蛋白質同種型的測定的制作方法

專利名稱：蛋白質同種型的測定的制作方法
技術領域：
本發明涉及蛋白質測定以及這些蛋白質測定所用的試劑盒，該蛋白質具有兩種或者更多種不同糖基化模式的同種型，例如，糖基化與未糖基化同種型或完全糖基化與部分糖基化同種型。
不同的蛋白質以兩種或者更多種的不同糖基化模式的同種型存在。不同糖基化同種型的這種差別，或相對比例，可能是疾病和機能紊亂或者藥物濫用的征兆，因此需要能夠區分不同糖基化同種型的測定系統。
然而，用抗體來區分內源性蛋白質的不同糖基化同種型是比較困難的，因為與內源性糖基化蛋白質的具體同種型特異性或者優先結合的抗體制備成功率比較低。
臨床上測定一種內源性蛋白質的不同糖基化同種型的相對濃度有臨床意義的一個實例是血液蛋白質的轉鐵蛋白。轉鐵蛋白的氨基酸骨架有兩個位點(Asn 413和Asn 611)，可以接納具有末端唾液酸基團的雙、或三觸角低聚糖側鏈。一個健康的病人，大部分的血液轉鐵蛋白分子帶有4個或者5個唾液酸基團；然而，如果該病人酗酒，那么轉鐵蛋白分子中，沒有唾液酸基團、或者含有2個或者3個唾液酸基團的比率就會相對增加。事實上，缺少1個或2個完整聚糖鏈，也是酗酒者體內轉鐵蛋白同種型的一個特征。(見例如Arndt in Clinical Chemistry 4713-27(2001))。轉鐵蛋白同種型的這種非正常的相對豐度，也出現在碳水化合物不足糖蛋白綜合癥(CDGS)或先天性糖基化疾病(CDG)的病人中，如Keir等在Ann.Clin.Biochem.3620-36(1999).中所討論的那樣。
已經提出這樣的“碳水化合物不足轉鐵蛋白(CDT)”或者“無碳水化合物轉鐵蛋白(CFT)”的各種測定方法；然而那些適合于自動化的方法一般都依賴于應用離子交換樹脂，基于在不同pH時不同轉鐵蛋白同種型被樹脂吸附和釋放不同，將具有3個或者更少唾液酸基團的轉鐵蛋白分子與具有4個或者5個唾液酸基團的轉鐵蛋白分子進行分離。這些測定方法的實例在US-A-4626355(Pharmacia)，WO 96/26444(Axis)和WO 01/42795(Axis)中有所描述。
翻譯后糖基化的任何蛋白質，都可能出現不同的糖基化同種型。因此，除了轉鐵蛋白外，其他臨床上有關的蛋白質也存在不同的糖基化同種型，包括癌癥以及其他疾病的糖基化標記，例如堿性磷酸酯酶(AP)(見Magnusson等Clinical Chemistry441621-1628(1998))、α-甲胎蛋白(AFP)、人絨毛膜促性腺激素(HCG))以及可能的朊病毒蛋白(CD230)。
哺乳動物堿性磷酸酯酶包括一個普遍存在的酶家族。AP是一種糖蛋白酶，存在于細胞質膜的外層糖基磷脂酰肌醇部分作為膜錨著點。肝AP、骨AP和腎AP的(天然)分子量經測定分別為152、166和168kDa。除了在正常骨礦化中的作用外，L/B/KAP在生理學和腫瘤學中的其他功能還不為所知。堿性磷酸酯酶在人血清中以幾種同種型存在。由于翻譯后修飾的多樣性，血清中不同同種型的鑒別是很復雜的。兩個主要的循環AP同工酶，骨骼和肝臟的，因為是單基因產品，只是糖基化不同，所以難于區分。在常規臨床測定中，經常需要總的血清AP來確定骨骼和肝膽管的狀況。已經表明，對總AP活性有貢獻的不同同種型提供有用的臨床信息。事實上，血清中骨AP(BAP)活性的定量測量，能夠提供骨形成程度的指數。
α-甲胎蛋白(AFP)是哺乳動物胎兒發育的主要蛋白質，主要由胎兒肝臟和卵黃囊合成。由于肝癌和卵黃囊瘤經常生成這種蛋白質，因此它通常在診斷中作為腫瘤標記使用。具體的說，在肝細胞癌(HCC)和非精原細胞瘤的生殖細胞瘤(NSGCT)診斷中，AFP作為血清學標記而廣泛使用。AFP在正常妊娠、良性肝臟疾病以及癌癥時也會升高。AFP表現為幾種與疾病相關的碳水化合物結構不同的同種型。現有的測定方法還不能容易的區分這些同種型。
本發明的其他目的糖蛋白包括α-1-酸糖蛋白、α-1-抗胰蛋白酶、結合球蛋白、甲狀腺球蛋白、前列腺特異性抗原、HEMPAS紅細胞帶形核粒細胞3(它與先天性紅細胞生成不良性貧血II型相關)、PC-1漿細胞膜糖蛋白、CD41糖蛋白II b、CD42b糖萼素、CD43白細胞唾液糖蛋白、CD63溶酶體膜結合糖蛋白3、CD66a膽糖蛋白、CD66f妊娠特異性b1糖蛋白、CD164多-糖基化核蛋白質24，和CD235血型糖蛋白族。
我們已經發現，采用抗體或者其他配偶體來識別測定中的不同糖基化蛋白質同種型的問題，可以通過在測定中附加使用蛋白水解酶來解決，該蛋白水解酶可以使目的蛋白質裂解成很多肽片段，所得片段的圖譜具有樣品分析物中糖基化圖譜的特征。分析物蛋白質同種型的這種蛋白水解作用，可以產生其他同種型水解不能產生的片段，并且該片段能夠相應的被特征片段的特異性結合配偶體所識別；或者一種同種型的蛋白水解作用可以產生一系列的片段，在應用碎片分離技術(例如色譜、質譜等)時，這些片段顯示出與其他同種型產生的碎片系列不同的分布類型(光譜)。具體地說，蛋白水解酶是一種在特異性位點，例如在特異性的氨基酸殘基或者在特異性的氨基酸殘基序列上起裂解肽鏈作用的酶。通過這樣的方式，當酶處于目的同種型中時，該同種型就會在這樣的位點發生裂解，但當酶處于其他同種型中，由于其他同種型中糖基化么模式不同，使酶被例如碳水化合物側鏈或者不同三級結構所遮蔽，就不會發生裂解。
如果一種同種型蛋白水解產生的片段不能由其他同種型蛋白水解所產生，那么就可以提供特征抗原表位，這些特征片段的特異性結合配偶體，可以用來測定樣品中其母體同種型的濃度。如果蛋白質水解產生的片段相似(例如抗原性或者沿分離中軸位置相似)但相對濃度不同時，可以測定兩種或者更多種這樣片段的相對濃度，并且用其來測定該樣品中不同同種型的相對豐度以及相應濃度。
因此從一方面來看，本發明提供一種用于具有至少兩種含不同糖基化模式同種型的蛋白質的測定方法，所述方法包括使含有所述蛋白質的樣品與蛋白水解酶接觸，該蛋白水解酶優選蛋白質位點特異性蛋白水解酶，并且檢測由該蛋白質的水解產生的至少一種肽片段的含量或者相對含量。
本發明的方法優選包括對樣品或者產生樣品的物質(例如血液)中目的蛋白質同種型濃度或者相對濃度示數，例如定量、半-定量、或者定性的示數的測定。例如該同種型的濃度可以測定，以該同種型存在的蛋白質的片段可以測定，或者該同種型的濃度或片段可以簡單的通過在預定的閾值，例如病人健康或者不健康情況的閾值之上或之下來測定。然而，一般優選以糖類缺乏同種型的百分比(例如摩爾百分比)來代表糖類的缺乏。為此目的，本發明的測定方法優選包括糖蛋白總量的測定，例如不使用蛋白水解酶平行操作測定。
因為在很多環境下，樣品在含有目的蛋白質的同時還會含有很多其他蛋白質，當蛋白水解產生目的蛋白質某一同種型的特征片段時，會出現“干擾”，例如其他蛋白質所得的肽片段，因此盡管不是嚴格必要，也希望在與蛋白水解酶接觸之前，將目的蛋白質與其他蛋白質分離，以避免這些干擾。這可以通過色譜法、選擇性的吸附到底物上以及從底物上釋放、離心分離、以及其他的標準蛋白質分離技術來實現。然而，為了簡化測定操作，優選采用樣品與底物接觸的方法來實現，該底物上結合著至少對目的蛋白質的目的同種型有特異性結合的配偶體，特別優選用于捕獲目的蛋白質所有同種型的特異性結合配偶體。在此情況下，特異性結合的配偶體優選為抗體或者是抗體片段。那么底物結合蛋白質就會與非結合蛋白質分離例如通過漂洗分離，并且可以任選的在與蛋白水解酶接觸之前，從底物中釋放出來。
因此，從另一方面來看，本發明提供一種用于本發明測定方法的試劑盒，該試劑盒包括蛋白水解酶和用于所述蛋白質的至少兩種和優選所有同種型的底物結合的特異性結合的配偶體(sbp)。該底物結合的sbp優選是在遠離糖基化位點的位點與蛋白質結合sbp。在特別優選的實施方案中，將底物結合的sbp固定在多孔膜上。
只要蛋白質水解發生，就可以通過任何常規技術對特征片段或者特征裂解圖進行測定。然而，為了簡化測定操作，優選對特征片段與特異性結合的配偶體形成的片段sbp結合物進行測定，從而對特征片段進行直接或間接測定。在一個優選實施方案中，本發明的試劑盒進一步含有至少一種任選的標記了的特異性結合的配偶體，該配偶體對于目的蛋白質的一種同種型經酶蛋白水解作用而產生的肽片段具有特異性。
所述試劑盒也優選含有本測定方法的操作說明書，還可以任選含有其他任選標記的能夠與蛋白質sbp結合物和/或片段結合的sbp相結合的第二配偶體。
本發明測定中所使用的sbp典型地為抗體或者抗體片段、寡肽、寡核苷酸、或者小的有機分子。抗體和抗體片段優選，尤其是單克隆抗體。在一個具體實施方案中，可以制備抗體來抗具有與特征蛋白質片段的全部或者部分氨基酸序列相符合(或者相似)的序列的寡肽免疫結合物，如US-A-5773572中所述的那樣。
由蛋白質片段形成的結合物的測定，如上所述，可以是直接或者間接的。可以測定結合物或sbp的特性(例如放射吸收、發射、或散射)，或者可應用其他具有可測定性質或者能夠引起可測定性質或事項的試劑。該其他結合試劑是與所述結合物結合或者與自由sbp結合的試劑，或者是在與其他底物結合中與所述結合物競爭的試劑。采用任選標記的結合試劑對分析物進行的這種直接或者間接測定在診斷測定領域是常規的。
所述蛋白質片段的測定方式，當然要取決于結合試劑的性質，亦即它們是否用報道分子部分，例如放射性標記、發色團、或者熒光染料(亦即熒光基團)標記；它們是否是酶活性的(亦即能催化過程可以測定的反應，例如通過產生光或者是產生可測定的物質)；它們是否形成用光散射可以測定的聚集物，等等。這樣的測定系統在診斷測定領域是常規的。
在本發明方法的優選實施方案中，將特征蛋白質片段的sbp固定在多孔底物上，例如任選具有也固定在相同底物上的目的蛋白質sbp的膜，并且隨著蛋白水解以及特征片段與底物的結合，片段-sbp或者片段-sbp片段結合物的標記的結合配偶體與底物相接觸。隨著對底物的漂洗，底物保留的標記可以直接或間接的表示出特征片段的濃度以及產生該片段的同種型的濃度。
在本發明方法的另一個優選實施方案中，將特征片段與特征片段形成大小足夠被多孔膜保留的結合物的標記sbp與樣品相接觸，樣品在水解之后，通過多孔膜(該膜也可以任選是固定有該蛋白質sbp的膜)。漂洗之后，該膜就可以提供保留在其上的片段標記sbp的直接示數，以及產生該片段的同種型的相應示數。
在類似的實施方案中，可以使用競爭性抗原(例如粒子，如帶有抗原的乳膠粒子)，該抗原與片段-sbp結合產生可被膜保留的結合物。在該實施方案中，最好競爭抗原和片段-sbp中的一個或者兩個要被標記，并且膜的孔徑應該足夠大，不能保留未結合的片段-sbp，并且如果片段-sbp被標記，那么對該片段-sbp片段結合物也不能保留。漂洗之后，該膜可以提供保留的抗原片段-sbp結合物的濃度示數，并間接提供該片段的濃度示數。
在這后兩個實施方案中，優選的標記為發色團、熒光染料，或者尤其是微粒，例如膠體金，如在US-A-5691207、US-A-5650333和EP-A-564449中所述的那樣。
這三個實施方案都尤其適用于在WO 02/090995中所述的平板測定。
正如前面提到過的，對片段的測定也可以通過不需要使用特異性結合配偶體的方法來進行，例如色譜、質譜、核磁共振等。
本發明測定方法中所用的蛋白水解酶，可以是能夠裂解蛋白質的任何酶。然而，尤其優選那些只在特異性位點裂解蛋白質的酶，例如靠近特性異氨基酸殘基或者序列的位置。這樣的特異性蛋白酶的一個實例為天冬酰胺內肽酶類，例如豆球蛋白，它在天冬酰胺部分的C端側裂解酰胺鍵。這種內肽酶的制備例如在US-A-5094952中說明，并且可以從Takara Shuzo Co.Ltd.，Kyoto，Japan商業獲得該酶。其他可以使用的蛋白酶包括，例如無色肽酶、酰氨肽酶、曲霉胃蛋白酶、羧肽酶(A、B或者C)、組織蛋白酶(B、D、G或者H)、木瓜凝乳蛋白酶、二肽基肽酶(I和IV)、內肽酶K、內蛋白酶精氨酸-C、腸肽酶、無花果蛋白酶、明膠酶、γ-Glu-X羧肽酶、谷氨酰基內肽酶、亮氨酰氨肽酶、膜丙氨酰胺氨基肽酶、膜Pro-C羧肽酶、微生物膠原酶、多催化內肽酶復合物、胰彈性蛋白酶、胃蛋白酶A、肽基-Asp金屬內切肽酶、肽基二肽酶、血漿激肽釋放酶、纖維蛋白質溶酶、t-纖溶酶原活化劑、u-纖溶酶原活化劑、焦谷氨酰肽酶、腎素、逆胃蛋白酶、莖菠蘿蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶、凝血酶、組織激肽釋放酶、胰凝乳蛋白酶、鈣蛋白酶、蛋白酶K、梭菌蛋白酶、凝固因子Xa、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶。如果需要，可以同時或者順序使用兩種或者更多種這樣的蛋白酶。尤其優選使用胰凝乳蛋白酶。
在本發明的方法中，優選用蛋白水解酶在使蛋白質被裂解的條件下，將蛋白質培養一定時間，以釋放出不同同種型產生的特征片段。
培養一般要持續1～120分鐘，優選為5～40分鐘，尤其優選溫度從室溫到42℃之間，特別是從室溫到38℃之間。
對于任一種具體的目的蛋白質，為了確定哪些片段要作為分析物應用，通常希望將糖基化和非糖基化同種型裂解，將用色譜方法產生的片段分離后對它們進行比較。之后可以用光譜學來鑒別要選擇的合適片段，并且，如果該蛋白質序列是已知的，且該蛋白酶的裂解是位點特異性的，那么這個被選擇的片段序列就能從一系列可能的片段中被鑒別出來。如此鑒別得到的片段，它的sbp就可以用常規技術來制備。
特別優選采用二模式分離和光譜技術，例如色譜與質譜、或核磁共振聯用對特征片段進行鑒別。
在本發明的一個實施方案中，可以通過表面細胞質基因組共振技術(SPR)來進行測定，該技術是一種非侵入性光學技術，當分子結合或者離解時，SPR感應可以反映出測定器表面上質量濃度的變化。
SPR可以通過叫做Biacore分析(可以從Biacore AB，Uppsala，Sweden獲得)的專用系統來進行。
本發明的方法尤其適合于多樣品測定，例如使用多孔微量滴定板(典型地為n×m孔板，其中n和m是正整數，最大值為20，尤其是96孔微量滴定板)。
本發明測定方法中所用的樣品，典型的為機體組織、器官或體液(例如尿、唾液、粘液、血液等)樣品或者它們產生的樣品。優選樣品為血液或者血液產生的樣品，例如血清。采集樣品的受試種屬，優選為哺乳動物、爬行類動物、鳥類、魚類或甲殼類動物，更優選哺乳動物(特別是人類)。
如果該糖蛋白是細胞結合的、或者是被細胞包囊的，樣品可以用常規方式處理以釋放該糖蛋白。類似的，如果需要，糖蛋白可以進行金屬化(例如如果該蛋白質是一種結合鐵的蛋白質，可以加入鐵離子)、去金屬化或者變性。經預先處理樣品的準確性質取決于所要測定的具體糖蛋白。
本發明中轉鐵蛋白測定方法的一個實例如附圖的

圖1所示。附圖的圖2和圖3表示糖基化和非糖基化轉鐵蛋白被胰凝乳蛋白酶消化后所得蛋白質片段的反相HPLC圖譜。圖1表示本發明測定方法的原理，亦即如何通過它們蛋白質水解的不同，將無唾液酸轉鐵蛋白與正常轉鐵蛋白區分開。柱A是四唾液酸轉鐵蛋白，柱B表示無唾液酸轉鐵蛋白。步驟1表示從血清中固相捕獲轉鐵蛋白。非糖基化和糖基化的轉鐵蛋白同種型都被捕獲。步驟2是抗體-轉鐵蛋白復合物的消化。只有非糖基化的被消化生成獨特的片段圖譜，步驟3是對特異性蛋白質片段的測定。抗體將辨認出肽上的抗原表位，而不是完整的完全糖基化轉鐵蛋白上的抗原。圖2表示糖基化轉鐵蛋白的圖譜，圖3表示非糖基化轉鐵蛋白的圖譜。如圖所示，非糖基化同種型有幾個特征碎片(即基本上是獨特的)。圖4是非糖基化轉鐵蛋白肽序列的一個實例，該肽序列由胰凝乳蛋白酶裂解產生，通過MALDI-TOF和MS-MS進行鑒別。
下表1～3中列出了分子量大于500g/mol的肽片段，這些片段理論上可以由轉鐵蛋白分別經胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、溶媒體-C裂解而得到。通過將片段的免疫結合物應用到載體分子上的抗體制備方法，如US-A-5773572中所述的那樣，可以很容易的制備這些片段的抗體。此測定方法可以簡單的通過HPLC并測定非糖基化轉鐵蛋白特征峰出現的量來實現。
表1
表2
表3
圖4顯示由MALDI-TOF和電噴霧MS-MS實驗測定的肽序列實例，該肽序列是從非糖基化轉鐵蛋白用胰凝乳蛋白酶裂解釋放得到的。該序列是NKSDNCEDTPEAGYF。
該序列是制備只識別非糖基化轉鐵蛋白的裂解產物的單克隆抗體的理想候選物。該序列與去酰胺基的非糖基化15殘基肽結合(compound)，經反相HPLC分離的峰部分MALDI-MS測定的單同位素分子量(mass value)為1690。該肽片段與表1中列出的第9片段緊密結合。
實施例1測定1.向預先涂有抗轉鐵蛋白單克隆抗體的96孔微滴定板單個孔中，加入150μL的血清試驗樣品或者對照樣品，并且于37℃溫和混合下培養大約30分鐘。
2.用200μL 100mM pH7.8含有0.05％的吐溫20的tris HCl緩沖液洗滌孔2次。再用200μL 100mM pH7.8的不含吐溫20的tris HCl緩沖液洗滌1次。
3.向每個孔中加入150μL預熱的100mM pH7.8的tris HCl緩沖液，然后加入10μL測序級胰凝乳蛋白酶(2μg/μL)，并且于37℃培養30分鐘。
4.通過加入10μL于4℃預冷的乙酸終止反應。
5.加入30μL 100mM的TCEP，并繼續培養10分鐘。
6.將每個孔的內容物轉移到預先涂有肽的新孔中。
7.加入50μL125I標記的抗肽抗體，并在37℃培養60分鐘。
8.用100Mm pH7.8含0.05％吐溫20的tris HCl緩沖液洗滌孔3次，并測定結合在板上的125I標記的抗肽抗體的量。
9.將結合抗體的量與標準曲線相比較，測定肽以及最初樣品中相應CDT的量。
實施例2熒光偏振免疫1.向適當容器中加入50μL血清試驗樣品或者對照樣品，用150μL預熱100mM pH7.8含測序級胰凝乳蛋白酶(40μg)tris HCl緩沖液，于35℃培養30分鐘。
2.通過加入標準抗胰凝乳蛋白酶抑制劑(例如100μM的TPCK或抑肽酶)來終止反應。
3.加入30μL 100mM的TCEP，并繼續培養10分鐘。
4.將蛋白水解的裂解混合物轉移到新孔中，新孔內含有預先規定量的已知熒光標記的肽。
5.測量偏振熒光程度，mP。
6.加入50μL抗肽抗體，并于35℃培養5分鐘。
7.第二次測量偏振熒光程度mP’。
8.偏振熒光的差值，反映了與抗體結合的肽的相對量，將差值與標準曲線相比較，測定肽以及最初樣品中相應CDT的量。
權利要求
1.一種用于具有至少兩種含不同糖基化模式的同種型蛋白質的測定方法，該方法包括使含有所述蛋白質的樣品與蛋白水解酶接觸，并且檢測由所述蛋白質的水解產生的至少一種肽片段的含量或者相對含量。
2.根據權利要求1所述的方法，其中所述蛋白質選自轉鐵蛋白、堿性磷酸酯酶、絨毛膜促性腺激素和α-甲胎蛋白。
3.根據權利要求1或2中任一項所述的方法，其中所述酶為蛋白質位點特異性蛋白水解酶。
4.根據前述各項權利要求中任一項所述的方法，其中目的蛋白質在與蛋白水解酶接觸之前，與其他蛋白質分離。
5.一種用于前述各項權利要求中任一項的測定方法的試劑盒，該試劑盒包括蛋白水解酶以及底物結合的對所述蛋白質的至少兩種同種型特異性結合的配偶體(sbp)。
6.根據權利要求5所述的試劑盒，其中所述sbp適用于所述蛋白質的所有同種型。
7.根據權利要求5或6任一所述的試劑盒，其中所述sbp為抗體或者抗體片段。
8.根據權利要求5～7中任一項所述的試劑盒，其中所述sbp在遠離糖基化位點的位點與蛋白質結合。
9.根據權利要求5～8中任一項所述的試劑盒，其中檢測是指對特征肽片段sbp結合物的檢測。
10.根據權利要求5～9中任一項所述的試劑盒，其中所述的sbp是標記的。
11.根據權利要求5～10中任一項所述的試劑盒，其中所述的sbp是用熒光染料標記的。
全文摘要
本發明提供一種具有至少兩種含不同糖基化模式的同種型蛋白質的測定方法，該方法包括使含有所述蛋白質的樣品與蛋白水解酶接觸，并且檢測由所述蛋白質水解后產生的至少一種肽片段的含量或者相對含量。
文檔編號G01N33/68GK1768269SQ200480009126
公開日2006年5月3日 申請日期2004年2月6日 優先權日2003年2月6日
發明者菲利普·D·賴伊 申請人:阿克西斯-希爾德公司