法
技術領域：
本發明大致涉及用于控制流式細胞計型測量系統的一個或多個參數的方法。某些實施例涉及包括基于參數監視而實時地改變流式細胞計型測量系統的一個或多個參數的方法。
背景技術：
以下的說明和范例并不因其包含于該部分之內而被認為是現有技術。通常，流式細胞計在激光激發的聚苯乙烯小珠或者細胞線性地通過流動室的時候提供對其熒光強度的測量。不過，流式細胞計同樣可以被用于提供對其它粒子的一個或多個特性的測量。某些系統被配置為用于測量由粒子所散射的與激發源成
90°或者180°的光的級別，兩個或更多個熒光測量被用于確定分類，也就是粒子的"身份"，被稱為"指示器"(reporter)的另外的熒光測量往往被用于量化所關注的化學反應。各熒光測量是在不同的波長下作出的。
由于流式細胞計型測量儀器的測量能力已有所改進，流式細胞計可以提供有用的測量的應用領域大大地增加了。例如，對于諸如生物化驗(例如，置換或競爭化驗、非競爭化驗、酶化驗)、核酸分析、以及組合化學等應用，流式細胞計已經變得越來越有助于提供數據。特別是，由于進行化驗的速度(特別是與其他化驗方法(例如常規的酶聯免疫吸附分析"ELISA"形式)相比較)的原因，流式細胞計越來越普及。
在通常環境下，為了確保精確可靠的化驗結果，作為準備儀器以用于適當的用途和測量的一個或多個初始步驟，進行流式細胞計的校準。此外，除非每個流式細胞計的熒光通道都被校準為進行相同的讀取，否則對于樣本間的變化源，就沒有保證。如果沒有采用完整而穩固的校準方法的話，很有可能同一個儀器在不同的幾天里對同一個樣本給出不同的讀取結果。類似地，如果任意兩個儀器即使在被正確地設置的前提下仍然不能保證給出相同的結果，盡管流式細胞計可能對樣本中的細胞進行識別和區分的測量效果要好一些，但其作為醫療儀器的用途可能是不大的。因此，已經開發了許多不同的用于校準流式細胞計的方法。起先，進行了有效的研究，開發出降低在校準時操作者的涉及程度的方法，從而提高了校準的精度。這一成果很大程度上使得流式細胞計的校準中的很多步驟實現了自動化。此外，進行了有效的研究以在其它方面提高校準的精度。例如，該成果已導致校準中的進步，諸如使用具有統一而恒定的特性的校準標準。特別是，由于生物樣本的特性會隨時間而變化，用于流式細胞計的生物校準標準基本上被具有更加穩定的特性的綜合校準標準(例如，聚合微球體或粒子)所取代。此外，通常情況下，校準微球體具有與測試微球體的特性基本相似(即，盡可能地相近)的特性(例如，尺度、體積、表面特性、粒度特性、折射率、熒光性等)。人們確信，通過將對與在測試中預期的值盡可能接近的值進行校準，此類校準微球體提高了流式細胞計的精度。
改進流式細胞計的校準的努力同時也導致了與校準有關的流式細胞計的參數的數量的增加。例如，流式細胞計測量系統的激光激發、探測器、以及電子會隨時間變化，從而影響最終測量結果。因此，流式細胞計的這些參數，以及在某些場合下的其它參數，往往與校準方法有關。
其它的一些更加難以控制的參數同樣影響流式細胞計的測量。樣本速度就是
一個這樣的參數。Ortyn等人的編號為6,532,061美國專利就描述了一個用于測量樣本速度的方法的例子，該專利通過被引用而結合于此，如同在這里完整提出那樣。在該方法中，對象夾帶在流過感應或者測量空間的液體流中。在這些實施例的每一個中，具有大致統一的節距的光柵被用于調制從移動的對象接收到的光。該調制光被轉換為電信號，電信號被數字化，然后進行快速傅利葉變換(FFT)以確定對象的速度。然而，Ortyn等人的用于測量樣本速度的方法和系統有一些缺陷。例如，這些方法需要相當復雜的光柵和軟件。此外，由于光柵所要求的精密度以及其制造的復雜性，光柵可能相當昂貴。而且，由于諸如移動的對象造成所檢測的光的光學畸變，可能會導致樣本速度測量不那么精確。
然而，流式細胞計測量的最大誤差通常是由溫度變化造成的。此外，已經發現，現有的可行的校準方法不能夠充分地說明溫度變化對流式細胞計進行的測量的影響。例如，Ortyn等人所描述的方法和系統盡管其試圖校準一些參數，但并未考慮溫度變化，以及這些變化將如何影響流式細胞計的測量。因此，盡管巳經有很多不同的可行的校準方法，但還是可以通過更加精確地考慮在不同的流式細胞計測量中或是在單個的流式細胞計測量中的溫度變化來對這些方法作出進一步的改進。
因此，發展用于對流式細胞計測量系統的至少主要的誤差因素進行控制的方法應該是有益的，這些方法可以被整合從而產生實時的校準方案。

發明內容
如前所細述的那樣，通常最流式細胞計的最顯著的誤差因素是溫度變化。由于溫度可以是一個可測量的量，而且其效應背后的物理機理是已知的，因此有可能降低甚至是完全消除這些誤差源中最關鍵的 一環。
已經識別了一些測量誤差的原因和對于這些測量誤差原因的實時校正技術。此外，已經創建了一種使用校準微球體進行實時微調節的方法，其中校準微球體因直徑與可能包含于微球體樣本混合物中的待測物略有不同而可被識別。微調節過程的額外特征包括系統健康狀態的實時識別、 一個或多個通道中的非線性性的校正、和/或流式細胞計測量系統的有用的指示器動態范圍的顯著擴展。所描述的實施例可用于補償主要由溫度導致的系統變化，從而擴展了操作的校準范圍。
此外，需要指出的是，此處描述了用于控制流式細胞計測量系統的一個或多個參數的方法的若干不同的實施例。要理解，每個方法都可單獨被使用和執行。另外，兩個或更多的方法可以被結合使用，這取決于例如測量系統的各種組件的可變性和/或測量系統的期望精度。
本發明的一個實施例涉及一種控制流式細胞計型測量系統的一個或多個參數的方法。該方法包括在測量系統進行樣本微球體的測量時，監測流式細胞計型測量系統的一個或多個參數。該方法還包括基于監測實時地改變所述一個或多個參數。
在一個實施例中，監測一個或多個參數可包括使用校準微球體的測量來監測一個或多個參數。校準微球體的直徑與樣本微球體的直徑不同(例如，稍小)。在某些實施例中，該一個或多個參數可包括由測量系統的探測器所產生的輸出信號。輸出信號響應于由樣本微球體所散射的光。
在另一個實施例中，監測一個或多個參數可包括使用校準微球體的測量來監測一個或多個參數。校準微球體的直徑與樣本微球體的直徑不同(例如，稍小)，
并且至少部分校準微球體具有不同的光譜地址(spectral address)。在一個此類實施例中，所述一個或多個參數包括測量系統的動態范圍。在另一個實施例中，對參數的改變可包括擴展測量系統的一個或多個通道的動態范圍。在又一個實施例中，所述一個或多個參數可包括對系統健康狀態的測量。系統健康狀態的測量可包括分類通道的健康狀態、指示器通道的健康狀態、或者其結合。在某些實施例中，所述一個或多個參數可包括樣本微球體的測量中的線性性。在這樣一個實施例中，測量可包括對分類通道的測量、對指示器通道的測量、或其組合。在另一個此類實施例中，對參數的改變包括在測量中大致地對任何非線性性進行校正。
在某些實施例中，參數可包括測量系統的雪崩光電二極管的參數。在一個此類實施例中，其方法還可包括使用經驗獲得數據來確定在改變參數時所要使用的校正因子。在另一個實施例中，參數可包括測量系統的光電倍增管的參數。
在還有一個實施例中，參數可包括樣本微球體的速度。在一個此類實施例中，對參數的監測可包括監測樣本微球體被置于其中的液體的溫度，并根據該溫度來確定樣本微球體的速度。在某些實施例中，該方法還可包括在對樣本微球體進行測量之前對一個或多個參數進行校準。前述方法的每一個實施例都可包括此處所述的任何其它步驟。
另一個實施例涉及控制流式細胞計型測量系統的一個或多個參數的一種不同的方法。該方法包括監測最接近于流式細胞計型測量系統的溫度。該方法還包括使用經驗數據來響應于溫度而改變測量系統的雪崩光電二極管的偏置電壓，從而大致上校正由于溫度所致的雪崩光電二極管的增益的變化。
在一個實施例中，其方法還包括通過在一個或多個溫度下將一基本恒定的光級別施加到雪崩光電二極管上，并且記錄在所述一個或多個溫度下對于多個偏置電壓的雪崩光電二極管的電流輸出，從而產生經驗數據。在另一個實施例中，對參數的改變是在測量系統進行樣本測量之前進行的。在一個此類實施例中，偏置電壓在樣本測量過程中可基本保持恒定。在一個不同的實施例中，對參數的監測和改變是實時進行的。
在某些實施例中，其方法還可包括在發射出已知強度的光的校準微球體被測量系統測量的同時，改變雪崩光電二極管的偏置電壓，直至從雪崩光電二極管獲得一個預定的信號級別為止。在一個此類實施例中，其方法還可包括確定雪崩光電二極管在反向偏置電壓下相應的相對電流、在預定信號級別下的偏置電壓、以及溫度。該方法的實施例還可包括使用相應的相對電流、溫度、反向偏置電壓、以及經驗數據來確定偏置電壓。前述的方法的每個實施例均可包括此處所述的任何其它步驟。
另一個實施例涉及控制流式細胞計型測量系統的一個或多個參數的又一個方法。該方法包括監測最接近于流式細胞計型測量系統的溫度。該方法還包括使用光電倍增管的特征曲線響應于溫度而改變測量系統的光電倍增管的輸出信號，從而基本上校正光電倍增管輸出信號的增益變化。光電倍增管的增益響應于溫度作近似線性變化。在某些實施例中，所述光電倍增管是測量系統的指示器通道的一部分。在另一實施例中，光電倍增管的特征曲線隨探測波長以及光電倍增管的陰極結構而變 化。此處前述方法的每個實施例可包括此處所述的任何其它步驟。
另一個實施例涉及控制流式細胞計型測量系統的一個或多個參數的一種方法 的另一實施例。該方法包括將測量系統的光電倍增管電壓設置為第一值和第二值。 該方法還包括在第一值和第二值測量光電倍增管的輸出電流。此外，該方法包括根 據第一值和第二值的對數與第一值和第二值下輸出電流的對數的相對關系來確定 光電倍增管的校準電壓。該方法還包括將該校準電壓施加到光電倍增管上。該方法 還包括測試該光電倍增管從而確定該光電倍增管的一個或多個參數是否在預定的 容差內。前述方法的每個實施例均可包括此處所述的任何其它步驟。
還有一個實施例涉及控制流式細胞計型測量系統的一個或多個參數的另一種 方法。該方法包括使用逐次逼近來確定測量系統的探測器的校準電壓。該方法還包 括將該校準電壓施加到探測器上。在一個實施例中，探測器可包括雪崩光電二極管。 在一個不同的實施例中，探測器可包括光電倍增管。 '
在一個實施例中，其方法包括將校準電壓與探測器的擊穿電壓相比較，如果 校準電壓超過了擊穿電壓則重復對校準電壓的確定過程。該方法的一個不同的實施 例包括收集和處理探測器樣本以確定探測器信號級別。在一個此類實施例中，其方 法可包括將探測器信號級別與校準目標信號級別相比較，如果探測器信號級別高于 校準目標信號級別，則減低探測器的偏置電壓，并且重復對校準電壓的確定過程。 在另一個此類實施例中，其方法可包括將探測器信號級別與校準目標信號級別進行 比較，如果探測器信號級別不在校準目標信號級別的預定范圍之內，則重復對校準 電壓的確定直至所有的期望的探測器電壓級別都被嘗試過為止。前述方法的每個實 施例均可包括此處所述的任何其它步驟。
再一個實施例涉及控制流式細胞計型測量系統的一個或多個參數的一種不同 的方法。該方法包括對將會流經流式細胞計型測量系統的液體的溫度進行監測。樣 本微球體被置于該液體中。該方法還包括根據液體在該溫度下的粘度來確定測量系 統中的樣本微球體的速度。
在一個實施例中，其方法還包括基于速度來確定樣本微球體之一將存在于測 量系統的探測窗口中的時間長度。在某些實施例中，其方法可包括基于速度來確定 樣本微球體之一從測量系統的一個探測窗口移動到另一個探測窗口的時間長度。在 另-個實施例中，其方法可包括基于速度來確定樣本微球體之一何時會出現在測量 系統的探測窗口中。在又一個實施例中，其方法包括控制測量系統的一個或多個探測窗口的采樣間隔從而對速度進行補償。
在還有一個實施例中，監測參數和確定速度是在測量系統對樣本微球體進行 測量之前進行的。在某些實施例中，其方法可包括根據速度來確定測量系統的輸出 信號的一個或多個特性。在一個此類實施例中，其方法包括利用校正因子來校正由 于速度所致的輸出信號的誤差。所述的校正因子是采用經驗測量值來確定的。在另 一個實施例中，測量系統被配置為在樣本微球體的測量過程中維持液體的壓力基本 恒定。
在一個實施例中，確定速度包括從表、泊肅葉(Poiseuille)等式、或者從對 應于溫度的速度的預定值來確定速度。在詞類的一些實施例中，該方法還可包括根 據速度在樣本微球體的測量過程中控制液體的壓力。前述方法的每個實施例均可包 括此處所述的任何其它步驟。
一種不同的實施例涉及控制流式細胞計型測量系統的一個或多個參數的另一 種方法。該方法包括測量微球體從流式細胞計型測量系統的第一探測窗口移動到測 量系統的第二探測窗口的時間。該方法還包括改變測量系統的施加壓力從而使得時 間大致恒定。在一個實施例中，該時間是平均時間。微球體可以是樣本微球體或者 校準微球體。測量時間可包括在第一和第二探測窗口中測量被微球體所散射的光。 在另一個實施例中，測量時間可包括用一個探測器測量在第一和第二探測窗口被微 球體所散射的光。在第一和第二探測窗口中被微球體所散射的光可被一個分光器導 向所述的一個探測器。該方法可以實時操作，也可以非實時地操作。前述方法的每 個實施例均可包括此處所述的任何其它步驟。
還有一個實施例涉及控制流式細胞計型測量系統的一個或多個參數的一種不 同的方法。該方法包括測量微球體從流式細胞計型測量系統的第一探測窗口移動到 測量系統的第二探測窗口的平均時間。微球體可包括樣本微球體、校準微球體、或 者二者兼而有之。該方法還包括將平均時間和參考微球體從第一探測窗口移動到第 二探測窗口所用的參考時間進行比較。此外，該方法包括，如果平均時間和參考時 間之間的差大于預定值，則改變測量系統的施加壓力。
在一個實施例中，改變施加壓力包括如果平均時間大于參考時間則增加施 加壓力。或者，如果平均時間小于參考時間則減小施加壓力。在某些實施例中，預 定值被選擇為對測量系統的已知的時間變化機制進行補償。該方法可以實時地操 作，也可以非實時地操作。前述方法的每個實施例均可包括此處所述的任何其它步 驟。


通過閱讀以下的詳細描述并參考附圖，可以明顯地獲知本發明的其它目的和 優點，其中
圖l是一示意圖，舉例描述可用于執行此處所述的方法的測量系統。
圖2是舉例描述示出作為溫度的函數的具有130伏的反向偏置電壓(V60)的
APD的響應的多條偏置曲線的示圖。
圖3是描述作為溫度的函數的各種PMT的響應的示圖。
圖4是舉例描述作為PMT偏置電壓的對數的函數的PMT增益的對數。
圖5是一流程圖，描述用于控制流式細胞計型測量系統的一個或多個參數的
方法的一個實施例。
圖6是一示意圖，描述可被用于執行此處所述的至少一個方法的測量系統的 一部分的一個實施例的截面圖。
圖7描述可在此處所述的方法中的一個實施例中測量的脈沖群(即，在不同 時間所測得的散射光)。
雖然本發明可采用各種修改和變化形式，其具體的實施例在圖中以示例形式 給出并且將詳細進行描述。但應該理解的是，此處的附圖和對其的詳細描述并不是 為了將本發明局限于此處所揭示的細節，相反，其應該覆蓋所有落入如所附的權利 要求中所定義的本發明的精神和范圍內的修改、等效方法和變化。
具體實施例方式
此處將描述用于控制流式細胞計型測量系統的一個或多個參數的方法的若干 不同的實施例。如上所提及的，可以單獨使用和進行每個方法。此外，可以組合地 使用或進行兩個或更多的方法，這取決于例如，測量系統中的各種組件的可變性和 /或測量系統的期望精度。
盡管此處對實施例的描述涉及的是微球體或者聚苯乙烯小珠，但應該理解的 是，所述測量系統和方法也可以用于微粒子、金納米粒子、小珠(bead)、微珠 (microbead)、膠乳粒子、膠乳小珠、熒光小珠、熒光粒子、有色粒子、有色小 珠、以及細胞(cell)。微球體可以作為分子反應的載體。合適的微球體、小珠、 以及粒子的例子被描述于Fulton的美國專利號5,736,330、 Chandler等人的美國專 利號5,981,180、 Fulton的美國專利號6,057,107、 Chandler等人的美國專利號6,268,222、 Chandler等人的美國專利號6,449,562、 Chandler等人的美國專利號 6,514,295、 Chandler等人的美國專利號6,524,793、 Chandler等人的美國專利號 6,528,165，這些專利都通過被引用而完全結合于此。此處所述的測量系統和方法可 以用于這些專利中所述的任何微球體、小珠、以及粒子。此外，用于流式細胞計的 微球體可以從諸如得克薩斯州奧斯丁市的盧米尼克斯股份有限公司(Luminex Corp.)等的制造商處獲得。術語"小珠(bead)"和"微球體(microsphere)" 在此是可互換使用的。
圖1舉例描述可用于實現此處所述的方法的測量系統的一個示例。特別是， 可以根據此處所述的方法來確定、監測、改變、和/或控制描述于圖1中的測量系 統的一個或多個參數。需要指出的是，此處所描述的圖并不是按實際的尺度比例繪 制的。特別地，圖中某些元件的尺度被夸大以用于強調這些元件的特征。出于闡述 清楚的考慮，測量系統的某些元件沒有被包括在圖中。
在圖1中，沿著過微球體所流經的試管12的橫截面的平面示出了測量系統。 在一個例子中，試管可以是標準石英試管，比如用于標準流式細胞計中的那種。不 過，任何其它適當類型的觀察或輸送室都可以被用于輸送要分析的樣本。測量系統 包括光源14。光源14可包括本領域已知的任何適當光源，比如激光器。光源可被 配置為發射具有一個或多個波長的光，比如藍光或綠光。光源14可被配置為在微 球體流經試管的時候對其進行照射。照射會導致微球體發出具有一個或多個波長或 波段的熒光。在某些實施例中，系統可包括一個或多個透鏡(未示出)，其被配置 為將來自光源的光聚焦到微球體上或聚焦到流動路徑上。系統也可包括不只一個光 源。在一個實施例中，這些光源可被配置為以具有不同波長或波段的光(例如，藍 光和綠光)來照射微球體。在某些實施例中，這些光源可被配置為以不同的方向照 射微球體。
從微球體前向散射的光可通過折疊式反射鏡18或者另一種適當的光導組件引 導到探測系統16。或者，探測系統16可以直接放置在前向散射的光的路徑上。如 此，折疊式反射鏡或者其它的光導組件可以不包含在系統中。在一個實施例中，前 向散射的光可以是由微球體以和光源14的照射方向成大約180°的角度所散射的 光，如圖1中所示。前向散射的光可以不與照射方向正好成180°角，從而來自光 源的入射光不會撞上探測系統的感光表面。例如，前向散射的光可以是被微球體以 與照射方向成小于或大于180°的角度所散射的光(例如，以大約170°、 175°、 185°、 或者190°所散射的光)。被微球體散射的、與照射方向成大約90°角度的光也可以被收集(collected)。 在一個實施例中，該散射光可以被一個或多個分光器或者分色鏡分為一個以上的光 束。例如，與照射方向成大約90。角度而散射的光可以被分光器20分為兩束不同 的光。這兩個不同的光束可以由分光器22和24進一步分成四束不同的光。每束光 可以被導入不同的探測系統，這些探測系統中可包括一個或多個探測器。例如，四 個光束中的一個可以被導入探測系統26。探測系統26可以被配置為探測由微球體 所散射的光。
由探測系統16和/或探測系統26所探測到的散射光通常與光源所照射的粒子 的體積成比例。因此，探測系統16的輸出信號和/或探測系統26的輸出信號可被 用于確定位于照射區域或者探測窗口中的粒子的直徑。此外，探測系統16和/或探 測系統26的輸出信號可被用于對粘在一起或者幾乎同時通過照射區域的一個以上 的粒子進行識別。因此，這些粒子可以與其它樣本微球體以及校準微球體相區別。 而且，探測系統16和/或探測系統26的輸出信號可如此處所述地被用于基于尺寸 的大小來區別樣本微球體和校準微球體。
其它3個光束可被導入探測系統28、 30和32。探測系統28、 30以及32可被 配置為探測由微球體所發出的熒光。每個探測系統可被配置為探測不同波長或者不 同波長范圍的熒光。例如，其中一個探測系統可被配置為探測綠色熒光。另一個探 測系統可被配置為探測黃-橙色的熒光，而其它探測系統則被配置為探測紅色熒光。
在某些實施例中，濾光器34、 36、以及38可以分別被耦合到探測系統28、 30以及32上。濾光器可被配置為阻隔除了探測系統配置為要探測的波長以外的其 它波長的熒光。此外， 一個或多個透鏡(未示出)可以被光學地耦合到各個探測系 統上。這些透鏡可以被配置為將散射光或者發出的熒光會聚到探測器的感光表面 上。
探測器的輸出電流與碰撞到其上的熒光成比例，并且產生電流脈沖。電流脈 沖可以被轉換為電壓脈沖，經過低通濾波，然后由A/D轉換器數字化。處理器40， 比如DSP，對脈沖下的區域進行積分以提供表示熒光的大小的數。此外，處理器 可以執行此處所述的另外的功能(例如，對流式細胞計型測量系統的一個或多個參 數進行監測，基于所監測的參數來實時地改變一個或多個參數，等等)。如圖1 中所示，處理器40可以通過傳輸媒介42被耦合到探測器26。處理器40還可通過 傳輸媒介42和一個或多個其它組件(如A/D轉換器)而間接地耦合于探測器26。 處理器可以類似的方式耦合到系統的其它探測器上。在某些實施例中，由微球體所發出的熒光所產生的輸出信號可以被用于確定
微球體的身份(identity)以及有關發生在微球體表面的反應的信息。例如，探測 系統的其中兩個探測系統的輸出信號可被用于確定微球體的身份，而另一探測系統 的輸出信號可被用于確定發生在微球體表面上的反應。因此，對于探測器以及濾光 器的選擇是可以變化的，這取決于結合或綁定于被測量的微球體和/或反應的染料 的類型(即，結合或綁定于反應中所涉及的反應物的染料)。
用于確定樣本微球體的身份的探測系統(例如，探測系統28和30)可以是 APD、 PMT、或者其它光探測器。如這里所述，可以對APD實時地校正如這里所 述的作為溫度的函數的增益變化。用于識別發生于微球體的表面的反應的探測系統 (例如，探測系統32)可以是PMT、 APD、或者其它形式的光探測器。通過采用 由PMT特征曲線所得出的一個簡單乘數，PMT可以被校正，其中所述PMT特征 曲線可以如此處所述地被施加到PMT的輸出信號上。探測器和測量系統還可以如 此處所述地進行配置。
盡管圖1所示系統包括具有兩個不同探測窗口的兩個探測系統，用于區分具 有不同染色特性的微球體，但應該理解的是，該系統可以包括超過兩個這樣的探測 窗口 (例如，3個探測窗口、 4個探測窗口，等等)。在這樣的實施例中，系統可 包括額外的分光器和額外的具有其它探測窗口的探測系統。此外，濾光器和/或透 鏡可被連接到各個所述的額外的探測系統上。
在另一個實施例中，系統可包括兩個或更多個被配置為區分在微球體的表面 上反應的不同材料的探測系統。不同的反應物材料可具有不同于微球體的染色特性 的染色特性。
其它可用于執行此處所述的方法的測量系統的例子被闡述于Chandler等人的 美國專利號5,981,180， Chandler等人的美國專利號6,046,807， Chandler等人的美 國專利號6,139,800， Chandler等人的美國專利號6,366,354， Chandler等人的美國 專利號6,411,904， Chandler等人的美國專利號6,449,562， Chandler等人的美國專 利號6,524,793中，所有這些專利都通過被引用而完全結合于此。此處所描述的測 量系統也可以按照這些專利中所述的方式來配置。
在流式細胞計型測量系統中，散射光和小珠身份探測通常是采用雪崩光電二 極管(APD)作為光學傳感器來進行的。APD相比于其它探測器的優勢在于，通 過施加反向偏置電壓，APD的輸出電流級別或者"增益"可以在較寬的范圍內變 化。所述的增益與施加的偏置電壓的大小成比例，其中該增益可以按照由恒定數量的入射光子所引起其流動的電子來表示。不幸的是，從入射光子到輸出電子間的轉 換對溫度的依賴性很強。因此，APD相當依賴于溫度，其程度比流式細胞計型測 量系統中的任何其它元件都要高。
因此， 一種控制流式細胞計型測量系統的一個或多個參數的方法的一個實施 例包括對最接近于流式細胞計型測量系統的溫度進行監測。該方法還包括響應該溫
度而改變測量系統的APD的偏置電壓。
每一個APD都由制造商額定了一個反向偏置電壓(V60)，在該電壓下可以 獲得的輸出電流比在大致相同照射下的硅二極管要大60倍。取決于個體器件，V60 的取值在幾十伏到100伏以上。
由于APD的輸出相對于溫度而言是非線性的，因此不能在APD的整個操作 范圍內使用恒定的補償因子。電流輸出一溫度的經驗測量可以被用于研究一種全面 的補償方法。換句話說，可以采用經驗數據來確定被用于改變APD的參數的校正 因子。特別是，可以采用經驗數據來改變APD的偏置電壓，從而大致上校正由于 溫度所導致的雪崩光電二極管的增益變化。
為了用經驗數據來表征APD的響應，在一個或多個溫度下，將一個大致恒定 的光級別施加到APD上。在一個或多個給定的溫度下，記錄在多個偏置電壓下APD 的電流輸出。改變溫度(例如，增加整數的度數)，然后再次重復在多個偏置電壓 下的測量。所得到的數據集合(例如，如圖2中所示)充分地描述了特定的V60 器件的照明一電流隨溫度變化的曲線。為了獲取多個不同器件的響應，可以對具有 不同V60額定值的APD重復這些測量。
在一個實施例中，偏置曲線表可被用于依下述方法校正溫度。在初始系統校 準時，發射出已知強度的光的校準微球體被引入系統。該校準微球體流經系統，當 校準微球體被測量系統測量時，偏置電壓被改變直至從APD獲得預定的信號級別。 然后，使用探測器的V60、在所述預定信號級別下的偏置電壓、以及溫度作為對 APD響應表中索引，將APD的當前讀數插入表中(R值)。
在另一個實施例中，偏置曲線表可以依以下方式產生。可使用如發光二極管 (LED)之類的恒定光輸出源經由光纜遠程地對APD的感光區域進行照射。APD 然后可以被放置在可以改變APD暴露于其中的環境溫度的環境艙中。然后，當溫 度和施加給APD的偏置電壓都變化時，測量系統將APD的電流輸出(R值)記錄 下來。
在正常的樣本運行期間，可監測最接近于流式細胞計型測量系統的溫度。然后可使用期望的相對電流、溫度、以及經驗數據來確定偏置電壓。例如，R值、測
得的溫度、以及V60參數可以被用作APD響應表的輸入以找出相應的偏置電壓。
如果測得的溫度處于表格的條目之間，則將對應于最接近的溫度條目的讀數進行內
插以獲得最佳偏置電壓。從表格中所獲得的偏置電壓被施加到APD上以校正其增
益隨溫度的變化。由于樣本運行的時間通常在兩分鐘內，而溫度在這段時間內變化 不大，所以通常情況下在樣本運行的開始階段進行單次偏置校正并且在運行的過程 中維持該偏置就足夠了。換句話說，可以在測量系統進行樣本測量之前改變偏置電 壓，而在樣本測量的過程中偏置電壓可以基本恒定。然而，有可能最接近于測量系
統的溫度在樣本運行的時候隨時間被監測，而APD的偏置電壓可相應地被改變。 在這種方式下，對溫度的監測以及對APD的偏置電壓的改變是實時進行的。
某些流式細胞計型測量系統的指示器通道包括用作感光探測器的光電倍增管
(PMT)。該指示器通道通常可被定義為用于識別在微球體表面發生的反應中涉 及的材料或結合于微球體表面的材料的通道。PMT產生與照射光電陰極的光的量、 施加的偏置電壓以及PMT內的內部倍增電極(internal dynode)的數量成比例的電 流。在一個流式細胞計中，PMT的偏置電壓通常被用作對給定級別的熒光的電流 輸出進行歸一化的"控制"點。目前所采用的用于在校準過程中獲得歸一化電壓的 方法是經驗性的，進行測量，然后對有可能產生更接近于期望值的輸出的PMT偏 置設置進行有根據的推測。通常，在輸出誤差級別達到一個可接受的范圍之前需要 多次迭代。所以，縮短校準時間，從而降低用于尋找最佳PMT電壓的校準試劑
(reagent)的量是很有利的。下文中將描述若干不同的可以使得校準過程比現有情 況更快的方法。
由于對于溫度的大致線性的響應，相比APD， PMT補償溫度變化要簡單得多。 例如，一種用于控制流式細胞計型測量系統的一個或多個參數的方法的一個實施例 包括對最接近于流式細胞計型測量系統的溫度進行監測。該溫度通常在盡量接近 PMT的位置測量，盡管由于PMT的溫度變化率相對輕微，精確的位置并不是很關 鍵。該方法還包括采用PMT的特征曲線來響應于溫度而改變測量系統的PMT的 輸出信號，從而大致上校正PMT的輸出信號增益由于溫度所致的改變。PMT的增 益接近線性地響應于溫度而改變。此外，PMT的特征曲線會隨著探測波長和陰極 結構而變化。在這種方式下，在給定的探測波長和陰極結構下，PMT對于溫度的 響應可以通過一個簡單的線性關系來表示，如圖3中所示，該圖來自Hamamatsu Photonics K.K 1994年的《光電倍增管-理論到應用》(Photomultiplier tube — Principalto Application)，在此將其完全地結合于此作為參考。
如前所述，由于PMT的增益隨溫度的變化要比APD的小得多，通常沒有必 要通過改變增益或者確定偏置電壓來對器件進行補償。相反，采用從諸如圖3中所 示的曲線那樣的PMT特征曲線導出的簡單乘數就足夠了，其中所述曲線可以通過 報告軟件應用到最終的PMT讀數上。
為了對PMT進行校準，具有已知熒光量的校準微球體被提供給儀器，并且從 系統中流過，就像取得正常的樣本那樣。當測量系統對校準微球體進行測量時，改 變偏置電壓，直至獲得預定的信號級別。
該方法是一種迭代過程，其中， 一組微球體讀數的統計值被計算出來，并且 在獲得期望的容差時終止該過程。如果誤差不夠小，那么前兩次迭代的結果可被用 于對下一個PMT偏置設定進行預測。在此過程中采用了一個線性等式y = m*x +b，其中斜率m由在前的偏置和產生的熒光測量值來定義。如果PMT的偏置電 壓對電流增益的傳遞函數是線性的，可以直接獲得最終結果，并由另一個測量來測 試。然而，由于PMT的電壓一電流增益傳遞函數隨偏置電壓增加而呈指數增長， 線性方法僅僅在曲線的相對較小的一段內有效，因此需要若千次迭代以滿足最終的 容差要求。
有趣的是，當把PMT的電壓一增益關系繪制在log—log圖表上(參見圖4) 時，其傳遞函數呈現為一條直線。圖4中的數據來自Hamamatsu Photonics K.K 1994
年的《光電倍增管-理論到應用》。
如早先所述的，內部倍增電極的數量和施加的偏置電壓決定PMT的電流放大。 對于固定的光級別，如等式l中所示，輸出電流與V的N次冪成比例，其中V是 施加的偏置電壓，N是內部倍增電極的數量，而A是包含了PMT的若干物理性質
的比例常數。
i=A*VN (1) 對等式l的兩邊取對數，得到以下等式
log (i) =N*log(V)+log(A) (2)
該式可以被寫成簡單和常見的一階線性等式
y=m*x+b (3) 其中y=log(i)， m=N， x=log(V)， b=log(A)。使用對數轉換后，現在就有可能僅采 用三個樣本測量來執行縮短的校準操作。
例如，在一個實施例中， 一種用于控制流式細胞計型測量系統的一個或多個參數的方法包括將測量系統的PMT的電壓設置為第一值和第二值。該方法還包括
測量在第一值和第二值的PMT的輸出電流。此外，該方法包括從第一值和第二值 的對數對第一值和第二值下的輸出電流的對數來確定PMT的校準電壓。該方法還 包括將校準電壓施加到PMT上，并且對PMT進行測試以確定該PMT的一個或多 個參數是否在預定的容差之內。
以下由步驟l一7概括出這種方法的一個具體的例子
1. 將PMT電壓設置為最接近于或位于其范圍的低端的值(V=Vl), 并且獲得一個測量值(i = L)。
2. 將PMT電壓設置為最接近于或位于其范圍的高端的值(V二Vh)， 并且獲得一個測量值(i = iH)。
3. 對所有四個值取對數。
4. 計算斜率m和截距b。
5. 求解目標PMT設置(在對數空間內)xcal。
6. 取xeal的反對數以獲得PMT校準電壓Veal。
7. 施加Vw，并測試來確定是否滿足期望的容差。 該方法已經過檢驗，每次均可成功地收斂在容差之內。如果沒有滿足容差，
可以通過采用先前計算所得的V^， ^和Vh， iH在對數空間生成新的斜率和截距， 這樣可能獲得可接受的結果。點V^， i^可能相對接近最終的PMT電壓，只需要 煙新的線進行較短的遍歷(traversal)即可產生可接受的結果。在這種情況下，四 個樣本測量將被用于尋找適當的校準電壓。
另一種用于校準流式細胞計型測量系統的探測器的方法使用逐次逼近法有利 地減少了校準迭代的次數。在一個實施例中， 一種用于控制流式細胞計型測量系統 的一個或多個參數的方法包括使用逐次逼近法來確定測量系統的探測器的校準電 壓，如圖5中步驟50所示。當所有的校準電壓都已被施加到探測器上卻仍未獲得 成功的校準時，該方法將以失敗退出校準，如步驟52中所示。由于探測器可以是 APD、 PMT、或者任何其它適用于該測量系統的探測器，每個探測器電壓可與探 測器電壓限值進行比較，如步驟54中所示。如果校準電壓超過了該電壓限值，可 以通過至少重復步驟50來確定一個不同的校準電壓。
如歩驟56、 58以及60中所示的，該方法將校準電壓施加給探測器，從探測 器收集數據，并可包括構件收集到的數據的直方圖，計算直方圖的峰值，并且將直 方圖峰值和校準目標峰值進行比較。如果直方圖峰值足夠接近于校準目標峰值，校準就可終止，如步驟62中所示。
該方法還可包括確定直方圖峰值是否在校準目標峰值之上，如步驟64中所 示。步驟64的輸出可被用于修正由步驟50中的逐次逼近法所產生的下一個校準電壓。
盡管該方法在上文中相對于直方圖進行了描述，但應該理解的是，可以采用 任何合適的統計測量來進行該方法。例如，確定探測器信號級別的任何適當方法都 可以被采用，這些方法可(但不需要)包括從小珠樣本的集合來確定測量的統計方 法，比如平均數，中值等。
特別是，逐次逼近法通過設置和清除命令字中的位，只嘗試多達N次來使得 測得的值等于目標值。在一個實施例中，該方法可包括收集和處理探測器樣本來確 定探測器信號級別。在另一個此類實施例中，該方法可包括將探測器信號級別和校 準目標信號級別進行比較，如果探測器信號級別高于校準目標信號級別，則降低探 測器偏置電壓并重復對校準電壓的確定。在又一個此類的實施例中，該方法可包括 將探測器信號級別和校準目標信號級別進行比較，如果探測器信號級別不在校準目 標信號級別的預定范圍以內，則重復對校準電壓的確定，直至所有所期望的探測器 電壓級別都巳被嘗試過為止。
這樣一種方法的一個具體的例子包括以下步驟
1. 將位掩碼(bit mask)和DacCmd值初始化為2N。對于12位Dac ("數 字一模擬轉換器")，N二12。在此例中，位掩碼=4096， DacCmd 值=4096。該Dac可包括任何適當的Dac，例如可從馬薩諸塞州的 諾伍德市的模擬設備有限公司(Analog Devices, Inc.)購得的Dac。
2. 使用當前的掩碼位來清除DacCmd中相應的位。我們驅動要么超出 目標，要么超出探測器最大電壓限值。
3. 將掩碼向右移一位(例如，移動到下一個最高有效位)。
4. 如果掩碼是0，則所有可能的位已經被檢測而還沒有獲得充分的校 準。該方法可進行到步驟12。
5. 將掩碼和DacCmd相或以設置下一個最高有效位。
6. 確定對應于DacCmd 二進制值的探測器電壓。將該探測器電壓和探 測器擊穿電壓或者最大電壓相比較。如果該電壓超過了探測器擊穿 電壓，則回到步驟2。
7. 將DacCmd值(例如，所述電壓)發送給測量系統。8. 等待電壓變化生效。
9. 將新的直方圖峰值和該通道的校準目標峰值進行比較。如果直方圖 峰值大于校準目標，則返回步驟2。
10. 如果直方圖峰值并不充分接近期望目標，則返回步驟3。
11. 校準通過。方法結束。
12. 校準失敗。方法結束。
在步驟1一12中所描述的示例性方法可包括此處所述的任何其它步驟。
某些流式細胞計型測量系統在小珠流經兩個探測窗口時使用流體靜力聚焦技 術將其分離出來進行個別測量。測量窗口具有固定的大小和物理間隔。例如，在測 量系統中的光源照射點之間的距離定義了所述間隔。
底層液體傳送體的速度的變化會改變小珠位于探測窗口內的時間的長度，以 及從一個窗口到下一個窗口的間隔時間的長度。最終的讀數與小珠存在于每個探測 窗口內的時間的長度是成比例的。此外，系統還使用窗口內傳送時間來確定第二探 測窗口何時有效(即小珠何時位于第二探測窗口中以待測量)。如果樣本測量和實 際小珠存在在時間上的對準不同于在校準期間所獲得的值，或者在照明窗口中的持 續(停留)時間不同，測量的精度就會下降。
如果測量系統被配置為在樣本微球體的測量過程中維持液體的壓力大致恒 定，則溫度的效果對于液體的速度變化造成的影響最大。粘度定義是液體的流動阻
力的度量。每單位時間內以壓力P流經直徑R、長度L的管子的液體的容積可以 由泊肅葉(PoiseuiUe)等式來表示
V/T=( Tt *R4*P)/(8*N*L) (4) 其中V/T是單位時間的容積(與速度成比例)，而N是以泊(poise)為單位的粘 度。流動艙的毛細管，雖然其尺度為矩形而不是圓形，但可以被視為簡單的管子。 所以，如泊肅葉等式中所定義的，小珠速度與液體傳送體的粘度成反比例。
用作流式細胞計型測量系統的小珠傳送體的液體的主要成分是水。在15°C到 3(fC的操作溫度范圍內，粘度由1.139厘泊變化到0.7975厘泊，其具有43%的顯 著變化。以上的粘度值是從第61版的《物理化學手冊》(Handbook of Chemistry & Physics)中的"水在0到100°C之間的粘度"(The Viscosity of Water 0 to 100°C ) 中所得的。護層(sheath)和樣本液體的速度如小珠的速度一樣也變化了大約43 %。因此，操作溫度可以被測量，然后被用于確定液體的粘度。相應地，可以從表、 泊肅葉等式、或者速度一溫度的預定值來確定液體的速度。在此類實施例中，該方法可包括基于速度在樣本微球體的測量期間控制液體的壓力。
此外，液體的速度可以被用于確定小珠速度。同樣，傳送時間可以被實時地 提取并校正。如果液體的溫度在樣本測量過程中基本上沒有變化，對溫度的監測和 對速度的確定可以在測量系統對樣本微球體進行測量之前進行。然而，該方法的這 些步驟也可以實時地進行。
相應地，用于控制流式細胞計型測量系統的一個或多個參數的一個方法包括 對將流經流式細胞計型測量系統的液體的溫度進行監測。樣本微球體被置于該液體 中。該方法還包括根據在所述溫度下的液體的粘度來確定測量系統中的樣本微球體 的速度。在一些實施例中，該方法還包括基于所述的速度確定樣本微球體的其中之 一將出現在測量系統的探測窗口中的時間長度。在另一個實施例中，該方法包括基 于所述的速度確定其中一個樣本微球體從測量系統的一個探測窗口移動到另一個 探測窗口的時問長度。此外，該方法可包括基于所述的速度確定何吋其中-個樣本 微球體會出現在測量系統的探測窗口中。而且，該方法可包括控制測量系統的一個 或數個探測窗口的采樣間隔，從而對速度進行補償。
窗口內傳送時間可以被測量，并保存在系統的非易失性存儲器中，或者保存 到在初始校準過程中對系統進行控制的計算機中。所測得的傳送時間然后可以被用 于后續的樣本運行中以適當地對第二探測窗口的采樣間隔進行定時。窗口內傳送時 間可以被縮短或者延長以補償粘度變化。校準系統時的溫度與當前溫度相對可用于 確定要施加的校正量。溫度對粘度因子的簡表可以被存儲在對系統進行控制的計算 機或者系統的非易失性存儲器中。在任一情況下，傳送時間校正因子可以從所述的 表計算而得，并且在樣本運行開始之前施加。作為選擇，任何其它在本領域內已知 的適當方法也可被用于確定校正因子。
該方法還可以包括根據速度確定測量系統的輸出信號的一個或多個特性。例 如，小珠存在于探測窗口中的時間長度決定了探測器的輸出電脈沖的幅度和形狀。 脈沖然后經過模擬低通濾波器，所述濾波器具有減小幅度和展寬脈沖寬度的顯著效 果。經濾波后的脈沖被數字化，脈沖下的區域被計算以得到與光級別大致成比例的 值。
此外，該方法可包括使用校正因子對輸出信號由于速度所致的誤差進行校正。 所述校正因子可以使用經驗測量值來確定。采用經驗測量值來構建用于由流速變化 所致的脈沖寬度變化的校正因子的表是顯而易見的。這張表可以被存儲在系統的存 儲器中，或者是連接到系統的控制計算機中。另一種對由于溫度變化所致的速度變化進行補償的方法是按照粘度的變化依 比例地改變施加的液體壓力。這會使得速度維持恒定，因此在每個測量窗口內，或 者其之間的時間不會有明顯的變化。可以實時地或在樣本運行開始時實時地使用泊 肅葉等式，或者經由從泊肅葉等式所計算出的預定表，或者通過其它的方法來進行 該方法，從而動態地設置合適的壓力。
這些方法已經證明對恒定壓力方案提供了很大的改進，不過，可能希望對于 溫度變化的其它補償。所以，此處描述了另一種方法，其可以與上述方法分開使用， 或與上述方法結合使用，來提供一種微調機制。與上述的方法不同，該方法采用光 學機制。此外，該方法可以使用測量和控制算法。然而，如此處所述的，撇開所附 加的光學機制和算法不談，該方法相對來說是便宜和快捷的。
當流式細胞計型測量系統的光學元件被裝配時，照明點(例如，激光點)之 間的距離被初始地設置。隨著照明點(例如，或者是光束)間的距離減少，由于小 珠在探測窗口間移動的距離較短，速度變化對于小珠傳送時間的影響被最小化。
由每個光束的垂直光照分布(profile)(即在與微球體流經測量系統的方向大 致平行的方向上的每個光束的分布)來進一步定義最小的間隔距離。例如，如果光 束強度自峰到肩迅速地減小，而且沒有第二最大值，就有可能將光束彼此相對接近 地放置，因為從一個光源出來的光不會溢出到其它的光照點中。需要留意以避免交 迭光束，因為這樣的交迭會導致在分類和指示器通道之間需要采用復雜的補償方 案，從而就造成了靈敏度降低。
如前所述的，重要的是保持照明點之間的小珠傳送時間基本恒定，該時間又 基本上使速度以及微球體在各自的照明窗口內所花費的時間固定。
用于使小珠傳送時間維持基本恒定的一個方法涉及實時地測量一個小珠通過 兩個探測窗口的平均時間，并且按需控制施加的壓力以保持傳送時間恒定。根據一 個實施例， 一種用于控制流式細胞計型測量系統的一個或多個參數的方法包括對微 球體從流式細胞計型測量系統的第一探測窗口運動到測量系統的第二探測窗口的 時間進行測量。在一個實施例中，該時間可以是平均時間。所述微球體可以是樣本 微球體或者是校準微球體。對時間的測量可包括測量在第一和第二探測窗口中被微 球體所散射的光。在另一個實施例中，對時間的測量可包括用一個探測器測量在第 一和第二探測窗口中被微球體所散射的光。在一個此類實施例中，在第一和第二探 測窗口中被微球體所散射的光被一個分光器導向一個探測器。該方法還包括改變測 量系統的施加壓力，從而使得時間基本恒定。該方法可以實時地操作。如上所述的實施例可以包括此處所述的任何其它步驟。
不幸的是，大多數流式細胞計型測量系統的當前的光學設計使得其不可能對 通過第二探測窗口的每個小珠進行探測，其中在第二探測窗口通常只有指示器熒光 被測量，這是因為熒光發射(它是無法預先得知的)不會對于各個小珠都恒定，而 且對于某些小珠而言非常可能是零。明顯的解決之道是增加另一個光學探測器來測 量由小珠所散射的第二光照源的光，不過這會對系統增加顯著的成本，因為為了處 理新信號，需要增加額外的電子和數字處理鏈。
所建議的方法則既簡單又便宜，因為其涉及的是在兩個探測窗口中采用同一 個散射光探測器來測量散射。由于當前的光學布局防止了第二 (指示器)窗口中的 散射光到達散射探測器；因此必須重新置放探測器以使得其接收由小珠發射或者反 射的所有光。這一步完成后，可由下游的電子設備分別辨認出與來自每個光源的散 射大致成比例的清晰的峰。
圖6描述了可以用于執行此處所述的方法的測量系統的一個實施例。如圖6 屮所示，測量系統包括光源70和72。光源70可以是例如發射的光波長大約為639nm 的激光器。該激光器可適用于為測量系統的分類通道提供光照。光源72可以是例 如發射的光波長大約為532nm的激光器。該激光器可適用于為測量系統的指示器 通道提供光照。注意，每個激光器的照射區域并非與小珠流動的軸(未示出)相重 合。其它的光源也可被用于上述的例子中。例如，依要被測量的樣本的不同，光源 及其波長可以改變。
如圖6中所示，光源70和72均照射試管74。特別地，光源70和72被配置 為在小珠76流經試管74時對其進行照射。如圖6中所進一步示出的，光源70和 72可以被配置為以大致相對的角度來照射小珠。不過，應該可以理解的是，光源 可以以任何合適的角度對小珠進行照射。
由于兩個光源的照射而被小珠所散射的光可以被透鏡78收集。透鏡78可以 包括本領域任何已知的合適的透鏡。此外，透鏡78可以由反射收集器(collector) 所代替，或者可以不包含在該系統中。雖然圖中顯示透鏡78以(相對于光源70 和72)大約90。的收集角來收集光，但應該理解的是，透鏡可以被設置為與光源成 任意合適的收集角度。
被透鏡78所收集的光被引向分光器80。分光器80可包括本領域任何己知的 合適的光學組件，比如玻璃板或者是分光濾光器。分光器80被配置為將透鏡收集 的光的一部分引導給探測器82。探測器82可被配置為對由于兩個(或多個)光源的照射而被小珠散射的光進行探測。在這種方式下，相對如前所提供的光源的例子
而言，探測器82可被配置為探測由小珠所散射的、波長大約為532nm和639nm的 光。該探測器可包括本領域任何已知的合適的探測器，比如CCD器件。
探測器82因此將探測單個小珠的兩個不同的散射信號。這些散射信號在不同 的波長下被探測，所述波長則基于光源的波長來決定。由于在小珠通過試管時，每 個光源在不同時間內照射小珠，則不同的散射信號被探測的時間就可以被用來測量 小珠或者微球體從測量系統的第一探測窗口移動到測量系統的第二探測窗口的時 間。
此外，分光器80被配置為傳輸透鏡所收集的光的其它部分。被傳輸的該部分 光可被光學組件84引導給系統的探測子系統的分類部分86。光學組件84可以包 括例如折疊式反射鏡、分光濾光器、局部透光鏡、或者本領域已知的其它合適的組 件。或者，取決于諸如探測子系統的分類部分的布置等因素，光學組件84可以不 被包含在系統中。所述探測子系統的分類部分可包括本領域任何已知的組件。在某 些實施例中，探測子系統的分類部分可以如圖l所述的那樣配置。被分光器80所 傳送的另一部分光可以被引導給探測子系統的指示器通道(未示出)。盡管該系統 使用第一照射區域用于分類，使用第二區域用于指示器信號，不過在采用了該技術 的設備中的使用方式不局限于這些實施例。熒光或者散射光可以被用于另一種用 途，例如，對熒光指示器或者在細胞、小珠及其它粒子中的其它染料進行測量。
被分光器80引導給探測器82的熒光發射(如果其存在的話)將被加到散射 信號，但其作用不是很重要，因為其幅度遠小于散射光的幅度。如上所述的，圖6 中所示的實現方法采用分光器80，其可以是波長分光器，它將散射的光重新引導 給位置重置的探測器而不改變施加給分類探測器的光譜。顯然，其它的實施例也是 可能的。例如，可以想像，可以將探測器安排成使得不包含額外的部件。圖6所示 的系統還可以進一步依此處所述進行配置。
一種用于控制流式細胞計型測量系統的一個或多個參數的方法的另一個實施 例包括測量微球體從流式細胞計型測量系統的第一探測窗口移動到測量系統的第 二探測窗口的平均時間。微球體可包括樣本微球體、校準微球體、或者二者兼而有 之。該方法還包括將平均時間和參考時間進行比較，所謂參考時間就是參考微球體 從第一探測窗口移動到第二探測窗口的時間。該方法可以包括對參考時間的測量， 也可以不包括這一步。此外，該方法包括，如果平均時間和參考時間的差異大于預 定值，則改變測量系統的施加壓力。在一些實施例中，可選擇該預定值來補償測量系統的已知的時間變化機制。在一個實施例中，改變施加的壓力包括，如果平均時 間大于參考時間，則提高施加的壓力。在一個不同的實施例中，改變施加的壓力包 括，如果平均時間小于參考時間，則降低施加的壓力。該方法同樣可以實時地進行。 上述的方法提供了一種直接地控制系統壓力從而使得連續的散射脈沖之間的 時間大致恒定的技術。利用由數字信號處理器或者其它合適的處理器所測得的采樣 信號，使用電子硬件(例如，計數器、數字比較器，等等)或軟件可實現該技術。 在任一實施例中，該方法是模擬的，得到相同的結果。以下在步驟1-6中提供該算 法的高級描述，脈沖群的例子示于圖7。
1. 當在已知的壓力和溫度下校準系統時，測量連續的散射脈沖峰之間的 平均傳送時間，并保存以便以后參考。
2. 在正常樣本獲取過程中，來自紅色激光器(或者第一個照射小珠的任 何其它光源)的第一散射脈沖啟動計時器。例如，如圖7中所示，在 ^時刻，對應于具有639nm波長的激光器照射的散射脈沖被探測到。 因此，計時器開始于h。
3. 當第二散射脈沖到達時，計時器停止。例如，如圖7中所示，當對應 于具有532nm波長的激光器照射的散射脈沖在12時刻被探測到時， 計時器停止。
4. 計時器的值隨后被用于和在校準操作期間所測得的傳送時間相比較。
5. 如果計時器值明顯高于校準時間，則壓力源(例如，泵)的一個或多 個參數會被改變以增加其壓力。壓力源的參數可以由處理器來改變。 或者，如果t2和ti的差大于t^，則可增加壓力源的壓力。t^可以是 定義小珠的傳送時間的可接受變化量的預定值。
6. 如果計時器值明顯低于校準時間，則壓力源的一個或多個參數會被改 變以降低其壓力。所述一個或多個參數可以由處理器來改變。或者， 如果t2和t,的差小于t^，則壓力源的壓力可以被減小。步驟5和步 驟6中所用的U具有相同值。
為了保持該"控制系統"相對穩定，有以下若干情況可被加以考慮。例如， 可以進行該方法使得系統不被控制為對經過系統的每個小珠事件嘗試或作出正向 或者反向的壓力校正。可以采用某些平均方法來補償被稱為"小珠抖動(bead jitter)" 的已知時間變化機制，該機制被認為至少是部分地由樣本核心的速度梯度造成的。 而且，應當謹慎地選擇引起壓力校正的時間誤差的閾值。誤差的幅度最好作為決定壓力校正量的控制器的輸入。很可能的是可使用經典的積分一差分控制器來用于良
好的操作。
雖然以上列舉的校正因子可以被用于在樣本微球體的測量之前對測量誤差的 主要部分進行校正，但在測量過程中也可以進行精細校正以補償實施了上述技術之 后可能存在的殘留誤差。例如，用于控制流式細胞計型測量系統的一個或多個參數 的一個方法包括在測量系統對樣本微球體進行測量時監測測量系統的一個或多個 參數。該方法還包括基于監測到的參數實時地改變一個或多個參數。例如，如上所
述，被監測且被改變的一個或多個參數可包括測量系統的PMT的參數。此外，使
用該過程也可消除那些沒有在本說明書加以標識的誤差源。
流式細胞計型測量系統基于測得的微球體內的兩個或多個染料的亮度 (intensity)來識別通過系統的微球體。這一識別技術也可以被用于在所有通道中 (指示器通道和分類通道兩者)識別含有已知量的熒光強度的校準微球體。在校準
微球體的測量結果已知之后，可以將精細校正因子施加給指示器和/或分類通道以 用于樣本微球體測量。
在區分校準微球體和樣本微球體時可能導致該技術復雜化。例如，校準微球 體的新的光譜地址可以基于染色級別組合而創建，但這會使得系統的多路處理能力 降低N-l 。另一種技術通過使得校準微球體的直徑大于或者小于樣本微球體的直徑 而對其進行識別。
測量系統可以對被微球體所散射的和照射平面成90°角的光線進行測量。散射 光的級別被用于識別那些可能粘在一起或者可能基本同時通過照射區域的多個微 球體。例如，散射光通常與存在于照射區域內的所有粒子的體積成比例；因此，多 個微球體要比單個微球體的散射信號更強。由于大多數的微球體通常作為單個對象 通過照射區域，通過考慮群體事件，就容易識別不屬于單個小珠的那些事件。通常， 兩個，有時為三個，微球體集合在一起并產生比單個微球體所產生的信號要強的信 號。單個微球體的散射信號級別通常在化驗進展期間進行，因為化驗形式對于散射 信號會產生影響。
較佳的情況下應該采用直徑小于而不是大于樣本微球體的直徑的校準微球 體，因為可以更容易地將校準微球體從通過照射區域的任意多的微球體組合中區分 出來。因此，對測量設備的參數監測可以采用直徑小于樣本微球體的直徑的校準微 球體的測量數據來進行。此外，被監測和改變的一個或多個參數可以包括由測量系 統的探測器所產生的輸出信號，這些輸出信號響應于由樣本微球體所散射的光。例如，如果校準微球體直徑對樣本微球體直徑的比率已知，就也有可能使用校準微球 體來對散射測量結果進行微調。
至少部分校準微球體也可具有不同的光譜地址。如此， 一系列不同的校準微 球體可以被用于增強上述的校準方法。例如，通過使用直徑作為第一區別點，校準 微球體的光譜地址可作為校準空間中的第二區別點，正如在樣本空間里那樣。具有 多個校準級別可用于下面的實現中，這些校準級別在分類空間內被充分地分開以對 微球體的身份加以辨別。
例如，可被監測和改變的一個或多個參數可包括樣本微球體的測量中的線性 性。監測或改變測量設備的參數的測量可包括測量系統的分類通道的測量。在此實 施例中，對測量設備的參數的改變較佳地校正了測量中的任何非線性性。如此，多 個校正級別可被用于探測和校正分級空間中的非線性性。當前的測量系統僅使用單 點校準，因此由于系統非線性性所導致的誤差就不能被校正。在以二維表示的雙染 料小珠系統中，該非線性性可以被當作基于分類微球體的被觀測的位置的平面中分 類空間的變體。對非線性性的校正改進了該平面中的微球體分類精度。該技術可以 類似效果被擴展到任何維數。
多個校準級別也可以被用于探測和校正指示器信號的非線性性。類似于如上 所述的技術，指示器通道在目前的測量系統中也可能經受單個校準點。對指示器通 道中的非線性性進行探測和校正可如上所述進行操作。例如，在測量系統的參數被 監測和改變期間所進行的測量可包括對于測量系統的指示器通道的測量。而且，在 測量系統的參數被監測和改變期間所進行的測量可包括對于測量系統的指示器通 道和分類通道的測量。如此，在分類和指示器通道中的非線性性可以大致同時地被 監測和校正。
在另一個例子中，可被監測和改變的測量系統的一個或多個參數包括測量系 統的動態范圍。例如，多個校準級別也可被用于對系統的動態范圍進行實時的確定。 測量系統具有有限的線性范圍。通過在一個或多個被唯一識別的校準微球體上使用 不同的指示器校準級別，就有可能識別出探測器的探測下限和/或上限，在下限和 上限處系統由于信號削波而變得非線性。
在某些實施例中，多個校準級別可被用于確定系統健康狀態分類。如此，被 監測和改變的一個或多個參數可包括測量系統健康狀態。測量系統健康狀態可包括 分類通道的健康狀態、指示器通道的健康狀態、或者二者兼而有之。例如，如果上 述的各個方法的集合不能就溫度或者其它效應對系統進行補償，校準微球體熒光分類級別將會比其預期值更高。可以設置一個閾值級別，而校準微球體熒光分類級別 可與該閾值相比較。如果校準微球體熒光分類級別落在閾值級別的選定的一側，可 向系統操作者提供或者向耦合于測量系統的計算機發送警告，告知測量結果是可疑 的。所述警告可以是可視的輸出信號和/或音頻輸出信號。在類似的方式下，多個 校準級別可以被用于確定指示器系統健康狀態。類似于對分類系統健康狀態的確 定，指示器系統中不可校正的誤差可以被識別并報告給系統操作者或者與測量系統 相連的計算機。
而且，多個校準級別可以被用于擴展指示器通道的線性動態范圍。如此，改 變測量系統的參數可包括對測量系統的指示器通道的線性動態范圍加以擴展。通過 包含存在于非線性區域內的若干明亮級別的校準微球體，有可能將實際測得的熒光 級別映射到其線性等價量上。通過在各個校準微球體值之間內插，可以從校準數據 構造出從測得的曲線到期望曲線的平滑映射。因此，如果采用該曲線對在非線性區 域內的樣本微球體進行調整，系統的線性的、可用的測量范圍可被顯著地擴展。
在以上描述中，已經識別出若干測量誤差因素(contributor)以及分別針對它 們的實時校正技術。此外，還創建了一種使用小直徑校準微球體的實時微調方法， 其中所述的校準微球體可以被包含于微球體樣本混合物中。微調過程的附加特征包 括對系統健康狀態的實時識別、對一個或多個通道中的非線性的校正、以及對于測 量系統的可用指示器動態范圍的顯著擴展。
執行諸如這里所述的方法的程序指令可通過載體介質傳送或存儲于載體介質 上。載體介質可以是諸如導線、電纜、或無線傳輸鏈路、或沿諸如導線、電纜或鏈 路傳播的信號之類的傳輸介質。載體介質可以是諸如只讀存儲器、隨機存取存儲器、 磁盤或光盤、或磁帶之類的存儲介質。
在一個實施例中，處理器可以被配置為執行程序指令以實行根據上述實施例 的由計算機所實現的方法。該處理器可以采取各種形式，包括采用數字信號處理芯 片或現場可編程門陣列的專用處理板、個人計算機系統、大型計算機系統、工作站、 網絡設備、因特網設備、個人數字助理(PDA)、電視系統、或者其它設備。總之， 術語"計算機系統"可以被寬泛地定義為包括具有一個或多個數字信號處理元件或 者其它處理元件的任何設備。
程序指令可以以各種方式實現，包括基于過程的技術、基于組件的技術、和/ 或面向對象的技術，以及其它技術。例如，程序指令可以采用ActiveX控件、C++ 對象、JavaBeans、 Microsoft Foundation Classes ( "MFC")、或者其它的技術或方法來按需實現。在采用FPGA實現方式時，可以使用諸如VHDL的高級語言來 設計嵌入于設備內的信號處理電路。
從本揭示中受益的那些本領域技術人員可以理解到本發明被確信可以提供
對流式細胞計型測量系統的一個或多個參數進行控制的方法。在參考本說明書的情 況下，本發明的各方面的進一步的修改以及替換實施例對于本領域技術人員而言是 顯而易見的。因此，本說明書要被理解為僅僅是示例性的，其目的在于教示本領域 技術人員實現本發明的總方式。應該理解的是，此處所示和所述的本發明的一些形 式是當前的優選實施例。在受益于本發明的說明書的教示之后，本領域的技術人員 將理解，此處所提及和描述的元件和材料可以被替換，部件和過程可被保留，而且 本發明的某些特征可以被單獨地使用。在不背離如所附的權利要求書中所描述的本 發明的精神和范圍的前提下，此處所述的元件可以被改變。
權利要求
1. 一種用于控制流式細胞計型測量系統的一個或多個參數的方法，包括在測量系統對樣本微球體進行測量時，對所述流式細胞計型測量系統的一個或多個參數進行監測；以及基于所述的監測實時地改變所述一個或多個參數。
2. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述監測包括使用校準微球體的測量來監測所述一個或多個參數，其中所述的校準微球體的直徑不同于樣本微球體的直徑。
3. 如權利要求l所述的方法，其特征在于，所述的一個或多個參數包括由測 量系統的探測器所產生的輸出信號，其中所述輸出信號響應于被樣本微球體所散射 的光。
4. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的監測包括使用校準微球體 的測量來監測所述一個或多個參數，其中所述的校準微球體具有不同于樣本微球體 的直徑的直徑，并且至少部分校準微球體的光譜地址不同。
5. 如權利要求4所述的方法，其特征在于，所述一個或多個參數包括測量系 統的動態范圍。
6. 如權利要求4所述的方法，其特征在于，所述改變包括擴展測量系統的指 示器通道的線性動態范圍。
7. 如權利要求4所述的方法，其特征在于，所述一個或多個參數包括測量系 統健康狀態。
8. 如權利要求7所述的方法，其特征在于，所述測量系統健康狀態包括分類 通道的健康狀態、指示器通道的健康狀態、或者二者兼而有之。
9. 如權利要求4所述的方法，其特征在于，所述的一個或多個參數包括樣本 微球體的測量中的線性性。
10. 如權利要求9所述的方法，其特征在于，所述的測量包括分類通道的測 量、指示器通道的測量、或者二者兼而有之。
11. 如權利要求9所述的方法，其特征在于，所述改變包括大致地校正測量 中的任何非線性性。
12. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述一個或多個參數包括測量 系統的雪崩光電二極管的參數。
13. 如權利要求12所述的方法，其特征在于，還包括使用經驗數據來確定在 所述改變中所要使用的校正因子。
14. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述一個或多個參數包括測量 系統的光電倍增管的參數。
15. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述一個或多個參數包括樣本 微球體的速度，且其中所述的監測包括監測樣本微球體被置于其中的液體的溫度， 并根據該溫度來確定樣本微球體的速度。
16. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，還包括在對樣本微球體測量之 前對所述 一個或多個參數進行校準。
17. —種用于控制流式細胞計型測量系統的一個或多個參數的方法，包括 對最接近于所述流式細胞計型測量系統的溫度進行監測；以及 使用經驗數據響應于所述溫度而改變測量系統的雪崩光電二極管的偏置電壓，從而大致上對由于溫度所致的雪崩光電二極管的增益變化進行校正。
18. 如權利要求17所述的方法，其特征在于，還包括通過在一個或多個溫度下將大致恒定的光級別施加到雪崩光電二極管上，并將所述光電倍增二極管在所述 一個或多個溫度下的多個偏置電壓記錄下來，從而產生經驗數據。
19. 如權利要求17所述的方法，其特征在于，所述的改變在測量系統進行樣 本測量之前進行，其中所述偏置電壓在整個樣本測量過程中大致恒定。
20. 如權利要求17所述的方法，其特征在于，所述的監測和改變是實時進行的。
21. 如權利要求17所述的方法，其特征在于，還包括在發射出已知強度的光 的校準微球體被測量系統測量的同時，改變偏置電壓，直至從雪崩光電二極管獲得 了預定信號級別為止。
22. 如權利要求21所述的方法，其特征在于，還包括根據雪崩光電二極管的 反向偏置電壓確定雪崩光電二極管的相應的相對電流、在預定信號級別下的偏置電 壓、以及溫度。
23. 如權利要求22所述的方法，其特征在于，還包括使用所述的相應的相對 電流、溫度、反向偏置電壓、以及經驗數據來確定偏置電壓。
24. —種用于控制流式細胞計型測量系統的一個或多個參數的方法，包括 對最接近于所述流式細胞計型測量系統的溫度進行監測；以及 使用光電倍增管的特征曲線響應于所述溫度而改變測量系統的光電倍增管的輸出信號，從而大致上對由于溫度所致的光電倍增管的輸出信號增益的變化進行校正。
25. 如權利要求24所述的方法，其特征在于，所述的光電倍增管的增益響應 于所述溫度作近似線性變化。
26. 如權利要求24所述的方法，其特征在于，所述光電倍增管是測量系統的指示器通道的一部分。
27. 如權利要求24所述的方法，其特征在于，所述光電倍增管的特征曲線隨 探測波長以及光電倍增管的陰極結構而變化。
28. —種用于控制流式細胞計型測量系統的一個或多個參數的方法，包括 將測量系統的光電倍增管的電壓設置為第一值和第二值； 在所述第一值和第二值下測量光電倍增管的輸出電流；根據第一值和第二值的對數與在第一值和第二值下的輸出電流的對數的相對 關系來確定光電倍增管的校準電壓；將該校準電壓施加到所述光電倍增管；以及測試所述光電倍增管以確定光電倍增管的一個或多個參數是否在預定的容差內。
29. —種用于控制流式細胞計型測量系統的一個或多個參數的方法，包括 使用逐次逼近來確定測量系統的探測器的校準電壓；以及 將校準電壓施加給探測器。
30. 如權利要求29所述的方法，其特征在于，所述探測器包括雪崩光電二極管。
31. 如權利要求29所述的方法，其特征在于，所述探測器包括光電倍增管。
32. 如權利要求29所述的方法，其特征在于，還包括將校準電壓和探測器的 擊穿電壓相比較，并且如果校準電壓超過擊穿電壓，則重復所述確定。
33. 如權利要求29所述的方法，其特征在于，還包括收集和處理探測器采樣 以確定探測器信號級別。
34. 如權利要求33所述的方法，其特征在于，還包括將探測器信號級別和校 準目標信號級別相比較，如果探測器信號級別高于校準目標信號級別，則降低探測器的偏置電壓，并重復所述確定。
35. 如權利要求33所述的方法，包括將探測器信號級別和校準目標信號級別 相比較，如果探測器信號不在校準目標信號級別的預定范圍內，則重復所述確定， 直至已經嘗試了所有期望的探測器電壓級別為止。
36. —種用于控制流式細胞計型測量系統的一個或多個參數的方法，包括 對將要流經流式細胞計型測量系統的液體的溫度進行監測，其中樣本微球體被置于所述液體中；以及根據在所述溫度下的液體的粘度來確定測量系統中的樣本微球體的速度。
37. 如權利要求36所述的方法，其特征在于，還包括基于速度確定樣本微球 體之一將存在于測量系統的探測窗口內的時間長度。
38. 如權利要求36所述的方法，其特征在于，還包括基于速度確定樣本微球 體之一從測量系統的一個探測窗口移動到測量系統的另一個探測窗口的時間長度。
39. 如權利要求36所述的方法，其特征在于，還包括基于速度確定微球體之 一何時將出現在測量系統的探測窗口中。
40. 如權利要求39所述的方法，其特征在于，還包括控制測量系統的一個或 多個探測窗口的采樣間隔從而對速度進行補償。
41. 如權利要求36所述的方法，其特征在于，所述的監測和確定是在測量系 統進行樣本微球體的測量之前進行的。
42. 如權利要求36所述的方法，其特征在于，還包括根據速度確定測量系統 的輸出信號的一個或多個特性。
43. 如權利要求42所述的方法，其特征在于，還包括使用校正因子對輸出信 號由于速度所致的誤差進行校正，其中所述的校正因子采用經驗測量值來確定。
44. 如權利要求36所述的方法，其特征在于，所述測量系統被配置為在樣本微球體的測量過程中維持大致恒定的液體壓力。
45. 如權利要求36所述的方法，其特征在于，所述的確定包括從表來確定速 度，其中該方法還包括基于該速度在樣本微球體的測量過程中控制液體的壓力。
46. 如權利要求36所述的方法，其特征在于，所述確定包括從泊肅葉等式來 確定速度，其中該方法還包括基于該速度在樣本微球體測量過程中控制液體的壓力。
47. 如權利要求36所述的方法，其特征在于，所述確定包括根據速度的預定 值與溫度的相對關系來確定速度，其中該方法還包括基于該速度在樣本微球體測量 過程中控制液體的壓力。
48. —種用于控制流式細胞計型測量系統的一個或多個參數的方法，包括 對微球體從流式細胞計型測量系統的第一探測窗口移動到該測量系統的第二探測窗口的時間進行測量；以及改變測量系統的施加壓力從而使得所述時間基本恒定。
49. 如權利要求48所述的方法，其特征在于，所述時間包括平均時間。
50. 如權利要求48所述的方法，其特征在于，所述微球體包括樣本微球體或者校準微球體。
51. 如權利要求48所述的方法，其特征在于，所述測量包括測量在第一和第 二探測窗口內被微球體所散射的光。
52. 如權利要求48所述的方法，其特征在于，所述測量包括用一個探測器測 量在第 -和第二探測窗口內被微球體所散射的光。
53. 如權利要求52所述的方法，其特征在于，在第一和第二探測窗口內被微 球體所散射的光被分光器引導給所述一個探測器。
54. 如權利要求48所述的方法，其特征在于，所述方法是實時進行的。
55. —種用于控制流式細胞計型測量系統的一個或多個參數的方法，包括 對微球體從流式細胞計型測量系統的第一探測窗口移動到該測量系統的第二探測窗口的平均時間進行測量；將所述平均時間和參考時間相比較，所述參考時間是參考微球體從所述第一 探測窗口移動到所述第二探測窗口的時間；以及如果平均時間和參考時間之間的差大于預定值，則改變測量系統的施加壓力。
56. 如權利要求55所述的方法，其特征在于，所述改變包括如果平均時間 大于參考時間，則提高施加壓力。
57. 如權利要求55所述的方法，其特征在于，所述改變包括如果平均時間 小于參考時間，則降低施加壓力。
58. 如權利要求55所述的方法，其特征在于，所述預定值被選擇為補償測量 系統的已知的時間變化機理。
59. 如權利要求55所述的方法，其特征在于，所述微球體包括樣本微球體、 校準微球體、或者二者兼而有之。
60. 如權利要求55所述的方法，其特征在于，該方法是實時進行的。
全文摘要
提供用于控制流式細胞計型測量系統的一個或多個參數的各種方法。一個實施例包括在對樣本微球體進行測量時監測測量系統的參數。該方法還包括基于所述的監測實時地改變所述參數。另一種方法包括對最接近于測量系統的溫度進行監測。一個這樣的方法包括利用經驗數據響應于所述溫度而改變雪崩光電二極管的偏置電壓。一種不同的此類方法包括利用特征曲線響應于所述溫度而改變光電倍增管的輸出。某些方法包括對將流經流式細胞計型測量系統的液體的溫度進行監測，其中樣本微球體被置于所述液體中。該方法還包括根據所述溫度下液體的粘度來確定樣本微球體的速度。
文檔編號G01N15/14GK101460827SQ200480023013
公開日2009年6月17日 申請日期2004年8月13日 優先權日2003年8月13日
發明者D·E·穆爾, W·D·羅斯 申請人:盧米尼克斯股份有限公司