專利名稱：使用經子宮頸細胞的非侵入性產前遺傳診斷的制作方法
技術領域：
和背景本發明涉及一種使用經子宮頸樣品的滋養層細胞診斷遺傳異常的方法，以及，更具體的，涉及用于測定胎兒性別和/或胎兒染色體異常的滋養層細胞的生物化學和遺傳分析。
產前診斷涉及鑒定人類胎兒中存在的主要的或次要的胎兒畸形或者遺傳疾病。超聲掃描通常能檢測結構畸形，如那些涉及神經管、心、腎、四肢等的畸形。另一方面，當前可使用絨毛膜絨毛取樣(CVS)和/或羊膜腔穿刺術檢測染色體畸變，如存在額外的染色體[例如，21三體性(唐氏綜合征)；Klinefelter氏綜合征(47，XXY)；13三體性(Patau綜合征)；18三體性(Edwards綜合征)；47，XYY；47，XXX]、染色體缺乏[例如，Turner氏綜合征(45，X0)]、或者各種易位和缺失。
當前，向年齡超過35歲的婦女和/或向如平衡易位或微小缺失(例如，Angelman綜合征)等遺傳疾病的已知攜帶者的婦女提供產前診斷。因此，年齡超過35歲，生有患染色體畸變如唐氏綜合征嬰兒的婦女的百分率急劇減少。然而，在更年輕的婦女中產前試驗的缺乏導致令人驚訝的統計學資料，即80％的唐氏綜合征嬰兒實際上是由年齡在35歲以下的婦女生的。
CVS通常是在妊娠的第9周至第14周進行的，其通過將導管經子宮頸插入或者將針插入腹部并且取一小部分胎盤樣品(即，絨毛膜絨毛)。通常在CVS操作的1到2周內測定胎兒的核型。然而，由于CVS是一種侵入性的操作，其具有2-4％的與操作有關的流產風險并且可能與增加的胎兒畸形的風險有關，如有缺陷的四肢發育，大概是由于被吸出的胎盤組織的出血或栓塞(Miller D，等，1999.HumanReproduction 2521-531)。
另一方面，在妊娠的第16到第20周，通過將細針經腹插入到子宮中進行羊膜腔穿刺術。羊膜腔穿刺術操作具有0.5-1.0％的與操作有關的流產風險。吸出羊膜液后將胎兒的成纖維細胞進一步培養1-2周，之后對其進行細胞遺傳學(例如，G顯帶技術)和/或FISH分析。因此，在采取細胞樣品的2-3周內獲得胎兒的核型分析。然而，在發現異常情況時，通常在妊娠的第18到第22周之間終止妊娠，其中包括Boero技術，一種在心理和臨床方面更復雜的操作。
為了克服這些局限性，發展了幾種使用非侵入性操作鑒定和分析胎兒細胞的方法。
一種方法基于在妊娠前三個月期間在母親血液中發現了胎兒細胞如胎兒滋養層、白細胞和具核紅細胞。然而，盡管從母親血液中分離滋養層受到它們的多核形態和抗體可用性的限制，但是白細胞的分離受缺乏區分母親和胎兒白細胞的獨特細胞標記的限制。而且，由于白細胞可能在母親血液中持續存在長達27年(Schroder J，等，1974.Transplantation，17346-360；Bianchi DW，等，1996.Proc.Natl.Acad.Sci.93705-708)，因此在母親血液中很可能存在來自先前的妊娠的殘余細胞，從而使得基于這種細胞的產前診斷實際上變得不可能。
另一方面，具核紅細胞(NRBCs)具有相對短的90天的半衰期，使得它們成為產前診斷的極好的候選物。然而，幾個研究已經發現從母親血液中分離的NRBCs中至少50％是母親來源的(Slunga-TallbergA等，1995.Hum Genet.9653-7)。而且，由于在母親血液中出現具核胎兒細胞的頻率異常低(0.0035％)，所以NRBC細胞必須首先純化(例如，使用Ficol-Paque或Percoll梯度密度離心)，然后進行富集，使用例如，磁性活化的細胞分選(MACS，Busch，J.等，1994，Prenat.Diagn.141129-1140)、鐵磁流體懸浮(ferrofluid suspension)(Steele，C.D.等，1996，Clin.Obstet.Gynecol.39801-813)、電流分離(charge flow separation)(Wachtel，S.S.等，1996，Hum.Genet.98162-166)或者FACS(Wang，J.Y.等，2000，Cytometry 39224-230)。然而，這種純化和富集步驟導致胎兒細胞的回收不一致并且限制診斷胎兒性別的靈敏度(綜述見Bischoff，F.Z.等，2002.Hum.Repr.Update 8493-500)。因此，技術問題、高費用以及細胞來源的不確定已經妨礙了這種方法被臨床上實際上接受。
另一種方法基于在子宮頸管中存在滋養層細胞(從胎盤上脫落的)[Shettles LB(1971).Nature London 23052-53；Rhine SA，等(1975).Am J Obstet Gynecol 122155-160；Holzgreve和Hahn，(2000)Clin Obstet and Gynaecol14709-722]。可使用(i)吸引術；(ii)細胞刷(cytobrush)或棉花拭子；(iii)子宮頸內灌洗；或者(iv)子宮內灌洗從子宮頸管回收滋養層細胞。
一旦獲得，則可對滋養層細胞應用各種測定遺傳疾病或染色體異常的方法。
Griffith-Jones等，[British J Obstet.and Gynaecol.(1992).99508-511]提出了基于PCR測定胎兒的性別，其中使用用棉花拭子或通過用鹽水沖洗更低子宮腔回收的滋養層細胞。然而，這種方法受到由于子宮頸中殘余精液造成的假陽性的限制。為了克服這些局限性，對通過粘液吸引或通過細胞刷獲得的樣品使用嵌套式PCR方法。這些分析導致胎兒性別預測的成功率更高(Falcinelli C.，等，1998.Prenat.Diagn.181109-1116)。然而，未純化的經子宮頸細胞的直接PCR擴增很可能導致母親細胞的污染。
一種使用PCR和FISH分析經子宮頸細胞的更新近的研究導致很差的胎兒性別檢測率(Cioni R.，等，2003.Prenat.Diagn.23168-171)。
因此，為了在經子宮頸細胞樣品中從占主導地位的母親細胞群中區分滋養層細胞，使用了抗胎盤抗原的抗體。
Miller等(Human Reproduction，1999.14521-531)使用了各種滋養層特異性抗體(例如，FT1.41.1、NCL-PLAP、NDOG-1、NDOG-5和340)，以從用經子宮頸的吸引或沖洗回收的經子宮頸細胞中鑒定滋養層細胞。這些分析導致總的檢測率為25％到79％，其中340抗體是最有效的抗體。
由Bulmer，J.N.等，(Prenat.Diagn.2003.2334-39)做的另一項研究在經子宮頸的細胞中使用FISH分析來測定胎兒性別。在這個研究中，發現所有從懷有男性胎兒的母親中回收的樣品含有一些具有Y特異性信號的細胞。平行地，對重復的經子宮頸的樣品進行IHC，其中使用可識別絨毛外滋養層的所有群體的人白細胞抗原(HLA-G)抗體(G233)(Loke，Y.W.，等，1997.Tissue Antigen 50135-146；Loke和King，2000，Ballieres Best Pract Clin Obstet Gynaecol 14827-837)。在50％的樣品中出現HLA-G陽性細胞(Bulmer，J.N.等，(2003)同上)。然而，由于在分開的載玻片上進行FISH分析和滋養層特異性IHC測定，所以使用這種方法診斷胎兒染色體異常是不實用的。
因此廣泛公認需要一種無上述局限性的測定胎兒性別和/或鑒定胎兒染色體異常的方法，并且其將非常有利。
發明概述根據本發明的一個方面，提供一種測定胎兒性別和/或鑒定至少一種胎兒染色體異常的方法(a)免疫染色含有滋養層的細胞樣品以便因此鑒定至少一種滋養層細胞，和(b)將至少一種滋養層細胞進行原位染色體和/或DNA分析以便因此測定胎兒性別和/或鑒定至少一種染色體異常。
根據下述本發明優選實施方案中的另外特征，從子宮頸和/或子宮獲得含有滋養層的細胞樣品。
根據所述優選實施方案中的另外特征，使用選自吸引術、細胞刷、棉花拭子、子宮頸內灌洗和子宮內灌洗的方法獲得含有滋養層的細胞樣品。
根據所述優選實施方案中的另外特征，從妊娠第6到第15周的懷孕婦女中獲得滋養層細胞樣品。
根據所述優選實施方案中的另外特征，使用抗滋養層特異性抗原的抗體實現免疫染色。
根據所述優選實施方案中的另外特征，滋養層特異性抗原選自HLA-G、PLAP、PAR-1、Glut 12、H315、FT1.41.1、I03、NDOG-1、NDOG-5、BC1、AB-340、AB-154和因子XIII。
根據所述優選實施方案中的另外特征，使用熒光原位雜交(FISH)和/或引物介導的原位標記(PRINS)實現原位染色體和/或DNA分析。
根據所述優選實施方案中的另外特征，至少一種染色體異常選自非整倍體性、易位、亞端粒(subtelomeric)重排、缺失、微小缺失、倒位和重復。
根據所述優選實施方案中的另外特征，染色體非整倍體性是完全和/或部分三體性。
根據所述優選實施方案中的另外特征，三體性選自21三體性、18三體性、13三體性、16三體性、XXY、XYY和XXX。
根據所述優選實施方案中的另外特征，染色體非整倍體性是完全和/或部分單體性。
根據所述優選實施方案中的另外特征，單體性選自X單體性、21單體性、22單體性、16單體性和15單體性。
本發明通過提供一種非侵入性、無風險的產前診斷的方法，成功地著手解決了目前已知構型的缺點。
除非有其它定義，這里所使用的所有技術和科學術語具有與本發明所屬技術領域普通技術人員通常所理解的相同含義。盡管可在本發明的實踐或試驗中使用與這里所描述的那些相似或者等同的方法和材料，但下面描述了適當的方法和材料。如果發生沖突，以本專利說明書為準，包括定義。另外，材料、方法和實施例僅僅是說明性的，不打算用于限制。
附圖的簡要說明這里僅通過實例的方式，參考附圖，描述本發明。現在詳細具體參考附圖，強調的是所顯示的細節是通過實例的方式并且僅用于本發明優選實施方案的說明性討論的目的，并且是為了提供相信是最有用的和最容易理解的本發明原理和概念方面的描述的目的而提供的。在這點上，不試圖顯示比基本理解本發明所必需的更詳細的本發明的結構細節，采取帶有附圖的描述使得在實踐中可以如何實現本發明的幾種方式對于本領域技術人員來說變得顯而易見。
在附圖中
圖1a-d是說明經子宮頸細胞的IHC(圖1a、c)和FISH(圖1b、d)分析的顯微照片。使用HLA-G抗體(mAb 7759，Abcam)對從兩個在妊娠第7周(圖1a-b，表1中的第73號病例)和第9周(圖1c-d，表1中的第80號病例)的懷孕婦女中獲得的經子宮頸的細胞進行IHC，隨后使用CEP X綠色和Y橙色(Abbott，Cat.5J10-51)探針進行FISH分析。顯示HLA-G陽性的絨毛外滋養層細胞具有微紅色的細胞質(圖1a，用黑色箭標標記的細胞；圖1c，兩個用兩個黑色箭標標記的細胞分裂前的細胞)。注意到在每個滋養層細胞中的單一橙色和綠色信號(圖1b，和d，白色箭標)，其分別對應于Y和X染色體，表明在每個病例中存在正常男性胎兒。
圖2a-b是說明經子宮頸細胞的IHC(圖2a)和FISH(圖2b)分析的顯微照片。使用PLAP抗體(Zymed，Cat.No.18-0099)對從在妊娠第11周(圖2a-b，表1中的第223號病例)的懷孕婦女中獲得的經子宮頸的細胞進行IHC，隨后使用CEP X綠色和Y橙色(Abbott，Cat.5J10-51)探針進行FISH分析。顯示PLAP陽性的絨毛狀細胞滋養層細胞具有微紅色的細胞質(圖2a，黑色箭標)。注意到在絨毛狀細胞滋養層細胞中的單一橙色和綠色信號(圖2b，白色箭標)，其分別對應于Y和X染色體，表明存在正常男性胎兒。
圖3a-b是說明經子宮頸細胞的IHC(圖3a)和FISH(圖3b)分析的顯微照片。使用HLA-G抗體(mAb 7759，Abcam)對從在妊娠第8周(表1中的第71號病例)的懷孕婦女中獲得的經子宮頸的細胞進行IHC，隨后使用LSI 21q22橙色和CEP Y綠色(Abbott，Cat.No.#5J10-24和5J13-02)探針進行FISH分析。注意到HLA-G抗體反應后滋養層細胞的微紅色細胞質(圖3a，白色箭標)，以及存在分別對應于第21和Y染色體的三個橙色和一個綠色信號(圖3b，白色箭標)，表明在男性胎兒中存在21三體性。
圖4a-b是說明經子宮頸細胞的IHC(圖4a)和FISH(圖4b)分析的顯微照片。使用HLA-G抗體對從妊娠第6周(表1中的第76號病例)的懷孕婦女中獲得的經子宮頸的細胞進行IHC，隨后使用CEPX綠色和Y橙色(ABBOTT，Cat.#5J10-51)探針進行FISH分析。注意到HLA-G抗體反應后在滋養層細胞胞質中的微紅色(圖4a，黑色箭標)以及對應于單一X染色體的單一綠色信號(圖4b，白色箭標)，表明存在具有Turner氏綜合征的女性胎兒。
圖5a-c是說明從妊娠第7周(表1中的第161號病例)的懷孕婦女中獲得的經子宮頸(圖5a-b)或胎盤(圖5c)細胞的IHC(圖5a)和FISH(圖5b，c)分析的顯微照片。圖5a-b-使用HLA-G抗體(mAb7759，Abcam)對經子宮頸的細胞進行IHC以及使用CEP X綠色和Y橙色(Abbott，Cat.#5J10-51)探針進行FISH分析。注意到在兩個滋養層細胞胞質中的微紅色(圖5a，Nos.1和2細胞)，以及在一個滋養層細胞中存在對應于兩個X和單一Y染色體的兩個綠色信號和單一橙色信號(圖5b，No.1細胞)，以及在第二個滋養層細胞中存在對應于單一X和單一Y染色體的單一綠色和單一橙色信號(圖5b，No.2細胞)，指示滋養層細胞中存在Klinefelter氏綜合征的鑲嵌性。圖5c-使用CEP X綠色和Y橙色(Abbott，Cat.#5J10-51)探針對胎盤細胞進行FISH。注意到在一個胎盤細胞中存在對應于單一X和單一Y染色體的單一綠色和單一橙色信號(圖5c，No.1細胞)，以及在第二個胎盤細胞中存在對應于兩個X和單一Y染色體的兩個綠色信號和單一橙色信號(圖5c，No.2細胞)，指示胎盤細胞中存在Klinefelter氏綜合征的鑲嵌性。
優選實施方案的描述本發明是一種可在產前診斷中使用的測定胎兒性別和/或鑒定胎兒中至少一種染色體異常的方法。具體地，本發明提供一種非侵入性、無風險的產前診斷方法，其可用于測定遺傳異常，如胎兒中的染色體非整倍體性、易位、倒位、缺失和微小缺失。
參考附圖和附有的說明可更好地理解本發明的原理和操作。
在詳細解釋本發明的至少一個實施方案前，應當理解的是本發明在其應用中不限于在下列描述中所闡述的或通過實施例舉例說明的細節。本發明能實施其它實施方案或者能夠以各種方式實踐或完成。而且，應當理解的是這里所使用的措辭和術語是用于描述的目的，并且不應當被認為是限制的。
胎兒畸形的早期檢測和遺傳異常的產前診斷對于遺傳疾病如，常見的易位(例如，羅伯遜易位)、染色體缺失和/或微小缺失(例如，Angelman綜合征、DiGeorge綜合征)的攜帶者以及對于各種染色體非整倍體性(例如，唐氏綜合征)風險增加的高齡母親(例如，超過35歲)的夫婦極重要。
當前產前診斷的方法包括在經羊膜腔穿刺術或絨毛膜絨毛取樣(CVS)獲得的胎兒細胞上進行的細胞遺傳學和FISH分析。然而，盡管在預測染色體畸變中有效，但是羊膜腔穿刺術或CVS操作分別具有0.5-1％或2-4％與操作有關的流產風險。因為相對高的流產風險，所以對于年齡35歲以下的婦女不提供羊膜腔穿刺術或CVS。因此，由于沒有檢驗，大多數(80％)唐氏綜合征嬰兒實際上是由年齡35歲以下婦女所生。因此，開發可向在任何母親年齡的所有婦女提供的非侵入性、無風險的產前診斷方法很重要。
在妊娠早期的母親血液中發現胎兒具核紅細胞已經促使許多研究者開發分離這些細胞并對它們進行遺傳分析的方法(例如，PCR、FISH)。然而，由于母親血液中具核胎兒細胞的頻率異常低(0.0035％)，所以NRBC細胞必需首先純化(例如，使用Ficol-Paque或Percoll梯度密度離心)，然后富集，使用例如，磁性活化的細胞分選(MACS，Busch，J.等，1994，Prenat.Diagn.141129-1140)、鐵磁流體懸浮(Steele，C.D.等，1996，Clin.Obstet.Gynecol.39801-813)、電流分離(Wachtel，S.S.等，1996，Hum.Genet.98162-166)或者FACS分析(Wang，J.Y.等，2000，Cytometry 39224-230)。盡管可使用這些方法實現胎兒NRBCs的回收，但是不一致的回收率結合有限的靈敏度妨礙了使用胎兒NRBCs的診斷技術的臨床應用(Bischoff，F.Z.等，2002.Hum.Repr.Update 8493-500)。
另一種一直被鑒定為診斷的潛在靶的胎兒細胞類型是滋養層。先前的技術研究描述了使用各種抗體如HLA-G(Bulmer，J.N.等，2003.Prenat.Diagn.2334-39)、PLAP、FTl.41.1、NDOG-1、NDOG-5和340(Miller等，1999.Human Reproduction，14521-531)鑒定經子宮頸樣品中的滋養層細胞。在這些研究中，抗體識別30-79％經子宮頸樣品中的滋養層細胞。另外，FISH、PCR和/或定量熒光PCR(QF-PCR)分析，其在重復的經子宮頸的樣品上進行，能夠鑒定所有男性胎兒中的大約80-90％。然而，由于在分開的載玻片上進行DNA(例如，FISH和/或PCR)和免疫學(例如，IHC)分析，所以這些方法對于診斷胎兒染色體異常是不實用的。
當實施本發明和用提高胎兒遺傳診斷的方法實驗時，本發明人設計了一種非侵入性、無風險的測定胎兒性別和/或鑒定胎兒染色體異常的方法。
如在下文和在隨后實施例部分的實施例1中所描述的，本發明人設計了一種順序地用滋養層特異性抗體(例如，抗HLA-G或PLAP)對經子宮頸的細胞進行染色，隨后對染色的細胞進行FISH分析的方法。如在表1和在隨后實施例部分的實施例1中所示，使用本發明的方法在92.89％的從正在懷孕和/或妊娠終止前獲得的含有滋養層的經子宮頸樣品中獲得了胎兒染色體FISH型的正確測定，因此，結論性地證明本發明的方法在診斷胎兒遺傳異常中大大比現有技術的方法更準確。
因此，根據本發明的一個方面，提供一種測定胎兒性別和/或鑒定至少一種胎兒染色體異常的方法。如這里所使用的術語“胎兒”指在胚胎的任何階段未出生的人后代(即，胚胎和/或胎兒)。
如這里所使用的“胎兒性別”指胎兒中是否存在或不存在X和/或Y染色體。
如這里所使用的“染色體異常”指染色體數目異常(例如21三體性、X單體性)或者指染色體的結構異常(例如，缺失、易位等)。
根據本發明的方法，通過首先免疫染色含有滋養層細胞的樣品以便因此鑒定至少一種滋養層細胞，隨后將鑒定的滋養層細胞進行原位染色體和/或DNA分析以便因此測定胎兒性別和/或鑒定至少一種染色體異常，實現胎兒性別和/或至少一種染色體異常的鑒定。
術語“滋養層”指從哺乳動物胚胎或胎兒的胎盤中獲得的上皮細胞；滋養層一般接觸子宮壁。在胎盤組織中有三種類型的滋養層細胞絨毛狀細胞滋養層、合胞體滋養層和絨毛外滋養層，同樣，這里所使用的術語“滋養層”包括這些細胞中的任何一種。絨毛狀細胞滋養層細胞是特化的胎盤上皮細胞，其分化、增殖并侵入子宮壁形成絨毛。細胞滋養層，其存在于錨定絨毛中，可融合形成合胞體滋養層或者形成絨毛外滋養層柱(Cohen S.等，2003.J.Pathol.20047-52)。
含有滋養層的細胞樣品可以是包括滋養層的任何生物樣品，無論是活的還是死的。優選地，含有滋養層的細胞樣品是血液樣品或者是來自任何妊娠階段的懷孕婦女的經子宮頸的和/或子宮內的樣品。
目前優選的滋養層樣品是來自懷孕婦女的子宮頸和/或子宮的那些樣品(分別是經子宮頸的和子宮內的樣品)。
可使用眾多公知細胞收集技術中的任何一種獲得本發明方法所利用的含有滋養層的細胞樣品。
根據本發明的優選實施方案，使用粘液吸引(Sherlock，J.，等，1997.J.Med.Genet.34302-305；Miller，D.和Briggs，J.1996.EarlyHuman Development 47S99-S102)、細胞刷(Cioni，R.，等，2003.Prent.Diagn.23168-171；Fejgin，M.D.，等，2001.Prenat.Diagn.21619-621)、棉花拭子(Griffith-Jones，M.D.，等，1992.同上)、子宮頸內灌洗(Massari，A.，等，1996.Hum.Genet.97150-155；Griffith-Jones，M.D.，等，1992.同上；Schueler，P.A.等，2001.22688-701)和子宮內灌洗(Cioni，R.，等，2002.Prent.Diagn.2252-55；Ishai，D.，等，1995.Prenat.Diagn.15961-965；Chang，S-D.，等，1997.Prenat.Diagn.171019-1025；Sherlock，J.，等，1997，同上；Bussani，C.，等，2002.Prenat.Diagn.221098-1101)獲得含有滋養層的細胞樣品。各種方法的比較見Adinolfi，M.和Sherlock，J.(Human Reprod.Update 1997，3383-392和J.Hum.Genet.2001，4699-104)，Rodeck，C.，等(Prenat.Diagn.1995，15933-942)。細胞刷方法是目前獲得本發明含有滋養層的細胞樣品的優選方法。
在細胞刷方法中，將Pap涂抹細胞刷(例如，MedScand-AB，Malm，瑞典)通過外口插到最深2cm并且將其完全旋轉(即，360°)后取出。為了取下在刷上捕獲的經子宮頸的細胞，將刷子在含有2-3ml存在1％青霉素鏈霉素抗生素的組織培養基(例如，RPMI-1640培養基，購自Beth Haemek，以色列)的試管中振蕩。為了在顯微鏡載玻片上濃縮經子宮頸的細胞，使用例如Cytofunel ChamberCytocentrifuge(Thermo-Shandon，英國)制備cytospin載玻片。將會意識到用于細胞離心(cytocentrifugation)的條件取決于經子宮頸樣品中的模糊度(murkiness)；如果樣品僅含有少量細胞，則首先將細胞離心5分鐘然后用1ml新鮮培養基重懸。一旦制備，可將cytospin載玻片保藏在95％乙醇中直到進一步使用。
如在表1和在隨后實施部分的實施例1中所示的，使用細胞刷方法，本發明人在收集的255份經子宮頸的樣品中獲得了230份含有滋養層的細胞樣品。
由于滋養層細胞是從胎盤中脫落到子宮腔中的，所以只要子宮腔繼續存在，就應該能夠回收含有滋養層的細胞樣品，直到約妊娠第13-15周(綜述見Adinolfi，M.和Sherlock，J.2001，同上)。
因此，根據本發明的優選實施方案，從妊娠第6周到第15周的懷孕婦女中獲得含有滋養層的細胞樣品。優選地，從妊娠第6周到第13周的懷孕婦女中獲得細胞，更優選地在妊娠第7周到第11周，最優選地，在妊娠的第7周到第8周。
將會意識到決定在懷孕期間妊娠的確切的哪一周進行取樣是在婦科學和產科學領域普通技術人員的能力范圍內的。
一旦獲得，將含有滋養層的細胞樣品(例如，其cytospin制劑)進行免疫染色。
根據本發明的優選實施方案，使用抗滋養層特異性抗原的抗體實現免疫學染色。
抗滋養層特異性抗原的抗體在現有技術中是已知的，并且包括例如，HLA-G抗體，其抗對絨毛外滋養層細胞特異的非經典I型主要組織相容性復合體(MHC)抗原的部分(Loke，Y.W.等，1997.TissueAntigens 50135-146)、對合胞體滋養層和/或細胞滋養層特異的抗人胎盤堿性磷酸酶(PLAP)抗體(Leitner，K.等，2001.Placental alkalinephosphatase expression at the apical and basal plasma membrane interm villous trophoblasts.J.Histochemistry and Cytochemistry，491155-1164)、與存在于胎兒細胞表面上的人滋養層膜糖蛋白相互作用的H315抗體(Covone AE和Johnson PM，1986，Hum.Genet.72172-173)、對合胞體滋養層特異的FT1.41.1抗體和I03抗體(Rodeck，C.，等，1995.Prenat.Diag.15933-942)、對合胞體滋養層特異的NDOG-1抗體(Miller D.，等.Human Reproduction，1999，14521-531)、對絨毛外細胞滋養層特異的NDOG-5抗體(Miller D.，等.1999，同上)、BCl抗體(Bulmer，J.N.等，Prenat.Diagn.1995，151143-1153)、分別對合胞體和細胞滋養層或合胞體滋養層特異的AB-154或AB-340抗體(Durrant L等，1994，Prenat.Diagn.14131-140)、在妊娠的第7周和第10周對胎盤細胞特異的蛋白酶活化的受體(PAR)-1抗體(Cohen S.等，2003.J.Pathol.20047-52)、在妊娠的第10周和第12周對合胞體滋養層和絨毛外滋養層特異的葡萄糖轉運蛋白(Glut)-12抗體(Gude NM等，2003.Placenta 24566-570)以及對細胞滋養層殼特異的抗因子XIII抗體(Asahina，T.，等，2000.Placenta，21388-393；Kappelmayer，J.，等，1994.Placenta，15613-623)。
免疫染色基于標記的抗體與細胞上存在的抗原的結合。免疫染色方法的實例包括但不限于，熒光標記的免疫組織化學(使用與抗體綴合的熒光染料)、放射性標記的免疫組織化學(使用放射性標記，例如，125I、抗體)和免疫細胞化學[使用酶(例如，辣根過氧化物酶)和顯色底物]。優選地，本發明使用的免疫染色是免疫組織化學和/或免疫細胞化學。
免疫染色之后優選使用結合未染色的細胞區室的染料對細胞進行復染。例如，如果標記抗體結合細胞質上存在的抗原，那么核染料(例如，蘇木精-伊紅染料)是一種適當的復染劑。
對細胞進行免疫染色的方法是現有技術中已知的。簡要地，為了檢測經子宮頸樣品中的滋養層細胞，將cytospin載玻片在70％乙醇溶液中洗滌，并在蒸餾水中浸5分鐘。然后將載玻片轉移到潮濕的室中，用磷酸緩沖鹽水(PBS)洗滌3次。為了在顯微鏡載玻片上顯示經子宮頸細胞的位置，使用例如，Pap Pen(Zymed Laboratories Inc.，SanFrancisco，CA，美國)標記經子宮頸樣品的邊界。為了封閉內源性細胞過氧化物酶活性，向每個載玻片加入50μl 3％過氧化氫(Merck，德國)溶液，在室溫下溫育10分鐘，隨后將載玻片在PBS中洗滌3次。為了避免抗體的非特異性結合，向每個載玻片加入兩滴封閉劑(例如，Zymed HISTOSTAIN-PLUS試劑盒，Cat No.858943)，在潮濕的室中溫育10分鐘。為了鑒定經子宮頸樣品中的胎兒滋養層細胞，向載玻片加入滋養層特異性抗體[例如，抗HLA-G抗體(mAb 7759，Abcam Ltd.，Cambridge，英國)或抗人胎盤堿性磷酸酶抗體(PLAP，Cat.No.18-0099，Zymed)]的等分試樣(例如，50μl)。然后將載玻片與抗體在潮濕的室中溫育60分鐘，隨后將它們用PBS洗滌3次。為了檢測結合的一抗，向每個載玻片加入兩滴生物素化的二抗(例如，購自Zymed的山羊抗小鼠IgG抗體)，在潮濕的室中溫育10分鐘。二抗用PBS洗滌3次。為了顯示生物素化的二抗，加入兩滴辣根過氧化物酶(HRP)-鏈霉抗生物素綴合物(購自Zymed)，在潮濕的室中溫育10分鐘，隨后在PBS中洗滌3次。最后，為了檢測HRP綴合的鏈霉抗生物素，加入兩滴氨乙基咔唑(AEC Single SolutionChromogen/Substrate，Zymed)HRP底物，在潮濕的室中溫育6分鐘，隨后用PBS洗滌3次。通過將載玻片浸在2％的蘇木精溶液(Sigma-Aldrich Corp.，St Louis，MO，美國，Cat.No.GHS-2-32)中25秒鐘進行復染，隨后將載玻片在自來水下洗滌并用蓋玻片覆蓋。
如在圖1-5和隨后實施例部分的實施例1中的表1所示的，使用抗HLA-G抗體(MEM-G/1，Abcam，Cat.No.ab7759，Cambridge，英國)和/或抗PLAP抗體(Zymed，Cat.No.18-0099，San Francisco，CA，美國)在230/255份經子宮頸的樣品中檢測到滋養層細胞。
將會意識到免疫染色后，在熒光或光學顯微鏡下(視染色方法而定)觀察免疫學陽性細胞(即，滋養層)，且優選地使用例如，CCD照相機進行照相。為了將相同樣品的相同滋養層細胞進一步進行染色體和/或DNA分析，將在載玻片上的這些細胞的位置(即，坐標位置)儲存在與其相連的顯微鏡或計算機中以用于后來的參考。能鑒定和儲存細胞坐標的顯微鏡系統的實例包括Bio View DuetTM(Bio ViewLtD，Rehovot，以色列)，以及Applied Imaging System(Newcastle英國)，基本上如在Merchant，F.A.和Castleman K.R.(Hum.Repr.Update，2002，8509-521)中所描述的。
如以前所提到的，一旦在含有滋養層的細胞樣品內鑒定了滋養層細胞，則對其進行原位染色體和/或DNA分析。
如這里所使用的，“原位染色體和/或DNA分析”指分析細胞內的染色體和/或DNA，其中使用熒光原位雜交(FISH)和/或引物介導的原位標記(PRINS)。
根據本發明的方法，在相同含有滋養層的細胞樣品中順序地進行免疫染色和原位染色體和/或DNA分析。
將會意識到需要特殊的處理來制備可改進以用于第二種染色方法(例如，FISH)的已經免疫染色的細胞。這種處理包括，例如，洗掉結合的抗體(使用例如，水和逐級的乙醇系列)、暴露細胞核(使用例如，甲醇-乙酸固定劑)以及消化蛋白(使用例如，胃蛋白酶)，基本上如在隨后實施例部分的實施例1中的“材料和實驗方法”和在Strehl S，Ambros PF(Cytogenet.Cell Genet.1993，6324-8)中所描述的。
使用FISH分析分裂間期染色體的方法在現有技術中是已知的。簡要地，將直接標記的探針[例如，CEP X綠色和Y橙色(Abbott catno.5J10-51)]與雜交緩沖液(例如，LSI/WCP，Abbott)和載體DNA(例如，人Cot1 DNA，購自Abbott)混合。將探針溶液應用到含有例如，經子宮頸的cytospin樣品的顯微鏡載玻片上，并用蓋玻片覆蓋載玻片。將含有探針的載玻片在70℃變性3分鐘，并使用雜交裝置(例如，HYBrite，Abbott Cat.No.2J11-04)在37℃進一步溫育48小時。雜交后，將載玻片在72℃溶于60mM NaCl和6mM檸檬酸鈉(0.4XSSC)的0.3％NP-40(Abbott)溶液中洗滌2分鐘。然后將載玻片在室溫下在溶于2XSSC的0.1％NP-40溶液中浸1分鐘，隨后將載玻片在黑暗中干燥。使用，例如DAPI II復染劑(Abbott)進行復染。
在基因缺失的檢測(Tharapel SA和Kadandale JS，2002.Am.J.Med.Genet.107123-126)、測定胎兒性別(Orsetti，B.，等，1998.Prenat.Diagn.181014-1022)和在染色體非整倍體性鑒定(Mennicke，K.等，2003.Fetal Diagn.Ther.18114-121)中已經使用PRINS分析。
進行PRINS分析的方法在現有技術中是已知的，并且包括例如，在Coullin，P.等(Am.J.Med.Genet.2002，107127-135)；Findlay，I.，等(J.Assist.Reprod.Genet.1998，15258-265)；Musio，A.，等(Genome 1998，41739-741)；Mennicke，K.，等(Fetal Diagn.Ther.2003，18114-121)；Orsetti，B.，等(Prenat.Diagn.1998，181014-1022)中所描述的那些方法。簡要地，將含有分裂間期染色體的載玻片在溶于2 X SSC(pH7.2)的70％甲酰胺的溶液中，在71℃變性2分鐘，在乙醇系列(70、80、90和100％)中脫水并且置于可編程的溫度循環儀(如購自MJ Research，Waltham，Massachusetts，美國的適合玻璃載玻片的PTC-200熱循環儀)平坦的平板塊上。通常在存在未標記的引物以及dNTPs與標記的dUTP(例如，分別用于直接或間接檢測的熒光素-12-dUTP或洋地黃毒苷-11-dUTP)的混合物時進行PRINS反應。可選擇地，或者另外，可使用例如，1-3熒光素或花菁3(Cy3)分子在5’端標記序列特異性引物。因此，一般的PRINS反應混合物包括序列特異性引物(50μl反應體積中50-200pmol)、未標記的dNTPs(0.1mM的dATP、dCTP、dGTP以及0.002mM的dTTP)、標記的dUTP(0.025mM)和帶有適當反應緩沖液的Taq DNA聚合酶(2單位)。一旦載玻片達到所需的退火溫度，則將反應混合物應用到載玻片上并且使用蓋玻片覆蓋載玻片。使序列特異性引物退火15分鐘，隨后將引發的鏈在72℃延伸另外15分鐘。延伸后，在室溫下將載玻片在4XSSC/0.5％Tween-20溶液中洗滌3次(每次4分鐘)，隨后在PBS中洗滌4分鐘。然后使用DAPI或碘化丙錠對載玻片進行核復染。可使用熒光顯微鏡和適當的濾色片組合(例如，DAPI、FITC、TRITC、FITC-羅丹明)觀察熒光染色的載玻片。
將會意識到可在使用不同5’綴合物的相同PRINS運行中使用幾種對幾種靶特異的引物。因此，PRINS分析可用作測定是否存在，和/或定位幾種基因或染色體基因座的多色試驗。
另外，如在Coullin等，(2002，同上)所描述的，可在與FISH分析相同的載玻片上進行PRINS分析，優選地，先于FISH分析。
總的說來，如在隨后的表1和在實施例部分的實施例1中進一步顯示的，通過使用胎盤活組織檢查、羊膜腔穿刺術或CVS的胎兒細胞所獲得的核型結果證實，在92.89％的含有滋養層的經子宮頸的樣品中獲得了成功的FISH結果。
由于在使用滋養層特異性抗體免疫染色的相同細胞上進行染色體和/或DNA分析，所以可使用本發明的方法測定胎兒性別和/或在胎兒中鑒定至少一種染色體異常。
根據本發明的優選實施方案，染色體異常可以是染色體非整倍體性(即，完全和/或部分三體性和/或單體性)、易位、亞端粒重排、缺失、微小缺失、倒位和/或重復(即，完全和/或部分染色體重復)。
根據本發明的優選實施方案，通過本發明所檢測的三體性可以是21三體性[使用例如，LSI 21q22橙色標記的探針(Abbott cat no.5J13-02)]、18三體性[使用例如，CEP 18綠色標記的探針(Abbott CatNo.5J10-18)；CEP18(D18Z1，α隨體)Spectrum OrangeTM探針(Abbott Cat No.5J08-18)]、16三體性[使用例如，CEP 16探針(AbbottCat.No.6J37-17)]、13三體性[使用例如，LSI13SpectrumGreenTM探針(Abbott Cat.No.5J14-18)]，以及可使用例如，CEP X綠色和Y橙色探針(Abbott cat no.5J10-51)；和/或CEPXSpectrumGreenTM/CEPY(μ隨體)SpectrumOrangeTM探針(AbbottCat.No.5J10-51)檢測的XXY、XYY或XXX三體性。
將會意識到根據本發明的教導，可使用各種染色體特異性FISH探針或PRINS引物在胎兒細胞中檢測各種其它三體性和部分三體性。這些包括，但不限于，部分1q32-44三體性(Kimya Y等，Prenat Diagn.2002，22957-61)、具有10p三體性的9p三體性(Hengstschlager M等，Fetal Diagn Ther.2002，17243-6)、4三體性鑲嵌現象(Zaslav AL等，Am J Med Genet.2000，95381-4)、17p三體性(De Pater JM等，Genet Couns.2000，11241-7)、部分4q26-qter三體性(Petek E等，Prenat Diagn.2000，20349-52)、9三體性(Van den Berg C等，Prenat.Diagn.1997，17933-40)、部分2p三體性(Siffroi JP等，Prenat Diagn.1994，141097-9)、部分1q三體性(DuPont BR等，Am J Med Genet.1994，5021-7)以及部分6p三體性/6q單體性(Wauters JG等，ClinGenet.1993，44262-9)。
也可使用本發明的方法檢測幾種染色體單體性如，22、16、21和15單體性，已知其涉及妊娠流產(Munne，S.等，2004.Reprod BiomedOnline.881-90)]。
根據本發明的優選實施方案，通過本發明的方法所檢測的單體性可以是X單體性、21單體性、22單體性[使用例如，LSI 22(BCR)探針(Abbott，Cat.No.5J17-24)]、16單體性(使用例如，CEP 16(D16Z3)Abbott，Cat.No.6J36-17)以及15單體性[使用例如，CEP15(D15Z4)探針(Abbott，Cat.No.6J36-15)]。
將會意識到在攜帶者的親代中幾種易位和微小缺失可以是無癥狀的，然而在后代中可導致嚴重的遺傳疾病。例如，攜帶15q11-q13微小缺失的健康母親可生出具有Angelman綜合征的孩子，所述綜合征是一種嚴重的神經變性障礙。因此，使用例如對這種缺失特異的FISH探針，本發明可用于鑒定胎兒中的這種缺失(Erdel M等，Hum Genet.1996，97784-93)。
因此，如果父母中的一方是這種異常的已知攜帶者，那么本發明也可用于檢測任何染色體異常。這些包括，但不限于，少量超數標記染色體(SMC)的鑲嵌性(Giardino D等，Am J Med Genet.2002，111319-23)；t(11；14)(p15；p13)易位(Benzacken B等，PrenatDiagn.2001，2196-8)；未平衡的易位t(8；11)(p23.2；p15.5)(Fert-Ferrer S等，Prenat Diagn.2000，20511-5)；11q23微小缺失(Matsubara K，Yura K.Rinsho Ketsueki.2004，4561-5)；Smith-Magenis綜合征17p11.2缺失(Potocki L等，Genet Med.2003，5430-4)；22q13.3缺失(Chen CP等，Prenat Diagn.2003，23504-8)；Xp22.3微小缺失(Enright F等，Pediatr Dermatol.2003，20153-7)；10p14缺失(Bartsch O，等，Am J Med Genet.2003，117A1-5)；20p微小缺失(Laufer-Cahana A，Am J Med Genet.2002，112190-3.)、DiGeorge綜合征[del(22)(q11.2q11.23)]、Williams綜合征[7q11.23和7q36缺失，Wouters CH，等，Am J Med Genet.2001，102261-5.]；1p36缺失(Zenker M，等，Clin Dysmorphol.2002，1143-8)；2p微小缺失(Dee SL等，J Med Genet.2001，38E32)；1型神經纖維瘤(17q11.2微小缺失，Jenne DE，等，Am J Hum Genet.2001，69516-27)；Yq缺失(Toth A，等，Prenaat Diagn.2001，21253-5)；Wolf-Hirschhorn綜合征(WHS，4p16.3微小缺失，Rauch A等，Am J Med Genet.2001，99338-42)；1p36.2微小缺失(Finelli P，Am J Med Genet.2001，99308-13)；11q14缺失(Coupry I等，J MedGenet.2001，3835-8)；19q13.2微小缺失(Tentler D等，J Med Genet.2000，37128-31)；Rubinstein-Taybi(16p13.3微小缺失，Blough RI，等，Am J Med Genet.2000，9029-34)；7p21微小缺失(Johnson D等，Am J Hum Genet.1998，631282-93)；Miiler-Dieker綜合征(17p13.3)、17p11.2缺失(Juyal RC等，Am J Hum Genet.1996，58998-1007)；2q37微小缺失(Wilson LC等，Am J Hum Genet.1995，56400-7)。
可使用本發明檢測倒位[例如，倒位的X染色體Lepretre，F.等，Cytogenet.Genome Res.2003.101124-129；Xu，W.等，Am.J.Med.Genet.2003.120A434-436)、倒位的10號染色體(Helszer，Z.，等，2003.J.Appl.Genet.44225-229)]、隱蔽的亞端粒染色體重排(Engels，H.，等，2003.Eur.J.Hum.Genet.11643-651；Bocian，E.，等，2004.Med.Sci.Monit.10CR143-CR151)和/或重復(Soler，A.，等，Prenat.Diagn.2003.23319-322)。
因此，可使用本發明的教導鑒定胎兒中的染色體畸變，而不對母親進行侵入性的和有風險的操作。
例如，根據本發明的教導，為了測定胎兒性別和/或是否存在唐氏綜合征胎兒(即，21三體性)，使用Pap涂抹細胞刷從妊娠第7周到第11周的懷孕婦女中獲得經子宮頸的細胞。將細胞在存在1％青霉素鏈霉素抗生素的RPMI-1640組織培養基(Beth Haemek，以色列)中重懸，并且根據生產商的使用說明使用Cytofunel ChamberCytocentrifuge(Thermo-Shandon，英國)制備cytospin載玻片。將cytospin載玻片在95％的乙醇中脫水直到進行免疫組織化學分析。
在免疫組織化學分析前，將cytospin載玻片在70％乙醇和水中水合、用PBS洗滌、用3％過氧化氫處理，隨后在PBS中洗滌三次并與封閉劑(來自Zymed HISTOSTAIN-PLUS試劑盒，Cat No.858943)溫育。根據生產商的使用說明，在載玻片上應用HLA-G抗體(mAb 7759，Abcam Ltd.，Cambridge，英國)，溫育60分鐘，隨后在PBS中洗滌3次。向載玻片上添加生物素化的山羊抗小鼠IgG二抗(Zymed HISTOSTAIN-PLUS試劑盒，Cat No.858943)，溫育10分鐘，隨后在PBS中洗滌3次。然后根據生產商的使用說明，使用HRP-鏈霉抗生物素綴合物(Zymed HISTOSTAIN-PLUS試劑盒，Cat No.858943)和氨乙基咔唑(AEC Single SolutionChromogen/Substrate，Zymed)HRP底物回收二抗。使用蘇木精溶液(Sigma-Aldrich Corp.，St Louis，MO，美國，Cat.No.GHS-2-32)進行復染。使用光學顯微鏡(AX-70Provis，Olympus，日本)和與其連接的CCD照相機(Applied Imaging，Newcastle，英國)觀察免疫染色的經子宮頸的樣品并照相，并使用顯微鏡坐標標記HLA-G陽性滋養層細胞的位置。
然后在水中洗滌含有HLA-G陽性細胞的載玻片，在70％和100％的乙醇中脫水，并且在甲醇-乙酸(以3∶1比率)固定劑溶液中固定10分鐘。然后將載玻片在2 X SSC的溫溶液(在37℃)中洗滌，在溶于PBS的0.9％的甲醛中固定并在PBS中洗滌。在FISH分析前，將載玻片用胃蛋白酶溶液(溶于0.01N HCl中，0.15％)消化，在乙醇系列中脫水并干燥。
對于測定胎兒性別，將7μl LSI/WCP雜交緩沖液(Abbott)與1μl含有著絲點區Xp11.1-q11.1(DXZ1)和Yp11.1-q11.1(DYZ3)的直接標記的CEP X綠色和Y橙色探針(Abbott cat no.5J10-51)、1μl人Cot1 DNA(1μg/μl，Abbott，Cat No.06J31-001)以及2μl純化的雙蒸水混合。將探針-雜交溶液離心1-3秒并且在每個載玻片上應用11μl探針-雜交溶液，隨后立即使用蓋玻片覆蓋載玻片。然后將載玻片在70℃變性3分鐘并在HYBrite裝置(Abbott Cat.No.2J11-04)中在37℃進一步溫育48小時。雜交后，將載玻片在溶于0.4 X SSC的0.3％NP-40中洗滌，隨后在溶于2 X SSC的0.1％NP-40中洗滌，并且使其在黑暗中干燥。使用DAPI II(Abbott)進行復染。然后根據以前標記的HLA-G陽性細胞的位置，使用熒光顯微鏡(AX-70Provis，Olympus，日本)觀察載玻片并照相。
為了測定是否存在或缺乏唐氏綜合征胎兒，第一組FISH分析后將載玻片在1 X SSC中洗滌(20分鐘，室溫下)，隨后將它們在71℃純化的雙蒸水中浸10秒種。然后將載玻片在乙醇系列中脫水并干燥。使用含有21q22.13到21q22.2區內的D21S259、D21S341和D21S342基因座的LSI 21q22橙色標記的探針(Abbott cat no.5J13-02)以及如第一組FISH探針所使用的相同雜交和洗滌條件實現雜交。使用熒光顯微鏡和HLA-G陽性滋養層細胞的相同坐標觀察第二組FISH探針雜交后所獲得的FISH信號。
發現使用分裂間期染色體13、18、21、X和Y的FISH探針將臨床上顯著畸形的剩余風險從分裂間期FISH測定前的0.9-10.1％降低到正常分裂間期FISH型后的0.6-1.5％[Homer J，等，2003.Residualrisk for cytogenetic abnormalities after prenatal diagnosis byinterphase fluorescence in situ hybridization(FISH).Prenat Diagn.23566-71]。因此，可使用本發明的教導，通過提供一種有效的產前診斷方法顯著降低臨床上異常嬰兒的風險。
當前在從CVS和/或羊膜腔穿刺術細胞樣品中獲得的DNA樣品上使用基于PCR的或RFLP分析進行產前親子關系試驗(Strom CM，等，Am J Obstet Gynecol.1996，1741849-53；Yamada Y，等，2001.J Forensic Odontostomatol.，191-4)。
將會意識到也可使用激光捕獲顯微解剖在經子宮頸的和/或子宮內樣品中存在的滋養層細胞上進行產前親子關系試驗。
使用細胞的激光捕獲顯微解剖從載玻片上含有的異種細胞群中選擇性地分離特異性細胞類型。使用激光捕獲顯微解剖的方法在現有技術中是已知的(見，例如Fein，Howard等的美國專利申請No.20030227611；Micke P，等，2004.J.Pathol.，202130-8；Evans EA，等，2003.Reprod.Biol.Endocrinol.154；Bauer M，等2002.Paternitytesting after pregnancy termination using laser microdissection ofchorionic villi.Int.J.Legal Med.11639-42；Fend，F.和Raffeld，M.2000，J.Clin.Pathol.53666-72)。
例如，將含有滋養層的細胞樣品(例如，經子宮頸細胞的cytospin載玻片)與激光活化后能附著到特異性細胞上的選擇性活化的表面(例如，熱塑性的膜)接觸。基本上如在隨后實施例部分的實施例1中所描述的對細胞樣品進行免疫染色(使用例如，HLA-G或PLAP抗體)。免疫染色后，使用顯微鏡觀察細胞樣品以鑒定免疫染色的滋養層細胞(即，分別是HLA-G或PLAP陽性細胞)。一旦鑒定，則經光學纖維發送的激光束[例如，使用PALM Microbeam系統(PALM MicrolaserTechnologies AG，Bernreid，德國)]激活附著到所選滋養層細胞上導致其顯微解剖和分離的表面。
一旦分離，可使用例如，對短串連重復(STRs)和/或D1S80基因座特異的PCR引物，和/或對多基因座(Myo)和單基因座(pYNH24)特異的RFLP探針，基本上如在Strom CM，等，(同上)和YamadaY，等，(同上)中所描述的，對滋養層細胞進行PCR和/或RFLP分析。
預計在本專利的保護期限期間將會開發許多相關的染色方法，并且術語染色的范圍意在包括所有這些由此演繹的新技術。
如這里所使用的術語“約”指±10％。
在研究下列實施例后，本發明的另外目的、優點以及新的特征對于本領域普通技術人員來說將是顯而易見的，其不意在用于限制。另外，在上文所描繪的和在下面權利要求部分中所要求的本發明的各種實施方案和方面中的每一種都能在下列實施例中得到實驗的支持。
實施例現在參考下列實施例，與上面描述一起，以非限制方式舉例說明本發明。
通常，這里所使用的術語和在本發明中利用的實驗室方法包括分子的、生物化學的、微生物學的以及重組DNA技術。在現有技術中完全解釋了這些技術。見，例如，“Molecular CloningA laboratoryManual”Sambrook等，(1989)；“Current Protocols in MolecularBiology”I-III卷Ausubel，R.M.，編(1994)；Ausubel等，“CurrentProtocols in Molecular Biology”，John Wiley和Sons，Baltimore，Maryland(1989)；Perbal，“A Practical Guide to MolecularCloning”，John Wiley & Sons，New York(1988)；Watson等，“Recombinant DNA”，Scientific American Books，New York；Birren等(編)“Genome AnalysisA Laboratory Manual Series”，Vols.1-4，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York(1998)；如在美國專利Nos.4,666,828；4,683,202；4,801,531；5,192,659和5,272,057中闡述的方法學；“Cell BiologyA Laboratory Handbook”，I-III卷Cellis，J.E.，編(1994)；Freshney，Wiley-Liss編“Culture of AnimalCells-A Manual of Basic Technique”，N.Y.(1994)，第三版；“CurrentProtocols in Immunology”I-III卷Coligan J.E.，編(1994)；Stites等(編)，“Basic and Clinical Immunology”(第8版)，Appleton &Lange，Norwalk，CT(1994)；Mishell和Shiigi(編)，“SelectedMethods in Cellular Immunology”，W.H.Freeman and Co.，New York(1980)；在專利和科學文獻中廣泛描述了可利用的免疫測定，見，例如，美國專利Nos.3,791,932；3,839,153；3,850,752；3,850,578；3,853,987；3,867,517；3,879,262；3,901,654；3,935,074；3,984,533；3,996,345；4,034,074；4,098,876；4,879,219；5,011,771和5,281,521；“Oligonucleotide Synthesis”Gait，M.J.，編(1984)；“Nucleic AcidHybridization”Hames，B.D.，和Higgins S.J.，編(1985)；“Transcription and Trahslation”Hames，B.D.，和Higgins S.J.，編(1984)；“Animal Cell Culture”Freshney，R.I.，編(1986)；“Immobilized Cells and Enzymes”IRL Press，(1986)；“A PracticalGuide to Molecular Cloning”Perbal，B.，(1984)和“Methods inEnzymology”Vol.1-317，Academic Press；“PCR ProtocolsA GuideTo Methods And APPlications”，Academic Press，San Diego，CA(1990)；Marshak等，“Strategies for Protein Purification andCharacterization-A Laboratory Course Manual”CSHL Press(1996)；“In Situ Hybridization Protocols”，Choo，K.H.A.，編HumanaPress，Totowa，New Jersey(1994)；所有這些都引入作為參考，如同這里完全闡述的一樣。整個這篇文件提供其它一般的參考文獻。這里的方法據信在現有技術中是公知的并且為了讀者的方便提供。將這里所包含的所有信息引入作為參考。
實施例1從經子宮頸樣品中獲得的絨毛外滋養層細胞測定胎兒FISH型如下所述，使用免疫組織化學染色分析從妊娠第6周至第15周懷孕的婦女中獲得的經子宮頸細胞，隨后進行FISH分析。
材料和實驗方法研究受試者-在妊娠的第6周至第15周的懷孕婦女，其被安排進行妊娠終止或者被邀請進行常規妊娠檢查，在獲得她們的書面同意后被編入研究中。
經子宮頸細胞的取樣-將Pap涂抹細胞刷(MedScand-AB，Malm，瑞典)通過外口插到最深2cm(刷的長度)，將其完全旋轉(即，360°)后取出。為了取下刷上捕獲的經子宮頸的細胞，將刷子在含有2-3ml存在1％青霉素鏈霉素抗生素的RPMI-1640培養基(Beth Haemek，以色列)的試管中振蕩。然后通過將1-3滴含有經子宮頸細胞的RPMI-1640培養基滴到Cytofunel ChamberCytocentrifuge(Thermo-Shandon，英國)中制備cytospin載玻片(每個經子宮頸的樣品6個載玻片)。用于細胞離心的條件取決于經子宮頸樣品的細胞的模糊度；如果樣品僅含有少量細胞，則首先將細胞離心5分鐘，然后用1ml新鮮RPMI-1640培養基重懸。將cytospin載玻片保藏在95％乙醇中。
經子宮頸細胞的免疫組織化學(IHC)染色-將含有經子宮頸細胞的cytospin載玻片在70％乙醇溶液中洗滌并在蒸餾水中浸5分鐘。在PBS中進行所有洗滌，所述PBS包括封閉劑，同時輕輕振蕩載玻片。然后將載玻片轉移到潮濕的室中，用磷酸緩沖鹽水(PBS)洗滌3次。為了顯示顯微鏡載玻片上細胞的位置，使用Pap Pen(ZymedLaboratories Inc.，San Francisco，CA，美國)標記經子宮頸樣品的邊界。向每個載玻片加入50微升3％過氧化氫(Merck，德國)，室溫下溫育10分鐘，隨后將載玻片在PBS中洗滌3次。為了避免抗體的非特異性結合，向每個載玻片上加入兩滴封閉劑(ZymedHISTOSTAIN-PLUS試劑盒，Cat No.858943)，在潮濕的室中溫育10分鐘。為了鑒定經子宮頸樣品中的胎兒滋養層細胞，向載玻片加入50μl在抗體稀釋液(Zymed)中1200稀釋的對絨毛外滋養層細胞特異的非經典I型主要組織相容性復合體(MHC)抗原的HLA-G抗體(mAb 7759，Abcam Ltd.，Cambridge，英國)部分(Loke，Y.W.等，1997.Tissue Antigens 50135-146)，或者50μl在抗體稀釋液中1∶200稀釋的對合胞體滋養層和/或細胞滋養層特異的抗人胎盤堿性磷酸酶抗體(PLAP Cat.No.18-0099，Zymed)(Leitner，K.等，2001.Placentalalkaline phosphatase expression at the apical and basal plasmamembrane in term villous trophoblasts.J.Histochemistry andCytochemistry，491155-1164)。將載玻片與抗體在潮濕的室中溫育60分鐘，隨后將它們用PBS洗滌3次。為了檢測結合的HLA-G特異性一抗，向每個載玻片加入兩滴生物素化的山羊抗小鼠IgG二抗(Zymed HISTOSTAIN-PLUS試劑盒，Cat No.858943)，在潮濕的室中溫育10分鐘。二抗用PBS洗滌3次。為了顯示生物素化的二抗，加入兩滴辣根過氧化物酶(HRP)-鏈霉抗生物素綴合物(ZymedHISTOSTAIN-PLUS試劑盒，Cat No.858943)，在潮濕的室中溫育10分鐘，隨后在PBS中洗滌3次。最后，為了檢測HRP綴合的鏈霉抗生物素，加入兩滴氨乙基咔唑(AEC Single SolutionChromogen/Substrate，Zymed)HRP底物，在潮濕的室中溫育6分鐘，隨后用PBS洗滌3次。通過將載玻片在2％蘇木精溶液(Sigma-Aldrich Corp.，St Louis，MO，美國，Cat.No.GHS-2-32)中浸25秒進行復染，隨后將載玻片在自來水下洗滌并用蓋玻片覆蓋。
免疫組織化學染色的顯微鏡分析-使用光學顯微鏡(AX-70，Provis，Olympus，日本)掃描含有經子宮頸細胞的免疫染色的載玻片，并用顯微鏡中的坐標數標記染色的細胞(滋養層)的位置。
FISH分析前免疫組織化學染色的載玻片的預處理-免疫組織化學染色后，將載玻片在雙蒸水中浸5分鐘，在70％和100％乙醇中脫水，每種5分鐘，并在甲醇-乙酸(以3∶1比率，Merck)固定劑溶液中固定10分鐘。然后將載玻片在pH7.0-7.5，300mM NaCl，30mM檸檬酸鈉(2 X SSC)的溫溶液(在37℃)中浸20分鐘。溫育后，排干過量的2 X SSC溶液并且在室溫下將載玻片在溶于PBS的0.9％甲醛溶液中固定15分鐘。然后將載玻片在PBS中洗滌10分鐘并將細胞在37℃在溶于0.01N HCl的0.15％胃蛋白酶溶液(Sigma)中消化15分鐘。胃蛋白酶消化后，將載玻片在PBS中洗滌10分鐘并使其干燥。為了確保完全脫水，將載玻片浸在70％、85％和100％乙醇系列中(每種1分鐘)，并在培養箱中45-50℃干燥。
FISH探針-使用雙色技術和隨后的直接標記的探針(Abbott，Illinois，美國)進行FISH分析性染色體CEP X綠色和Y橙色(Abbott cat no.5J10-51)；CEPXSpectrumGreenTM/CEPY(μ，隨體)SpectrumOrangeTM(Abbott Cat.No.5J10-51)；CEP X/Y由用SpectrumGreenTM直接標記的、并與SpectrumOrangeTM直接標記的探針混合的對著絲點區Xp11.1-q11.1(DXZ1)特異的μ隨體DNA組成，其中所述探針對包含在著絲點區Yp11.1-q11.1(DYZ3)內的μ隨體DNA序列是特異的。
21號染色體橙色標記的LSI 21q22(Abbott cat no.5J13-02)。LSI 21q22探針含有與21號染色體長臂上21q22.13到21q22.2區內的D21S259、D21S341和D21S342基因座互補的獨特的DNA序列。
13號染色體LSI13SpectrumGreenTM探針(Abbott Cat.No.5J14-18)，其包括成視網膜細胞瘤基因座(RB-113)和對13號染色體13q14區特異的序列。
18號染色體綠色標記的CEP 18(Abbott Cat No.5J10-18)；CEP18(D18Z1，α隨體)Spectrum OrangeTM(ABBOTT Cat No.5J08-18)。CEP 18探針由對包含在18號染色體著絲點區(18p11.1-q11.1)內的α隨體DNA(D18Z1)特異的DNA序列組成。
16號染色體CEP16(Abbott Cat.No.6J37-17)探針與16號染色體(16q11.2)的著絲點區(隨體II，D16Z3)雜交。用spectrum綠色熒光團直接標記CEP16探針。
AneuVysion探針用于18號染色體(Aqua)、X染色體(綠色)、Y染色體(橙色)的CEP探針以及用于13號染色體的綠色和21號染色體的橙色LSI探針。這種FDA批準的試劑盒(Abbott cat.#5J37-01)包括陽性和陰性對照載玻片、20 X SSC、NP-40、DAPI II復染劑和詳細的包裝插頁。
免疫組織化學染色的載玻片上的FISH分析-雜交前，將7μlLSI/WCP雜交緩沖液(Abbott)與1μl直接標記的探針(見上文)、1μl人Cot 1DNA(1μg/μl)(Abbott，Cat No.06J31-001)和2μl純化的雙蒸水混合。將探針-雜交溶液離心1-3秒鐘并在每個載玻片上應用11μl探針-雜交溶液，隨后，使用蓋玻片立即覆蓋載玻片。
通過將解鏈溫度設置到70℃以及將解鏈時間設置為3分鐘，在HYBrite裝置(Abbott Cat.No.2J11-04)中進行原位雜交。在37℃雜交48小時。
雜交后，將載玻片在72℃在溶于60mM NaCl和6mM檸檬酸鈉(0.4 X SSC)的0.3％NP-40(Abbott)溶液中洗滌2分鐘。然后將載玻片在室溫下在溶于2 X SSC的0.1％NP-40溶液中浸1分鐘，隨后使載玻片在黑暗中干燥。使用10μl DAPI II復染劑(Abbott)進行復染，隨后使用蓋玻片覆蓋載玻片。
將載玻片進行重復的FISH分析-對于幾個載玻片，使用不同組探針重復FISH分析。與第一組FISH探針雜交后，將載玻片在150mMNaCl和15mM檸檬酸鈉(1X SSC)中洗滌20分鐘，隨后將載玻片在71℃的純化的雙蒸水中浸10秒鐘。然后將載玻片在70％、85％和100％乙醇系列中脫水，每種2分鐘，并在培養箱中于45-50℃進行干燥。根據如上文所描述的方法進行雜交和雜交后洗滌。
FISH結果的顯微鏡評估-FISH分析后，使用免疫組織化學染色后獲得的標記的坐標鑒定滋養層細胞(即，HLA-G陽性細胞)，并且使用熒光顯微鏡(AX-70Provis，Olympus，日本)觀察這些細胞中的FISH信號。
胎盤組織的取樣和處理-妊娠終止后獲得一塊大約0.25cm2的活組織檢查胎盤組織。使用解剖刀將胎盤組織壓碎成小塊，在含有1∶1比率的KCl(43mM)和檸檬酸鈉(20mM)的溶液中洗滌3次，并在室溫下溫育13分鐘。然后通過添加3滴甲醇-乙酸(以3∶1比率)固定劑溶液溫育3分鐘來固定胎盤組織，隨后將溶液用新鮮的3ml固定劑溶液替換，在室溫下溫育45分鐘。為了將胎盤組織分離成細胞懸浮液，用1-2ml 60％乙酸替換固定劑溶液，振蕩溫育10秒鐘。然后將胎盤細胞懸浮液置于載玻片上風干。
在正在進行的妊娠中進一步證實染色體的FISH分析-使用羊膜腔穿刺術和絨毛膜絨毛取樣(CVS)測定染色體核型并使用超聲掃描(US)測定正在妊娠中的胎兒性別。
實驗結果在母親的經子宮頸的細胞中鑒定絨毛外滋養層細胞-為了鑒定絨毛外滋養層，從懷孕的婦女(妊娠第6-15周)中制備經子宮頸的樣品并使用HLA-G抗體對經子宮頸的細胞進行免疫組織化學染色。如在下文表1中所示的，使用HLA-G和/或PLAP抗體的IHC染色能在255份經子宮頸樣品中的230份中鑒定出絨毛外的、合胞體滋養層或細胞滋養層細胞。在25份經子宮頸的樣品中(所有病例的10％)，經子宮頸的細胞不包括滋養層細胞。在幾個病例中，邀請患者重復進行經子宮頸取樣并進一步證實存在滋養層(沒有顯示)。正如可從下文表1中所計算的，HLA-G陽性細胞的平均數是每個經子宮頸樣品6.67個(包括所有6個cytospin載玻片)。
對絨毛外滋養層細胞進行FISH分析-IHC染色后，對含有HLA-G或PLAP陽性細胞的載玻片進行甲醛和胃蛋白酶處理，隨后使用直接標記的FISH探針進行FISH分析。正如可從下文表1中的數據所計算的，使用FISH探針標記的細胞的平均數是3.44。在大多數病例中，將FISH結果與從胎盤組織(在妊娠終止的病例中)或CVS和/或羊膜腔穿刺術(在正在懷孕的病例中)的細胞核型分析中獲得的結果進行比較。在一些病例中，使用超聲掃描進一步證實胎兒性別。
表1測定經子宮頸樣品的滋養層中的FISH型
表1與IHC和FISH陽性細胞的數目以及使用胎盤活組織檢查、CVS或羊膜腔穿刺術測定性別和/或染色體畸變一起顯示胎兒FISH型測定的成功(+)或失敗(-)。Gest.＝懷孕的妊娠；“錯誤”＝HLA-G或PLAP抗體對母親細胞的非特異性結合和/或FISH分析后殘余的抗體來源的信號；*＝由于細胞數少導致鑲嵌性鑒定的失敗。
在經子宮頸樣品中存在的絨毛外滋養層中鑒定正常男性胎兒-對含有在妊娠第7周和第9周的兩個不同的懷孕婦女(在上文的表1中分別是73和80號病例)中獲得的經子宮頸細胞的載玻片進行HLA-GIHC染色。如在圖1a和1c中所示的，兩個經子宮頸的樣品都包括HLA-G陽性細胞(即，絨毛外滋養層)。為了測定胎兒的性別，IHC染色后，使用CEP X和Y探針對載玻片進行FISH分析。如在圖1b和1d中所示的，在每個病例中檢測對應于男性胎兒的正常FISH型。這些結果證明經子宮頸的樣品在測定胎兒細胞FISH型中的用途。
使用PLAP抗體可在經子宮頸樣品中存在的細胞滋養層細胞中成功地測定FISH型-使用能鑒定合胞體滋養層和絨毛狀細胞滋養層細胞的抗人胎盤堿性磷酸酶(PLAP)抗體對從妊娠第11周的懷孕婦女中獲得的經子宮頸的細胞進行IHC染色(Miller等，1999Hum.Reprod.14521-531)。如在圖2a中所示的，PLAP抗體能鑒定經子宮頸樣品中的絨毛狀細胞滋養層細胞。使用CEP X和Y探針的FISH分析后，在絨毛狀細胞滋養層細胞上存在單一橙色和單一綠色信號(圖2b，白色箭標)證實存在正常男性胎兒。
使用經子宮頸樣品中的絨毛外滋養層診斷唐氏綜合征(21三體性)-將從妊娠第8周的懷孕婦女(上文表1中的第71號病例)中獲得的經子宮頸細胞進行HLA-G IHC染色，隨后使用對Y和21號染色體特異的探針進行FISH分析。如在圖3a-b中所示的，HLA-G陽性細胞(圖3a，用白色箭標標記的細胞)含有3個橙色信號和單一綠色信號(圖3b)，表明在男性胎兒的絨毛外滋養層中存在21三體性(即，唐氏綜合征)。這些結果暗示在經子宮頸樣品制劑中鑒定具有唐氏綜合征胎兒的用途。
使用經子宮頸細胞診斷Turner氏綜合征(XO)-對從妊娠第6周的懷孕婦女中獲得的經子宮頸的細胞(上文表1中第76號病例)進行HLA-G IHC，隨后使用對X和Y染色體特異的探針進行FISH分析。如在圖4a-b中所示，FISH分析(圖4b)后HLA-G-陽性絨毛外滋養層細胞中存在單一綠色信號，表明女性胎兒中存在Turner氏綜合征(即，XO)。這些結果提示在經子宮頸樣品制劑中鑒定具有Turner氏綜合征胎兒的用途。
使用經子宮頸細胞診斷Klinefelter氏鑲嵌性-從妊娠第7周被安排進行妊娠終止的懷孕婦女(上文表1中的第161號病例)中制備經子宮頸樣品的cytospin載玻片。如在圖5a-b中所示的，雖然一個絨毛外滋養層細胞(圖5b，1號細胞)顯示正常FISH型(即，單一X和單一Y染色體)，但第二個滋養層細胞(圖5b，2號細胞)顯示具有兩個X染色體和單一Y染色體的異常FISH型。這些結果提示在男性胎兒中存在Klinefelter氏鑲嵌性。為了證實該結果，將來源于妊娠終止后獲得的胎盤組織的細胞進行相同的FISH分析。如在圖5c中所示的，在胎盤細胞中進一步證實了Klinefelter氏鑲嵌性。因此，可在經子宮頸的樣品中檢測染色體的鑲嵌性。然而，將會意識到這種鑒定可能取決于在經子宮頸的樣品中存在的滋養層細胞(即，IHC陽性細胞)的總數以及取決于滋養層細胞內的鑲嵌細胞的百分率。
在從正在懷孕和妊娠終止前獲得的含有滋養層的經子宮頸樣品中，本發明的聯合檢測方法在92.89％的樣品中成功地測定了胎兒的FISH型-上文表1，總結了妊娠終止前(1-165號病例，表1)或在常規檢查期間(166-255號病例，表1，正在妊娠)，在從妊娠第6周到第15周的懷孕婦女中制備的255份經子宮頸樣品上進行的IHC和FISH分析的結果。本發明的聯合檢測方法(即，IHC和FISH分析)在經子宮頸的樣品中測定胎兒FISH型的總成功率是76.86％。在25/255病例中，由于沒有足夠的IHC陽性細胞而沒有進行FISH分析，在19/255病例中，由于FISH測定的失敗而沒有測定FISH型(表1，用“-”標記的病例)。在剩余的211份病例中，通過使用胎盤活組織檢查、羊膜腔穿刺術或CVS的胎兒細胞所獲得的核型結果進一步證實，在92.89％的病例中成功地在含有滋養層的經子宮頸樣品中測定了胎兒的FISH型(表1，用“+”標記的病例)。在15/211病例中(即，7.11％)，在與HLA-G或PLAP抗體非特異性相互作用的細胞上進行了FISH分析，因此，導致在母親細胞上的FISH雜交(表1，標記為“錯誤”病例)。將會意識到通過改善抗體制備或IHC測定條件，預計將降低與滋養層特異性抗體(例如，HLA-G或PLAP)非特異性相互作用細胞的百分率。
本發明的聯合檢測方法在87.34％來源于正在妊娠的含有滋養層的經子宮頸樣品中成功地測定了胎兒的FISH型-如可從上文表1中所計算的，使用正在妊娠的經子宮頸樣品測定胎兒細胞中FISH型的總成功率是76.67％。在常規檢查期間從懷孕婦女(即，正在懷孕)中獲得的總計90份經子宮頸的樣品中(第166-255號病例，表1)，11份經子宮頸的樣品(12.2％)包含了IHC陰性細胞。在剩余的79份經子宮頸的樣品中，在8份IHC陽性樣品中抗體與母親細胞非特異性相互作用，結果在母親染色體的FISH分析中(標記為“錯誤”的病例，表1)，一個經子宮頸的樣品(第247號病例，表1)由于樣品中滋養層細胞數目少而不能鑒定XY/XXY鑲嵌性，然而，能鑒定XY細胞，且一個經子宮頸的樣品(第174號病例，表1)由于FISH測定的技術問題而不能鑒定。總的來說，在79份IHC陽性(即，含有滋養層)的經子宮頸樣品中的69份(87.34％)中成功地測定了FISH型。
總而言之，這些結果證明經子宮頸的細胞用于測定胎兒滋養層的FISH型的用途。此外，從正在懷孕婦女的經子宮頸樣品所獲得的結果提示，為了測定胎兒性別和常見的染色體畸變(例如，三體性、單體性等)，經子宮頸的細胞在常規產前診斷中的用途。更具體地，可將本發明的聯合檢測方法用于能使用FISH分析檢測的與染色體畸變相關疾病的產前診斷，尤其是，在父母一方是這類疾病，例如，羅伯遜易位t(14；21)、平衡相互易位t(1；19)、小微小缺失綜合征(例如，DiGeorge、Miller-Dieker)、已知倒位(例如，染色體7、10)等疾病攜帶者的情況時。
應當意識到也可能在單獨的實施方案中以組合方式提供為了清楚起見描述在單獨實施方案上下文中的本發明的某些特征。相反地，也可單獨地或以任何適當的亞組合方式提供為了清楚起見描述在單獨實施方案上下文中的本發明的各種特征。
盡管結合其具體實施方案已經描述了本發明，但是很顯然許多備選方案、修改和變化對于本領域技術人員來說將是顯而易見的。因此，意欲包括落在所附權利要求的精神和廣泛范圍內的所有這些備選方案、修改和變化。這里將在本說明書中所提到的所有出版物、專利和專利申請的全部內容結合到本說明書中作為參考，其程度與具體地和單獨地指出在這里結合參考每個單獨的出版物、專利或專利申請的相同的程度。另外，本說明書中任何參考文獻的引用或鑒定不應當被解釋為承認這些參考文獻作為本發明的現有技術。
權利要求
1.一種測定胎兒性別和/或鑒定至少一種胎兒染色體異常的方法(a)免疫染色含有滋養層的細胞樣品以便鑒定至少一種滋養層細胞，和；(b)對所述至少一種滋養層細胞進行原位染色體和/或DNA分析以便測定胎兒性別和/或鑒定至少一種染色體異常。
2.權利要求1的方法，其中從子宮頸和/或子宮獲得所述含有滋養層的細胞樣品。
3.權利要求1的方法，其中使用選自吸引術、細胞刷、棉花拭子、子宮頸內灌洗和子宮內灌洗的方法獲得所述含有滋養層的細胞樣品。
4.權利要求1的方法，其中從妊娠第6周到第15周的懷孕婦女中獲得所述滋養層細胞樣品。
5.權利要求1的方法，其中使用抗滋養層特異性抗原的抗體實現所述免疫染色。
6.權利要求5的方法，其中所述滋養層特異性抗原選自HLA-G、PLAP、PAR-1、Glut12、H315、FT1.41.1、I03、NDOG-1、NDOG-5、BC1、AB-340、AB-154和因子XIII。
7.權利要求1的方法，其中使用熒光原位雜交(FISH)和/或引物介導的原位標記(PRINS)實現所述原位染色體和/或DNA分析。
8.權利要求1的方法，其中所述至少一種染色體異常選自非整倍體性、易位、亞端粒重排、缺失、微小缺失、倒位和重復。
9.權利要求8的方法，其中所述染色體非整倍體性是完全和/或部分三體性。
10.權利要求9的方法，其中所述三體性選自21三體性、18三體性、13三體性、16三體性、XXY、XYY和XXX。
11.權利要求8的方法，其中所述染色體非整倍體性是完全和/或部分單體性。
12.權利要求11的方法，其中所述單體性是X單體性、21單體性、22單體性、16單體性和15單體性。
全文摘要
提供一種非侵入性、無風險的產前診斷方法。根據本發明的方法，為了測定胎兒性別和/或鑒定胎兒染色體的異常，對經子宮頸的樣品進行滋養層特異性免疫染色，隨后進行FISH和/或PRINS分析。
文檔編號G01N33/68GK1798853SQ200480015391
公開日2006年7月5日 申請日期2004年4月1日 優先權日2003年4月3日
發明者A·艾米爾, M·D·費金 申請人:蒙娜麗莎醫療有限公司