基于酰基載體蛋白的蛋白標記方法

專利名稱：基于酰基載體蛋白的蛋白標記方法
技術領域：
本發明涉及將標記從底物轉移到包含目的蛋白和酰基載體蛋白或其片段的融合蛋白上的方法，特別是進一步包括檢測組分和/或操縱被標記的融合蛋白的方法。
背景技術：
對復雜生物系統理解的過程依賴于特性描述生物分子特別是蛋白質分子間潛在的相互作用。雖然通過對越來越多種生物的DNA測序鑒別了它們的開放閱讀框(ORF)，但是在體內和體外對相應蛋白性質的鑒定的可能性仍是有限的。絕大多數致力于實現這一目標的策略基于構建一個融合蛋白，這個融合蛋白不僅可以純化以在體外應用，也可以進一步在體內應用。這類標簽的實例包括6×His標簽、S-谷胱甘肽轉移酶、麥芽糖結合蛋白、抗原決定簇標簽、酵母雙雜交系統、O6-烷基鳥嘌呤-DNA烷基轉移酶、斷裂-泛素和綠色熒光蛋白(GFP)融合蛋白。但是，這些巰基乙胺(P-pant)連接到apo-ACP保守的絲氨酸殘基上，得到了完整酰基載體蛋白(holo-ACP)。磷酸泛酰巰基乙胺來源于輔酶A。Gehring等人(1997)進一步證實使用在泛酰巰基乙胺部位被修飾但仍可作為ACPS底物的輔酶A類似物，可獲得具有修飾的P-pant的holo-ACP。
在國際專利申請WO 97/13845中對分離的磷酸泛酰巰基乙胺轉移酶如ACPS進行了描述。
在國際專利申請WO 02/083937中描述了將一個標記物轉移到O6-烷基鳥嘌呤-DNA烷基轉移酶(AGT)融合蛋白上的方法，以及這種方法在檢測AGT融合蛋白中的應用。
發明概要本發明涉及一種檢測和/或操縱目的蛋白的方法，內容包括用被標記的輔酶A(CoA)型底物以及酰基載體蛋白合酶(ACPS)全酶或是它的同源物接觸融合蛋白，使ACPS將標記物轉移到融合蛋白上，此融合蛋白包含目的蛋白、酰基載體蛋白(ACP)或者該載體一個片段；以及任選在以識別/運用標記物為目的而設計的系統中，利用該標記物檢測和/或進一步操縱所得的標記融合蛋白。此外，本發明還涉及包含了目的蛋白和ACP或其片段的融合蛋白的應用。特別是，利用本發明方法連接上的標記物可用來在體內或體外對目的蛋白進行純化、固定或是持續監測。
任何種類的蛋白都可用本發明方法來構建融合蛋白，包括蛋白質分子、多肽、還是任意長度的肽鏈，不管有無二級、三級和四級結構。
本發明中獨特的被標記輔酶A(CoA)型底物是從輔酶A或者修飾的輔酶A獲得的，通過一個接頭連接到該輔酶A上，這個接頭至少含有一個反應位點，用以進一步連接標記，即一個可檢測的標記。本發明也涉及這些新穎的標記輔酶A(CoA)型底物，制備這些底物的方法，和在合成這些底物過程中有用的中間體，以及這些底物在本發明中的應用。
附圖簡述

圖1(A)6×His-ACP(1μM)，6×His-ACPS(0.2μM)和CoA-Bt(5μM)反應分析。按照所指示的時間(t)，從反應混合物中取出等份試樣，使用鏈霉親和素-過氧化物酶綴合物，通過Western blotting來探測6×His-ACP的生物素酰化反應。
(B)6×His-ACP的生物素酰化過程的定量6×His-ACP(3μM)，6×His-ACPS(5μM)和CoA-Bt(10μM)一起溫育30min，透析，然后等份樣品與鏈霉親和素一起溫育，將樣品上SDS-PAGE(第二泳道)。穩定的生物素-鏈霉親和素綴合物的生成會引起生物素酰化蛋白在凝膠中的移動。通過比較第一泳道含等濃度6×His-ACP但沒有鏈霉親和素的帶和第二泳道6×His-ACP的帶亮度，來評價生物素酰化反應的量。
(C)作為ACPS底物的CoA和CoA-Bt(或CoA-Dg)間的競爭性實驗6×His-ACP(0.4μM)，6×His-ACPS(0.4μM)，CoA-Bt或CoA-Dg(2μM)和不同濃度的CoA(0-80μM)一起溫育30min，標記反應的程度用Western blotting來測定。Western blots中相關信號強度(I)，負相關于[CoA]/[CoA-L]值(L＝標記物)，并與方程式I＝A/(1+Bx)擬合，這里x代表[CoA]/[CoA-L]，A是一個非特定常數，B是(Kcat/KM)CoA/(Kcat/KM)CoA-L。這些實驗得到了特定常數為0.48時(Kcat/KM)CoA/(Kcat/KM)CoA-Bt的比值和常數為0.35時(Kcat/KM)CoA/(Kcat/KM)CoA-Dg的比值，揭示了游離CoA和CoA衍生物沒有顯著差異。
圖2(A-F)是在酵母細胞表面標記ACP融合蛋白。熒光顯微照片(A)是表達了Cy3標記Aga2-ACP的酵母細胞，(D)是用鏈霉親和素包被的量子點標記的表達了生物素標記酵母細胞。(B)類似于(A)，(E)類似于(D)，但是細胞不表達Aga2-ACP蛋白。(C)和(F)分別是(B)和(D)相同樣品的透射顯微照片。這些實驗表明只有那些表達Aga2-ACP蛋白的酵母細胞才能被標記。
發明詳述本發明涉及一種檢測和/或操縱目的蛋白的方法，內容包括用被標記的輔酶A(CoA)型底物以及酰基載體蛋白合酶(ACPS)全酶或是它的同源物接觸融合蛋白，使ACPS將標記物轉移到融合蛋白上，此融合蛋白包含目的蛋白、酰基載體蛋白(ACP)或者該載體一個片段；以及任選在以識別/運用標記物為目的而設計的系統中，利用該標記物檢測和/或進一步操縱所得的標記融合蛋白。
ACP或ACP的結構域蛋白在脂肪酸、聚酮化合物和非核糖體多肽的生物合成中作為載體。酰基載體蛋白合酶(ACPS)全酶對ACP進行翻譯后修飾，將輔因子4′-磷酸泛酰巰基乙胺從輔酶A轉移到ACP的一個保守絲氨酸殘基上。ACPS也被稱為磷酸泛酰巰基乙胺轉移酶。在對CoA的磷酸泛酰巰基乙胺部分中硫醇基進行修飾時，ACPS表現出相對低的底物特異性。利用這一點，將ACP融合蛋白與ACPS和通過其磷酸泛酰巰基乙胺部分攜帶標記物的CoA衍生物一起溫育，ACP融合蛋白即被特異性標記。由此，這個標記物通過磷酸泛酰巰基乙胺部分傳遞到ACP的保守絲氨酸殘基上。這個標記過程不依賴于融合蛋白的性質。
這里ACPS和ACP的概念代表了任意一對蛋白分子，其中之一(ACP)是磷酸泛酰巰基乙胺衍生物基團的受體，這個磷酸泛酰巰基乙胺衍生物基團來源于CoA衍生物，另一個(ACPS)催化磷酸泛酰巰基乙胺衍生物轉運到這個ACP上。
在這里術語ACPS和磷酸泛酰巰基乙胺轉移酶可以互相交換使用，盡管有以下事實很多與大腸桿菌ACPS同源的磷酸泛酰巰基乙胺轉移酶所修飾的蛋白并不參與脂肪酸的合成，而參與天然產物的生物合成(Lambalot等，1996)。這種磷酸泛酰巰基乙胺轉移酶諸如EntD，參與腸桿菌素的合成；Sfp和Psf-1，參與枯草菌脂肽的生物合成；Gsp，參與短桿菌肽S的生物合成；LYS5，參與賴氨酸的生物合成；Bli，參與桿菌肽的合成；Lpa-14，參與伊枯草菌素A的生物合成；以及NshC，參與諾雪七肽的生物合成。此發明包括了所有與大腸桿菌來源的ACPS同源的泛酰巰基乙胺轉移酶在標記蛋白方面的應用。
術語ACP代表任意一種蛋白，這種蛋白可以被大腸桿菌ACPS催化或者被依據Lambalot等人(1996)定義的任何與大腸桿菌ACPS同源的ACPS催化，進行翻譯后的磷酸泛酰巰基乙胺修飾。這不僅包括參與脂肪酸合成的蛋白，也包括參與聚酮合成，非核糖體多肽合成，氨基酸合成以及縮酚酸肽合成的蛋白。除了被ACPS催化進行翻譯后修飾，這些蛋白的共性還在于它們通過不同底物形成了酰基-泛酰巰基乙胺硫醇酯，以及磷酸泛酰巰基乙胺部分被連接到一個絲氨酸殘基上。這些ACP蛋白的天然功能可能是作為一個多功能酶(例如I類脂肪酸合成酶)的結構域或者是一個分離的蛋白分子(例如II類脂肪酸合成酶)的結構域。
“檢測”意味著在以觀察標記物為目的而設計的系統中，基于標記物的特性對標記物和連接在其上的目的蛋白進行觀測。包括識別特定標記物，根據標記物性質在特定環境里尋找該標記物，任選對標記物和連接其上的蛋白定量分析，以及任選確定標記物所處微環境的性質等。
“操縱”意味著操作標記物和連接其上的目的蛋白，包括在以操作標記物為目的而設計的系統中，基于標記物特性，操作標記物和連接其上的目的蛋白，還包括將標記物和目的蛋白從一個化學或生物環境里分離出來，導入另一個化學或生物環境，純化，即將標記物和目的蛋白從非目的產物和雜質中分離出來，通過標記物與固相載體反應來固定標記物和目的蛋白，使標記物和目的蛋白與化學或生物試劑接觸以修飾標記物和/或目的蛋白的特性，諸如此類。
這里公開的方法在一定應用范圍內普遍適用，能夠特異性共價標記融合蛋白，使用(1)在被標記融合蛋白所處環境里能夠感知和引起變化的標記物，(2)導致融合蛋白產生物理和/或化學特性的標記物，借此特性標記物有助于操作融合蛋白，和/或(3)導致融合蛋白產生某些特性的標記物，借此特性標記物有助于純化融合蛋白。這里公開的方法能夠用于在體外和體內如細胞內標記ACP融合蛋白。
此外，本發明還涉及對包含目的蛋白和ACP或其片段的融合蛋白在此方法中的應用。特別是，涉及通過連接的標記物純化或固定目的蛋白，或在體內、外持續監測目的蛋白的方法。
一方面，本發明提供了在體內或體外持續監測目的蛋白的方法。其中，包含目的蛋白和酰基載體蛋白(ACP)或載體蛋白一個片段的融合蛋白與被標記的輔酶A(CoA)型底物，酰基載體蛋白合酶(ACPS)全酶或它的同源物相接觸，從而使得ACPS將標記物轉移到融合蛋白上，即可在以識別該標記物為目的而設計的系統中觀測到該標記物。
另一方面，本發明也提供了一種在體內或體外持續操縱目的蛋白的方法。其中，包含目的蛋白和酰基載體蛋白(ACP)或載體蛋白一個片段的融合蛋白與被標記的輔酶A(CoA)型底物，酰基載體蛋白合酶(ACPS)全酶或它的同源物相接觸，從而使得ACPS將標記物轉移到融合蛋白上，即可基于該標記物的物理和/或化學性質操縱融合蛋白。
再一方面，基于標記物的物理和/或化學性質可有效純化標記的融合蛋白，且本發明相應的提供了純化目的蛋白的方法，按照此發明中的方法步驟，利用標記物的物理和/或化學性質純化融合蛋白后，將融合蛋白切割，即獲得純的目的蛋白。
又一方面，本發明提供了在固相支持物上固定包含了目的蛋白、酰基載體蛋白(ACP)或其片段的融合蛋白的方法。這個方法包含使融合蛋白與標記的輔酶A(CoA)型底物接觸，該底物被固定或是能夠固定在一個固相支持物上，其中酰基載體蛋白合酶(ACPS)全酶轉移標記物，使得標記物共價結合到融合蛋白上，從而使融合蛋白被連接到固相支持物上或者在后續操作中被固定。在本發明的特定實施方案中，標記物并不是開始就被固定在支持物上的，這方法包含的后續步驟可以使標記有ACP的融合蛋白與支持物接觸，從而被固定于固相支持物上。在這些本發明優選實施方案中，標記物可能是在被轉移的同時，或是在被轉移的后續反應時共價的結合于支持物上；或者標記物是一對可特異性偶合的分子之一，而另外之一通過共價鍵或其它任何方式連接或可被連接在固相支持物上，例如利用生物素與抗生物素或與鏈霉抗生物素間的特異性偶合能力。
又一方面，本發明也提供了一種在體內和體外標記ACP融合蛋白的方法。術語體內標記ACP融合蛋白包括對細胞內所有區室的ACP融合蛋白或指向細胞外空間的ACP融合蛋白進行標記。如果ACP融合蛋白在體內進行標記并且與ACP融合的蛋白是一個原生質膜蛋白，那么融合蛋白的ACP部分可被連接在膜的胞內面或胞外面。如果標記在體外進行，那么融合蛋白的標記可在細胞提取物中進行，也可在純化或富集的ACP融合蛋白中進行。
本發明基于如下認識，即一個標記物與目的蛋白的特異性結合可以通過構建融合蛋白實現，此融合蛋白包含了目的蛋白和酰基載體蛋白(ACP)或其片段。
在一個優選的應用中，酰基載體蛋白或“ACP”具有能夠被酰基載體蛋白合酶全酶或“ACPS”催化修飾的特性，ACPS將標記的4′-磷酸泛酰巰基乙胺基團從合適的輔酶A(“CoA”)轉移到ACP或ACP片段的絲氨酸殘基上構成部分融合蛋白。在一個優選實施方案中，ACP為大腸桿菌酰基載體蛋白，例如Rawling和Cronan(1992)的論文及它的參考文獻的描述。但是，其它所知酰基載體蛋白(ACP)也可應用本發明，例如Gehring等人(1997)描述的鏈霉菌來源ACP，或在合適標記CoA存在時能按如上定義方式被ACPS修飾的其它任何ACP。在本發明里，ACP還包括野生型ACP的變異體，它們雖然可能由于一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失和添加而與野生型ACP不同，但是仍保持了在ACPS催化的反應中作為4′-磷酸泛酰巰基乙胺受體的性質。其它一些ACP變異體可用所屬領域的技術人員已知的技術進行化學修飾。ACP變異體可以通過技術人員應用蛋白質工程方法得到，和/或應用分子進化來產生和選擇新的能在ACPS催化的反應中下接受標記4′-磷酸泛酰巰基乙胺基團的受體序列。ACP片段是指那些含有可連接磷酸泛酰巰基乙胺基團衍生物的絲氨酸殘基的片段，和那些具有接受磷酸泛酰巰基乙胺基團衍生物能力的片段。
在最佳的實施方案里的ACPS，是如Lambalot和Walsh(1995)的論文及它的參考文獻的描述的大腸桿菌酰基載體蛋白合酶全酶。但是，其他酰基載體蛋白合酶全酶也被認識，例如Lambalot等人(1996)描述的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)來源ACPS，或在合適標記的CoA存在時能修飾如上定義的ACP的其它任何蛋白分子，它們都可應用于本發明。正如Lambalot等人(1996)描述的，這些ACPS也稱為磷酸泛酰巰基乙胺轉移酶，本發明包含了這一大類酶的應用。在本發明里，酰基載體蛋白合酶全酶也包括野生型ACPS的變異體，它們雖然可能由于發生一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失和添加而與野生來源ACPS不同，但是都具有將標記的4′-磷酸泛酰巰基乙胺基團特異性轉移到ACP融合蛋白上的能力。其它一些ACPS變異體可能用所屬領域的技術進行了化學修飾。ACPS變異體能夠通過應用蛋白質工程方法得到，和/或用分子進化產生和選擇具有新的能轉移標記4′-磷酸泛酰巰基乙胺基團到不同受體序列的特征來得到。
為有利于用ACPS標記ACP融合蛋白的許多考慮予以了重視。最重要的是，ACP融合蛋白的標記依賴于，在標記以前融合蛋白的ACP部分以脫輔基形態存在。如果ACP融合蛋白在一個有內源性ACPS的宿主中表達，并且內源性ACPS以這個ACP融合蛋白為翻譯后修飾作用的底物，那么對這個ACP融合蛋白的目的修飾至少會被部分阻礙。我們采取了不同的措施來最大程度減小這種非目的性的修飾作用。首先，選擇一個ACP，確保這個ACP不會被宿主ACPS有效修飾，也就是說，這個ACP與宿主的生化過程正交。例如，當大腸桿菌來源的ACP在人細胞中融合表達時，它不會被人的ACPS顯著修飾(見圖3)。第二，ACP融合蛋白過量表達會引起apo-ACP在ACP融合蛋白中大量形成。例如，盡管內源性ACPS存在，大腸桿菌來源6×His-ACP在大腸桿菌細胞中過量表達會導致6×His-ACP中ACP主要以apo-ACP形式存在。
為了標記反應，ACP融合蛋白還要與相應ACPS和CoA衍生物接觸。這意味著，當標記反應在體內進行時，要么ACP融合蛋白存在于細胞表面，要么通過如微注射之類的技術將ACPS和CoA衍生物導入目的細胞。
在本發明里，用來與ACP構成融合蛋白的蛋白包括蛋白質分子、多肽和任意長度的肽鏈，不管有無二級、三級或四級結構，而且優選由至少12個至多至2000個氨基酸組成，優選在50到1000個氨基酸之間。本發明的目的蛋白選自酶、DNA結合蛋白、轉錄調節蛋白、膜蛋白、核受體蛋白、核定位信號蛋白、蛋白輔因子、抗體、膜泵蛋白、膜通道蛋白、膜載體蛋白、動力蛋白、信號傳導相關蛋白、核蛋白、核糖體蛋白、小單體GTP酶、ATP結合盒蛋白、胞內結構蛋白、具有負責靶向引導蛋白至胞內特定區室的序列的蛋白、常用作標記物或親和標簽的蛋白，以及上述蛋白的結構域或亞結構域。ACP融合蛋白可由一個或多個，如一個、兩個或三個目的蛋白，它們連接于ACP的N-端、C-端，或同時連接在N-端和C-端。
更具體的，本發明的蛋白選自酶例如轉移酶(EC 2)、更具體的是除甲基外的芳基或烷基轉移酶(EC 2.5)，尤其是谷胱甘肽轉移酶(EC2.5.1.18)；或激酶，能夠轉移含磷基團的一類轉移酶(EC 2.7)，特別是將一個乙醇基作為轉運受體的激酶(EC 2.7.1)，如其底物蛋白含絲氨酸殘基和蘇氨酸殘基作為磷酸化靶位點的蛋白激酶，如酵母酪蛋白激酶(EC 2.7.1.37)，或酪氨酸激酶(EC 2.7.1.112)；或以氧化還原酶(EC 1)為例，具體如作用于作為受體的過氧化物的氧化還原酶(EC 1.11)，特別是細胞色素酶C過氧化物酶(EC1.11.1.5)；以水解酶(EC 3)為例，具體如作用于酯鍵的水解酶(EC 3.1)，特別是磷酸單酯水解酶(EC 3.1.3)，這種酶如蛋白磷酸單酯水解酶；或肽鍵水解酶，也被認為是肽酶或蛋白酶(EC 3.4)，尤其是半胱天冬酶；DNA結合蛋白，具體如轉錄抑制蛋白，它是抑制mRNA合成的蛋白因子，特別是大腸桿菌的mRNA合成抑制蛋白因子，尤其是LexA蛋白的DNA結合結構域；轉錄調節蛋白，具體如轉錄抑制蛋白，特別含有色氨酸/天冬氨酸重復結構的抑制蛋白；膜蛋白，如至少含有一個跨膜螺旋結構的膜蛋白，具體如內質網起源的膜蛋白，尤其是參與引導蛋白進入內質網的膜蛋白，如內質網跨膜蛋白Sec62；或者例如來源于7-跨膜螺旋(7-TM)家族的蛋白，具體如作為G蛋白偶聯受體(GPCR)的7-TM蛋白，特別是那些連有分子量大于1kDa的大分子配體的蛋白，比如哺乳動物的，如人，神經激肽-1受體(NK1)；或細胞膜上的跨膜離子通道蛋白，尤其是配體門控離子通道蛋白，具體如對血清素敏感的配體門控離子通道蛋白，如血清素受體5-HT3；或除離子通道和G蛋白偶聯受體外的膜受體蛋白；或過氧化物酶體膜蛋白，特別是來源于酵母的該類蛋白，如Pex15蛋白；核受體蛋白，如來源于轉錄因子家族的核受體蛋白，具體如來源于可被配體誘導的轉錄因子家族的核受體蛋白，尤其是來源于類固醇激素(如雌激素)家族的核受體，如人雌激素受體hER；核定位信號蛋白，如猴病毒40(SV40)的核定位信號蛋白；蛋白輔因子，如在遺傳結構里含泛素序列的蛋白；小單體GTP酶，具體如膜黏著小單體GTP酶，如Ras家族的成員；ATP結合盒(ABC)蛋白，如多藥抗藥性蛋白；胞內結構蛋白，具體如細胞骨架蛋白，更具體的如人胞質β-肌動蛋白；具有負責靶向引導蛋白至胞內特定區域的序列的蛋白，如引導至高爾基體、內質網、線粒體、原生質膜或者過氧化物酶體；常用作標記物或親和標簽的蛋白，如可在紫外線或可見光激發下發出熒光信號的熒光蛋白，尤其是綠色熒光蛋白家族(GFP)的成員，如增強深藍色熒光蛋白(ECFP)；以及上述種種蛋白的結構域和亞結構域。
而且，本發明依據來源對目的蛋白進行選擇。特別是那些存在于人、小鼠、大鼠、其他高級哺乳動物、真核生物、細菌的目的蛋白，如沙門氏菌屬(Salmonella)，具體如傷寒沙門氏菌(Salmonella typhi)或鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)，分枝桿菌屬(Mycabacteria)，具體如結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)，或者葡萄球菌屬(Staphylococci)，具體如金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，或來源于病毒，如人免疫缺陷病毒(HIV)、人流感病毒、肝炎病毒或者冠狀病毒。
此外，根據某個疾病中的蛋白作用選擇目的蛋白，例如癌癥、心血管疾病、精神疾病、阿爾茨海默病(Alzheimer)、肥胖癥、病毒感染和細菌感染。
在一個特定的本發明實施方案中，所用的融合蛋白一端由這種ACP DNA的大腸桿菌ACP或其變異體構成，目的蛋白(如上文列舉)的編碼序列連接在ACP DNA的C-端(C)或N-端(N)，或同時連接于ACP DNA的兩端，形成本發明中的融合蛋白。融合蛋白可另外含有合適的接頭，例如在合適環境下容易被酶切的接頭，其位置可在ACP和目的蛋白之間，和/或在同一融合蛋白中的兩個目的蛋白之間。這類接頭實例為那些在DNA階段可被合適限制性酶切開的，例如AGATCT可被BglII切開，和/或那些在蛋白階段可被蛋白酶切開的，例如煙草蝕刻病毒Nla(TEV)蛋白酶。
融合蛋白可以在原核宿主中表達，優選大腸桿菌，或者在真核宿主中表達，如酵母，真菌，昆蟲或哺乳動物細胞。
本發明也涉及到由目的蛋白和ACP或其一個部分組成的新的融合蛋白。
在本發明中，優選作為被標記輔酶A類的底物的輔酶A衍生物具有以下通式(I) 或以下通式(II) 其中R是連接輔酶A和標記物的接頭基團；“標記物”是一個適合用來對融合蛋白進行檢測、純化和/或操縱的標記分子。
但是，本發明并不局限于式(I)或(II)的底物，因為寬范圍內的其他底物可以用來將標記物轉運到ACP融合蛋白。例如認為在分子式(I)中置換嘌呤部分、對糖基部分或泛酰巰基乙胺酸部分進行修飾都可行。
式(I)或(II)化合物中的接頭基團R是一個將標記物連接到輔酶A的柔韌的接頭。接頭單位根據預想使用的需要，也就是要將標記物轉移到包含ACP的融合蛋白上進行選擇。它們也提高了底物在適當溶劑中的溶解能力。所用的接頭在實際操作的環境中其化學性質穩定。接頭R并不干擾與ACP的反應，也不干擾對標記物的檢測，但是可以構造成在其結構的某些位點會在輔酶A型底物和ACP融合蛋白反應進行完畢后及時被切割。
接頭基團R是一個直鏈或支鏈亞烴基，有1-300個碳原子，其中任選(a)一個或多個碳原子被氧置換，特別是其中每第三個碳原子被氧置換，例如帶有1-100個亞乙氧基(ethylenoxy)單位的聚亞乙氧基；(b)一個或多個碳原子被攜帶有氫原子的氮置換，相鄰碳原子被氧代基取代，代表酰胺官能團-NH-CO-；(c)一個或多個碳原子被氧置換，相鄰碳原子被氧代基取代，代表酯官能團-O-CO-；(d)兩個相鄰碳原子間的鍵是雙鍵或者三鍵，代表官能團-CH＝CH-或-C≡C-；(e)一個或多個碳原子被亞苯基、飽和或不飽和的亞環烴基、飽和或不飽和的亞二環烴基、橋聯雜芳基或者飽和或不飽和雜環基團置換；(f)兩個相鄰碳原子被二硫鍵-S-S-置換；或是一種兩個或更多綴合物的組合，特別是兩個亞烴基和/或如上(a)到(f)項下定義的修飾的亞烴基，任選含有取代基團。
認可的取代基例如低級烴基如甲基、低級烷氧基如甲氧基、低級酰氧基如乙酰氧基或鹵基如氯。
其他認可的取代基團是當α-氨基酸引入到接頭R中時而獲得的，其中所述接頭的碳原子被(b)項下所定義的酰胺官能團-NH-CO-置換。在這樣的接頭上，亞烴基基團R的部分碳鏈被一個-(-NH-CHR′-CO-)n-基團置換，其中的n在1-100之間，R′代表一個可變的α-氨基酸殘基。
還有一種取代基團導致接頭R具有光裂解功能，如鄰硝基苯基團。尤其是這種鄰硝基苯基取代基團定位在一個相鄰酰胺鍵的碳原子上，如-NH-CO-CH2-CH(鄰硝基苯基團)-NH-CO-。
如(e)項下所定義，取代碳原子的亞苯基為例如1，2-、1，3-，或優選的1，4-亞苯基。如上文(e)所定義，置換碳原子的飽和或不飽和的亞環烴基為，如亞環亞戊基或亞環己基，或不飽和亞環烴基，如在1-或2-位不飽和。如上文(e)所述取代碳原子的飽和或不飽和的亞二環烴基為，例如亞二環[2.2.1]庚基或亞二環[2.2.2]辛基，任選在2-位不飽和或在2-位5-位均不飽和。如上文(e)所述取代碳原子的雜芳基為，例如亞三唑基，優選是1，4-三唑基，或亞異噁唑基特別是3，5-亞異噁唑基。如上文(e)所述取代碳原子的飽和或不飽和雜環基團為，例如2，5-四氫呋喃二基，或2，5-二氧六環二基或者亞異噁唑烷基(isoxazolidiene)，優選3，5-亞異噁唑烷基。
優選柔韌的接頭，如含有1-20個碳原子的烴基鏈，任選被甲基、甲氧基或乙氧基取代，或者是一個聚乙二醇鏈基團，含1-20個亞乙氧基單位。
底物的標記物部分可根據打算使用融合蛋白的應用，由本領域技術人員進行選擇。標記物的實例包括(1)光譜探針，例如熒光團、發色團、磁性探針或對照試劑，或是在電子顯微術中可用的探針；(2)放射性標記的分子；(3)特異性結合對中的一個分子，其可與其配偶體特異性結合。這種特異結合對為本領域熟知的，包括如生物素，其可和抗生物素或鏈霉抗生物素結合；(4)有可能與其它生物分子相互作用的分子；(5)有可能與其它生物分子相互作用的分子的分子文庫；(6)能與其他本領域技術人員已知的生物分子交聯的分子，如Nadeau等(2002)所描述的；
(7)暴露于過氧化氫和抗壞血酸鹽時產生羥基自由基的分子如縛著的金屬螯合物，如Hori等(2002)所描述的；(8)能在光輻射下產生活性自由基的分子如孔雀石綠，如Jay等(1999)所描述的；(9)共價結合在固體支持物上的分子，這里支持物可以是玻璃片、微量滴定板或任何本領域技術人員公知的聚合物；(10)能與其互補鏈進行堿基配對的核酸分子或其衍生物；(11)具有膜嵌入性質的脂分子或其它疏水性分子；(12)具有所需的酶、化學或物理性質的生物分子；(13)具有上述任何性質的組合的分子。
被標記的CoA衍生物在磷酸泛酰巰基乙胺部位攜帶了一個可檢測的并且可被轉移到ACP融合蛋白上的標記物，例如熒光團、發色團、磁性探針、放射活性標記分子或其它任何光學探針。這種被標記的CoA衍生物使得本發明在體外或細胞內或在細胞表面上(體內)用來將一個可檢測的標記物特異的共價連接到ACP融合蛋白上。這樣便可在體內或體外對ACP融合蛋白進行檢測和定性。術語體內既包括在細胞的所有區室中標記也包括指向胞外空間的ACP融合蛋白的標記。此方法可以和綠色熒光蛋白(GFP)的應用相比較，它也是在遺傳上與目的蛋白融合，可以在活細胞內對目的蛋白進行研究。GFP及其變異體的缺點是其主要受限于GFP中天然存在的的熒光團的使用。在細胞內(體內)進行標記也可以在固定細胞后進行，采用普通固定方法并要確保對蛋白的功能性結構產生較小的影響，從而確保ACP保持通過磷酸泛酰巰基乙胺部分被標記的功能。
被標記CoA類衍生物的磷酸泛酰巰基乙胺部分攜帶一個親和標記物如生物素，這個標記物可以被轉移到ACP融合蛋白上，這種被標記CoA衍生物使得本發明用于轉運一個親和標記物到ACP融合蛋白上，從而利用親和標記物的結合配偶體分子來結合融合蛋白。例如，把用親和標記物如生物素進行標記的輔酶A型底物與ACPS添加到表達ACP融合蛋白的細胞提取物中(細菌細胞或真核生物細胞)，或添加到純化的ACP融合蛋白中，即可導致這個親和標記物對融合蛋白的共價修飾。然后通過親和標記物與其結合配偶體的相互作用來分離融合蛋白，例如，使用生物素與固定的抗生物素或與鏈霉抗生物素間的作用。如果標記物是通過接頭R連接到ACP融和蛋白上，R含有一個可以切割的鍵如二硫鍵，或者如果接頭可以發生光裂解，那么ACP融合蛋白即可在分離后與親和標記物分開。
被標記CoA類衍生物的磷酸泛酰巰基乙胺部分攜帶一個標記物，這個標記物可以轉移到ACP融合蛋白上，并且在外部刺激下能產生有活性的自由基，如羥自由基，這種被標記CoA衍生物即可對目的蛋白和其相鄰蛋白的構造進行研究。產生的自由基能夠使ACP融合蛋白和其相鄰蛋白失活，從而研究這些蛋白的作用。這類標記物的實例為縛著的金屬螯合物，在過氧化氫和抗壞血酸鹽存在時產生羥自由基的分子，和發色基團如孔雀石綠在激光照射下產生羥自由基。應用發色基團和激光產生羥自由基在發色團輔助下激光引起失活(CALI)的技術中也被認識到，例如Jay等人(1998)所描述的。CALI是一種在細胞中特異的使某個蛋白失活的方法，失活方式在時間上可控并由空間關系決定，而且這種失活作用取決于發色團和蛋白間的空間相鄰關系。在激光的照射下發色基團產生羥自由基，自由基使得在也只在發色基團周圍約100nm范圍內的所有蛋白失活。目前，通過微注射將發色團標記的特異針對目的蛋白的抗體引入到目的蛋白的相鄰空間。在本發明中，使用發色團如孔雀石綠對ACP融合蛋白進行標記并隨后進行激光照射，會使ACP融合蛋白和與ACP融合蛋白發生作用的蛋白失活，失活方式在時間上可控并由空間關系決定。在體內或體外均能用這種方法。
相似的，ACP融合蛋白可用縛著的金屬螯合物進行標記，并且融合蛋白和與其發生作用的蛋白可在過氧化氫和抗壞血酸鹽的存在下發生特異性的失活。這種方法不僅可以用來研究ACP融合蛋白和其相鄰蛋白的功能，也可以用來鑒別那些與融合蛋白相鄰的蛋白。這里，可以通過可檢測該蛋白片段的特異性抗體，也可以通過研究這些蛋白在2D高分辨率電泳凝膠中的消失或者通過使用分離和蛋白測序技術如質譜技術和蛋白N-端降解測序技術鑒別這些蛋白的裂解片段來鑒別ACP融合蛋白的相鄰蛋白。
被標記CoA衍生物中磷酸泛酰巰基乙胺部分攜帶一個配基，這個配基可以轉移到ACP融合蛋白上，這種被標記CoA衍生物使本發明用于將這個配基和其結合配偶體如蛋白分子，特異性的連接到ACP融合蛋白上。如果配基與另一個蛋白Y結合，并且蛋白Y與ACP融合蛋白的二聚作用會產生某種生物功能或者會產生可測量的信號，那么這種生物功能或者信號就依賴于標記的ACP融合蛋白的添加。如果ACP偶聯到細胞表面展示的蛋白上，那么結合配偶體與配基間的作用就能介導ACP與其它由該配基修飾的分子包括生物分子間的作用，這種作用可以與單獨的分子發生，也可以與其它由該配基修飾的細胞、組織或完整生物體的組成部分發生。
被標記CoA衍生物中磷酸泛酰巰基乙胺部分被共價連接到一個載體的表面，或者其中標記物能被另外的附著于載體表面的分子非共價結合，這種被標記CoA衍生物使本發明用于在固相支持物上構建蛋白陣列。后種方式的實例為標記物是生物素，而連接在載體表面的分子是抗生物素或鏈霉抗生物素。可能的載體例如玻璃片，微量滴定板或任何具備所需功能的聚合物。將用作底物CoA衍生物通過其標記固定在載體上，隨后在ACP融合蛋白的ACPS催化作用下，通過將標記物轉移到融合蛋白，從而固定融和蛋白于載體。將(不同的)ACP融合蛋白和ACPS一起按陣列空間要求點到載體上，載體用相應的輔酶A衍生物進行預處理，即得到蛋白陣列。
被標記CoA衍生物中磷酸泛酰巰基乙胺部分與標記物共價連接，該標記物可以與其它蛋白發生交聯，這種被標記CoA衍生物使本發明用于研究在一個合適環境里目的蛋白間的相互作用。這種有交聯功能的標記物的實例為那些含有諸如馬來酰亞胺、活性酯或疊氮化物這樣官能團的分子，和其它本領域技術人員已知的分子，如Nadeau等人(2002)的描述。在ACPS的存在下，這種被標記CoA類衍生物與和其它蛋白相互作用(體內或體外)的ACP融合蛋白相接觸，會導致融合蛋白和與其作用的蛋白間通過標記物發生共價交聯。這樣就可以鑒別與融合蛋白發生作用的蛋白。
被標記CoA衍生物中磷酸泛酰巰基乙胺部分攜帶一個配基，這個配基可以轉移到ACP融合蛋白上，此融合蛋白由ACP和一個膜受體蛋白組成，這樣就可以檢測被標記的受體。如此標記細胞表面受體可以觀察受體的內化作用。特別是應用于研究受體蛋白在結合一個配基后的內化作用，例如通過藥物、藥物引導物或試探藥物引導物。受體的內化作用可通過不同方法來檢測，如通過顯微觀測標記物從胞膜到胞內的遷移，或通過觀測標記物移動到胞內環境過程中的熒光特性變化。這種變化也可不通過顯微裝置觀檢測而是并可通過在胞外介質中添加淬滅劑來促進。
被標記CoA衍生物中磷酸泛酰巰基乙胺部分攜帶一個配基，這個配基可以使用電子顯微技術直接檢測，如電子致密納米顆粒。另一種用電子顯微術檢測磷酸泛酰巰基乙胺部分的應用基于用作光敏劑的標記物，如四溴螢光素在光照時氧化芳胺如聯茴香胺會形成電子致密沉淀，從而可被電子顯微鏡檢測到。
通過實施例，參考附圖來更加詳細的描述本發明的實施方案。
實施例以下實施例和實驗過程是給本領域技術人員提供如何實施本發明的完整公開和說明，而不是限制本發明的應用范圍。
合成CoA-Bt向生物素-馬來酰亞胺1(1mg，0.0022mmol)的100μl DMF溶液中加入輔酶A二鈉鹽(1.79mg，0.0022mmol，1eq.)的DMF溶液(90μl)和10μl 50mM pH 7.5 Tris·Cl。將混合物在室溫下攪拌4h。然后用CH3CN/H2O溶液1∶4稀釋，每份500μl注入制備型HPLC柱梯度2min內(A＝H2O 99％，CH3CN 1％，50mM NH4OAc/B＝CH3CN)從A/B 95∶5到A/B 80∶20，在7min內到A/B 68∶32，在2min內到A/B 20∶80，再回到A/B 95∶5。CoA-生物素的保留時間為6.5min。真空濃縮含有目的產物的流分，溶解于DMSO，并且注入一份分析量以控制純度。合并純的流分。CoA-生物素的濃度通過260nm(ε(腺嘌呤，260nm)＝15′300[M-1m-1])的吸收峰確定。CoA-Bt的產量是0.895mg(33％)。
ESI-MS(m/z)計算值為1217.296[M(-1)]，實際值為1217.2657[M(-1)]。
合成CoA-Dg輔酶A二鈉鹽(3.6mg，0.0044mmol，1eq.)溶于DMF/buffer混合液中(70μl DMF/30μl 50mM TrisCl，pH 7.5)加入含有N-(ε-馬來酰亞胺己酸)酰肼2(1mg，0.0044mmol)的DMF溶液(50μl)中。反應后用分析型HPLC(在260nm處檢測)來驗證反應的完成。然后，3-氨基-3-脫氧洋地黃毒苷半琥珀酰胺琥珀酰亞胺酯(2.6mg，0.0044mmol，1eq)溶于50μl DMF中，并加入10μl Et3N，將反應混合物在室溫下攪拌4h。反應液上制備型的HPLC，真空濃縮含有目的產物的流分，溶解于DMSO，通過分析HPLC進行純度分析。合并含有純產物的流分。CoA-Dg的濃度通過腺嘌呤的消光系數(ε(腺嘌呤，260nm)＝15′300[M-1m-1])確定。CoA-Dg的產量是2.37mg(37％)。
ESI-MS(m/z)計算值為1462.3707[M(-1)]，實際值為1462.481[M(-1)]。

合成CoA-Cy3輔酶A二鈉鹽(1.05mg，0.00126mmol，1eq.)的DMF(90μl)溶液和10μl 50mM pH 7.5 TrisCl加入含有Cy3-馬來酰亞胺3(Pharmacia，1mg，0.00126mmol)的100μl DMF溶液中。混合物在室溫下攪拌4h。然后用CH3CN/H2O 1∶4稀釋，每份500μl打入制備型HPLC柱梯度在2min內從A/B 95∶5到A/B 90∶10，在15min內到A/B 65∶35，在2min內到A/B 20∶80，再回到A/B 95∶5(A和B見以上實施例中所述)。CoA-Cy3的保留時間為10min。真空濃縮含有目的產物的流分，溶解于DMSO，并且注入一份分析量以控制純度。合并純的流分。CoA-Cy3的濃度通過549nm(ε(549nm)＝150′000[M-1cm-1])處的吸收峰確定。CoA-Cy3的產量為0.847mg(44％)。
ESI-MS(m/z)計算值為1519.370[M(-1)]，實際值為1519.3071[M(-1)]。

合成CoA-Cy5CoA-Cy5的合成由Cy5-馬來酰亞胺4(1mg，0.00122mmol)開始進行，與合成CoA-Cy3的步驟描述一樣。CoA-Cy5的濃度通過Cy5的消光系數(ε(645nm)＝250′000[M-1cm-1])確定。CoA-Cy5的產量為0.828mg(44％)。
ESI-MS(m/z)計算值為1545.386[M(-1)]和772.189[M(-2)]，實際值為771.6524[M(-2)]。
6×His-ACPS的克隆、表達和純化大腸桿菌XL1-blue的ACPS基因用單克隆PCR進行擴增，并克隆到pET-15b質粒(Novagen)中，上游引物為5′-TCT GGTCAT ATGGCA ATA TTA GGT TTA GGC ACG G-3′，含有一個Nde I限制性酶切位點(下劃線部分)，下游引物為5′-TCA AGTCTC GACTTA ACTTTC AAT AAT TAC CGT GGC A-3′，含有一個Xho I限制性酶切位點(下劃線部分)。融合到大腸桿菌ACPS的N-端的肽鏈序列(來自pET-15b質粒)為MGSSHHHHHHSSGLVPRGSH(氨基酸單個字母簡稱)，其后面就是ACPS的第一個氨基酸，甲硫氨酸。這個融合蛋白就是設計的6×His-ACPS。
液體培養含有一個編碼6×His-ACPS的表達載體pET-15b質粒(Novagen)的大腸桿菌BL21，直至培養物的光學密度OD 600nm達到0.6。添加IPTG至終濃度為1mM以誘導6×His-ACPS的表達。在24℃下220rpm搖床培養3.5h，然后4℃3000g離心10min。用10ml提取緩沖液(150mM NaCl，5mM咪唑，50mM KH2PO4，pH 8.0)重懸沉淀物，添加PMSF和aprotinmin至終濃度分別為1mM和2μg/ml。加入溶菌酶至終濃度為1mg/ml，并將混合物至于冰上反應15min，其間翻轉數次。隨后超聲波破碎10min(95％Power，50％Duty)。DNase I加至終濃度為0.01mg/ml。4℃反應30min后，18000rpm離心10min。
為了純化蛋白，將事先用提取緩沖液洗滌了3次的350μl Ni-NTA添加到溶菌液中，混合物置于冰上反應20min，其間混合數次。將提取的混合物加到一個聚丙烯柱中排水。用5×400μl DNA洗脫緩沖液(10mM TrisCl，pH 8.5)洗柱，然后用2×5ml洗滌緩沖液(300mMNaCl，10mM咪唑，50mM KH2PO4，pH 7.5)洗柱。為了洗脫蛋白，將洗脫緩沖液(300mM NaCl，150mM咪唑，pH7.5)加入柱子孵育10min，然后收集流出液。用150μl洗脫緩沖液繼續逐步洗脫蛋白，直至用Bradford法檢測不到蛋白為止。最后，將洗脫液在透析緩沖液(50mM HEPES，30％甘油，pH 7.5)中透析過夜，以除去殘余鹽分。將純的6×His-ACPS蛋白(MW 16.215kDa)分裝保存于-80℃。蛋白濃度用Bradford法確定為37.6μM。每升BL21大腸桿菌培養液得到0.912mg蛋白。
6×His-ACP的克隆，表達和純化大腸桿菌XL1-blue的ACP基因用單克隆PCR進行擴增，并克隆到pET-15b質粒(Novagen)中，上游引物為5′-GT CGG TATCATATGAGC ACT ATC GAA GAA CG-3′，含有一個Nde I限制性酶切位點(下劃線部分)，下游引物為5′-TCA TGCGGA TCCTTA CGC CTGGTG GCC GTT-3′，含有一個BamH I限制性酶切位點(下劃線部分)。融合到大腸桿菌ACP的N-端的肽鏈序列(產生6×His-ACP)為MGSSHHHHHHSSGLVPRGSH(氨基酸單個字母簡稱)，其后面就是ACP的第一個氨基酸，甲硫氨酸。
液體培養含有一個編碼6×His-ACP的表達載體pET-15b質粒(Novagen)的大腸桿菌BL21，直至培養基的光學密度OD 600nm達到0.6。添加IPTG至終濃度為1mM以誘導6×His-ACP的表達。37℃ 220rpm搖床培養3.5h，然后4℃3000g離心10min。沉淀物的處理與上述純化6×His-ACPS的實驗操作完全相同。6×His-ACP的濃度用Bradford法確定為188μM。每升BL21大腸桿菌培養液得到3.1mg蛋白。
為了確定apo-6×His-ACP和holo-6×His-ACP間的比例，對純化的6×His-ACP通過ESI-MS(pos.mode)用Q-Tof-Ultima(Micromass/water)、任選偶聯到Cap-LC(Waters)、Xterra RP-C4柱(Waters，5um，0.32×50mm；流速8μl/min)層析和MaxEnt1軟件系統分析。ESI-MS對混合物的分析說明制備樣品含apo-6×His-ACP和holo-6×His-ACP的混合物。發現純化的apo-6×His-ACP(不含第一個甲硫氨酸)分子量為10.6720kDa(計算值為10.6716kDa)，holo-6×His-ACP分子量為11.012kDa(計算值為11.01190kDa)。LC-ESI-MS可鑒別和積分apo-型和holo-型對應的峰。holo-型的比例確定為16％(保留時間11.77min)，apo-型的比例為84％(保留時間為14.16min)。
6×His-ACP-ha的表達和純化融合到大腸桿菌ACP的N-端的肽鏈序列為(氨基酸單個字母簡稱)MGSSHHHHHHSSGLVPRGSH，其后面就是ACP的第一個氨基酸，甲硫氨酸，融合到大腸桿菌ACP的C-端的肽鏈序列為(氨基酸單個字母簡稱)TSRYPYDVPDYARW(產生6×His-ACP-ha)。
液體培養含有一個編碼6×His-ACP-ha的表達載體pET-15b質粒的大腸桿菌BL21(DE3)，直至培養物的光學密度OD 600nm達到0.6。添加IPTG至終濃度為1mM以誘導6×His-ACP-ha的表達。24℃220rpm搖床培養3h，然后4℃3000g離心10min。后續純化操作與上述純化6×His-ACPS的實驗操作相同。6×His-ACP-ha蛋白(MW 12.65kDa)的濃度用Bradford法確定為400μM。每升搖瓶培養液總共得到10mg蛋白。
體外用6×His-ACPS和CoA-Bt對6×His-ACP進行生物素酰化室溫下純化的6×His-ACP(1μM)與6×His-ACPS(0.2μM)、MgCl2(10mM)在反應緩沖液(43μl，50mM TrisCl，pH 8.8)中溫育。取7.5μl組分進行分析。添加CoA-Bt至終濃度為5μM。在限定的時間內每份7.5μl分裝。添加輔酶A(終濃度1mM)至這些組分中作用30s以猝滅酰化反應，加入8.2μl 2×SDS緩沖液。將樣品在95℃加熱2min。利用鏈霉抗生物素-辣根過氧化物酶綴合物(NEN)與化學發光的過氧化物酶底物(Renaissance rengent plus，NEN)，用Western-blotting來檢測生物素酰化的6×His-ACP。用圖像工作站(Kodak 440)分析western blot的結果。作為對照，制備單獨含有每一種蛋白的樣品、含有兩種蛋白中的一種與CoA-Bt的樣品進行同上的生物素酰化分析，以檢查酰化反應的背景和特異性。生物素酰化作用依賴于所有三種成分的存在。
通過凝膠移動實驗定量6×His-ACP的生物素酰化室溫下將純化的6×His-ACP(3μM)與CoA-Bt(10μM)，純化的6×His-ACPS(5μM)與反應緩沖液(50mM TrisCl，pH 8.8，10mM MgCl2)中孵育，終體積50μl。反應30min后，將混合物在TBS(10mM TrisCl，150mM NaCl，pH 7.9)中透析過夜以除去過量CoA-Bt。分裝的反應液加入鏈霉抗生物至終濃度0.6μg/μl，反應1h。添加只含有2％SDS的2×SDS上樣緩沖液至樣品中，不加熱樣品直接進行SDS-PAGE電泳。用考馬斯染色檢測蛋白，通過比較樣品和對照物的條帶亮度來估計酰化反應的程度，對照物含有等量的未與鏈霉抗生物素反應未酰化的6×His-ACP。
CoA和被標記CoA間的競爭實驗室溫下，將CoA-Bt或CoA-Dg(2μM)、純化的6×His-ACPS(0.4μM)、純化的6×His-ACP-ha(0.4μM)、不等量CoA(0、2、4、8、12、20、40、80μM)，孵育在20μl反應緩沖液(50mM TrisCl，pH7.5，10mMMgCl2)。25min后，向每個樣品中加入20μl 2×SDS上樣緩沖液以猝滅反應，并在95℃加熱2min。利用鏈霉抗生物素-辣根過氧化物酶綴合物(1∶12500稀釋)，或洋地黃毒苷抗體-辣根過氧化物酶綴合物(1∶500稀釋)和化學發光過氧化物酶底物，用Western-blotting來檢測標記的6×His-ACP-ha。每個實驗中0μM CoA的信號強度任意定為1。
在酵母細胞面標記Aga2-ACP從酵母染色體組DNA中擴增出AGA2的DNA，通過PCR片段的末端引入的EcoR I和Sal I限制性位點，將其插入到酵母的表達載體pRS314的PCUP1啟動子后。通過擴增時在ACP DNA上引入的Sal I和Acc 651限制性位點將ACP DNA克隆到AGA2之后。在ACP DNA后面的序列編碼HA抗原決定簇。連接Aga2p和ACP的蛋白序列是FVDEMYFQGM。Aga2p的最后一個氨基酸殘基和ACP的第一個氨基酸殘基用下劃線表示。ACP蛋白的C-端序列包括了HA-抗原決定簇，序列為QAYPYDVPDYAG。ACP的最后一個氨基酸殘基用下劃線表示。酵母菌株EBY100(MATa ura3-52 trp1 leu2Δ1 his3Δ200pep4∷HIS3 can1 GAL pIU211URA3)(Invitrogen，Carisbad，CA)的PGAL1啟動子啟動Agalp的表達，PCUP1啟動子啟動Aga2p-ACP的表達。在10ml含2％半乳糖，0.1mM銅的選擇培養基里培養該酵母至OD 600nm值達到1.4個OD 600nm單位，用2ml水洗滌細胞并重懸細胞于0.2ml標記緩沖液(50mM TrisCl，pH 8.8，100mMNaCl，10mM MgCl2)。添加CoA底物和6×His-ACPS至終濃度分別達到10和1μM。室溫反應20min后用2ml PBS緩沖液稀釋反應液以中止標記反應。用2ml PBS緩沖液洗滌細胞4次，隨后或者直接用熒光顯微鏡觀察，或者將反應液與0.2ml QdotTM孵育緩沖液(含20nM QdotTM605鏈霉抗生物素綴合物)(Milan Analytica AG，Switzerland)混合孵育20min，再用2ml PBS緩沖液洗滌4次細胞，然后用熒光顯微鏡觀察。用Zeiss Axiovert熒光顯微鏡觀察細胞(AarlZeiss，Gottingen，Germany)，使用63×oil(1.4數值孔徑)物鏡。
標記展示在HEK293細胞表面的ACP-NK1融合蛋白為了瞬時表達ACP-NK1，5-HT3受體(Sig5HT3)的信號序列通過一個短DYV接頭連接到ACP蛋白的N末端，NK1則通過一個短TS接頭連接到ACP蛋白的C端。在所得結構里，一個FLAG標簽和一個6×His標簽也被連接到NK1的C端。相應的融合蛋白基因插入到pCEP4載體(Invitrogen)的Nhe I位點和BamH I位點之間。用添加了2.2％小牛血清(GIBCO，BRL)的DMEM/F12培養基(Dulbeccomodified Eagle medium；GIBCO，BRL)培養HEK293細胞。按文獻(NatBiotechnol 21，86-89(2003))描述進行瞬時轉染，用表達ACP-NK1的表達載體和核定位EGFP(EGFP-NLS3)對HEK293細胞進行共轉染。24h后，與500μl PBS緩沖液混合反應，此緩沖液中含MgCl2(10mM)，6×His-ACPS(1μM)，及任一CoA-Cy3、CoA-Cy5、CoA-Bt(每個5μM)。然后用PBS緩沖液洗滌細胞三次以除去任何過量的底物，當用Cy3或Cy5標記時直接用激光掃描共聚焦熒光顯微鏡觀察細胞。生物素酰化的細胞則要與含1μg/ml FluoroLinkTMCy5標記的鏈霉抗生物素(Amersham Bioscienecs)的PBS緩沖液混合發生反應，然后用PBS緩沖液洗滌3次。使用488nm氬/氪激光線，或543nm氦氖激光線或633nm氦氖激光線，用一臺Zeiss LSM 510顯微鏡(Carl ZeissAG，Gottingen，Germany)獲得激光掃描共聚焦熒光顯微照片，用63×water(1.2數值孔徑)物鏡。調節激光掃描速度和強度以避免使熒光探針光漂白，及避免使細胞發生損害或形態上的變化。在對GFP敏感和對各自染料敏感的通道分析熒光。細胞樣品在用CoA-Cy3或CoA-Cy5標記后，或用CoA-Bt標記再用鏈霉抗生物素-Cy5染色后，在GFP通道可觀察到清晰的核標記，在細胞膜區域可觀察到清晰的膜標記。沒有發生轉染的細胞不在胞核表達GFP，因此觀察不到膜染色，這表明了Cy3、Cy5和生物素標記ACP-Nk1的特異性。在HEk293細胞中瞬時表達的ACP-Nk1受體在進一步實驗中被CoA-Cy5和四甲基若丹明標記P物質(SP-rho)共染色，P物質是NK1的天然配體。這兩種物質都對胞膜區域進行特異性染色，產生相同的染色區域。用過量的未標記P物質在一分鐘內進行逆SP-rho染色，證明了標記作用的特異性，也證明了ACP-NK1結合配基的功能。
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序列表<110>洛桑生態綜合技術聯合公司(Epfl-Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne)K.約翰森(Johnsson，Kai)N.喬治(George，Nathallia)<120>基于酰基載體蛋白的蛋白標記方法<130>P311A<150>EP03405364.5<151>2003-05-23<160>8<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>將ACPS克隆進pET-15b的正向引物<400>1tctggtcata tggcaatatt aggtttaggc acgg 34<210>2<211>37<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>將ACPS克隆進pET 15b的反向引物<400>2tcaagtctcg agttaacttt caataattac cgtggca 37<210>3
<211>20<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>ACPS和ACP的6×His突出端<400>3Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro1 5 10 15Arg Gly Ser His20<210>4<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>將ACP克隆進pET-15b的正向引物<400>4gtcggtatca tatgagcact atcgaagaac g 31<210>5<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>將ACP克隆進pET-15b的反向引物<400>5tcatgcggat ccttacgcct ggtggccgtt g 31<210>6<211>15<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>ACP的IIA抗原表位突出端<400>6Thr Ser Arg Ser Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Arg Trp1 5 10 15<210>7<211>11<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>聯系Aga2p和ACP的序列<400>7Phe Val Asp Glu Met Leu Tyr phe Gln Gly Met1 5 10<210>8<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>HA Epitope extension for Aga2p ACP fusion protein<400>8Gln Ala Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Gly1 5 10
權利要求
1.一種檢測和/或操縱目的蛋白的方法，所述方法包括使包含目的蛋白和酰基載體蛋白(ACP)或其片段的融合蛋白與被標記的輔酶A(CoA)型底物和酰基載體蛋白合酶(ACPS)全酶或其同源物接觸以使ACPS將標記物轉移到融合蛋白上，并在以檢測和/或操縱所述標記物為目的而設計的系統中，利用該標記物檢測和/或進一步操縱所得的標記融合蛋白。
2.權利要求1的檢測目的蛋白的方法，其中所述所得的標記融合蛋白可于體內或體外在以持續監測所述標記物為目的而設計的系統中被持續監測。
3.權利要求2的檢測目的蛋白的方法，所述方法用于體外檢測。
4.權利要求2的檢測目的蛋白的方法，所述方法用于體內細胞內檢測。
5.權利要求1的操縱目的蛋白的方法，其中所述標記的融合蛋白在以純化所述標記物為目的而設計的系統中被純化，并且所述目的蛋白在后續步驟中從所述標記的融合蛋白上被切下。
6.權利要求1的操縱目的蛋白的方法，其中所述標記的融合蛋白被固定在以固定所述標記物為目的而設計的系統中的固體支持物上。
7.權利要求1的操縱目的蛋白的方法，其中ACPS為來自大腸桿菌(E.coli)的ACPS。
8.權利要求1的操縱目的蛋白的方法，其中所述ACPS同源物選自EntD、Sfp、Psf-1、Gsp、LYS5、Bli、Lpa-14和NshC，參與諾雪七肽的生物合成；本發明包括所有與來自大腸桿菌的ACPS同源的標記方案中的ACPS的應用。
9.權利要求1的操縱目的蛋白的方法，其中ACP是大腸桿菌酰基載體蛋白。
10.權利要求1的操縱目的蛋白的方法，其中ACP來自鏈霉菌(Streptomyces)種。
11.權利要求1的操縱目的蛋白的方法，其中ACP是野生型ACP的ACP變異體，其由于一個或多個氨基酸取代、缺失或添加而與野生型ACP不同，但其仍保留了在ACPS催化的反應中用作被標記的4′-磷酸泛酰巰基乙胺受體的性質。
12.權利要求1的操縱目的蛋白的方法，其中ACP是ACP片段，所述片段包含連接磷酸泛酰巰基乙胺衍生物的絲氨酸殘基，并保留了接受這類磷酸泛酰巰基乙胺衍生物的功能。
13.一種包含目的蛋白和酰基載體蛋白(ACP)或其片段的融合蛋白，其特征在于所述目的蛋白由12到5000個氨基酸組成。
14.權利要求13的融合蛋白，其特征在于該目的蛋白由50到1000個氨基酸組成。
15.權利要求13的融合蛋白，其特征在于所述目的蛋白選自酶、DNA結合蛋白、轉錄調節蛋白、膜蛋白、核受體蛋白、核定位信號蛋白、蛋白輔因子、抗體、膜泵蛋白、膜通道蛋白、膜載體蛋白、發動蛋白、信號傳導相關蛋白、核蛋白、核糖體蛋白、小單體GTP酶、ATP結合盒蛋白、胞內結構蛋白、具有負責靶向引導蛋白至特定胞內區室的序列的蛋白、常用作標記物或親和標簽的蛋白以及這類蛋白的結構域或亞結構域。
16.權利要求13的融合蛋白，其特征在于所述目的蛋白得自人或其它高等哺乳動物、真核生物、細菌或得自病毒。
17.權利要求13的融合蛋白，其特征在于所述目的蛋白得自沙門氏菌屬(Salmonella)、分枝桿菌屬(Mycobacteria)、葡萄球菌屬(Staphylococci)、人免疫缺陷病毒(HIV)、人流感病毒、肝炎病毒或冠狀病毒。
18.權利要求13的融合蛋白，其特征在于所述目的蛋白在癌癥、心血管病、精神疾病、阿耳茨海默病、肥胖癥、病毒感染或細菌感染中起作用。
19.權利要求13的融合蛋白，其特征在于所述融合蛋白包含通過在合適條件下易被酶切割的接頭連接的ACP和目的蛋白。
20.權利要求13的融合蛋白，所述融合蛋白包含ACP和神經激肽-1受體。
21.權利要求13的融合蛋白在權利要求1的方法中的用途。
22.一種式(I)或(II)的標記的CoA型底物 其中R是橋接輔酶A和標記物的接頭基團；“標記物”是適用于在以檢測和/或操縱所述標記物為目的而設計的系統中檢測和/或操縱所述融合蛋白的標記分子。
23.權利要求22的標記的CoA型底物，其中R是1到300個碳原子的直鏈或支鏈亞烴基基團，其中任選(a)一個或多個碳原子被氧置換；(b)一個或多個碳原子被攜帶氫原子的氮置換，且相鄰碳原子被氧代基團取代，代表酰胺官能團-NH-CO-；(c)一個或多個碳原子被氧置換，且相鄰碳原子被氧代基團取代，代表酯官能團-O-CO-；(d)兩個相鄰碳原子間的鍵是雙鍵或三鍵，代表官能團-CH＝CH-或-C≡C-；(e)一個或多個碳原子被亞苯基、飽和或不飽和的亞環烴基、飽和或不飽和的亞二環烴基、橋聯雜芳基或橋聯飽和或不飽和雜環基基團置換；(f)兩個相鄰碳原子被二硫鍵-S-S-置換；或是兩個或多個的組合，特別是兩個上述(a)到(f)項下定義的亞烴基和/或修飾的亞烴基基團，任選含有取代基。
24.權利要求22的標記的CoA型底物，其中“標記物”選自(1)光譜探針；(2)放射活性標記的分子；(3)特異性結合對中的一個分子，其能與其配偶體特異性結合；(4)有可能與其它生物分子相互作用的分子；(5)有可能與其它生物分子相互作用的分子文庫；(6)能與其它生物分子交聯的分子；(7)暴露于過氧化氫和抗壞血酸鹽時能產生羥自由基的分子；(8)能在光輻射下產生活性自由基的分子；(9)共價結合在固體支持物上的分子；(10)能與其互補鏈進行堿基配對的核酸或其衍生物；(11)具有膜嵌入性質的脂分子或其它疏水性分子；(12)具有所需的酶、化學或物理性質的生物分子；和(13)具有上述任何性質(1)-(12)的組合的分子。
25.權利要求22的標記的CoA型底物，其中“標記物”選自生物素、洋地黃毒苷、Cy-3和Cy-5。
26.權利要求22的標記的CoA型底物在權利要求1的方法中的用途。
全文摘要
本文公開了用各種不同的標記物標記酰基載體蛋白(ACP)融和蛋白的方法。該方法的原理是用酰基載體蛋白合酶(ACPS)全酶或是它的同源物將標記物從輔酶A(CoA)型底物轉移到融合蛋白上。本方法通過將分子連接在融合蛋白上，給融合蛋白帶來新的物理或化學性質，從而可以在體內或體外檢測和操縱融合蛋白。這類標記物的實例中包括光譜探針或報道分子、親和標簽、產生活性自由基的分子、交聯物、介導蛋白蛋白相互作用的配體或適于固定融合蛋白的分子。
文檔編號G01N33/534GK1826527SQ200480020985
公開日2006年8月30日 申請日期2004年5月19日 優先權日2003年5月23日
發明者K·約翰森, N·喬治 申請人:洛桑生態綜合技術聯合公司