涉及g－蛋白偶聯受體寡聚體的材料和方法

專利名稱：涉及g－蛋白偶聯受體寡聚體的材料和方法
技術領域：
本發明涉及與G-蛋白偶聯受體(GPCR)寡聚體相關的材料和方法。本發明特別，但不限于提供了包括GPCR寡聚體的生物學試劑、生產所述生物學試劑的方法和用于測定其功能的試驗。本發明還提供了用于測定具有調節GPCR寡聚體，特別是雜-寡聚體功能的能力的化合物的試驗。
背景技術：
GPCR是人類基因組中最大的基因家族之一且已經成為用于研發臨床有效的小分子藥物的最易于控制的一組靶物。據估計在臨床用于人的藥物中約有40％以GPCR為靶。由此對GPCR的結構、調節和活化機制以及它們控制的下游信號級聯放大的詳細情況存在巨大關注。A類或視紫紅質類家族的GPCR是迄今為止含有80％以上總GPCR家族成員的最大類。已經在人類基因組測序程序中鑒定了800個以上編碼GPCR的基因，但它們中僅有約25個目前成為臨床有效藥物的靶物。因此，對此進行發展并找到靶向目前鑒定的GPCR的有用藥物有巨大潛力(Lee等，2001)。
在最近的過去，GPCR作為二聚體存在的概念已經從假說迅速發展成顯然被接受(參見Bouvier，2001，Milligan，2001，George等，2002綜述)。盡管均二聚體(即含有一個單個GPCR的兩個拷貝的二聚體)已經得到了最佳研究，產生的證據提示既發生雜二聚化(即二聚體由兩個不同的GPCR各自的一個分子組成)，又可以具有功能性和藥理性后遺癥(Devi，2001，George等，2002)。然而，與形成這類雜二聚體的選擇性和在共表達兩種不同GPCR還必然導致均二聚體對產生時如何在分離中監測雜二聚體的功能相關的重要問題仍然存在。假定在單個細胞中共表達許多GPCR，則很可能細胞中GPCR二聚體的補體為復雜的。
已經對γ-氨基丁酸(GABA)B型受體(GABABR)進行了研究(Duthey等，2002)。這是一種罕見的GPCR，因為迄今為止已知它是唯一一種需要兩個亞單位GB1和GB2起作用的受體。GB1亞單位含有GABA結合位點，但不能單獨活化G-蛋白。GB2不結合GABA，但確實具有活化G-蛋白的能力。Duthey等考慮了G-蛋白偶聯中GB1-GB2雜聚體(heteromer)內每一種亞單位的作用。該研究包括將突變引入GB1和GB2，特別是在第3胞內環內。他們確定使GB2突變防止了G-蛋白活化，而使GB1發生相似的突變不會影響受體功能。盡管關注GABAB受體，但是這項研究令人遺憾地沒有提供任何有關GPCR的信息，其中相同蛋白質既能使配體結合又能使G-蛋白活化。
其它研究著眼于在激素結合中有缺陷的第一種突變體受體與在信號世代中有缺陷的第二種突變體受體的共表達。據報導這兩種突變體的共表達挽救了激素-活化的cAMP產生(Lee等，《生物化學雜志》(J.Biol.Chem.)277卷，18期，2002；Osuga等，《生物化學雜志》(J.Biol.Chem.)272卷，40期，1997)。
然而，盡管公認GPCR作為潛在藥物靶物是極為重要的，但是不存在令人滿意的篩選試驗，而令人滿意的篩選試驗要求采集有關可能天然存在的GPCR寡聚體，特別是GPCR雜-寡聚體的功能特性，例如配體結合特性的可靠數據。

發明內容
本發明人令人意外地發現，在配體結合后，GPCR具有活化與第二種GPCR結合的G-蛋白的能力，在此情況中，兩種GPCR均形成寡聚體。
具體地且如下文給出的實施例中解釋的，本發明人已經發現，在細胞中共表達(A)GPCR相對于G-蛋白而言被賦予非功能性的GPCR和G-蛋白的融合蛋白和(B)G-蛋白被賦予非功能性，即不能對GPCR所接受的信號起作用的GPCR和G-蛋白的融合蛋白，產生了下列復合物A、B、AA、BB、AB和BA，其中僅AB和BA為功能性的，即G-蛋白被活化以結合GTP并啟動GPCR信號級聯放大。
基本策略利用如下事實可以將GPCR/G-蛋白α亞單位融合蛋白(Milligan，2000；Milligan，2002)看作含有GPCR和G-蛋白這兩種成分的序列和功能特性的雙-功能多肽類。通過產生不同的突變體對，其中第一種在GPCR中得到突變而使其不能活化與之融合的野生型G-蛋白，而第二種在G-蛋白中得到突變，使得它不能被與之連接的野生型GPCR活化，本發明人證實當共表達這兩種突變體時，功能可以得到恢復。因此，只有包括至少每種突變體的寡聚體才能產生功能互補且能夠產生對激動劑配體產生反應的信號。
本發明人理解可以將這種現象用于提供可靠的篩選試驗，以便測定GPCR寡聚體，特別是雜-寡聚體的特性并提供這類試驗中使用的生物學試劑。
因此，本發明在其最一般的方面中提供了用于測定GPCR寡聚體的功能特性，包括測定潛在的配體的材料和方法。術語GPCR在本領域中眾所周知且指的是任意細胞表面跨膜蛋白，當被合適的化合物活化時，它由此活化鳥嘌呤核苷酸結合蛋白(G-蛋白)。
本發明在第一個方面中提供了包括GPCR寡聚體的生物學試劑，所述的GPCR寡聚體含有(a)與第一種G-蛋白結合的第一種GPCR，其中相對于結合的第一種G-蛋白而言，第一種GPCR為非功能性的；(b)與第二種G-蛋白結合的第二種GPCR，其中第二種G-蛋白為非功能性的。
術語“非功能性”指的是與野生型相反，蛋白質(GPCR或G-蛋白)不能執行特定的生物功能。因此，GPCR相對于G-蛋白而言為非功能性的這一事實指的是它相對于G-蛋白而言不能執行其野生型的生物功能，即不能在配體結合后活化G-蛋白。優選野生型的其它生物功能特征(例如配體結合)得到保持。
同樣，非功能性G-蛋白不能執行其野生型生物功能，即在來自GPCR的刺激后不能啟動細胞信號級聯放大。
第一種和第二種GPCR形成寡聚體的能力使得功能性的第二種GPCR接觸功能性的第一種G-蛋白的環境。功能性GPCR隨之能夠活化功能性G-蛋白，而活化的G-蛋白由此產生細胞信號級聯放大。
第一種和第二種GPCR可以相同，即均-寡聚體，例如均二聚體、均三聚體或高級寡聚體；或第一種和第二種GPCR可以不同，即雜-寡聚體，例如雜二聚體、雜三聚體或高級寡聚體。
理想的情況是，所述的寡聚體存在于細胞膜中。如果第一種和第二種GPCR及其結合的G-蛋白在細胞中得到共表達，那么可以便利地實現這一目的。因此，需要GPCR及其G-蛋白彼此結合為融合蛋白。然而，本領域技術人員理解其它結合方式是可能的。例如，可以通過偶聯方式，諸如結合對、化學鍵等或單純通過在細胞環境中的自然結合使蛋白質彼此結合。
本發明還提供了用于生產第一個方面的生物學試劑且特別是用于本發明方法的突變體GPCR/天然G-蛋白融合蛋白(即包括修飾的非功能性GPCR/功能性G-蛋白)以及相應的核酸構建體。可以對蛋白質序列進行較少的修飾，例如，可以將附加表位添加到受體的N-末端，導入間隔節段，以便在GPCR蛋白質序列與G-蛋白序列之間產生缺口和/或除去G-蛋白基因的末端甲硫氨酸。本領域技術人員可以預計許多這類修飾，條件是在受體/G-蛋白融合蛋白的使用過程中的功能性基本上保持不受影響。
此外，本發明提供了如本文所述的突變體GPCR/G-蛋白融合蛋白在本發明方法中的應用(即包括修飾的非功能性GPCR/功能性G-蛋白或功能性GPCR/非功能性G蛋白)。
本發明的核酸構建體包括核酸，一般為編碼符合讀框的融合的特定受體的DNA、RNA、mRNA或cDNA，即編碼G-蛋白的合適的核酸序列。一般來說，通過表達載體在細胞中表達所述的核酸構建體。
因此，還提供了包括GPCR寡聚體的細胞，所述的GPCR寡聚體含有(a)與第一種G-蛋白結合的第一種GPCR，其中相對于結合的第一種G-蛋白而言，第一種GPCR為非功能性的；(b)與第二種G-蛋白結合的第二種GPCR，其中第二種G-蛋白為非功能性的。
一般來說，所述的細胞來源于真核生物，包括酵母，諸如脊椎動物來源，包括兩棲動物和哺乳動物(尤其是人)且選擇的表達載體為適合于在特定細胞類型中表達的載體。合適的細胞和表達載體在下文中更詳細地討論。
為了所述的生物學試劑可以用于測定GPCR寡聚體的天然特性的試驗，重要的是保持存在于GPCR上的任何配體結合位點。因此，優選第一種GPCR僅相對于結合的第一種G-蛋白而言被賦予非功能性。換句話說，第一種GPCR保持任何它必須結合配體，但不能在配體結合后活化G-蛋白的能力。當然，GPCR的實際組合可以改變配體結合位點的特性，而這一結果是寡聚化形成后可能天然發生的情況的反映而不應該是人工操作的結果。
就第二種G-蛋白而言，優選它至少相對于第二種GPCR而言被賦予非功能性，即使得它不能對GPCR發送的信號起作用。因此，為了使所述的生物學試劑用于試驗，重要的是第二種G-蛋白被賦予的非功能性至少達到不能活化細胞信號，即不能以功能方式結合GTP和啟動GPCR信號級聯放大的程度。
本發明人已經發現，對G11αG-蛋白而言，例如，可以通過替換使這些G-蛋白所共有的甘氨酸208突變，以便使G-蛋白成為非功能性的。
因此，優選通過至少一種氨基酸替換修飾第二種G-蛋白，其中所述的至少一種氨基酸為等同于G11α中的甘氨酸208的甘氨酸。
如上所述，優選修飾第一種GPCR以便使它僅相對于G-蛋白而言被賦予非功能性。分子生物學領域的發展已經能夠極為特異性地修飾蛋白質的氨基酸序列以便維持某些功能(例如結合配體的能力)，同時破壞其它功能(例如活化G-蛋白的能力)。本發明人已經發現，GPCR的第2胞內環中高度保守的殘基特別適合于突變，因為它們使受體相對于其結合的G-蛋白而言成為基本上非功能性的。具體地，本發明人已經發現，該區中一個或多個殘基的突變使GPCR相對于G-蛋白而言成為非功能性的(即G-蛋白未被活化)，但仍然能夠結合配體。下文中更詳細地討論對GPCR的突變。
本發明在第二個方面中提供了生產第-個方面的生物學試劑的方法，所述的方法包括下列步驟(a)生產或提供編碼第一種GPCR和第一種G-蛋白的融合蛋白的第一種核酸構建體，其中第一種GPCR與野生型相比得到突變，使得它相對于融合的G-蛋白而言為非功能性的；(b)生產或提供編碼第二種GPCR和第二種G-蛋白的融合蛋白的第二種核酸構建體，其中第二種G-蛋白與野生型相比得到突變，從而使它成為非功能性的；(c)在細胞中共表達第一種和第二種核酸構建體，以便生產包括所述的第一種和第二種GPCR的GPCR寡聚體。
如果已經產生了第一種和第二種核酸構建體，那么該方法可以簡單地包括下列步驟(a)在細胞中表達第一種核酸構建體，所述的核酸構建體編碼第一種GPCR/G-蛋白融合蛋白，其中GPCR與天然GPCR相比得到突變，由此使它相對于其G-蛋白而言成為非功能性的；(b)在所述細胞中表達第二種核酸構建體，所述的第二種核酸構建體編碼第二種GPCR/G-蛋白融合蛋白，其中G-蛋白與天然G-蛋白相比得到突變，由此使它成為非功能性的；(c)使所述的第一種和第二種融合蛋白在細胞膜中裝配成GPCR寡聚體。
該方法可以進一步包括分離包括所述復合物的一部分細胞膜的步驟。可以通過溶解所述細胞并分離細胞膜完成該步驟。
如上所述，第一種GPCR和第二種GPCR可以相同(均-寡聚體)或不同(雜-寡聚體)。
本發明人認為為了使第一種和第二種GPCR形成寡聚體，它們必須彼此具有一定的親和性。因此，本發明人已經設計了一種可以測定這種親和性的方法。因此，作為本發明的第三個方面，提供了彼此具有親和性以便形成復合物(GPCR寡聚體)的第一種和第二種GPCR的測定方法，所述的方法包括下列步驟(a)生產或提供編碼作為融合蛋白的第一種GPCR及其結合的G-蛋白的第一種核酸構建體，其中GPCR與野生型相比得到突變，使得它相對于其結合的G-蛋白而言為非功能性的；(b)生產或提供編碼第二種GPCR及其結合的G-蛋白的第二種核酸構建體，其中G-蛋白與野生型G-蛋白相比得到突變，使得它為非功能性的；(c)在細胞中共表達所述的第一種和第二種核酸構建體；和(d)確定包括所述的第一種和第二種GPCR的復合物的存在。
可以通過使所述細胞與用于所述第二種GPCR的配體接觸并測定所述第一種G-蛋白是否被活化來確定包括所述的第一種和第二種GPCR的GPCR寡聚體的存在。
如上所述，所述的第一種和第二種GPCR可以不同。在它們不同的情況下，優選它們天然出現在同一細胞上。這能夠合理地預計實際上形成所述的寡聚體。由于這一原因，所以所述的方法可以進一步包括測定哪些GCPRs存在于特定細胞類型上，即對同一細胞而言為內源性的起始步驟。因為充分地表征了許多GPCR，所以可以通過篩選特定細胞的基因產物，例如基于芯片的篩選或技術，諸如rt-PCR，隨后通過測序來完成這一步驟。
測定彼此具有親和性，即能夠形成寡聚體的GPCR在藥理學上具有顯著的重要性。例如，兩種受體形成寡聚體(雜或均)的能力可以為組織特異性的。因此，這些組織特異性GPCR寡聚體可以形成重要的藥物靶物。表1中表示了可能與每一細胞類型相關的典型醫學含義。
生產本發明的生物學試劑首次開辟了各種篩選試驗的可能性，這些試驗提供測定寡聚體功能，特別是在配體結合和隨后的細胞信號級聯放大方面的功能的便利和可靠的方式。
例如，在本發明的第四個方面中提供了檢測化合物對GPCR寡聚體具有的作用的方法，包括下列步驟a)提供包括本發明第一個方面的生物學試劑的細胞或細胞膜；b)使化合物與所述細胞或細胞膜接觸；和c)觀察所述化合物對GPCR寡聚體，特別是對GPCR寡聚體的信號傳導具有的作用。
本發明的該方面中還提供了鑒定能夠與GPCR寡聚體發生相互作用的化合物的方法，所述的方法包括下列步驟a)生產表達GPCR寡聚體的細胞，所述的GPCR寡聚體包括(i)與第一種G-蛋白結合的第一種GPCR，其中第一種GPCR相對于結合的第一種G-蛋白而言為非功能性的；(ii)與第二種G-蛋白結合的第二種GPCR，其中第二種G-蛋白為非功能性的；b)使所述細胞或分離的其細胞膜與所述化合物接觸；c)測定所述化合物是否與GPCR寡聚體發生相互作用。
應理解包括GPCR寡聚體的細胞或細胞膜還包括非功能性或基本上非功能性的GPCR，例如包括第一種或第二種GPCR(i或ii)的單體；第一種GPCR的二聚體(i/i)；或第二種GPCR的二聚體(ii/ii)。本發明的優點在于這些單體或二聚體的形成不會影響篩選方法的結果，這是因為，由于對第一種和第二種GPCR進行了突變，所以唯一的功能受體(能夠刺激G-蛋白和啟動信號級聯放大)為包括至少第一種和第二種GPCR的寡聚體。因此，任何單體或均-寡聚體(即兩種第一種GPCR或兩種第二種GPCR)與包括至少第一種GPCR和第二種GPCR的寡聚體相比均不具有除可能的本底活性外的活性。
本底活性被理解為指的是低于20％、15％、10％或優選5％的天然或野生型活性。
化合物在試驗中與GPCR寡聚體的相互作用可以導致許多生物事件中的一種或多種。例如，相互作用可以導致配體結合位點的構象改變。這可以改變受體的天然配體的功效。另一方面，化合物與GPCR寡聚體的相互作用可以產生細胞受體信號級聯放大，表明化合物為潛在的激動劑。該化合物可以結合到存在于天然GPCR單體上的配體結合位點上或它可以結合到作為GPCR寡聚化結果生成的新結合位點上。
本發明第四個方面的方法可以用于測定能夠結合GPCR寡聚體的新配體(激動劑、拮抗劑等)。可能的情況是這些配體不同于能夠結合GPCR寡聚體的那些配體，可能的情況是這些配體不同于能夠結合和活化相應GPCR單體的那些配體，或可能的情況是結合作用與各單體的結合作用可以不同。例如，與相應單體相反，配體與寡聚體結合可以產生改變的信號，例如增加或減少的信號，或可以導致不同的活化細胞途徑。使用第四方面的方法可以測定所有這些受體寡聚體特性。
此外，所述化合物在試驗中可以具有阻滯GPCR寡聚體的已知配體，例如激動劑的能力。為了測定這一情況，可以使化合物在有已知配體存在下與細胞接觸并將配體活化GPCR的能力與其在沒有所述化合物存在下活化GPCR的能力進行比較。
因此，本發明進一步提供了鑒定具有調節GPCR寡聚體與其配體結合能力的化合物的方法，所述的方法包括a)生產或提供表達GPCR寡聚體的細胞，所述的GPCR寡聚體包括(i)與第一種G-蛋白結合的第一種GPCR，其中第一種GPCR相對于結合的第一種G-蛋白而言為非功能性的；(ii)與第二種G-蛋白結合的第二種GPCR，其中第二種G-蛋白為非功能性的；b)使所述細胞在有所述配體存在下與所述化合物接觸；c)將所述配體結合GPCR寡聚體的能力與所述配體在相差無幾條件，但沒有所述化合物存在下結合GPCR的能力進行比較。
因此，所述化合物可以具有競爭性抑制配體與GPCR結合的能力或它實際上可以導致結合增加和/或受體刺激增加作為配體結合的結果，即它增加了配體的功效。
一種可能性在于第三種GPCR可以與GPCR寡聚體復合并具有變構效應。當化合物為第三種GPCR時，可以通過上述方法測定這種作用。在這種情況中，優選在至少一種細胞類型中內源性共表達野生型第三種GPCR與野生型第一種和第二種GPCR。
如上所述，能夠在兩種GPCR形成寡聚體時，其相應的配體結合位點可以改變和/或形成新的配體結合位點。這些結果可能具有顯著的藥理學重要性。因此，作為第五個方面，本發明進一步提供了用于確定不存在于相應單體上的GPCR寡聚體上的新的或改變的配體結合位點存在的方法，所述的方法包括下列步驟a)使化合物與表達GPCR復合物的第一種細胞接觸，所述的GPCR復合物含有(i)與G-蛋白結合的第一種GPCR，其中第一種GPCR被修飾，使得它相對于所述G蛋白而言為非功能性的；和(ii)與G-蛋白結合的第二種GPCR，其中G-蛋白被修飾，使得它為非功能性的；b)使所述化合物與表達未修飾的第一種GPCR單體的第二種細胞接觸；和c)將化合物對第一種細胞和第二種細胞的作用進行比較以便確定由GPCR寡聚體產生的新的或改變的配體結合位點的存在。
如果GPCR寡聚體為雜-寡聚體，即它包括至少兩種不同的GPCR，則所述方法可以進一步包括下列步驟使化合物與表達未修飾的第二種GPCR單體的第三種細胞接觸并再次比較化合物對第三種細胞的作用以便確定作為兩種或多種GPCR寡聚化結果產生的新的或改變的配體結合位點的存在。
優選分別通過重組方式在所述第二種或第三種細胞中表達未修飾的(即功能性)第一種和第二種GPCR單體。
可以根據特定化合物能夠在接觸寡聚體，但不接觸相應的單體時在細胞中產生受體信號級聯放大這一事實確定新的配體結合位點的存在。
可以根據作為寡聚體與相應單體之間的受體信號級聯放大改變，例如信號增加或減少和/或信號傳導途徑改變這一事實測定改變的配體結合位點的存在。
化合物對第一種或第二種細胞的“作用”包括其結合GPCR寡聚體的能力(例如，通過標記化合物測定)及其啟動細胞信號級聯放大的能力(例如，通過檢測信號傳導途徑中的化合物活性的改變測定)。
盡管各種配體結合位點在受體寡聚化后保持不變，但是可以發生受體功能的其它改變。
因此，本發明進一步提供了用于確定作為形成GPCR寡聚體結果的GPCR功能改變的方法，所述的方法包括a)使化合物與表達GPCR寡聚體的第一種細胞接觸，所述的GPCR寡聚體含有(i)與G-蛋白結合的第一種GPCR，其中第一種GPCR被修飾，使得它相對于所述G蛋白而言為非功能性的；和(ii)與G-蛋白結合的第二種GPCR，其中G-蛋白被修飾，使得它為非功能性的；b)使所述化合物與表達未修飾的第一種GPCR的第二種細胞和/或表達未修飾的第二種GPCR的第二種細胞接觸；和c)將所述GPCR寡聚體的功能與所述未修飾的第一種GPCR的功能和/或與所述第二種GPCR的功能進行比較以便確定因寡聚化導致的受體功能改變。
在上述用于測定能夠活化GPCR寡聚體的化合物(例如第四個方面)和用于測定因GPCR寡聚化導致的新的或改變的配體結合位點的存在(例如第五個方面)的方法中，本領域技術人員可以選擇使第一種和第二種GPCR再突變以便再次測定配體結合的改變。操作GPCR蛋白質完全屬于本領域技術人員的能力范圍。例如，就本發明的所有方面而言，能夠將GPCR融合蛋白再修飾成組成型活性形式。美國專利US6,555,339(引入本文作為參考)和PCT/US98/07496、WO 98/46995(引入本文作為參考)中提供了用于以組成型方式活化GPCR序列的方法實例。
本發明的生物學試劑還能夠測定單體、均-寡聚體和雜-寡聚體之間的差異性G-蛋白偶聯。
作為實例，本發明允許用于評價的方法得以實施，以便評價與雜二聚體(例如AB或BA)相比均二聚體(例如AA或BB)是否與不同的G蛋白偶聯，該方法包括下列步驟(a)生產或提供多個融合蛋白，它們各自包括一種與多個不同G蛋白之一融合的GPCR(例如A和B)，所述的不同G蛋白包括所有主要的G-蛋白類別(例如Gs、Gq和Gi)。例如，一對含有通過在與Gs融合的第2胞內環中突變而失活的受體。在該對中的第二種受體含有與突變的Gs融合的功能受體，以便突變使G蛋白失活。
第二對含有通過在與Gq融合的第2胞內環中突變而失活的受體。在該對中的第二種受體含有與突變的Gq融合的功能受體，以便突變使G蛋白失活。
第三對含有通過在與Gi融合的第2胞內環中突變而失活的受體。在該對中的第二種受體含有與突變的Gi融合的功能受體，以便突變使G蛋白失活。
可以按照類似方式評價其它G蛋白，諸如G12和G13。
(b)生產或提供每種G蛋白的對照融合蛋白，它們帶有未修飾的完整功能受體(A或B)和未修飾的完整功能G-蛋白。
因此，對任意一種G蛋白而言，可以制備幾種構建體(a)受體突變的受體A與完整功能Gs、Gi和/或Gq融合；(b)受體為功能性的受體B與突變的Gs、Gi和/或Gq融合；(c)受體為功能性的受體A與突變的Gs、Gi和/或Gq融合；(d)受體突變的受體B與完整功能Gs、Gi和/或Gq融合；(e)制備受體A和B各自的Gs、Gi和Gq的完整功能融合體。
可以進行幾種細胞轉染以便比較各自的相關偶聯。例如。為了比較Gs在均二聚體與雜二聚體之間的偶聯效力，進行如下步驟(a)用上述a)和b)的組合轉染第一種細胞。
(b)用上述c)和d)的組合轉染第二種細胞。
(c)用受體A的完整功能融合體轉染第三種細胞。
(d)用受體B的完整功能融合體轉染第四種細胞。
比較各組合的反應以評價受體A和B的激動劑功效和組成活性。對每種G蛋白重復該方法。
Jurgen Wess(《藥物療法》(Pharm.Ther.)80卷，3期，1998)中提供了有關受體/G-蛋白-偶聯選擇性的分子基礎，將該文獻引入本文作為參考。


現在通過參照附圖以實例的方式解釋本發明的方面和實施方案。其它方面和實施方案對本領域技術人員而言顯而易見。將文本中提及的所有對比文件引入本文作為參考。
圖1表示如何預計發生突變體對對功能的重組的示意圖。該附圖以使用與一般使胞內鈣濃度升高的G蛋白融合的GPCR為典型。
圖2表示為何僅寡聚體(在這種情況中為二聚體)GPCR/G-蛋白融合體為功能性的且均聚形式為非功能性的示意圖。
圖3表示不同A類GPCR及其結合的G-蛋白以及GPCR的第2胞內環中適合于突變的殘基(突出顯示的)的代表。
圖4表示α1b-腎上腺素受體-G11α融合蛋白的不同非功能性突變體對重組功能。
A.將表達40(I-IV)或80(V)fmol的各種α1b-腎上腺素受體-G11α融合蛋白的HEK293細胞膜用于測定在沒有(空心條)或有(實心條)10μM去氧腎上腺素存在下的[35S]GTPγS結合。(1)野生型α1b-腎上腺素受體-G11α；(2)α1b-腎上腺素受體-Gly208AlaG11α；(3)Leu151Aspα1b-腎上腺素受體-G11α；(4和5)α1b-腎上腺素受體-Gly208AlaG11α+Leu151Aspα1b-腎上腺素受體-G11α。
B.Leu151Aspα1b-腎上腺素受體-G11α和α1b-腎上腺素受體-Gly208AlaG11α僅在它們被共表達時重組功能。測定HEK293細胞膜中沒有(空心條)或有(實心條)10μM去氧腎上腺素存在下的[35S]GTPγS結合，其中共表達Leu151Aspα1b-腎上腺素受體-G11α和α1b-腎上腺素受體-Gly208AlaG11α(1)；或其中在膜制備前混合的分離的細胞群中表達兩種構建體(2)；或分別由它們制備膜且然后在試驗前混合(3)。
圖5表示組胺H1受體-G11α融合蛋白的不同非功能性突變體對也可以重組功能。將表達25(1-4)或50(5)fmol的各種組胺H1受體-G11α融合蛋白的HEK293細胞膜用于測定在沒有(空心條)或有(實心條)1mM組胺存在下的[35S]GTPγS結合。(1)野生型組胺H1受體-G11α；(2)組胺H1受體-Gly208AlaG11α；(3)Leu133Asp組胺H1受體-G11α；(4和5)組胺H1受體-Gly208AlaG11α+Leu133Asp組胺H1受體-G11α。
圖6表示單個細胞中的GPCR二聚化和功能重組。轉染EF88(來源于動物的小鼠胚胎成纖維細胞，其中使編碼鈣質動用G蛋白Gqα和G11α的基因失活)細胞以表達GPCR-G11α融合蛋白和GFP并監測激動劑配體升高胞內Ca2+的能力。
A.用GFP和組胺H1受體-G11α(黑色，n＝6)、組胺H1受體-Gly208AlaG11α(藍色，n＝10)、Leu133Asp組胺H1受體-G11α(綠色，n＝12)以及組胺H1受體-Gly208AlaG11α和Leu133Asp組胺H1受體-G11α(紅色，n＝8)轉染EF88細胞。然后測定GFP陽性細胞對1mM組胺的反應。N＝定量的各細胞數。
B.僅正轉染的細胞對激動劑有反應。用野生型組胺H1受體-G11α融合體與GFP共轉染細胞。在所示的視野中，僅單個細胞表達GFP(左)。然后在這些細胞中監測基線(中央)和1mM組胺(右)刺激的Ca2+。較暖色表示[Ca2+]升高。僅在表達GFP的細胞中觀察到熒光增加(較暖色)。
圖7表示單個細胞中的GPCR二聚化和功能重組。具體地，該附圖表示兩種不同的GPCR形成寡聚體，即雜-寡聚體的能力。
A.轉染EF88細胞以共表達與野生型G11α融合的組胺H1受體的非功能形式(Leu133Asp)和與G11α的失活形式(Gly208Ala)融合的α1b-腎上腺素受體的野生型形式。這兩種GPCR-G蛋白融合體在單獨被表達時都是無活性的，因為它們各自形成非功能性的均二聚體。用GFP共轉染允許檢測正轉染的細胞。添加去氧腎上腺素(10μM)導致胞內鈣濃度升高，而添加組胺(1mM)使鈣濃度幾乎沒有改變或無改變。這一結果僅可以反映出激動劑去氧腎上腺素占據α1b-腎上腺素受體導致與失活的組胺H1受體以物理方式連接的野生型G11α活化并反映出功能性的α1b-腎上腺素受體-組胺H1受體雜二聚體的存在。
B.也按照類似方式轉染EF88細胞以共表達與野生型G11α融合的α1b-腎上腺素受體的非功能形式(Leu151Asp)和與G11α的失活形式(Gly208Ala)融合的組胺H1受體的野生型形式。在這種形式中，添加去氧腎上腺素(10μM)使鈣濃度幾乎沒有改變或無改變，而添加組胺(1mM)導致胞內鈣升高。
圖8表示GPCR和GPCR-G蛋白融合體的差別表位標記形式的共免疫沉淀并證實向GPCR的C-末端尾添加G蛋白不會防止二聚化。
A.α1b-腎上腺素受體構建體。
B.組胺H1受體構建體。模擬轉染HEK293細胞(對照組)或轉染HEK293細胞以表達FLAG、c-myc或分離的GPCR或GPCR-G蛋白融合體的兩種表位標記形式的組合(FLAG+myc)。還混合了表達FLAG或c-myc標記形式的細胞(混合物)。用抗-FLAG抗體對樣品進行免疫沉淀，通過SDS-PAGE分離這些沉淀并用抗c-myc抗體對其進行免疫印跡。
圖9表示trFRET顯示了GPCR和GPCR-G蛋白融合體的細胞表面寡聚體。
A.α1b-腎上腺素受體構建體。
B.組胺H1受體構建體。分別轉染HEK293細胞(混合物)以表達分離的GPCR或GPCR-G蛋白融合體的FLAG或c-myc標記形式。然后將這些細胞彼此混合。還轉染了HEK293細胞以共表達分離的GPCR或GPCR-G蛋白融合體的FLAG或c-myc表位標記形式(共轉染)。然后使細胞接觸Eu3+-標記的抗-c-myc抗體和別藻藍蛋白標記的抗-FLAG抗體(參見方法)。然后如McVey等(2001)所述監測能量傳遞。能量傳遞與形成物理復合物(二聚體)的FLAG和c-myc標記的多肽類一致。當在不同細胞中表達時，FLAG與c-myc標記多肽類之間的距離過大而無法進行有效的能量傳遞，且在不同細胞中時，它們不能發生相互作用。這些實驗由此起到陰性對照的作用。
圖10表示非功能性GPCR-G蛋白融合蛋白對的共表達應產生50％的活性二聚體。如果在單個細胞中共表達兩種不同的GPCR或GPCR-G蛋白融合體且A與A相互作用的親和力與在A與B之間的相同，那么必然隨機推測到AA、AB、BA和BB以等摩爾量存在。正如圖2中所示，本發明人研發的方法確保了AA和BB不會對添加A或B的配體產生功能性反應。然而，AB和BA在添加A或B的配體時可能具有功能性(參見圖7C)。因此，預計在共表達A和B后形成的二聚體中僅有50％為功能性的且它們是不同突變的融合蛋白的組合，例如AB或BA。
圖11表示α1b-腎上腺素受體和組胺H1受體可以形成雜二聚體復合物。
A.在HEK293細胞中分別或共同(flag+myc)表達了組胺H1受體的FLAG-標記形式(flag H1)和α1b-腎上腺素受體的c-myc-標記形式(mycα1b)。還在分析前混合了各自表達兩種構建體的細胞。用抗-FLAG對樣品進行免疫沉淀并在SDS-PAGE和傳遞后，用抗-c-myc-抗體對其進行免疫印跡。
B.用Eu3+-標記的抗-c-myc和APC-標記的抗-FLAG抗體的組合處理共表達FLAG H1和c-myc α1b(實心條)的細胞或表達然后混合的這兩種構建體中的任一種的單獨的細胞群并且測定tr-FRET。
圖12表示α1b-腎上腺素受體的失活形式的共表達可抑制組胺H1受體-G11α融合蛋白的信號傳導。
轉染HEK293細胞以表達組胺H1受體-G11α融合蛋白并與增加量的編碼分離的失活Leu151Aspα1b-腎上腺素受體的cDNA一起表達。(A)將來自這些細胞的膜用于測定組胺H1受體-G11α融合蛋白的表達且將含有25fmol特異性[3H]美吡拉敏結合位點的量用于測定基線和1mM組胺-刺激的[35S]GTPγS結合。(B)轉染EF88細胞以表達組胺H1受體-G11α融合蛋白(1)或與Leu151Aspα1b-腎上腺素受體一起共表達。然后評價1mM組胺升高細胞[Ca2+]i的能力。數據代表平均值+/-S.E.M.n＝6。
圖13表示過量膜定向G11α的供給不會引起表達非功能性突變體對的細胞中的功能重組。轉染HEK293細胞以表達c-myc-標記的α1b-腎上腺素受體-G11α融合蛋白(1)；與α1b-腎上腺素受體的N-末端和第一個跨膜區的c-myc-標記形式的C-末端連接的G11α(2)；α1b-腎上腺素受體和c-myc-Nt-TM1α1b-G11α構建體(3)；或c-myc-Nt-TM1α1b-G11α和α1b-腎上腺素受體-Gly208AlaG11α融合蛋白(4)。(A)通過SDS-PAGE分離膜樣品并用抗-c-myc抗體進行免疫印跡。(B)基線(空心條)和10μM去氧腎上腺素刺激(實心條)的[35S]GTPγS結合在抗-c-myc免疫沉淀物中恢復。
詳細描述圖1表示本發明人預計由突變體對產生功能重組如何可以發生而由此形成功能性寡聚體的代表。正如可以觀察到的，功能性寡聚體由如下成分構成第一種融合蛋白(a)，包括天然GPCR和突變體G-蛋白；和第二種融合蛋白(b)，包括突變體GPCR和天然G-蛋白。當這兩種融合蛋白合并時，GPCR信號級聯放大的功能活化通過結合第一種融合蛋白的天然GPCR的激動劑配體發生且功能偶聯和信號傳導通過第二種融合蛋白的G-蛋白進行。
圖2表示如何預計形成非功能性均二聚體。非功能性均二聚體包括兩種天然GPCR和兩種突變體G-蛋白(a)或兩種突變體GPCR和兩種天然G-蛋白(b)。在各自的情況中，均二聚體的兩種形式在合適的配體結合GPCR時不能產生功能性信號傳導。
GPCR和結合的G-蛋白GPCR和G-蛋白可以為任意合適的GPCR/G-蛋白組合。GPCR的非限制性實例可以在http//www.gpcr.org/7tm/上找到。優選GPCR和G-蛋白來源于哺乳動物，更優選來源于人。典型的G蛋白偶聯受體例如為多巴胺受體、毒蕈堿性膽堿能受體、α-腎上腺素能受體、β-腎上腺素能受體、阿片受體、大麻素受體、5-羥色胺受體、促生長素抑制素受體、腺苷受體、內皮受體、趨化因子受體、黑皮質素受體、神經肽Y(NPY)受體、GnRH受體、GHRH受體、TSH受體、LH受體和FSH受體。在如下文獻中描述了可以用于本發明的其它GPCR(與其配體)S.P.H.Alexaqnder & J.A.Peters編譯的《藥理學科學趨勢離子通道命名法增刊》(Trends in Pharmacological SciencesIonChannel Nomenclature Supplement)，第11版，Current Trends，London，UK 2000；和《受體分類與信號轉導RBI手冊》(The RBIHandbook of Receptor Classification and Signal Transduction)，K.J.Watling，J.W.Kebabian，J.L.Neumeyer，eds.ResearchBiomedicals International，Natick，Mass.，1995.Vassilatis等PNAS，2003年4月，100卷，4903-4908。將這些參考文獻引入本文作為參考。
就本發明的所有方面而言，優選的情況是，當第一種與第二種GPCR不同時，它們被至少一種細胞類型內源性共表達。
目前將GPCR分成3個主要類別-A、B & C。A類也稱作視紫紅質-類或視紫紅質族受體；B類為促胰液素類受體；C類為促代謝(metabotropic)受體。盡管它們均為GPCR，但是這三族不具有序列相似性且看起來已經成為趨同進化的實例。A類的實例包括諸如腎上腺素、組胺、多巴胺和5-羥色胺這類兒茶酚胺類的受體以及(神經)肽類，包括阿片樣活性肽、神經激肽、食欲素等的受體。嗅感受器也為該組的組成部分。B類受體總計大約有65種且C類受體約有18種，它們包括GABAb受體、鈣傳感受體和7種促代謝谷氨酸受體的族。存在最終仍然分類為GPCR的其它族蛋白質。它們包括“卷曲的”受體族和″Methuselah″受體。
G-蛋白可以為任意能夠與GPCR結合/偶聯的G-蛋白。G-蛋白優選具有調節Ca2+、cAMP、cGMP、肌醇1，4，5三磷酸、二酰基甘油、蛋白激酶C活性或MAP激酶活性的胞內水平的能力。
例如，Gi、Go或Gz的活化導致cAMP的胞內水平下降。Gq、G11、G15或G16的活化導致肌醇1，4，5三磷酸和Ca2+的胞內水平增加。
G-蛋白還可以選自Gi、Go、Gz、G11、G12、G13、G15、G16、Gs和Gq組成的組。
除本文鑒定的外，在本領域技術人員的讀者的知識范圍內可以基于序列信息充分鑒定其它GPCR。所有GPCR均帶有7個足以通過質膜的長度(20-25個氨基酸)的高度疏水區。其中基本上始終存在某些氨基酸。例如，在A類GPCR中，實際上始終存在序列天冬氨酸-精氨酸-酪氨酸或極為相似的某些序列(因天冬氨酸(D)-精氨酸(R)-酪氨酸(Y)的單字母氨基酸代碼而稱作DRY結構域)。本領域技術人員還可以使用諸如″Hidden Markov″法這類數學算法進行檢索以鑒定其它GPCR。
適宜的情況是，所述的GPCR可以為A類GPCR，其實例與它們結合的G-蛋白如圖3中所示。
GPCR和G-蛋白的修飾圖3還表示了GPCR的第2胞內環中例如適合于突變和賦予GPCR基本上非功能性的高度保守的殘基。本發明人已經證實使這些殘基突變可以特別有效地使GPCR失活，但仍然能夠結合配體。此外，因為疏水殘基為高度保守的，所以預計可以按照這種方式使所有A類GPCR突變以使它們失活。一般來說，殘基為疏水殘基，例如，可以通過本領域中公知的定點誘變技術使疏水殘基突變成酸性殘基。然而，可以進行使GPCR功能失活或基本上功能失活的任意其它突變且關于測定雜二聚體活性可以使用下文所述的試驗檢測其活性/缺乏活性。即，可以對誘變的GPCR進行用于天然GPCR的功能性試驗，以便在誘變處理后確定多少程度的活性保留下來。如果第一個循環的誘變不足以使GPCR失活，可以再進行一次誘變循環并在此后檢測活性。
還能夠進行隨機誘變或應用分子進化且然后檢測突變體活性。此外，G蛋白的晶體結構是已知的且根據它鑒定重要的殘基，以便可以進行定向誘變。
本領域技術人員可以使用公眾可得到的互聯網站(http//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)鑒定具有GPCR結構的跨膜結構域。它允許進行定點誘變以確定使GPCR失活，但仍然能夠結合配體的突變體。可以將第2胞內環(IC2)定義為跨膜(TM)3與TM4之間的多肽節段。該站點至少可以在鑒定相鄰的GPCR氨基酸序列方面提供指導，所述相鄰的GPCR氨基酸序列需要與圖3中的IC2序列進行序列對比以便進行類似的突變。
一般通過使結合的G-蛋白與受體融合修飾本文所述的膜GPCR。一般可以使編碼G-蛋白的核酸與編碼已經消除了終止密碼子的特定GPCR的基因的3′末端進行符合讀框的融合。以這種方式，在表達核酸時，對報道蛋白進行功能表達并使其與GPCR的C-末端融合。修飾該受體使得膜受體的功能性基本上保持不受G-蛋白與該受體融合的影響。
可以對G-蛋白進行的突變可以為賦予G-蛋白非功能性的任意合適的突變(即不能與GTP功能性結合和啟動GPCR信號級聯放大)。此外，本領域技術人員易于使用本文所述的試驗測試這種突變。可以進行的一種合適的突變為例如使G11α的208位上的甘氨酸突變成丙氨酸。所有G-蛋白均在208位，或等同位點/殘基上帶有甘氨酸且由此可以預計等同的突變使其它G-蛋白失活。易于鑒定其它合適的突變，因為它們可以影響使蛋白質結合和水解GTP的序列。迄今為止，已經觀察到G-蛋白序列通過進化為高度保守的且所鑒定的在使蛋白質結合和水解GTP中所涉及的序列為高度保守的。
因此，相對直接的任務在于能夠使任意受體(天然的或突變體)與合適的G-蛋白(天然的或突變體)偶聯。
組成型活性的GPCR和功能基因組在當今的藥物研發中可能最具挑戰的步驟涉及靶物的確立。近年來已經獲得成果的大量的公開的和非公開的人類基因組測序工作提供了用于藥物研發的空前數量的基因靶物。解密這些基因靶物的功能性，且最重要的是它們的潛在治療關聯性作為研發下一代治療劑的基礎具有高度前瞻性。這種挑戰的等級并不比在較大數量的新基因已經得到鑒定的GPCR基因族內的挑戰大。由于已經鑒定了在所關注的組織內表現出高度或選擇性表達的GPCR，所以能夠進一步將分析改進至細胞水平。這一過程可能涉及使用RNA探針和抗體以便對表達任意所關注的GPCR的組織內的細胞群作圖。
就沒有鑒定的配體的孤獨GPCR而言，可以將受體的組成型活性形式用作進一步研究其功能作用的工具。這類手段本質上模擬了配體刺激對靶GPCR的作用。例如，已經鑒定了在胰腺B細胞中選擇性表達的孤獨GPCR作為鑒定調節胰島素分泌的潛在靶物的手段。在體外系統中檢驗一種這類受體“胰島受體1”的組成型活性形式證實該受體與合適的細胞信號傳導分子(腺苷酸環化酶)偶聯以便調節胰島素釋放。此外，在產生胰島素的細胞系中利用這種組成型活性受體證實該受體的活性形式促進了葡萄糖敏感性胰島素釋放。這些數據提供了支持研發“胰島1”GPCR激動劑作為調節胰島素釋放的手段的高度建設性信息。
為了全面地檢驗GPCR表達，寡核苷酸GPCR芯片已經由ArenaPharmaceuticals Inc.，6166 Nancy Ridge Drive，San Diego，CA92121，USA.合成，它含有所有可得到的人GPCR序列以及用于細胞功能和疾病狀態的標記。這種手段能夠快速鑒定大規模通過各種人體組織的GPCR的基因表達特性。還可以應用簇叢分析以鑒定可以顯示功能作用的基因表達的組織特異性模式。評價GPCR和相關信號傳導分子的組織分布由此可以闡明受體信號傳導轉導胞外刺激的分子機制的復雜性。對人類基因組的測序帶來了新的途經，通過這種途經，可以采取整體法來研究GPCR信號傳導的寬度。目前據估計GPCR超家族由600-1000個受體組成。微陣列技術的出現考慮到了對受體族進行大規模取樣。這項技術允許人們在指定樣品中同時監測數以千計的基因的信息水平。對通過一大組組織的這些基因的轉錄水平進行評價由此可以對人體內GPCR的信號傳導提供整體見解。
適合于表達修飾的GPCR和G-蛋白的細胞各種細胞可以用于表達編碼本發明融合蛋白的核酸構建體。將可以轉染以表達修飾的GPCR的所有細胞看作屬于本發明的范圍。這類細胞的實例包括新生兒細胞、內分泌細胞、腫瘤細胞、腺泡細胞、胰島細胞、免疫細胞、神經內分泌細胞、神經元細胞和垂體細胞。完全在本領域技術人員能力范圍內還有確定能夠表達本發明修飾的GPCR的其它細胞系，例如CHO(中國倉鼠卵巢)細胞(CHO-K1)和HEK(人胚腎)細胞。
在進行本發明的試驗過程中，可以優選使用不將任何內源性GPCR表達至高水平的細胞系。CHO-K1為這類細胞系的實例。
可以選擇某些表達本發明GPCR寡聚體的細胞，因為它們具有對GPCR信號級聯放大起反應的能力。例如，在用于測定GPCR寡聚體的配體的試驗中，便利的是可以在受體活化時具有可檢測到的特征改變的細胞，例如色素細胞中表達GPCR。US 5,462,856(引入本文作為參考)中描述了使用色素細胞系研發用于評價GPCR的新激動劑和拮抗劑的快速和靈敏性生物測定的方法。下文中更詳細地討論用于測定GPCR活性的試驗。因此，可以用本發明的核酸構建體轉染的色素細胞包括載色素細胞、載黑色素細胞或黑素細胞、黃色素細胞、紅色素細胞、白色素細胞和虹細胞。這類細胞可以便利地獲自低等動物，諸如爬行綱，例如安樂蜥屬；兩棲綱，例如非洲爪蛙；Pieces，例如，Zaccotemmincki；甲殼綱，例如Uca pugilator；棘皮動物門，例如，Diademaantillarum；和Cinidaria，例如Nanomsa cara。用于本發明的特別優選的色素細胞為來自非洲爪蛙的培養的載黑色素細胞(《色素細胞》(Pigment Cell)1985)，ed.Bagnara等，University of Tokyo Press，219-227頁)和Lerner等(1988)P.N.A.S.USA，85261-264。
使用核酸構建體轉染細胞完全屬于本領域技術人員的能力范圍。標準方法包括脂質轉染胺(lipofectamine)、磷酸鈣沉淀、電穿孔、基因槍、脂質體和病毒載體。
表達載體，例如質粒、病毒載體等為可復制的DNA構建體，其中核酸可操作地與能夠引起特定細胞中膜受體/報道基因融合體表達的合適控制序列連接。控制序列一般可以包括轉錄啟動子、控制轉錄的任選的操縱基因序列、編碼合適的mRNA核糖體結合位點的序列和控制轉錄和/或翻譯終止的序列。表達載體一般可以包括例如質粒、噬菌體或病毒且這類載體可以整合入宿主基因組或在特定細胞中自主復制。
各種表達載體是本領域技術人員可得到的。優選的載體為寄存在ATCC并給予ATCC#203351寄存號的pCMV。
為了使特定細胞表達突變體GPCR/G-蛋白融合蛋白，必須用合適的表達載體轉化細胞。本文所用的“轉化”指的是將異源多核苷酸片段導入宿主細胞，而與使用的方法無關，例如直接攝入、轉染或轉導。
本發明因此還涉及已經用包括本發明突變體GPCR/G-蛋白融合體轉化并表達突變體GPCR/G-蛋白融合蛋白的細胞。在本發明的方法中，可以在使用前溶解細胞，使得僅可以使用GPCR定位的細胞膜。
用于測定GPCR活性的試驗由于使用編碼修飾的GPCR的核酸構建體共轉染了細胞，所以可以評價至少對功能性(第二種)GPCR具有特異性的至少一種配體的結合。可以通過大量標準和眾所周知的技術測定本發明GPCR寡聚體的功能活性。已知GPCR影響腺苷酸環化酶活性，以便調節電壓控制的鈣通道的傳導性、調節鉀通道、激活MAP激酶途經、激活磷脂酶C(PLC)-IP3途經、活化磷酸酪氨酸磷酸酶、刺激有絲分裂、刺激胞吐作用、刺激白細胞郁積、刺激趨化性和誘導編程性細胞死亡。本領域技術人員可以使用常規和標準方法測定這些活性。還可以在用于測定GPCR配體的試驗中使用這些技術測定功能活性(參見下文)。
可以通過測定所述GPCR信號級聯放大的下游組成部分的水平觀察所述化合物對GPCR雜二聚體起作用所具有的影響。檢測的一種適宜的組成部分為鈣的水平/鈣水平的改變。一般為鈣離子。作為對鈣檢測的替代選擇，還能夠使用結合活性G蛋白的GTP類似物作為檢測試劑且還有本領域技術人員公知的報道基因試驗。
可以通過本領域技術人員公知的監測胞質鈣水平的方法檢測正常和異常細胞中的胞質鈣水平。可以使用指示劑染料，例如熒光探針(諸如fura-2、fluo-3或-4、indo-1、quin-2)在結合鈣時表現出光譜響應且然后能夠例如使用熒光顯微術、流式細胞計量術和熒光光譜學檢測胞內游離鈣濃度的改變。大部分上述熒光指示劑為非熒光鈣螯合劑EGTA和BAPTA的變化形式。其它實例可獲自，例如MoleclarProbes，Oregon，USA。
另外，本方法特別適合于研發高流通量篩選，其中例如可以使用CCD照相機、發光計或任意其它合適的光檢測系統進行檢測。以這種方式，例如，可以將細胞/細胞膜維持在可以加入檢測胞內鈣必不可少的測試物質和試劑的多孔平板中。此外，可以使用商購的儀器，諸如“基于FLIPR-熒光(flumetric)成像的平板讀出器”(MolecularDevices Corp，Sunnyvale，CA，USA)。還可以使用稱作“變色龍”的鈣的新熒光指示劑且它不需要使用輔因子進行遺傳編碼并可靶向至具體的胞內位置。這些所謂的“變色龍”由綠色熒光蛋白(GFP)、鈣調蛋白、鈣調蛋白-結合肽M13的發射藍色或青綠色的突變體和增強發射綠色或黃色的GFP的銜接融合體組成。鈣的結合使得鈣調蛋白包裹在M13結構域周圍，從而增加(Miyawaki等1997)或減少(Romoser等1997)了側翼GFPs之間的熒光共振能量傳遞。
另一種胞內鈣濃度測定的方法在于如Sheu等(1993)所述使用超表達GPCR和脫輔基水母發光蛋白的細胞系。在該系統中，將表達脫輔基水母發光蛋白的細胞與為水母發光蛋白輔因子的coelenterazine一起溫育。在該溫育過程中，coelenterazine進入細胞并與脫輔基水母發光蛋白綴合形成水母發光蛋白，為該酶的活性形式。在將細胞與GPCR激動劑一起溫育時，胞內鈣濃度增加。這種增加導致水母發光蛋白的催化活性活化，從而氧化coelenterazine并產生脫輔基水母發光蛋白、coelenteramide、CO2和光。一旦發射了光予，則復合物必然解離且脫輔基水母發光蛋白必然與新的coelenterazine分子重組以便能夠再次發光。因此，在該系統中，添加激動劑后光發射的測定結果反映出其活化GPCR且由此增加胞內鈣濃度的能力。
其它合適的檢測機理包括檢測除Ca2+外的其它第二信使(例如cAMP水平、cGMP水平、肌醇1，4，5三磷酸水平、二酰基甘油水平、蛋白激酶C活性或MAP活性)。還能夠使用報道基因，因為活化GPCR一般隨時間導致基因表達改變(可以使用與對cAMP水平改變或激酶活化作出反應的啟動子元件偶聯的報道基因進行該步驟)。另外的方法如US5,462,856(引入本文作為參考)和US6,051,386(引入本文作為參考)所述使用黑素細胞，這兩篇文獻中描述了方法，其中因GPCR功能活化產生的信號改變細胞中色素聚集狀態且細胞看起來因色素沉著而近乎不透明，例如易于通過比色法檢測。改變聚集狀態可以使聚集增加或反之使聚集減少(分散)。
報道基因試驗還可以使用各種報道基因系統評價來自GPCR寡聚體的信號傳導。為了測定胞內cAMP水平的改變，可以優選由含有環AMP反應元件(CRE)的啟動子驅動的報道基因構建體。為了測定由導致蛋白激酶C活化的Gq途經驅動的反應，可以優選在其啟動子序列中含有AP1位點的PKC-敏感性報道基因系統。對MAP激酶活化敏感的其它報道基因和含有血清反應元件(SREs)的報道基因也可以用于測定來自GPCR寡聚體的反應。報道分子自身可以在一定范圍內且它們的實例包括熒光素酶、β-半乳糖苷酶、β-內酰胺酶、綠色熒光蛋白、黃色熒光蛋白等。
配體結合的測定本發明特別適合于測定與GPCR結合作為寡聚化結果的新配體。可以測試本領域技術人員眾所周知的天然存在和合成的配體。合適的測試配體可以來源于組合文庫、肽和肽模擬物、確定的化學個體、寡核苷酸和可以針對活性篩選的天然產物文庫。在一種可能的手段中，例如，候選物質可以分批用于開始的篩選，例如，每一反應使用10種物質，且分別測試表現出作用的那些批次的物質。
一般來說，可以將本試驗用于篩選對特定膜GPCR起作用的化合物。例如，鑒定為對特定膜受體具有作用的化合物可以用于調節野生型和/或突變體膜受體的活性；可以用于完善特定膜受體的生理功能；和/或可以用于鑒定化合物的篩選中，所鑒定的化合物破壞正常的膜受體相互作用或自身可以破壞這類相互作用。
本試驗特別適合于檢測用作膜受體的反激動劑、拮抗劑或激動劑的化合物。將術語反激動劑理解為指在與受體結合時選擇性穩定和由此增加不能誘導下游信號的一種或多種構象的受體的化合物。將激動劑理解為指在與受體結合時選擇性穩定和由此增加能夠誘導下游信號的一種或多種構象的受體的化合物。將拮抗劑理解為指在與受體結合時不具有富集活性或無活性構象的選擇性能力且由此無法改變它們之間的平衡的化合物。
本發明因此還涉及使用本發明試驗鑒定的受體蛋白的反激動劑、拮抗劑或激動劑并涉及這類反激動劑、拮抗劑或激動劑在研究二聚體或寡聚體GPCR功能或療法中的應用。
具體實施例方式
下文提供了實施本發明的具體實施例并概括了導致本發明的本發明人所進行的工作。
材料和方法來源于組合的Gαq/Gα11雙剔除小鼠(Offermans等，1998)的成纖維細胞細胞系(EF88)(Gohla等，1999)為M.I.Simon博士(California Institute of Technology，Pasadena CA)的贈品。用于組織培養的所有材料均由Life Technologies Inc.(Paisley，Stratclyde，UK)提供。[3H]哌唑嗪(80Ci/mmol)、[3H]美吡拉敏(30Ci/mmol)和[35S]GTPγS(1250Ci/mmol)來自NEN/Perkin Elmer。寡核苷酸購自Cruachem(Glasgow，Strathclyde，UK)。用于時間分辨熒光共振能量轉移的試劑來自Wallac。受體配體購自RBI(Gillingham，Kent，U.K.)。抗-Gq/G11α抗血清CQ的生產和表征由(Mitchell等，1991；Mitchell等1993)描述。用針對于預計的C-末端十肽的抗肽抗血清通過免疫法檢測Gq/G11α的廣泛分布。《FEBS通訊》(FEBSLett.)287，171-174。
所有其它化學藥品來自Sigma(Poole，Dorset，U.K.)且屬于可得到的最高等級。
融合蛋白的構建如(Carrillo等，2002)所述進行野生型和突變的α1b-腎上腺素受體-Gα11融合蛋白的生產和亞克隆。在兩個單獨的階段中進行人組胺H1受體-G11α融合蛋白的生產和亞克隆。在第一個步驟中，使用氨基-末端引物5′-GATACTGGGCTATCCAAGCTTATGAGCCTCCCCAATTCCTC-3′，通過PCR將HindIII限制位點(加下劃線的)導入人組胺H1受體編碼序列的上游。使用羧基-末端引物5′-AAGGAAAAAAGCGGCCGCTGGAGCGAATATGCAGAATTCTCT-3′，將三氨基酸間隔基(Ser-Gly-Arg)和NotI限制位點緊接著導入終止密碼子的上游。類似地，通過PCR，使用氨基-末端引物5′-AAGGAAAAAAGCGGCCGCATGACTCTGGAGTCCATGATGGC-3′和羧基-末端引物5′-ATGAAACCGCTCGAGTCACACCAGGTTGTACTCCTTCAG-3′擴增小鼠G11α序列。該步驟分別導入了位于G11α編碼序列側翼的NotI和XhoI限制位點。在第二個步驟中，用HindIII/NotI消化擴增的受體片段并用NotI/XhoI消化G11α片段。純化這些片段并連入預先用HindIII/XhoI消化的pcDNA 3載體(Invitrogen)。對胞內環2Leu-Asp突變體的選擇基于Greasley等2001的研究。在大部分A類GPCR中，等同的位置也為疏水氨基酸(參見圖2)。使用PCR誘變，通過定向誘變的標準方法(Sambrook等和Carrillo等，Manufacturers Kit等)將這類突變導入融合蛋白構建體。
為了進行共免疫沉淀和trFRET研究，在NH2-末端甲硫氨酸后緊接著導入c-myc(EQKLISEEDL)或FLAG(DYKDDDDK)表位。對每一構建體進行完整測序，此后對其進行表達和分析(Mitchell等，1991；Mitchell等，1993)。
HEK293細胞的瞬時轉染在37℃下和5％CO2加濕氣體環境中將HEK293細胞維持在補充了0.292g/升L-谷氨酰胺和10％(v/v)新生小牛血清的DMEM中。使細胞生長至60-80％融合，此后在60mm平皿中進行瞬時轉染。使用LipofectAMINE試劑(Life Technologies，Inc.)，按照制造商的說明進行轉染。
GTPγS結合通過將含有定量融合構建體(詳見結果)的膜添加到含有所示濃度受體配體的測定緩沖液(20mM HEPES(pH 7.4)、3mM MgCl2、100mMNaCl、1μM 鳥苷5’-二磷酸、0.2mM抗壞血酸、50nCi[35S]GTPγS)中啟動[35S]GTPγS結合實驗。在相同條件下但在有100μM GTPγS存在下測定非特異性結合。將該反應體系在30℃下溫育15分鐘并通過添加含有20mM HEPES(pH 7.4)、3mM MgCl2和100mM NaCl的0.5ml冰冷緩沖液終止反應。在4℃下將樣品以16,000g離心15分鐘并將所得沉淀重新懸浮于增溶緩沖液(100mM Tris、200mM NaCl、1mM EDTA、1.25％ Nonidet P-40)+0.2％十二烷基硫酸鈉中。用Pansorbin(Calbiochem)預凈化樣品，隨后用CQ抗血清進行免疫沉淀(Mitchell等，1993)。
最后，用增溶緩沖液將免疫復合物洗滌兩次并通過液體-閃爍光譜測定法測定結合的[35S]GTPγS。
配體結合研究如(Carillo等，2002)中所述進行用于監測含有α1b-腎上腺素受體的構建體的表達的[3H]哌唑嗪結合研究。通過將3μg細胞膜添加到含有[3H]美吡拉敏(0.1-10nM)的測定緩沖液(50mM Tris-HCl、100mMNaCl、3mM MgCl2，pH 7.4)中啟動用于監測含有組胺H1受體的構建體的表達的[3H]美吡拉敏結合試驗。在有100μM美吡拉敏存在下測定非特異性結合。將該反應體系在25℃下溫育30分鐘并通過經GF/B濾膜的真空過濾從游離配體中分離結合的配體。用測定緩沖液將濾膜洗滌兩次并通過液體-閃爍光譜測定法估計結合的配體。
i成像在37℃下以及95％空氣和5％CO2氣體環境中使EF88細胞生長在補充了10％(v/v)加熱失活的胎牛血清和L-谷氨酰胺(1mM)的DMEM中。將胰蛋白酶消化過程中收集的部分細胞平板固定在玻璃蓋玻片上且在24小時生長期后，使用LipofectAMINE(Life Technologies Inc.)，按照制造商的說明轉染它們。3小時后，用OPTIMEM 1將細胞洗滌兩次且然后在DMEM生長培養基中再培養24小時。將含有相關cDNA種類的總計3μg的pCDNA 3用于轉染每一蓋玻片。通過在減弱光條件下的含有染料的膜透性乙酰氧基甲酯形式(1.5μM)的DMEM生長培養基中溫育(15-20分鐘，37℃)給轉染的EF88細胞中加載Ca2+-敏感性染料。成像研究的詳細內容及其分析描述在Liu等，2002中。
GPCR共免疫沉淀研究如(McVey等，2001)所述，使用α1b-腎上腺素受體和組胺H1受體構建體的FLAG和c-myc標記形式進行共免疫沉淀研究。在使用組胺H1受體進行的研究中，加入30U/ml內切糖苷酶F。
時間分辨熒光共振能量傳遞如(McVey等，2001)中所述使用Eu3+-標記的抗-c-myc抗體和別藻藍蛋白-標記的抗-FLAG抗體對完整的HEK293細胞進行時間分辨熒光共振能量傳遞。
結果本發明人已經預先生產了α1b-腎上腺素受體與結合包括[3H]哌唑嗪在內的激動劑和拮抗劑配體的G11的α亞單位的融合蛋白(Carillo等，2002)。向為表達這種構建體轉染的HEK293細胞膜中添加激動劑去氧腎上腺素對使用針對G11α的C-末端十肽的抗血清的測定免疫沉淀結束后監測的[35S]GTPγS結合產生顯著刺激(圖4A)。
將Gly208AlaG11α突變體導入融合蛋白基本上消除了在使用表達等量該構建體的膜時對[35S]GTPγS的去氧腎上腺素刺激(圖4A(2)，因為G蛋白的這種形式不能釋放結合的GDP。然而，這種突變沒有改變[3H]哌唑嗪或去氧腎上腺素的結合特性)。
上述研究已經證實在α1b-腎上腺素受體的胞內環2中疏水氨基酸的突變可以消除激動劑介導的信號轉導(Greasley等，2001)。本發明人由此生產了Leu151Aspα1b-腎上腺素受體與G11α的融合蛋白。它結合了[3H]哌唑嗪和去氧腎上腺素作為野生型融合蛋白(未顯示)，但去氧腎上腺素還不能刺激[35S]GTPγS的結合(圖4A(3))。然而，兩種功能性突變體的共表達重組了去氧腎上腺素介導的[35S]GTPγS的結合(圖4A(4))且在所用的膜量中含有兩倍于用于各構建體的[3H]哌唑嗪結合位點時，激動劑介導的[35S]GTPγS水平幾乎與使用野生型融合構建體時同樣高(圖4A(5))。
功能的重組要求共表達兩種突變體融合體。如果在單獨的細胞群中表達兩種構建體且在膜制備前混合細胞或分別制備膜且然后在試驗前合并，那么沒有觀察到激動劑刺激的[35S]GTPγS的結合(圖4B)。這類結果與GPCR二聚化是激動劑功能所需的推定一致。此外，在該二聚體內，一種GPCR元件活化以物理方式與配偶體GPCR連接的G蛋白。
為了擴展這一基本概念，使用組胺H1受體與G11α的融合體進行了等同的一組實驗。基本結果相同。含有GPCR與G蛋白的野生型形式的融合體在有組胺存在下對[35S]GTPγS結合產生了顯著刺激(圖5(1))。這一結果在單獨表達組胺H1受體-Gly208AlaG11α融合蛋白(圖5(2))或Leu133Asp組胺H1受體與野生型G11α的融合體(圖5(3))時不存在。這兩種突變體的共表達再次重組了G蛋白的激動劑活化(圖5(4))。此外，在共表達這兩種突變體后，表達2倍以上數量[3H]拮抗劑結合位點的膜在添加激動劑組胺時產生了與分離中表達的野生型組胺H1受體-G11α融合蛋白同樣高水平的[35S]GTPγS結合(圖5(5))。
作為對這些研究的擴展，本發明人試圖監測單個細胞中的功能重組和二聚化。為了進行這種嘗試，他們使用了應用EF88細胞的Ca2+成像。EF88細胞為來源于Gqα/G11α雙剔除小鼠的小鼠胚胎成纖維細胞的品系(Mao等，1998；Yu和Hinkle，(1999)。它們由此需要表達功能性GPCR和功能性Ca2+動用G蛋白以使胞內[Ca2+]升高(Liu等，(2002；Stevens等，2001)。在導入組胺H1受體或α1b-腎上腺素受體的野生型形式與G11α激動劑之間的融合體時使胞內[Ca2+]升高(圖6)。
這種情況僅在正轉染的細胞中出現。當EF88細胞抗拒轉染時，本發明人使用強化的綠色熒光蛋白(GFP)共轉染以使正轉染的細胞顯色。僅對GFP呈陽性的那些細胞對激動劑配體起反應(圖6b)。就組胺H1受體和α1b-腎上腺素受體而言，含有非激動劑反應性GPCR或G蛋白突變體的融合體無法升高胞內[Ca2+]。然而，共表達非功能性融合體對可以再次產生有效的信號(圖6a、6b、7a和7b)。
本發明人還直接證實了分離的GPCR和GPCR/G蛋白融合體形成二聚體/寡聚體的能力。構建體為用c-myc或FLAG標記物標記的N-末端表位。在HEK293細胞中共表達α1b-腎上腺素受體的標記形式，但并未對其進行單獨表達、隨后進行細胞混合后，使用抗-FLAG抗體進行免疫沉淀在有抗-c-myc免疫反應性存在下產生沉淀(圖8a)。SDS-PAGE顯示存在通過與α1b-腎上腺素受體的單體和二聚體形式一致的53kDa和110kDa表觀大小的c-myc抗體鑒定的帶。還在接近凝膠頂部觀察到了抗c-myc免疫反應性且這一結果可表示高級寡聚體或聚集的蛋白質(圖8a)。當使用α1b-腎上腺素受體-G11α融合蛋白進行等同實驗時，得到了類似的結果，但抗-c-myc反應帶目前具有的表觀質量為90kDa和200kDa，與這種融合蛋白的單體和二聚體形式的預計大小一致(圖8A)。對組胺H1受體的FLAG和c-myc標記形式獲得了類似的結果(圖8B)。分離的受體的單體形式作為約50kDa多肽遷移，而對二聚體形式預計作為約100kDa多肽遷移(圖8B)。此外，當使用α1b-腎上腺素受體時，還檢測到了一系列較高分子量的種類。當使用組胺H1受體-G11α融合蛋白時，也便利地檢測到了單體和二聚體種類(圖8b)。
已經提出了有關僅依賴于共免疫沉淀的GPCR二聚化數據的意義和可靠性方面的一系列問題(Milligan G，2001；Salim等，2002)。本發明人由此使用時間分辨熒光共振能量傳遞(tr-FRET)監測了完整HEK293細胞中分離的α1b-腎上腺素受體和α1b-腎上腺素受體-G11α融合蛋白的二聚化/寡聚化。當共表達分離的GPCR或融合蛋白的c-myc和FLAG-標記形式時，在添加作為能量供體的Eu3+-標記的抗-c-myc抗體與作為能量受體的別藻藍蛋白(APC)-標記的抗-FLAG抗體的組合時，獲得了清楚的能量傳遞信號(圖9A)。當在添加所述抗體前混合的單獨細胞群中表達GPCR構建體的標記形式時，未獲得能量傳遞信號。在表達組胺H1受體和組胺H1受體-G11α融合蛋白的N-末端c-myc和FLAG-標記形式的HEK293細胞中獲得了等同的結果(圖9B)。
為了檢驗組胺H1受體與α1b-腎上腺素受體之間雜二聚化的能力和GPCR二聚體使G蛋白活化的機制，本發明人共表達了組胺H1受體的FLAG-標記形式和α1b-腎上腺素受體的c-myc-標記形式。在使用抗-FLAG抗體和SDS-PAGE進行免疫沉淀后，在與僅通過所用電泳條件部分分離的組胺H1受體-α1b-腎上腺素受體雜二聚體的免疫沉淀一致的50和100kDa表觀分子量的多肽類中檢測到了c-myc免疫反應性(圖11A)。在共表達組胺H1受體的FLAG-標記形式和α1b-腎上腺素受體的c-myc-標記形式后進行的tr-FRET研究證實了在細胞表面存在組胺H1受體/α1b-腎上腺素受體雜二聚體(圖11B)，不過，絕對信號水平顯示這些形成的雜二聚體的有效性低于相應的均二聚體對(參見與圖11B比較的圖9A和9B的y-軸)。與在所述的均二聚體的研究中一樣，當在分析前混合表達這些受體中的每一種的單獨的細胞群時，沒有觀察到tr-FRET信號(圖11B)。
當在EF88細胞中與α1b-腎上腺素受體-Gly208AlaG11α一起共表達Leu133Asp組胺H1受體-G11α時，去氧腎上腺素能夠升高胞內[Ca2+]，但組胺不能(圖12A)。這種情況僅在α1b-腎上腺素受體活化與Leu133Asp組胺H1受體以物理方式連接的G蛋白時發生。當通過共表達Leu151Aspα1b-腎上腺素受體-G11α和組胺H1受體-Gly208AlaG11α使該方案反向進行時，組胺使胞內[Ca2+]升高，而去氧腎上腺素不能(圖7B)。為了擴展這種類型的分析，將組胺H1受體-G11α融合體與不能活化G蛋白且由此刺激[35S]GTPγS結合的分離的Leu151Aspα1b-腎上腺素受體一起共表達。對[35S]GTPγS結合的組胺刺激與表達相同水平的僅組胺H1受體-G11α融合體的膜相比顯著減少(圖12A)。這類數據與產生失活的與組胺H1受體-G11α的雜二聚體的Leu151Aspα1b-腎上腺素受體一致并表明所述雜二聚體中的組胺H1受體不會活化以物理方式與之結合的G蛋白。在共轉染中的組胺產生的其余信號反映出在有Leu151Aspα1b-腎上腺素受體存在下仍然形成某些功能性組胺H1受體-G11α均二聚體。實際上，當本發明人將組胺H1受體-G11α與增加量的Leu151Aspα1b-腎上腺素受體cDNA一起共表達時，組胺使表達相同數量的組胺H1受體結合位點的膜中[35S]GTPγS結合的能力因Leu151Aspα1b-腎上腺素受體cDNA水平增加而下降(圖12A)。在EF88細胞中共轉染Leu151Aspα1b-腎上腺素受體與組胺H1受體-G11α后，獲得了類似的結果。對胞內[Ca2+]的組胺刺激顯著下降(圖12B)。
共表達兩種不同的GPCR必須使相應的均二聚體存在并提供使雜二聚體形成的可能性。本發明人希望確保在共表達Leu133Asp組胺H1受體-G11α與α1b-腎上腺素受體-Gly208AlaG11α時觀察到的Ca2+信號傳導的重組并不反映僅存在α1b-腎上腺素受體和組胺H1受體的均二聚體且α1b-腎上腺素受體-Gly208AlaG11α均二聚體單純能夠接觸并活化與Leu133Asp組胺H1受體-G11α均二聚體連接的G11α。為了提高膜適當靶向的G蛋白的水平，生產了一種構建體，其中G11α與α1b-腎上腺素受體的N-末端和第一個跨膜區的c-myc-標記形式的C-末端連接(c-myc-Nt-TM1α1b-G11α)。當將其轉染入HEK293細胞時，膜部分的免疫印跡清楚地顯示其表示為53和47kDa雙峰，無論是使用抗-c-myc(圖13A)還是抗-G蛋白抗血清(數據未顯示)進行檢測。基于使用抗-c-myc抗體進行的免疫檢測，c-myc-Nt-TM1α1b-G11α的水平顯著高于c-myc-α1b-腎上腺素受體-G11α融合蛋白的水平(圖13A)。[35S]GTPγS結合試驗(在該試驗結束時，使用抗-c-myc抗體對c-myc-Nt-TM1α1b-G11α構建體進行免疫沉淀)證實了該構建體不結合[35S]GTPγS作為對去氧腎上腺素的反應(圖13B)。平行實驗表明抗-c-myc抗體確實俘獲了去氧腎上腺素刺激的[35S]GTPγS與全長c-myc-標記的α1b-腎上腺素受體-G11α融合蛋白的結合(圖13B)。然而，共表達c-myc-Nt-TM1α1b-G11α與分離的α1b-腎上腺素受體同樣不會對抗-c-myc免疫沉淀物中的[35S]GTPγS結合產生顯著刺激(圖13B)且這一結果在c-myc-Nt-TM1α1b-G11α與α1b-腎上腺素受體-Gly208AlaG11α融合蛋白共表達時也是如此(圖13B)。因此，單純增加膜結合的G蛋白濃度不會使α1b-腎上腺素受體或α1b-腎上腺素受體-融合蛋白均二聚體活化這種G蛋白。這一結果強烈主張來自失活的組胺H1受體和α1b-腎上腺素受體受體G蛋白融合體對共表達的數據必須因雜二聚體內的反式激活而產生。
用于測定胞內鈣濃度的熒光成像平板讀出器(FLIPR)試驗的實施例將來自相應克隆品系的靶受體(實驗)和pCMV(陰性對照)穩定轉染的細胞以5.5×104個細胞/孔接種入聚-D-賴氨酸預處理的含有完全培養基(DMEM含有10％FBS、2mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸鈉)的96-孔平板(Becton-Dickinson，#356640)，在第2天用于試驗。為了制備Fluo4-AM(分子探針，#F14202)溫育緩沖儲備溶液，將1mgFluo4-AM溶于467μl DMSO和467μl Pluoronic acid(分子探針，#P3000)而得到1mM儲備溶液，可以將其貯存在-20℃下1個月。Fluo4-AM為熒光鈣指示劑染料。
在洗滌緩沖液(pH 7.4下的1X HBSS/2.5mM Probenicid/2o mMHEPES)中制備候選化合物。
在試驗時，從孔中取出培養基并向細胞中加載100μl pH 7.4下的4μM Fluo4-AM/2.5mM Probenicid(Sigma，#P8761)/20mM HEPES/完全培養基。要求將在37℃/5％CO2下的溫育持續60分鐘。
在1小時溫育后，除去Fluo4-AM溫育緩沖液并用100μl洗滌緩沖液將細胞洗滌2X。在各孔中保留100μl洗滌緩沖液。將平板放回37℃/5％CO2下的恒溫箱內60分鐘。
使FLIPR(熒光成像平板讀出器；Molecular Device)執行程序以便在第30秒時添加50μl候選化合物并再記錄150秒該候選化合物引起的胞內[Ca2+]濃度的瞬時改變。將總熒光改變計數用于使用FLIPR軟件測定激動劑活性。儀器軟件校準了熒光讀數而得到0時的等同起始讀數。
在某些實施方案中，包括靶受體的細胞進一步包括混雜Gα15/16或嵌合Gq/Giα單位。
盡管上述提供了使用穩定轉染細胞對激動劑活性進行的FLIPR試驗，但是本領域技術人員能夠便利地改變該試驗以便表征拮抗劑活性。所述的本領域技術人員還易于理解，在另一方面，可以使用瞬時轉染的細胞。
用于檢測配體結合的載黑色素細胞試驗的實施例載黑色素細胞為在低等脊椎動物中發現的皮膚細胞。它們含有稱作黑素體的色素細胞器。載黑色素細胞能夠在G-蛋白偶聯受體(GPCR)活化時沿微管網絡重分配這些黑素體。這種色素運動的結果為細胞明顯發亮或顏色變深。在載黑色素細胞中，因Gi-偶聯受體活化導致的胞內cAMP水平下降使黑素體遷移至細胞中心，從而導致顏色明顯發亮。如果在Gs-偶聯受體活化后，cAMP水平升高，那么黑素體再分散且細胞看起來再次顏色變深。因Gq-偶聯受體活化導致的二酰基甘油水平升高也可以誘導這種再分散。此外，這項技術還適合于研究某些受體酪氨酸激酶。載黑色素細胞的反應在受體活化的數分鐘內發生且產生單純強烈的顏色改變。易于使用常用吸收度微量平板讀出器或適當的視頻成像系統檢測到這種反應。不同于其它皮膚細胞，載黑色素細胞來源于神經嵴且看起來可以表達信號蛋白。特別是，這些細胞表達極其廣泛的G-蛋白且由此能夠以功能方式表達幾乎所有的GPCR。
載黑色素細胞可以用于鑒定化合物，包括天然配體、激動劑GPCR。該方法可以通過下列步驟進行導入能夠分散或聚集其色素作為對特異性刺激的反應的色素細胞系并表達編碼GCPR的外源性克隆。刺激劑，例如褪黑素設立了色素分布的起始狀態，其中如果GPCR的活化誘導色素分散，那么色素聚集在測試細胞內。然而，用刺激劑刺激細胞可以設定色素分布的起始狀態，其中如果GPCR的活化誘導色素聚集，那么色素分散。然后使測試細胞接觸化學化合物并測定細胞中的色素分布是否因色素分布的起始狀態而改變。因候選化合物，包括，但不限于配體而導致色素細胞分散，所以與GPCR偶聯看起來在培養皿上的顏色變深，而色素細胞聚集看起來發亮。
材料和方法遵循美國專利US 5,462,856和美國專利US 6,051,386中披露的內容。將這些專利公開文獻的全部內容引入本文作為參考。
將細胞平板固定在96-孔平板(一種受體/平板)中。轉染后48小時，用10nM褪黑素處理每一平板上一半的細胞。褪黑素激活了載黑色素細胞中的內源性Gi-偶聯受體并使它們聚集其色素。將剩余的一半細胞轉入不含血清的培養基0.7X L-15(Gibco)中。1小時后，不含血清的培養基中的細胞保持色素分散狀態，而褪黑素-處理的細胞呈色素聚集狀態。此時，用產生劑量反應的選擇的測試化合物處理細胞。如果平板固定的GPCR與選擇的測試化合物結合，那么可以預計載黑色素細胞發生了顏色改變作為對所述化合物的反應。如果受體為Gs或Gq偶聯受體，那么褪黑素-聚集的載黑色素細胞可以發生色素分散。相反，如果受體為Gi-偶聯受體，那么可以預計色素分散的細胞發生劑量依賴性色素聚集。
討論通過使用α1b-腎上腺素受體和組胺H1受體與G蛋白G11α的融合蛋白，本發明人目前證實這些GPCR二聚化且這一結果并不因將G蛋白添加到GPCR的C-末端尾而受到損害。同樣，通過使用trFRET檢測完整細胞中的GPCR二聚體/寡聚體，他們能夠證實在細胞表面上存在這些復合物。這一結果也并不因將G蛋白序列添加到GPCR上而受到損害。此外，通過將防止G蛋白的激動劑活化的突變導入GPCR或G蛋白，本發明人生產了能夠在共表達時恢復激動劑介導的功能的非功能性融合蛋白對。以兩種方式監測功能重組。首先，激動劑僅能夠在共表達分離中各自為非功能性的兩種突變體后EF88細胞中產生升高的胞內[Ca2+]。EF88細胞缺乏磷脂酶C-偶聯G蛋白的表達且由此必需導將合適的GPCR和G蛋白導入這些細胞以產生Ca2+信號。這一試驗具有明顯有益性的方面在于Ca2+成像允許本發明人監測單細胞中的功能性二聚化。可以在信號轉導級聯中測定的最早期步驟之一為G蛋白上激動劑誘導的鳥嘌呤核苷酸交換。可以根據[35S]GTPγS的結合便利地監測這一步驟。在所有的[35S]GTPγS結合試驗中，本發明人最初通過使用飽和[3H]拮抗劑結合研究測定了GPCR G蛋白融合蛋白的表達水平。這一過程允許他們將含有定量構建體的膜量加入到試驗中。本發明人已經預先證實激動劑刺激的[35S]GTPγS結合隨增加量GPCR-G11α融合蛋白的添加而呈線性增加(Stevens等，2001)。當共表達組胺H1受體-Gly208AlaG11α和Leu133Asp組胺H1受體-G11α融合蛋白時，要求存在兩倍數量的[3H]拮抗劑結合位點以產生基本上與僅表達野生型組胺H1受體-G11α融合蛋白時相同量的激動劑刺激的[35S]GTPγS結合。這一結果提供了良好的證據，即功能元件為二聚體或高級寡聚體。如果功能性組胺H1受體為二聚體，那么當共表達兩種非功能性突變體融合體時，產生的半數二聚體隨機應為非功能性的，因為它們為組胺H1受體-Gly208AlaG11α或Leu133Asp組胺H1受體-G11α的均二聚體。可以預計50％的二聚體為含有組胺H1受體-Gly208AlaG11α的一個拷貝和Leu133Asp組胺H1受體-G11α的一個拷貝的功能性雜二聚體(圖10)。這些研究還支持了如下構思就C類GPCR而言，aminergic A類GPCR通過反式激活機制起作用。可以被活化的二聚體中G蛋白的拷貝與GPCR的非功能形式連接，而GPCR的功能形式與非功能性G蛋白結合。
為了進一步支持這一機制，本發明人利用了已知的結構相關GPCR形成雜二聚體的能力。最初的研究證實當共表達時，可以使組胺H1受體和α1b-腎上腺素受體共免疫沉淀。此外，在EF88細胞中共表達Leu133Asp組胺H1受體-G11α和α1b-腎上腺素受體-Gly208AlaG11α使去氧腎上腺素而非組胺介導的[Ca2+]i升高。如果α1b-腎上腺素受體活化以物理方式與失活組胺H1受體連接的G蛋白，那么僅可以發生上述結果(圖2)。當實驗以反向進行以便無活性的α1b-腎上腺素受體與野生型G蛋白連接且野生型組胺H1受體與突變體G蛋白連接時，組胺為功能性的，但去氧腎上腺素不是。本發明人通過當將組胺H1受體融合蛋白與增加量的分離且失活的Leu151Aspα1b-腎上腺素受體一起共表達時，檢驗組胺刺激[35S]GTPγS結合的有效性而擴展了這一構思。組胺的作用下降。這類信息與增加水平的組胺H1受體-G11α-Leu151Aspα1b-腎上腺素受體雜二聚體減少了組胺H1受體-G11α均二聚體的量且與所述雜二聚體結合的組胺不能使與組胺H1受體以物理方式結合的G蛋白活化這一觀點一致。在這種情況中，當Leu151Aspα1b-腎上腺素受體不能刺激任何G蛋白時，去氧腎上腺素是無活性的。大量報導證實GPCR-G蛋白融合體可以與內源性表達的G蛋白以及所述融合體中的G蛋白元件發生相互作用并活化它們(Burt等，1998，《生物化學雜志》(J.Biol.Chem)273，10367-10375；Molinari等，2003《生物化學雜志》(J.Biol.Chem)278，15778-15788)。然而，在這些研究中，已經以極高水平表達了GPCR-G蛋白融合體，所述的極高水平屬于已經報導的因膜中的物理鄰近性而產生的非特異性“旁觀者”(Mercier等，2002《生物化學雜志》(J.Biol.Chem)277，44925-44931)作用的范圍。EF88細胞的應用消除了與內源性G蛋白發生相互作用的可能性，因為它們不表達Gqα或G11α且由此的作用必須反映出融合的G蛋白的活化。此外，在將Gly208Ala突變導入融合體的G蛋白元件后，對轉染的HEK293細胞膜中[35S]GTPγS結合的激動劑刺激實際上得到消除。這一結果表明在達到的表達水平下，盡管表達了內源性Gqα或G11α，但實際上，HEK293細胞中的內源性Gqα或G11α沒有活化。在HEK293細胞中的異二聚化實驗中，將過量的G蛋白與第二種GPCR按照1∶1的摩爾比導入，這是因為由融合體確定的GPCR和G蛋白的化學計算量為1∶1。為了評價這些結果是否可以簡單地歸因于存在的額外G蛋白，本發明人通過可選策略提供了額外的G蛋白。為了進行這類步驟，生產了與α1b-腎上腺素受體的N-末端和第一個跨膜區連接的G11α形式。預先使用了用于其它G蛋白的等同構建體(Lee等，1999《生物化學》(Biochemistry)38，13801-13809，Guzzi等，2001《生物化學雜志》(Biochem J.)355，323-331，Molinari等，2003《生物化學雜志》(J.Biol.Chem)278，15778-15788)且已經提示與跨膜α螺旋結構的連接以特別有效的方向提供了用于活化的G蛋白(Molinari等，2003，如上所述)。盡管可以將這種構建體表達至顯著高于α1b-腎上腺素受體-G11α融合體的水平，但是G蛋白并非由去氧腎上腺素活化，無論是單獨表達還是與分離的α1b-腎上腺素受體或α1b-腎上腺素受體-G11α融合體組合表達。這些研究證實通過共表達GPCR-G蛋白融合體的非功能對重組信號必須反映出重組的二聚體內的內部反式激活。
表1






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權利要求
1.包含復合物的生物學試劑，所述的復合物具有(a)與第一種G-蛋白結合的第一種GPCR，其中相對于結合的第一種G-蛋白而言，第一種GPCR為非功能性的；(b)與第二種G-蛋白結合的第二種GPCR，其中第二種G-蛋白為非功能性的。
2.權利要求1的生物學試劑，其中所述的復合物存在于細胞膜中。
3.權利要求1或權利要求2的生物學試劑，其中所述的第一種GPCR和第一種G-蛋白結合為融合蛋白，且其中所述的第二種GPCR和第二種G-蛋白結合為融合蛋白。
4.上述權利要求中任意一項的生物學試劑，其中所述的第一種GPCR帶有與天然GPCR序列相比修飾的氨基酸序列，以便使它相對于第一種G-蛋白而言成為非功能性的。
5.權利要求4的生物學試劑，其中第一種GPCR的氨基酸序列在第2胞內環中被修飾。
6.權利要求4或權利要求5的生物學試劑，其中通過氨基酸殘基替換修飾第一種GPCR的氨基酸序列。
7.權利要求6的生物學試劑，其中通過疏水氨基酸殘基替換為酸性氨基酸殘基修飾第一種GPCR的氨基酸序列。
8.權利要求4-7中任意一項的生物學試劑，其中所述的第一種GPCR帶有選自圖3中所示的組的第2胞內環的氨基酸序列且突出顯示的氨基酸殘基中的一個或多個被修飾。
9.上述權利要求中任意一項的生物學試劑，其中所述的第二種G-蛋白帶有與天然G-蛋白相比修飾的氨基酸序列，以便使它成為非功能性的。
10.權利要求9的生物學試劑，其中所述的第二種G-蛋白與天然氨基酸序列相比通過至少一種氨基酸殘基替換而得到修飾。
11.權利要求10的生物學試劑，其中被替換的氨基酸殘基為甘氨酸。
12.上述權利要求中任意一項的生物學試劑，其中所述的第一種和第二種GPCR為A類GPCR。
13.權利要求12的生物學試劑，其中A類GPCR選自圖3中提供的組。
14.上述權利要求中任意一項的生物學試劑，其中所述的第一種GPCR不同于所述的第二種GPCR。
15.包括GPCR和G-蛋白的融合蛋白，其中GPCR維持結合配體的能力，而相對于野生型GPCR而言被修飾，使得它不能在配體結合后刺激所述的G-蛋白。
16.權利要求15的融合蛋白，其中GPCR的氨基酸序列在第2胞內環中被修飾。
17.權利要求15或權利要求16的融合蛋白，其中通過氨基酸殘基替換修飾GPCR的氨基酸序列。
18.權利要求17的融合蛋白，其中通過疏水氨基酸殘基替換為酸性氨基酸殘基修飾GPCR的氨基酸序列。
19.權利要求15-18中任意一項的融合蛋白，其中GPCR帶有選自圖3中所示的組的第2胞內環的氨基酸序列且突出顯示的氨基酸殘基中的一個或多個被修飾。
20.包括GPCR和G-蛋白的融合蛋白，其中G-蛋白相對于其野生型而言被修飾，使得它為非功能性的。
21.權利要求20的融合蛋白，其中G-蛋白帶有與野生型G-蛋白相比修飾的氨基酸序列，以便使它成為非功能性的。
22.權利要求21的融合蛋白，其中G-蛋白與野生型氨基酸序列相比通過至少一種氨基酸殘基的替換而得到修飾。
23.權利要求22的融合蛋白，其中被替換的氨基酸殘基為甘氨酸。
24.編碼權利要求15-23中任意一項的融合蛋白的分離的核酸序列。
25.包括權利要求24的核酸序列的表達載體。
26.包括權利要求24的核酸序列或權利要求25的表達載體的宿主細胞。
27.生產權利要求1-14中任意一項的生物學試劑的方法，包括下列步驟(a)在細胞中表達第一種核酸構建體，所述的核酸構建體編碼第一種GPCR/G-蛋白融合蛋白，其中GPCR與野生型GPCR相比得到突變，由此使它相對于其G-蛋白而言成為非功能性的；(b)在所述細胞中表達第二種核酸構建體，所述的第二種核酸構建體編碼第二種GPCR/G-蛋白融合蛋白，其中G-蛋白與野生型G-蛋白相比得到突變，由此使它成為非功能性的；(c)使所述的第一種和第二種融合蛋白在細胞膜中裝配成一種復合物。
28.生產權利要求1-14中任意一項的生物學試劑的方法，所述的方法包括下列步驟(a)生產第一種核酸構建體，它編碼第一種GPCR和第一種G-蛋白的融合蛋白，其中所述的第一種GPCR與野生型相比得到突變，使得它相對于融合的G-蛋白而言為非功能性的；(b)生產第二種核酸構建體，它編碼第二種GPCR和第二種G-蛋白的融合蛋白，其中所述的第二種G-蛋白與野生型相比得到突變，從而使它成為非功能性的；(c)在細胞中共表達所述的第一種和第二種核酸構建體，以便產生包括所述的第一種和第二種GPCR的復合物。
29.權利要求27或權利要求28的方法，進一步包括步驟(d)分離包括所述復合物的一部分細胞膜。
30.權利要求27-29中任意一項的方法，其中所述的第一種GPCR與其野生型GPCR相比通過至少一種氨基酸殘基的替換而得到突變。
31.權利要求30的方法，其中所述的至少一種氨基酸存在于GPCR的第2胞內環中。
32.權利要求31的方法，其中所述的至少一種氨基酸為疏水氨基酸殘基且被替換為酸性氨基酸殘基。
33.權利要求31或權利要求32的方法，其中所述的第2胞內環帶有選自圖3中所示的組的序列且所述至少一種氨基酸殘基選自突出顯示的氨基酸殘基。
34.權利要求27-33中任意一項的方法，其中所述的第二種G-蛋白與野生型G-蛋白相比通過至少一種氨基酸殘基的替換而得到突變。
35.權利要求34的方法，其中被替換的氨基酸殘基為甘氨酸。
36.權利要求27-35中任意一項的方法，其中所述的第一種和第二種GPCR為A類GPCR。
37.權利要求36的方法，其中所述的A類GPCR選自圖3中提供的組。
38.權利要求27-37中任意一項的方法，其中所述的第一種GPCR不同于所述的第二種GPCR。
39.彼此具有親和性而形成GPCR寡聚體的第一種和第二種GPCR的測定方法，所述的方法包括下列步驟(a)生產第一種核酸構建體，它編碼作為融合蛋白的第一種GPCR及其結合的G-蛋白，其中所述的GPCR與其天然GPCR相比得到突變，使得它相對于其結合的G-蛋白而言為非功能性的；(b)生產第二種核酸構建體，它編碼作為融合蛋白的第二種GPCR及其結合的G-蛋白，其中所述的G-蛋白與其天然G-蛋白相比得到突變，使得它為非功能性的；(c)在細胞中共表達所述的第一種和第二種核酸構建體；和(d)確定包括所述的第一種和第二種GPCR的復合物的存在。
40.權利要求39的方法，其中通過使細胞與所述第二種GPCR的配體接觸并確定所述第一種G-蛋白是否被激活來確定復合物的存在。
41.權利要求39或權利要求40的方法，其中所述的第一種GPCR與其天然GPCR相比通過至少一種氨基酸殘基的替換而得到突變。
42.權利要求41的方法，其中所述的至少一種氨基酸存在于GPCR的第2胞內環中。
43.權利要求42的方法，其中所述的至少一種氨基酸為疏水氨基酸殘基且被替換為酸性氨基酸殘基。
44.權利要求42或權利要求43的方法，其中所述的第2胞內環帶有選自圖3中所示的組的序列且所述至少一種氨基酸殘基選自突出顯示的氨基酸殘基。
45.權利要求39-44中任意一項的方法，其中所述的第二種G-蛋白與天然G-蛋白相比通過至少一種氨基酸殘基的替換而得到突變。
46.權利要求45的方法，其中被替換的氨基酸殘基為甘氨酸。
47.權利要求39-46中任意一項的方法，其中所述的第一種和第二種GPCR為A類GPCR。
48.權利要求47的方法，其中所述的A類GPCR選自圖3中提供的組。
49.權利要求39-48中任意一項的方法，其中所述的第一種與第二種GPCRs不同。
50.權利要求39-49中任意一項的方法，其中野生型第一種和第二種GPCR被至少一種細胞類型內源性共表達。
51.確定因GPCR寡聚化而產生的新的或改變的配體結合位點存在的方法，所述的方法包括下列步驟a)使化合物與表達GPCR寡聚體的第一種細胞接觸，所述的GPCR寡聚體含有(i)與G-蛋白結合的第一種GPCR，其中第一種GPCR被修飾，使得它相對于所述的G蛋白而言為非功能性的；和(ii)與G-蛋白結合的第二種GPCR，其中所述的G-蛋白被修飾，使得它為非功能性的；b)使所述的化合物與表達未修飾的第一種GPCR的第二種細胞接觸和/或使所述化合物與表達未修飾的第二種GPCR的第二種細胞接觸；和c)將所述化合物對第一種細胞的作用與對第二種細胞的作用進行比較，以便確定由所述GPCR寡聚體產生的新的或修飾的配體結合位點的存在。
52.確定作為形成GPCR寡聚體的結果的GPCR功能改變的方法，所述的方法包括a)使化合物與表達GPCR寡聚體的第一種細胞接觸，所述的GPCR寡聚體含有(i)與G-蛋白結合的第一種GPCR，其中第一種GPCR被修飾，使得它相對于所述的G蛋白而言為非功能性的；和(ii)與G-蛋白結合的第二種GPCR，其中所述的G-蛋白被修飾，使得它為非功能性的；b)使所述的化合物與表達未修飾的第一種GPCR的第二種細胞和/或表達未修飾的第二種GPCR的第二種細胞接觸；和(c)將所述GPCR寡聚體的功能與所述未修飾的第一種GPCR和/或與所述第二種GPCR的功能進行比較，以便確定因寡聚化導致的受體功能的改變。
53.權利要求52的方法，其中所述的受體功能的改變是化合物功效的改變。
54.權利要求52的方法，其中所述的受體功能的改變是因所述化合物使受體活化而導致的細胞信號傳導途經的改變。
55.權利要求51-54中任意一項的方法，其中所述的第一種GPCR與其天然GPCR相比通過至少一種氨基酸殘基的替換而得到突變。
56.權利要求55的方法，其中所述的至少一種氨基酸存在于GPCR的第2胞內環中。
57.權利要求55或權利要求56的方法，其中所述的至少一種氨基酸為疏水氨基酸殘基且被替換為酸性氨基酸殘基。
58.權利要求56或權利要求57的方法，其中所述的第2胞內環帶有選自圖3中所示的組的序列且所述至少一種氨基酸殘基選自突出顯示的氨基酸殘基。
59.權利要求51-58中任意一項的方法，其中所述的第二種G-蛋白與天然G-蛋白相比通過至少一種氨基酸殘基的替換而得到突變。
60.權利要求59的方法，其中被替換的氨基酸殘基為甘氨酸。
61.權利要求51-60中任意一項的方法，其中所述的第一種和第二種GPCR為A類GPCR。
62.權利要求61的方法，其中所述的A類GPCR選自圖3中提供的組。
63.權利要求51-62中任意一項的方法，其中所述的第一種與第二種GPCR不同。
64.確定化合物對GPCR寡聚體具有的作用的方法，包括下列步驟a)使所述化合物與表達GPCR寡聚體的第一種細胞接觸，所述的GPCR寡聚體含有(i)與G-蛋白結合的第一種GPCR，其中第一種GPCR被修飾，使得它相對于所述的G蛋白而言為非功能性的；和(ii)與G-蛋白結合的第二種GPCR，其中所述的G-蛋白被修飾，使得它為非功能性的；b)檢測因所述化合物與所述GPCR寡聚體接觸產生的細胞信號的存在；和c)確定所述化合物對GPCR寡聚體具有的作用。
65.權利要求64的方法，其中所述的第一種GPCR與其野生型GPCR相比通過至少一種氨基酸殘基的替換而得到突變。
66.權利要求65的方法，其中至少一種氨基酸存在于GPCR的第2胞內環中。
67.權利要求66的方法，其中所述的至少一種氨基酸為疏水氨基酸殘基且被替換的酸性氨基酸殘基。
68.權利要求65或權利要求66的方法，其中所述的第2胞內環帶有選自圖3中所示的組的序列且所述的至少一種氨基酸殘基選自突出顯示的氨基酸殘基。
69.權利要求64-68中任意一項的方法，其中所述的第二種G-蛋白與野生型G-蛋白相比通過至少一種氨基酸殘基的替換而得到突變。
70.權利要求69的方法，其中被替換的氨基酸殘基為甘氨酸。
71.權利要求64-70中任意一項的方法，其中所述的第一種和第二種GPCR為A類GPCR。
72.權利要求71的方法，其中A類GPCR選自圖3中提供的組。
73.權利要求64-72中任意一項的方法，其中所述的第一種與第二種GPCR不同。
74.權利要求64-73中任意一項的方法，進一步包括下列步驟將所述的作用與因所述化合物與未修飾的第一種GPCR接觸產生的作用和/或與因所述化合物與未修飾的第二種GPCR接觸產生的作用進行比較。
75.鑒定能夠與GPCR寡聚體發生相互作用的化合物的方法，所述的方法包括下列步驟a)提供表達權利要求1-14中任意一項的生物學試劑的細胞；b)使所述的生物學試劑與所述的化合物接觸；和c)測定所述化合物是否與GPCR寡聚體發生相互作用。
76.權利要求75的方法，其中通過鑒定因所述相互作用產生的細胞信號的存在來確定所述化合物與GPCR寡聚體之間的相互作用。
77.權利要求76的方法，其中根據Ca2+、cAMP、肌醇1，4，5三磷酸水平、蛋白激酶C活化、MAP激酶活化的存在測定細胞信號。
78.權利要求76的方法，其中使用報道基因試驗測定所述的細胞信號。
79.權利要求75或權利要求76的方法，其中所述的細胞為色素細胞且通過細胞中色素聚集狀態的改變來測定細胞信號。
80.權利要求79的方法，其中所述的色素細胞為黑素細胞。
81.權利要求75-80中任意一項的方法，其中所述的化合物與作為激動劑、拮抗劑或反激動劑的所述GPCR寡聚體發生相互作用。
82.權利要求75-81中任意一項的方法，其中所述的第一種GPCR與其野生型GPCR相比通過至少一種氨基酸殘基的替換而得到突變。
83.權利要求82的方法，其中所述的至少一種氨基酸存在于GPCR的第2胞內環中。
84.權利要求83的方法，其中所述的至少一種氨基酸為疏水氨基酸殘基且被替換為酸性氨基酸殘基。
85.權利要求82或權利要求83的方法，其中所述的第2胞內環帶有選自圖3中所示的組的序列且所述的至少一種氨基酸殘基選自突出顯示的氨基酸殘基。
86.權利要求75-85中任意一項的方法，其中所述的第二種G-蛋白與野生型G-蛋白相比通過至少一種氨基酸殘基的替換而得到突變。
87.權利要求86的方法，其中被替換的氨基酸殘基為甘氨酸。
88.權利要求75-87中任意一項的方法，其中所述的第一種和第二種GPCR為A類GPCR。
89.權利要求88的方法，其中A類GPCR選自圖3中提供的組。
90.鑒定具有調節GPCR寡聚體與其配體結合的能力的化合物的方法，所述的方法包括a)提供表達GPCR寡聚體的細胞，所述的GPCR寡聚體包括(i)與第一種G-蛋白結合的第一種GPCR，其中GPCR相對于G-蛋白而言為非功能性的；(ii)與第二種G-蛋白結合的第二種GPCR，其中第二種G-蛋白為非功能性的；b)使所述的細胞與測試化合物在所述配體存在下接觸；和c)將所述配體結合GPCR寡聚體的能力與所述配體在相差無幾的條件，但不存在所述化合物下結合GPCR寡聚體的能力進行比較。
91.權利要求90的方法，其中所述的化合物為蛋白質。
92.權利要求91的方法，其中所述的蛋白質為第三種GPCR。
93.權利要求92的方法，其中所述的第一種、第二種和第三種GPCR被至少一種細胞類型內源性共表達。
94.權利要求90-93中任意一項的方法，其中所述的配體結合到通過權利要求51和55-74中任意一項的方法測定存在于所述寡聚體上的新的或改變的配體結合位點上。
95.權利要求90-94中任意一項的方法，其中所述的第一種GPCR與其野生型GPCR相比通過至少一種氨基酸殘基的替換而得到突變。
96.權利要求95的方法，其中所述的至少一種氨基酸存在于GPCR的第2胞內環中。
97.權利要求96的方法，其中所述的至少一種氨基酸為疏水氨基酸殘基且被替換為酸性氨基酸殘基。
98.權利要求95或權利要求96的方法，其中所述的第2胞內環帶有選自圖3中所示的組的序列且所述的至少一種氨基酸殘基選自突出顯示的氨基酸殘基。
99.權利要求90-98中任意一項的方法，其中所述的第二種G-蛋白與野生型G-蛋白相比通過至少一種氨基酸殘基的替換而得到突變。
100.權利要求99的方法，其中被替換的氨基酸殘基為甘氨酸。
101.權利要求90-100中任意一項的方法，其中所述的第一種和第二種GPCR為A類GPCR。
102.權利要求101的方法，其中A類GPCR選自圖3中提供的組。
103.用于評價差異性G-蛋白偶聯的方法，包括下列步驟a)提供表達GPCR寡聚體的第一種細胞，所述的GPCR寡聚體包括(i)與第一種G-蛋白結合的第一種GPCR，其中GPCR相對于G-蛋白而言為非功能性的；(ii)與第二種G-蛋白結合的第二種GPCR，其中第二種G-蛋白為非功能性的；b)提供表達GPCR寡聚體的第二種細胞，所述的GPCR寡聚體包括(i)與所述第一種G-蛋白結合的所述第一種GPCR，其中所述的第一種GPCR為功能性的且所述的G-蛋白為非功能性的；(ii)與所述第二種G-蛋白結合的所述第二種GPCR，其中所述的第二種GPCR相對于G-蛋白而言為非功能性的；(c)提供表達與所述第一種G-蛋白結合的所述第一種GPCR的單體的對照細胞，其中GPCR和G-蛋白均為功能性的；(d)使所述的第一種、第二種和對照細胞與能夠結合到存在于第一種和/或第二種GPCR上的配體結合位點上的化合物接觸；(e)使用不同的第一種和/或第二種G-蛋白重復步驟(a)-(d)；和(f)評價差異性G-蛋白偶聯。
104.權利要求103的方法，其中所述的第一種和第二種G-蛋白選自Gs、Gi、Gq、G11、G12、G13、G15、G16、Go或Gz。
105.權利要求103的方法，其中所述的第一種和第二種G-蛋白選自調節胞內水平的G-蛋白，所述的胞內水平選自Ca2+、cAMP、cGMP、肌醇1，4，5三磷酸、二酰基甘油、蛋白激酶C活性或MAP激酶活性的胞內水平。
106.權利要求103-105中任意一項的方法，其中所述的第一種與第二種GPCR相同。
107.權利要求103-106中任意一項的方法，其中所述的第一種與第二種GPCR不同。
108.權利要求103的方法，其中野生型第一種和第二種GPCR在至少一種細胞類型中被內源性共表達。
109.權利要求103-108中任意一項的方法，其中所述的第一種GPCR與其野生型GPCR相比通過至少一種氨基酸殘基的替換而得到突變。
110.權利要求109的方法，其中所述的至少一種氨基酸存在于GPCR的第2胞內環中。
111.權利要求110的方法，其中所述的至少一種氨基酸為疏水氨基酸殘基且被替換為酸性氨基酸殘基。
112.權利要求109或權利要求110的方法，其中所述的第2胞內環帶有選自圖3中所示的組的序列且所述的至少一種氨基酸殘基選自突出顯示的氨基酸殘基。
113.權利要求103-112中任意一項的方法，其中所述的第二種G-蛋白與野生型G-蛋白相比通過至少一種氨基酸殘基的替換而得到突變。
114.權利要求113的方法，其中被替換的氨基酸殘基為甘氨酸。
115.權利要求103-114中任意一項的方法，其中所述的第一種和第二種GPCR為A類GPCR。
116.權利要求115的方法，其中A類GPCR選自圖3中提供的組。
117.用于評價差異性G-蛋白偶聯的方法，包括下列步驟a)提供表達GPCR寡聚體的第一種細胞，所述的GPCR寡聚體包括(i)與第一種G-蛋白結合的第一種GPCR，其中GPCR相對于G-蛋白而言為非功能性的；(ii)與第二種G-蛋白結合的第二種GPCR，其中第二種G-蛋白為非功能性的；b)提供表達與第一種G-蛋白結合的第二種GPCR的第二種細胞，其中GPCR和G-蛋白均為功能性的；(c)使所述的第一種和第二種細胞與能夠結合到存在于第二種GPCR上的配體結合位點上的化合物接觸；(d)使用不同的第一種G-蛋白將步驟(a)-(c)重復一次或多次；和(e)任選地使用不同的第一種GPCR將步驟(a)-(d)重復一次或多次；和(f)用第二種GPCR評價差異性G-蛋白偶聯。
118.權利要求117的方法，其中所述的第一種和第二種G-蛋白選自Gs、Gi、Gq、G11、G12、G13、G15、G16、Go或Gz。
119.權利要求117的方法，其中所述的第一種和第二種G-蛋白選自調節胞內水平的G-蛋白，所述的胞內水平選自Ca2+、cAMP、cGMP、肌醇1，4，5三磷酸、二酰基甘油、蛋白激酶C活性或MAP激酶活性的胞內水平。
120.權利要求117-119中任意一項的方法，其中所述的第一種與第二種GPCR不同。
121.權利要求120的方法，其中野生型第一種和第二種GPCR在至少一種細胞類型中被內源性共表達。
122.權利要求117-121中任意一項的方法，其中所述的第一種GPCR與其野生型GPCR相比通過至少一種氨基酸殘基的替換而得到突變。
123.權利要求122的方法，其中所述的至少一種氨基酸存在于GPCR的第2胞內環中。
124.權利要求123的方法，其中所述的至少一種氨基酸為疏水氨基酸殘基且被替換為酸性氨基酸殘基。
125.權利要求122或權利要求123的方法，其中所述的第2胞內環帶有選自圖3中所示的組的序列且所述的至少一種氨基酸殘基選自突出顯示的氨基酸殘基。
126.權利要求117-125中任意一項的方法，其中所述的第二種G-蛋白與野生型G-蛋白相比通過至少一種氨基酸殘基的替換而得到突變。
127.權利要求126的方法，其中被替換的氨基酸殘基為甘氨酸。
128.權利要求117-127中任意一項的方法，其中所述的第一種和第二種GPCR為A類GPCR。
129.權利要求128的方法，其中A類GPCR選自圖3中提供的組。
130.生產藥物組合物的方法，該藥物組合物包含能夠與GPCR寡聚體發生相互作用的化合物，所述的方法包括下列步驟a)提供表達權利要求1-14中任意一項的生物學試劑的細胞；b)使所述的生物學試劑與所述的化合物接觸；c)測定所述的化合物是否與GPCR寡聚體發生相互作用；和d)將所述的化合物與藥物上可接受的載體混合以便生產藥物組合物。
131.生產藥物組合物的方法，該藥物組合物包括具有調節GPCR寡聚體與其配體結合的能力的化合物，所述的方法包括a)生產表達GPCR寡聚體的細胞，所述的GPCR寡聚體包括(i)與第一種G-蛋白結合的第一種GPCR，其中GPCR相對于G-蛋白而言為非功能性的；(ii)與第二種G-蛋白結合的第二種GPCR，其中所述的第二種G-蛋白為非功能性的；b)使所述細胞與測試化合物在所述配體存在下接觸；c)將所述配體結合GPCR寡聚體的能力與所述配體在相差無幾的條件，但不存在所述化合物下結合GPCR寡聚體的能力進行比較；和d)將所述的化合物與藥物上可接受的載體混合以便生產藥物組合物。
132.治療個體疾病的方法，包括對所述的個體給予有效量的權利要求75-90鑒定的化合物，其中所述的疾病與已知內源性共表達所述第一種GPCR和所述第二種GPCR的細胞類型相關。
133.權利要求132的方法，其中所述的第一種GPCR和所述的第二種GPCR被表1中包括的細胞類型共表達。
134.權利要求132或權利要求133的方法，其中所述的化合物為激動劑且所述的疾病通過增加所述寡聚體的活性被緩解。
135.權利要求132或權利要求133的方法，其中所述的化合物為拮抗劑且所述的疾病通過降低所述寡聚體的活性被緩解。
136.權利要求132或權利要求133的方法，其中所述的化合物為反激動劑且所述的疾病通過降低所述寡聚體的活性被緩解。
137.治療個體疾病的方法，包括對所述的個體給予有效量的權利要求75-90鑒定的化合物，其中所述的疾病與已知內源性共表達所述第一種GPCR和所述第二種GPCR的細胞類型相關。
138.權利要求137的方法，其中所述的第一種GPCR和所述的第二種GPCR被表1中包括的細胞類型共表達。
139.權利要求137或權利要求138的方法，其中所述的配體為激動劑，所述的化合物增加所述激動劑與所述寡聚體的結合且所述的疾病通過增加所述寡聚體的活性被緩解。
140.權利要求137或權利要求138的方法，其中所述的配體為激動劑，所述的化合物減少所述激動劑與所述寡聚體的結合且所述的疾病通過降低所述寡聚體的活性被緩解。
141.權利要求137或權利要求138的方法，其中所述的配體為拮抗劑，所述的化合物增加所述拮抗劑與所述寡聚體的結合且所述的疾病通過降低所述寡聚體的活性被緩解。
142.權利要求137或權利要求138的方法，其中所述的配體為拮抗劑，所述的化合物減少所述拮抗劑與所述寡聚體的結合且所述的疾病通過增加所述寡聚體的活性被緩解。
143.權利要求137或權利要求138的方法，其中所述的配體為反激動劑，所述的化合物增加所述反激動劑與所述寡聚體的結合且所述的疾病通過降低所述寡聚體的活性被緩解。
144.權利要求137或權利要求138的方法，其中所述的配體為反激動劑，所述的化合物減少所述反激動劑與所述寡聚體的結合且所述的疾病通過增加所述寡聚體的活性被緩解。
全文摘要
本發明提供了涉及G－蛋白偶聯受體(GPCR)寡聚體的材料和方法。本發明提供了與G－蛋白結合的兩種或多種GPCRs的復合物。本發明還提供了包括GPCR和G－蛋白的融合蛋白、核酸、表達載體和宿主細胞。本發明還提供了生產本發明復合物和融合蛋白的方法。
文檔編號G01N33/68GK1809587SQ200480017258
公開日2006年7月26日 申請日期2004年5月18日 優先權日2003年5月20日
發明者G·米利根, D·貝漢 申請人:格拉斯哥大學管理處