專利名稱：：細胞表面蛋白質的調節的制作方法
技術領域：
：本發明涉及一種調節蛋白質插入或保留在細胞表面膜上的方法。本發明還涉及由細胞表面膜蛋白的異常插入或活性引起的疾病的診斷與治療或預防方法，所述疾病如囊性纖維化(cysticfibrosis)。本發明進一步涉及篩選調節轉運分子進或出細胞的化合物和調節細胞表面蛋白質活性的化合物的方法。
背景技術：
：細胞極性(cellpolarity)的建立及維持是上皮細胞的內在功能。這些獨特功能域的建立涉及其在提供屏障及控制離子和溶質轉運方面的功能。產生所述功能性極化發展的因素包括E-鈣粘蛋白(E-cadherin)介導的細胞-細胞接觸及整聯蛋白(integrin)介導的細胞-胞外基質粘連。這些空間連接通過細胞骨架及信號傳導復合體(signalingcomplex)的區域化組裝(assembly)與細胞內部組分進行通訊。這又接下來指導了細胞表面和分泌系統的重新組織。肌動蛋白細胞骨架通過與含有整聯蛋白及鈣粘蛋白的復合物直接相互作用而在上皮細胞極性的建立中具有重要作用。相似地，肌動蛋白絲系統負責芽殖酵母中的定向分泌。因而，肌動蛋白細胞骨架在不同門物種的極性建立中似乎都具有一定作用。肌動蛋白細胞骨架的極化功能可能超出肌動蛋白絲與含有整聯蛋白及鈣粘蛋白的復合物之間的特異相互作用。肌動蛋白絲本身的同工型(isoform)組合物可以在細胞的不同位置有所區別的證據正在不斷出現。在胃壁(gastricparietal)細胞中，β及γ肌動蛋白同工型在細胞中的分布是不同的，β肌動蛋白主要位于代謝更加活躍的頂端表面。在成熟神經元(adultneuron)中發現了相似的β及γ肌動蛋白極化。極化還延伸到mRNA定位，β肌動蛋白mRNA在與運動性相關的細胞如lamellapodia和生長錐(growth-cone)中特異地定位于外周位點，而γ肌動蛋白mRNA則不是這樣。有很多以上皮細胞極性改變或定向蛋白質運送過程中的缺陷為重要特征的疾病狀態。例如在常染色體多囊腎病(autosomalpolycystickidneydisease)中，基底外側蛋白(basolateralprotein)在頂膜(apicalmembrane)上的異常表達導致產生充滿液體的囊。最近報道了3個基底外側膜組織化所需的細胞骨架結合蛋白，E-鈣粘蛋白、sec6及sec8在患病細胞內異常定位。這導致了向基底外側膜的蛋白及脂質運送受損(Charronetal.，2000，JournalofCellBiology149，111-124)。囊性纖維化是一種常染色體隱性情況，通常是由于ΔF508突變。這個突變導致囊性纖維化跨膜傳導調節蛋白(cysticfibrosistransmembraneconductanceregulator，CFTR)氯離子通道異常。在ΔF508突變導致的囊性纖維化中，CFTR異常折疊，從而在RER中滯留并被降解(Quetal.，1997，JournalofBioenergetics&Biomembranes29，483-490；BrownandBreton，2000，KidneyInternational57，816-824)。另外，具有ΔF508突變的CFTR在頂膜中半衰期縮短(Hedaetal.，2001，AmericanJournalofPhysiology-CellPhysiology280，C166-C174)。在囊性纖維化患者中，肺上皮細胞表面的CFTR蛋白質數量減少。過去已經表明稱為deltaF508的CFTR普通突變形式被滯留于細胞內部并且幾乎沒有拷貝能夠成功到達其所屬的細胞表面。一種理論是CFTR蛋白質被滯留僅僅是因為其未能快速折疊，并且這些錯誤折疊的蛋白質在其獲得到達其位置(即細胞表面)的機會之前即被降解。另一種可能是CFTR被滯留在細胞中是因為其被細胞中另一種蛋白質結合，例如BAP31。因而，任何可以促進CFTR到達細胞表面的試劑都可以是治療囊性纖維化的潛在治療劑。在對局部缺血的反應中，在近端腎小管細胞(renalproximaltubulecell)中同樣觀察到了細胞骨架蛋白質分布的變化(Brownetal.，1997，AmericanJournalofPhysiology273，F1003-F1012)。在大鼠腎中，發現一小時的局部缺血再灌注導致刷狀緣蛋白質、絨毛蛋白和肌動蛋白再定位至基底外側極(Brownetal.，1997，AmericanJournalofPhysiology273，F1003-F1012)。再灌注24小時后觀察到了部分恢復，5日之內完全恢復。本文作者推測皮層肌動蛋白細胞骨架的解離可能允許細胞形狀的改變以使存活細胞(survivingcells)覆蓋細胞損失的區域。在另一研究中，發現近端腎小管細胞局部缺血導致原肌球蛋白與F肌動蛋白解離，原肌球蛋白再定位至微絨毛遠端。這些作者提出原肌球蛋白再定位允許一種競爭性肌動蛋白結合蛋白質，肌動蛋白去寡聚化因子(actindepolymerisingfactor，ADF)去破壞頂端微絲進而破壞頂端微絨毛。上皮細胞極性改變或定向蛋白質輸送過程缺陷導致的疾病狀態(如囊性纖維化)的診斷與治療方法是非常需要的。發明簡述本發明研究了胃腸上皮細胞肌動蛋白微絲的組分及其在運送囊性纖維化跨膜傳導調節蛋白(CFTR)到頂膜中的作用。本研究揭示了一種特異的微絲群體，其含有在單細胞層中極化的原肌球蛋白同工型。這種微絲群體的極化在對細胞-細胞和細胞-基底(substratum)接觸的反應中發生得非常迅速，并且其還涉及未被接觸的微絲的移動。在長時間培養中觀察到了原肌球蛋白同工型和CFTR的共定位(co-localisation)。原肌球蛋白同工型表達降低導致CFTR表面表達和cAMP刺激引起的氯離子外向通量(chlorideefflux)均增加。此結果表明原肌球蛋白同工型可以表示調節蛋白質在細胞膜中的插入和/或保留的頂端微絲群體。因此，本發明第一個方面提供了一種篩選調節細胞表面蛋白質活性的化合物的方法，所述方法包括確定在候選化合物存在的情況下原肌球蛋白的活性或細胞定位，其中相對比于所述化合物不存在時，在所述化合物存在的情況下原肌球蛋白的活性或細胞定位改變提示所述化合物調節所述細胞表面蛋白質的活性。在此方面的一個優選的實施方案中，在所述化合物存在的情況下，原肌球蛋白細胞定位的改變，優選地是極化分布的喪失，提示所述化合物增加了所述細胞表面蛋白質的活性。在另一個方面，本發明提供了一種篩選調節分子轉運進細胞或轉運出細胞的化合物的方法，所述方法包括確定在候選化合物存在的情況下原肌球蛋白的活性或細胞定位，其中相對比于所述化合物不存在時，在所述化合物存在的情況下原肌球蛋白的活性或細胞定位改變提示所述化合物調節分子轉運進細胞或轉運出細胞。在此方面的一個優選的實施方案中，在所述化合物存在的情況下，原肌球蛋白細胞定位的改變，優選地是極化分布的喪失，提示所述化合物增加了分子轉運進和/或出細胞。在另一個方面，本發明提供了一種用于篩選治療囊性纖維化的治療性化合物的方法，所述方法包括在候選化合物存在的情況下確定原肌球蛋白的活性或細胞定位，其中相對比于所述化合物不存在時，在所述化合物存在的情況下原肌球蛋白的活性或細胞定位改變提示所述化合物在治療囊性纖維化中是有用的。在此方面的一個優選的實施方案中，在所述化合物存在的情況下，原肌球蛋白細胞定位的改變，優選地是極化分布的喪失，提示所述化合物在治療囊性纖維化中是有用的。在這些方面的一個獨特的優選實施方案中，原肌球蛋白的細胞定位被視為所述化合物調節分子轉運進細胞或轉運出細胞或調節細胞表面蛋白質活性的能力的指示物。通常顯示原肌球蛋白極化分布的細胞(例如胃腸上皮細胞、成纖維細胞或神經元)優選地被這種篩選方法選擇。在所述候選化合物暴露于所選擇的細胞后，接下來評估原肌球蛋白的定位或分布，并且與未被暴露于所述候選化合物的細胞內的原肌球蛋白的定位或分布對比。在一個優選實施方案中，原肌球蛋白在已被暴露于所述候選化合物的細胞內極化分布的喪失提示所述候選化合物能夠增加細胞表面蛋白質的活性或所述化合物能夠增加分子轉運進和/或出細胞，或所述化合物在治療囊性纖維化中是有用的。在另一個方面，本發明提供了一種篩選調節細胞表面蛋白質的活性的化合物的方法，所述方法包括在候選化合物存在的情況下確定原肌球蛋白的表達水平，其中相對比于所述化合物不存在時，在所述化合物存在的情況下原肌球蛋白表達改變提示所述化合物調節所述細胞表面蛋白質的活性。在此方面的一個優選的實施方案中，在所述化合物存在的情況下，原肌球蛋白表達降低提示所述化合物增加所述細胞表面蛋白質的活性。在另一個方面，本發明提供了一種篩選調節分子轉運進細胞或轉運出細胞的化合物的方法，所述方法包括確定在候選化合物存在的情況下原肌球蛋白的表達水平，其中相對比于所述化合物不存在時，在所述化合物存在的情況下原肌球蛋白表達改變提示所述化合物調節分子轉運進細胞或轉運出細胞。在此方面的一個優選的實施方案中，在所述化合物存在的情況下，原肌球蛋白表達降低提示所述化合物增加分子轉運進細胞或轉運出細胞。在另一個方面，本發明提供了一種用于篩選治療囊性纖維化的治療性化合物的方法，所述方法包括確定在候選化合物存在的情況下原肌球蛋白的表達水平，其中相對比于所述化合物不存在時，在所述化合物存在的情況下原肌球蛋白表達改變提示所述化合物在治療囊性纖維化中是有用的。在此方面的一個優選的實施方案中，在所述化合物存在的情況下，原肌球蛋白表達降低提示所述化合物在治療囊性纖維化中是有用的。在一個優選實施方案中，確定原肌球蛋白的表達水平包括測量原肌球蛋白蛋白質和/或mRNA的量。在一個優選實施方案中，原肌球蛋白蛋白質的量是用抗-原肌球蛋白抗體測量的。在另一個實施方案中，原肌球蛋白相關轉錄物(例如mRNA)的量是通過與原肌球蛋白轉錄物選擇性雜交的多核苷酸樣品接觸來測量的。在另一個方面，本發明提供了一種篩選調節細胞表面蛋白質活性的化合物的方法，所述方法包括測量在候選化合物存在的情況下原肌球蛋白與其結合配偶體(bindingpartner)的結合，其中相對比于所述化合物不存在時，在所述化合物存在的情況下原肌球蛋白與其結合配偶體的結合水平改變提示所述化合物調節細胞表面蛋白質的活性。在此方面的一個優選的實施方案中，在所述化合物存在的情況下，原肌球蛋白與其結合配偶體的結合水平降低提示所述化合物增加細胞表面蛋白質的活性。在另一個方面，本發明提供了一種篩選調節分子轉運進細胞或轉運出細胞的化合物的方法，所述方法包括測量在候選化合物存在的情況下原肌球蛋白與其結合配偶體的結合，其中相對比于所述化合物不存在時，在所述化合物存在的情況下原肌球蛋白與其結合配偶體的結合水平改變提示所述化合物調節分子轉運進細胞或轉運出細胞。在此方面的一個優選的實施方案中，在所述化合物存在的情況下，原肌球蛋白與其結合配偶體的結合水平降低提示所述化合物增加分子轉運進細胞或轉運出細胞。在另一個方面，本發明提供了一種用于篩選治療囊性纖維化的治療性化合物的方法，所述方法包括測量在候選化合物存在的情況下原肌球蛋白與其結合配偶體的結合，其中相對比于所述化合物不存在時，在所述化合物存在的情況下原肌球蛋白與其結合配偶體的結合水平改變提示所述化合物在治療囊性纖維化中是有用的。在此方面的一個優選的實施方案中，在所述化合物存在的情況下，原肌球蛋白與其結合配偶體的結合水平降低提示所述化合物在治療囊性纖維化中是有用的。在本發明這些方面的一個進一步的優選實施方案中，原肌球蛋白結合配偶體選自calponin、CEACAM1、內抑制素(endostatin)、Enigma、凝溶膠蛋白(Gelsolin)(優選地是亞結構域2)、S100A2及肌動蛋白。在另一個優選實施方案中，原肌球蛋白結合配偶體是肌動蛋白。為使本領域技術人員容易理解，本發明的方法提供了一種設計和選擇與原肌球蛋白相互作用并調節原肌球蛋白活性的化合物的合理方法。大多數情況下，這些化合物會需要進一步的改進以增強活性。在獨特的實施方案中，本發明的方法包括這些進一步的改進步驟。例如，本發明的實施方案中進一步包括制造步驟，如在藥劑制造中將所述化合物摻入治療組合物中。因此，在另一個方面，所述方法進一步包括配制所鑒定的化合物以給予人或非人類動物，如本文所描述。在另一個方面，本發明提供了一種調節蛋白質在細胞表面膜上插入或保留的方法，所述方法包括給予細胞一種調節原肌球蛋白表達、定位或活性的試劑。在另一個方面，本發明提供了一種增加蛋白質在細胞表面膜上插入或保留的方法，所述方法包括給予細胞一種原肌球蛋白拮抗劑。在另一個方面，本發明提供了一種調節分子轉運進細胞或轉運出細胞的方法，所述方法包括給予細胞一種調節原肌球蛋白表達、定位或活性的試劑。在另一個方面，本發明提供了一種增加分子轉運進細胞或轉運出細胞的方法，所述方法包括給予細胞一種原肌球蛋白拮抗劑。在本發明的一個實施方案中，被轉運的分子選自電解質、水、單糖和離子。在另一個方面，本發明提供了一種治療或預防個體由于細胞表面膜蛋白異常插入、保留或活性而引起的疾病的方法，所述方法包括給予所述個體一種調節原肌球蛋白表達、定位或活性的試劑。優選地，所述調節原肌球蛋白表達、定位或活性的試劑是一種原肌球蛋白拮抗劑。在本發明的一個優選的實施方案中，所述細胞表面膜蛋白選自轉運蛋白、通道、受體、生長因子、抗原、信號傳導蛋白和細胞粘著蛋白。所述轉運蛋白優選地是囊性纖維化跨膜傳導調節蛋白(CFTR)。在本發明的一個進一步優選的實施方案中，所述細胞是非肌細胞。在一個優選的實施方案中，所述細胞是神經元細胞或上皮細胞。優選地，所述上皮細胞是胃腸上皮細胞。所述由于細胞表面膜蛋白異常插入或活性而引起的疾病可以是例如囊性纖維化、多發性硬化、多囊腎病、病毒感染、細菌感染、再灌注損傷、門克斯病(Menkesdisease)、威爾遜病(Wilson’sDisease)、糖尿病、肌強直性營養不良、癲癇或心境障礙如抑郁、雙相性精神障礙或情緒惡劣性障礙。在另一個方面，本發明提供了一種治療或預防個體中囊性纖維化的方法，所述方法包括給予所述個體一種調節原肌球蛋白表達、定位或活性的試劑。優選地，所述調節原肌球蛋白表達、定位或活性的試劑是原肌球蛋白拮抗劑。在本發明文中，優選地所述原肌球蛋白是由一個選自但不限于下述組中的人基因編碼的同工型，所述組由TPM1、TPM2、TPM3及TPM4組成。例如，所述同工型可以選自TM1、TM2、TM3、TM4、TM5、TM5a、TM5b、TM6、Tm5NM-1、Tm5NM-2、Tm5NM-3、Tm5NM-4、Tm5NM-5、Tm5NM-6、Tm5NM-7、Tm5NM-8、Tm5NM-9、Tm5NM-10和Tm5NM-11。在一個優選的實施方案中，所述原肌球蛋白同工型包括由TPM1基因外顯子1b編碼的氨基酸序列(SEQIDNO11)或由TPM3基因外顯子1b編碼的氨基酸序列(SEQIDNO12)。在另一個優選實施方案中，所述原肌球蛋白同工型是TM5a(優選地具有SEQIDNO9所示序列)或TM5b(優選地具有SEQIDNO10所示序列)。本發明所用原肌球蛋白拮抗劑可以選自肽、抗原肌球蛋白的抗體、小有機分子、抗原肌球蛋白編碼mRNA的反義化合物、抗原肌球蛋白催化性分子如核酶或脫氧核酶(DNAzyme)及以原肌球蛋白表達為目標的dsRNA或小干擾RNA(RNAi)分子。在一個優選的實施方案中，所述原肌球蛋白拮抗劑是針對原肌球蛋白編碼mRNA的反義化合物、催化性分子或RNAi分子。在一個進一步的優選實施方案中，所述原肌球蛋白拮抗劑是特異針對TPM1基因外顯子1b(SEQIDNO7)或反TPM3基因外顯子1b(SEQIDNO8)的反義化合物、催化性分子或RNAi分子。在一個進一步的優選實施方案中，所述原肌球蛋白拮抗劑是靶向序列AGCTCGCTGGAGGCGGTG(SEQIDNO13)的反義化合物、催化性分子或RNAi分子。在一個特別優選的實施方案中，所述原肌球蛋白拮抗劑是一個包括序列CACCGCCUCCAGCGAGCT(SEQIDNO14)的反義化合物。在一個優選的實施方案中，所述原肌球蛋白拮抗劑特異性地改變TM5a或TM5b的細胞定位。“特異性地改變TM5a或TM5b的細胞定位”意思是所述化合物顯著地改變TM5a或TM5b的細胞定位同時不會顯著地改變其它原肌球蛋白同工型的細胞定位。在另一個優選的實施方案中，所述原肌球蛋白拮抗劑特異性地降低或抑制TM5a或TM5b表達。“特異性地降低或抑制TM5a或TM5b表達”意思是所述化合物顯著地降低或抑制TM5a或TM5b表達同時不會顯著地降低或抑制其它原肌球蛋白同工型的表達。在另一個優選的實施方案中，所述原肌球蛋白拮抗劑特異性地改變TM5a或TM5b與其結合配偶體之一的結合。“特異性地改變TM5a或TM5b與其結合配偶體之一的結合”意思是所述化合物顯著地改變TM5a或TM5b與其結合配偶體之一的結合同時不會顯著地改變其它原肌球蛋白同工型與其配偶體的結合。在另一個方面，本發明提供了一種評估一個個體對于由細胞表面膜蛋白的異常插入、保留或活性而引起的疾病的易感性(predisposition)的方法，所述方法包括確定在所述個體的原肌球蛋白基因中存在突變的步驟。所述原肌球蛋白基因中的突變可能是一個點突變(即單核苷酸多態性(singlenucleotidepolymorphism，SNP))、缺失和/或插入。此類突變可通過從所述原肌球蛋白基因分離及測序DNA片段來檢測或通過從所述個體分離mRNA并通過其合成DNA(例如通過RT-PCR)測序檢測。突變還可以通過用有差別的寡核苷酸探針雜交或用有差別的寡核苷酸引物擴增程序來檢測。在另一個方面，本發明提供了一種評估一個個體對于由細胞表面膜蛋白異常插入、保留或活性而引起的疾病的易患性的方法，所述方法包括分析所述個體的細胞中原肌球蛋白的極化分布。如果一種獨特的原肌球蛋白同工型的分布在從所述受檢個體衍生出的細胞中與在正常個體細胞中觀察到的不同，這提示所述受檢個體易患由于一種細胞表面膜蛋白異常插入、保留或活性而引起的疾病。為了實現本發明的方法，本發明還提供了試劑盒，所述試劑盒包括多核苷酸探針和/或單克隆抗體及可能包括的定量標準。進一步地，本發明提供了在治療本文所提到的病癥的臨床試驗中涉及的評價藥物效力和監控患者進程的方法。很明顯，本發明的一個方面的優選特征和性質也適用于本發明的其它方面。本說明書全文中的詞語“包含”應理解為是指包括所述要素、整數或步驟，或一組要素、一組整數或一組步驟，而且不是指排除任何其它要素、整數或步驟，或一組要素、一組整數或一組步驟。圖1.四個原肌球蛋白(Tm)基因及其產物的圖譜。外顯子用陰影方塊表示，3’非翻譯序列用無陰影方塊表示，內含子用線表示。(A)fast基因(α-Tmf)。注意外顯子1b對于Tm5a和Tm5b是特有的。(B)Tm5NM基因。(C)β-TM基因。(D)TM-4基因(得自Temm-GroveCJetal1998和Percivaletal2000)圖2.原肌球蛋白抗體特異性。原肌球蛋白抗體在T84細胞和人成纖維細胞中的特異性示于Western印跡中。311在T84細胞(左)和人成纖維細胞(右)中的特異性顯示在A中，αf9d和CG3抗體的特異性分別顯示在B和C中。311抗體在人成纖維細胞中檢測Tm6(40kDa)、Tm2(36kDa)和Tm3(34kDa)。T84細胞中不存在Tm2。T84細胞和人成纖維細胞中都不存在Tm1(36kDa)。αf9d檢測Tm6(40kDa)、Tm3(34kDa)、Tm5a(30kDa)和Tm5b(30kDa)。CG3抗體檢測11個在30kDa共遷移的可能同工型。圖3.T84單細胞層表達Tm5a和Tm5b的極化分布。(A-F)成熟T84單細胞層用αf9d(A和B)、311(C和D)及CG3抗體標記。抗體分布用共聚焦激光掃描顯微鏡(ConfocalLaserScanningMicroscopy)分析。垂直平面(xz)的圖像顯示在左側，水平平面(xy)的圖像顯示在右側。αf9d和311的不同染色模式代表了Tm5a和Tm5b。比例尺條(Bar)10μm。(G)通過各個單細胞層的頂端及中央區域測量頂端和中央像素強度(pixelintensity)的平均值。在共染色的單細胞層中比較αf9d和311的頂端中央平均像素強度比并且每一組都以平均值±標準差表示。結果代表了8個共染色的單細胞層的平均值。圖4.原肌球蛋白同工型在大鼠十二指腸小囊(crypt)和絨毛中的定位。大鼠十二指腸組織切片被固定并用αf9d(C和D)、311(E和F)及CG3(G和H)抗體染色。左側是穿過小囊的切片，右側是穿過絨毛的切片。A和B代表抗體陰性對照。箭頭所示為胃腸上皮細胞。免疫反應性由藍色染色表示，載玻片用核快紅(Nuclearfastred)對比染色。比例尺條10μm。圖5.原肌球蛋白同工型極化的發展。(A-L)T84細胞免疫熒光共聚焦顯微圖像，細胞在接種(seeding)后不同時間點進行原肌球蛋白同工型染色。所有圖像都是在垂直平面(xz)。在每一個時間點，左側和中間的圖像屬于同一共染色的細胞。左側顯示的是311抗體(Tm3，6)染色。中間顯示的是αf9d抗體(Tm3，5a，5b，6)染色。右側細胞是用CG3抗體(TmNM1-11)染色。(A，B和C)10分鐘；(D，E和F)1小時；(G，H和I)2小時；(J，K和L)24小時。箭頭所示為一個懸浮的環染色(circumferentialstaining)的T84細胞。比例尺條10μm。(M和N)T84單細胞層發育過程中的總蛋白質和特異的原肌球蛋白同工型表達。蛋白質在接種后1、2、4、24小時及7天從T84細胞中提取。(M)凝膠用考馬斯藍染色顯示總蛋白質。(N)用αf9d抗體(Tm3、5a、5b、6)免疫印跡的Western印跡。圖6.原肌球蛋白同工型在T84細胞中經過jasplakinolide或諾考達唑(nocodazole)處理后的定位。T84細胞免疫熒光共聚焦顯微圖像，細胞在接種后10分鐘進行的原肌球蛋白同工型染色(A-D)及成熟的T84單細胞層圖像(E和F)。全部圖像是在垂直平面(xz)。左側細胞用311抗體(Tm3、6)染色，右側細胞用αf9d抗體(Tm3、5a、5b、6)染色。(A和B)用1μMjasplakinolide處理的細胞。(C和D)用33μM諾考達唑處理的細胞。(E和F)用20μM細胞松弛素D處理3小時的T84單細胞層。箭頭所示為一個懸浮的環染色的T84細胞。比例尺條10μm。圖7.T84單細胞層對原肌球蛋白同工型和CFTR共染色。T84單細胞層對原肌球蛋白同工型和CFTR共染色的免疫熒光共聚焦顯微圖像。全部圖像是在垂直平面。(A)αf9d抗體(Tm3、5a、5b、6)。箭頭所示為在與CFTR不相關的頂膜上富集αf9d染色的區域。(B)CFTR抗體。箭頭所示為位于細胞質中的CFTR。(C)圖像A和圖像B的重疊。比例尺條10μm。圖8.針對Tm5a和Tm5b的反義和無義寡核苷酸對T84單細胞層中αf9d抗體染色分布的作用。T84單細胞層的免疫熒光共聚焦顯微圖像。兩個圖像均在垂直平面。兩個單細胞層都已用αf9d抗體(Tm3、5a、5b、6)染色。(A)無義寡核苷酸2μM處理24小時；(B)反義寡核苷酸2μM處理24小時。比例尺條10μm。(C和D)Western印跡顯示針對Tm5a和Tm5b的反義和無義寡核苷酸對T84細胞的作用。在用針對Tm5a和Tm5b的2μM反義或無義寡核苷酸處理24小時后，從T84單細胞層提取蛋白質。(C)凝膠用考馬斯藍染色顯示總蛋白質。(D)用αf9d抗體(Tm3、5a、5b、6)免疫印跡的Western印跡。(E)針對Tm5a和Tm5b的反義和無義寡核苷酸對在T84單細胞層中用αf9d抗體頂端染色的強度的作用。所述頂端αf9d抗體染色像素強度在用2μM反義或無義寡核苷酸處理24小時的T84單細胞層中通過共聚焦顯微鏡確定。每一組用平均值±1標準差描述。(無義150.86±48.28，反義53.62±31.62；p＜0.001)圖9.針對Tm5a和Tm5b的反義和無義寡核苷酸對T84單細胞層的CFTR細胞表面表達和氯離子外向通量的作用。(A)酶聯CFTR表面表達測試在用2μM反義或無義寡核苷酸處理24小時的T84單細胞層上進行。CFTR表達在655nm處吸收表示，在每個實驗內以無義寡核苷酸處理組的平均吸收值做標準化。每一組用平均值±1標準差描述。(無義1±0.42，反義1.49±0.78；p＜0.001)。(B)MQAE氯離子外向通量測試在用針對Tm5a和Tm5b的2μM反義或無義寡核苷酸的對照T84單細胞層上進行。15分鐘的累積氯離子外向通量由自基線(baseline)的熒光百分比增長平均值表示，在每個實驗內以無義寡核苷酸處理組的平均百分比增加做標準化。每一組用平均值±1標準差描述。(無義1±0.36，反義1.47±0.41；p＜0.001)。圖10.諾考達唑處理對T84單細胞層的CFTR細胞表面表達和氯離子外向通量的作用。酶聯CFTR表面表達測試在用或未用33μM諾考達唑處理3小時的毛喉素刺激的T84單細胞層上進行。CFTR表達用655nm處的吸收表示，在每個實驗內以對照組的平均吸收值做標準化。每一組用平均值±標準差描述。(對照1.00±0.29，諾考達唑0.92±0.25；p＝0.64)。(B)MQAE氯離子外向通量測試在對照T84單細胞層上和在用33μM諾考達唑處理3小時的T84單細胞層上進行。15分鐘的累積氯離子外向通量由自基線的熒光百分比增長平均值表示，在每個實驗內以對照組的平均百分比增加做標準化。每一組用平均值±標準差描述。(對照1.00±0.22，諾考達唑1.01±0.43；p＝0.93)。序列表簡述SEQIDNO1原肌球蛋白1(α)(TPM1)基因序列編碼的一種同工型的人(Homosapiens)cDNA序列；SEQIDNO2原肌球蛋白2(β)(TPM2)基因序列編碼的一種同工型的人cDNA序列；SEQIDNO3原肌球蛋白3(TPM3)基因序列編碼的一種同工型的人cDNA序列；SEQIDNO4原肌球蛋白4(TPM4)基因序列編碼的一種同工型的人cDNA序列；SEQIDNO5同工型TM5a的人cDNA序列；SEQIDNO6同工型TM5b的人cDNA序列；SEQIDNO7TPM1基因外顯子1b的人DNA序列；SEQIDNO8TPM3基因外顯子1b的人DNA序列；SEQIDNO9同工型TM5a的人蛋白質序列；SEQIDNO10同工型TM5b的人蛋白質序列；SEQIDNO11TPM1基因外顯子1b的人蛋白質序列；SEQIDNO12TPM3基因外顯子1b的人蛋白質序列；SEQIDNO13用于優選的反義構建體的TPM1基因外顯子1b中的人靶序列；SEQIDNO14靶向TPM1基因外顯子1b的反義寡核苷酸序列；SEQIDNO15無義寡核苷酸序列(對照序列)；SEQIDNO16和17用于產生下調人TM5a或TM5b產物的siRNA分子的多核苷酸；SEQIDNO18-20TPM1基因外顯子1b編碼的氨基酸序列中的抗原性表位。優選實施方案的詳細描述除非另外說明，本文所用全部技術性及科學性術語具有本領域(例如細胞培養、分子遺傳學、核酸化學、雜交技術及生物化學)技術人員所通常理解的含義。標準技術被用于分子、遺傳及生化方法(一般地參見Sambrooketal.，MolecularCloningALaboratoryManual，3rded.(2001)ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，N.Y.和Ausubeletal.，ShortProtocolsinMolecularBiology(1999)4thEd，JohnWiley&Sons，Inc.-和題為“CurrentProtocolsinMolecularBiology”的完全版，這些文獻并入此處作參考)和化學方法。原肌球蛋白本發明基于蛋白質在細胞表面膜的插入、保留或維持被原肌球蛋白調節的發現。此發現提供了關于由細胞表面蛋白質的異常插入或功能導致的疾病的診斷及治療方法的基礎。原肌球蛋白(tropomyosins，TMs)是在所有真核細胞中都有發現的一組有多種形式的蛋白質，其在肌肉(骨骼肌、心肌和平滑肌)、大腦和多種非肌細胞中都有獨特的同工型。它們是伸長的蛋白質，在其全長上具有簡單的二聚α-螺旋卷曲螺旋結構。所述卷曲螺旋結構基于一種在第一和第四個位置具有疏水殘基的7個氨基酸的重復模式，并且此結構在從酵母到人類的真核生物中的所有TM同工型中是高度保守的，都具有一個顯著的7殘基重復周期(5個基序)。不同的同工型由差別剪接產生，例如α-原肌球蛋白的同工型在橫紋肌和平滑肌中不同。TMs與肌細胞的肌節(sarcomere)中的細絲和非肌細胞的微絲相關。TMs用頭-尾相接(head-to-tail)方式互相結合并處于F-肌動蛋白的溝內，每一個TM都與6或7個肌動蛋白單體互相作用。TM在骨骼肌和心肌中的作用是與肌鈣蛋白復合物(肌鈣蛋白T、C和I)一起調節肌動蛋白和肌球蛋白的鈣敏感性相互作用。在靜息胞內鈣離子濃度下，肌鈣蛋白-原肌球蛋白復合物抑制肌動球蛋白ATP酶活性。當一個刺激誘導肌細胞中的鈣離子釋放時，肌鈣蛋白C結合多余的鈣離子并且通過肌鈣蛋白-原肌球蛋白復合物傳遞一個構象變化，所述肌鈣蛋白-原肌球蛋白復合物不再抑制肌動球蛋白ATP酶活性，導致收縮。對比于骨骼肌和心肌，平滑肌和非肌肉TMs的生物學功能還不清楚。平滑肌和非肌細胞缺少肌鈣蛋白復合物，并且肌球蛋白輕鏈的磷酸化似乎是控制肌動蛋白和肌球蛋白相互作用的主要鈣敏感性調控機制。不同細胞類型的收縮性結構(contractileapparatus)調節的差異似乎需要結構和功能上都不同的TM形式。當本文用到術語“原肌球蛋白”時，其應該包括該蛋白質的所有同工型。例如，所述術語包括由哺乳動物基因TPM1(也稱為α-TM基因)(MacLeodandGooding，1988，Mol.Cell.Biol.8，433-440)、TPM2(也稱為β-TM基因)(MacLeodetal.，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.USA82，7835-7839)、TPM3(也稱為γ-TM基因)(Claytonetal.，1988，J.Mol.Biol.201，507-515)和TPM4(也稱為δ-TM基因)(MacLeodetal.，1987，J.Mol.Biol.194，1-10)編碼的所有同工型。通過可變剪接從這4個基因衍生出至少40種原肌球蛋白同工型(圖1)。例如參見Lees-MillerandHelfman，1991，Bioessays13(9)429-437。盡管原肌球蛋白同工型具有高度相似性，但是在肌動蛋白結合域和頭-尾結合域還是有一些差異。不同的原肌球蛋白同工型具有對肌動蛋白不同的結合親和性，并且這被認為在肌動蛋白微絲的穩定性方面導致了不同作用。另外，肌球蛋白在肌動蛋白微絲上的位置可能調節肌動蛋白在細胞運動和細胞骨架重塑(remodeling)方面的作用。一旦被插入，原肌球蛋白影響肌動蛋白和其它肌動蛋白結合蛋白之間的相互作用。例如，高分子量的原肌球蛋白對于抵抗肌動蛋白結合蛋白凝溶膠蛋白的切割活性(severingactivity)有保護作用。由人TPM1、TMP2、TPM3和TPM4基因編碼的同工型的cDNA序列分別列于SEQIDNO1至4。這些序列僅僅是代表性的例子，不是為了限制本方面的范圍。本發明的方法可以用于其它人類或非人類的原肌球蛋白序列。診斷分析本發明的一個方面涉及一種預期一個個體具有易患由細胞表面蛋白異常插入、保留或活性而引起的疾病的可能性的方法，或幫助診斷此類疾病的方法。在一個實施方案中，所述診斷方法包括從一個個體獲取一個待測多核苷酸樣品并分析樣品的原肌球蛋白基因的步驟。所述待測遺傳樣品可以從所述個體任何具核的細胞中獲取。對于基因組DNA分析，事實上任何生物學樣品(除純紅細胞外)都是合適的。例如，易獲取的組織樣品包括全血、精液、唾液、淚液、尿、排泄物、汗液、皮膚、睪丸、胎盤、腎和毛發。對于cDNA或mRNA分析，所述組織樣品優選地從有靶核酸表達的器官中獲取。例如，上皮細胞是獲取原肌球蛋白基因cDNA的合適來源。分析原肌球蛋白基因可能需要從靶樣品擴增DNA。這可以通過例如PCR完成。一般地可參見PCRTechnologyPrinciplesandApplicationsforDNAAmplification(ed.H.A.Erlich，FreemanPress，NewYork，N.Y.，1992)；PCRProtocolsAGuidetoMethodsandApplications(eds.Innis，etal.，AcademicPress，SanDiego，Calif.，1990)；Mattilaetal.，NucleicAcidsRes.19，4967(1991)；Eckertetal.，PCRMethodsandApplications1，17(1991)；PCR(eds.McPhersonetal.，IRLPress，Oxford)；和U.S.Pat.No.4,683,202。其它合適的擴增方法包括連接酶鏈式反應(LigaseChainReaction，LCR)(參見WuandWallace，Genomics4，560(1989)，Landegrenetal.，Science241，1077(1988))、轉錄擴增(Kwohetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86,1173(1989))和自動維持序列擴增(Guatellietal.，Proc.Nat.Acad.Sci.USA，87，1874(1990))和基于核酸的序列擴增(nucleicacidbasedsequenceamplification，NASBA)。后兩種擴增方法包括基于同時產生單鏈RNA(ssRNA)和雙鏈DNA(dsDNA)擴增產物的等溫轉錄的等溫反應，所述單鏈RNA和雙鏈DNA產物的比例大約分別是30或100比1。位于感興趣的多態位點的核苷酸可以被多種方法鑒別，如基因組DNA的Southern分析；限制酶消化的直接突變分析；RNA的Northern分析；變性高壓液相色譜(DHPLC)；基因分離及測序；等位基因特異性寡核苷酸與基因擴增產物的雜交；外顯子捕獲(exontrapping)；單堿基延伸(singlebaseextension，SBE)；或原肌球蛋白蛋白質分析。在另一個實施方案中，所述診斷方法包括分析原肌球蛋白在所述個體的細胞中的極化分布。此分析可以通過例如取自所述受檢個體的細胞(優選地是上皮細胞)內一種獨特的原肌球蛋白同工型的抗體染色進行。原肌球蛋白拮抗劑/激動劑本發明的一個方面涉及篩選調節原肌球蛋白活性或細胞內定位的方法。在某些實施方案中，潛在調節物的組合文庫(combinatoriallibrary)根據結合原肌球蛋白或調節活性的能力被篩選。傳統上，具有有用性質的新的化學實體(chemicalentity)通過鑒別一種具有某種所希望的性質或活性(例如抑制活性)的化學化合物(稱為“前導化合物(leadcompound)”)、生成所述前導化合物的變體及評價那些變體化合物的性質及活性來產生。經常地，高通量篩選(HTS)方法被用于此類分析。在一個優選的實施方案中，高通量篩選方法包括提供一個含有大量潛在治療性化合物(候選化合物)的文庫。此類“組合化學文庫”接下來在一種或多種檢測中被篩選，以鑒別那些顯示所希望的特征活性的文庫成員(尤其是化學種(species)或亞類(subclass))。被如此鑒別的化合物可以用作傳統的“前導化合物”或其自身可以用作潛在的或實際的治療劑。一個組合化學文庫是一個由化學合成或生物學合成產生的不同化學化合物的集合，所述化學合成或生物學合成通過組合一定數量的化學“積木(buildingblocks)”如試劑來完成。例如，一個線性組合化學文庫如一個多肽(例如突變蛋白(mutein))文庫通過對于指定的化合物長度(即一個多肽化合物中的氨基酸數目)以所有可能的方式組合一組稱為氨基酸的化學積木建立。數以百萬計的化學化合物可以通過此類化學積木的組合性混和(combinatorialmixing)合成(Gallopetal.，1994，J.Med.Chem.37(9)1233-1251)。組合化學文庫的制備和篩選是本領域技術人員所熟知的。所述組合化學文庫包括但不限于肽文庫、類肽(peptoid)、被編碼的肽、隨機生物寡聚物(randombio-oligomer)、非肽肽模擬物(nonpeptidalpeptidomimetics)、小化合物文庫的類似有機合成物(analogousorganicsynthesesofsmallcompoundlibrary)、核酸文庫、肽核酸文庫、抗體文庫、碳水化合物文庫和小有機分子文庫。原肌球蛋白結合化合物可以用本領域技術人員所熟知的方法容易地鑒別并分離。可用于鑒別原肌球蛋白結合化合物的方法例如酵母雙雜交篩選、噬菌體展示、親和層析、表達克隆和Biacore系統。Biacore系統被用于鑒別原肌球蛋白的化學模擬物，因為這些系統可以實時檢出與監測生物分子的結合事件而不需要標記，并且其通常不需要純化所包含的物質(Biacore，Rapsagatan7，SE75450Uppsala.)。特別地，酵母雙雜交篩選方法利用了轉錄激活以測定蛋白質-蛋白質相互作用。很多轉錄因子可被分為兩個結構域一個DNA結合結構域和一個轉錄激活結構域，它們在分開時是無活性的。當這兩個結構域被置于“緊密接近(closelyproximity)”狀態，它們的功能性轉錄激活活性重新產生。在本發明中，原肌球蛋白與一個轉錄因子的DNA結合結構域融合，從cDNA文庫中得到的cDNA與編碼一個轉錄激活結構域的序列融合。一個被編碼與一個轉錄因子DNA結合結構域相融合的感興趣蛋白的cDNA轉化的酵母菌株，被所述轉錄激活結構域/cDNA融合文庫轉化。任何編碼與感興趣的蛋白質相結合的蛋白質的cDNA將允許生成一個功能性雜交轉錄激活物(因為所述DNA結合結構域和轉錄激活結構域現在處于“緊密接近”狀態)，其引起報道基因的表達并導致細胞存活。編碼所述結合蛋白的cDNA接下來被分離，其編碼的蛋白質也被鑒別。鑒別調節物的測定優選地適用于高通量篩選。因此優選的測定可以檢出原肌球蛋白基因轉錄的增強或抑制、多肽表達的抑制或增強、和多肽活性的抑制或增強。特定核酸或蛋白質產物的存在、缺失、量化、或其它性質的高通量測定是本領域技術人員所熟知的。類似地，結合測定和報道基因測定也是被熟知的。因此，例如U.S.PatentNo.5,559,410公開了蛋白質的高通量篩選方法，U.S.PatentNo.5,585,639公開了核酸結合(即陣列(array))的高通量篩選方法，U.S.PatentNos.5,576,220和5,541,061公開了配體/抗體結合的高通量篩選方法。另外，高通量篩選系統已可商業獲得(參見例如ZymarkCorp.，Hopkinton，MA；AirTechnicalIndustries，Mentor，OH；BeckmanInstruments，Inc.Fullerton，CA；PreeisionSystems，Inc.，Natick，MA，等等)。這些系統典型地使所述測定全程自動化，包括所有樣品及試劑加樣、液體分液(liquiddispensing)、定時孵育(timedincubaion)、和在適于所示測試的檢測儀上進行微平板(microplate)的最終讀數。這些可配置的系統提供高通量和快速啟動，以及高度可調性和高度用戶化。此類系統的制造者對于不同的高通量系統提供詳細的使用方案。例如ZymarkCorp.提供技術手冊描述檢測基因轉錄調節、配體結合調節等的篩選系統。蛋白質或肽抑制劑在一個實施方案中，調節物是蛋白質，通常是天然產生的蛋白質或天然產生的蛋白質的片段。因而，可以應用例如含有蛋白質的細胞提取物或蛋白質細胞提取物的隨機或指定消化物。以這種方式，蛋白質文庫可針對用本發明的方法篩選而建立。本實施方案中特別優選的是細菌、真菌、病毒、及哺乳動物蛋白質文庫，其中哺乳動物蛋白質文庫是優選的，人類蛋白質文庫是尤其優選的。特別有用的測試化合物是被歸類到靶所屬的蛋白質種類的那些，例如酶底物或配體和受體。在一個優選的實施方案中，調節物是大約5到大約30個氨基酸的肽，優選地是大約5到大約20個氨基酸，特別優選地是大約7到大約15個氨基酸。所述肽可以是如上所述的天然產生的蛋白質的消化物，隨機肽，或“有傾向性的(biased)”隨機肽。本文中“隨機化的(randomized)”或其語法上的等同物是指每一個核酸和肽基本上分別由隨機核苷酸或氨基酸組成。由于通常這些隨機肽(或核酸，在后文討論)是化學合成的，它們可能在任何位置摻入任何核苷酸或氨基酸。所述合成過程可以被設計為產生隨機化的蛋白質或核酸，以允許在序列上生成全部或大部分可能的組合，從而建立一個隨機化的候選生物活性蛋白質制劑的文庫。在一個實施方案中，肽基原肌球蛋白抑制劑是化學或重組合成的，如衍生自原肌球蛋白序列的寡肽(約10-25氨基酸長)。或者，原肌球蛋白片段由天然或重組產生的原肌球蛋白被例如用蛋白酶消化產生，所述蛋白酶例如胰蛋白酶、嗜熱芽孢菌蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、或胃蛋白酶。應用電腦分析(用已有商業軟件例如MacVector，Omega，PCGene，MolecularSimulation，Inc.)鑒別蛋白切割位點。所述蛋白切割或合成片段可包括部分或完全抑制原肌球蛋白功能所需數目的氨基酸殘基。優選的片段長度包括至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100個或更多個氨基酸。蛋白質或肽抑制劑也可以是原肌球蛋白的顯性失活突變體。術語“顯性失活突變體(dominant-negativemutant)”是指一個原肌球蛋白肽段被從其天然狀態突變并與一種通常與原肌球蛋白相互作用的蛋白質相互作用，從而阻止內源性天然原肌球蛋白發生所述相互作用。抗-原肌球蛋白抗體本發明所用術語“抗體”包括完整分子及其片段，如能夠結合原肌球蛋白表位決定簇的Fab、F(ab′)2和Fv。這些抗體片段保留一定選擇性結合其抗原的能力，并定義如下(1)Fab，含有一個抗體分子的一個一價抗原結合片段的片段，可通過用木瓜蛋白酶消化整個抗體以獲取一條完整輕鏈和一條重鏈的一部分來產生；(2)Fab’，一個抗體分子片段，可通過用胃蛋白酶處理整個抗體、再進行還原以獲取一條完整輕鏈和重鏈的一部分獲得；每個抗體分子可獲得兩個Fab’片段；(3)(Fab’)2，一個抗體片段，可通過用胃蛋白酶處理整個抗體而不進行還原獲得；F(ab)2是兩個Fab’片段通過兩個二硫鍵連在一起而形成的二聚體；(4)Fv，定義為一個含有輕鏈可變區和重鏈可變區的遺傳工程片段，表達為兩條鏈；及(5)單鏈抗體(SCA)，定義為一個含有通過合適的多肽接頭(linker)連接的輕鏈可變區和重鏈可變區的作為一個遺傳融合單鏈分子的遺傳工程分子。制造這些片段的方法被本領域所熟知。(參見例如HarlowandLane，AntibodiesALaboratoryManual，ColdSpringHarborLaboratory，NewYork(1988)，并入此處作參考)。本發明的抗體可以通過以完整原肌球蛋白或其片段為免疫抗原制備。一個用于免疫動物的肽可以衍生自翻譯的cDNA或化學合成并被純化及綴合到載體蛋白質，如果需要的話。此類通常用的與所述肽化學偶聯的載體包括匙孔血藍蛋白(KLM)、甲狀腺球蛋白、牛血清清蛋白(BSA)和破傷風毒素。偶聯的肽可以接下來用于免疫所述動物(例如小鼠或兔)。如果需要，多克隆抗體可被進一步純化，例如通過在一種結合了產生所述抗體的所述肽的基質上結合并洗脫。本領域技術人員應當了解免疫學領域的對于純化和/或濃縮多克隆抗體及單克隆抗體的各種普通技術。(參見例如Coligan，etal.，Unit9，CurrentProtocolsinImmunology，WileyInterscience，1991，并入此處作參考)。單克隆抗體可用任何通過培養中的持續細胞系產生抗體分子的技術制備，例如雜交瘤技術、人類B細胞雜交瘤技術和EBV雜交瘤技術(Kohleretal.Nature256，495-497，1975；Kozboretal.，J.Immunol.Methods81，31-42，1985；Coteetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA80，2026-2030，1983；Coleetal.，Mol.CellBiol.62，109-120，1984)。本領域所熟知的技術使顯示結合原肌球蛋白的抗體可從抗體表達文庫中鑒別并分離。例如，一種鑒別并分離一個顯示結合原肌球蛋白的抗體結合結構域的方法是噬菌體λ載體系統。此載體系統已被用于在大腸桿菌(Escherichiacoli)中表達一個得自小鼠抗體所有組成成分的Fab片段組合文庫(Huse，etal.，Science，2461275-1281，1989)和一個得白人抗體所有組成成分的Fab片段組合文庫(Mullinax，etal.，Proc.Nat.Acad.Sci.，878095-8099，1990)。通過與預選擇的配體結合，此方法學還可用于表達單克隆抗體的雜交瘤細胞系。分泌所希望的單克隆抗體的雜交瘤可以通過利用本領域技術人員所熟知技術的多種途徑產生，此處不再重復。這些技術的詳細內容在下列參考文獻中被描述MonoclonalAntibodies-HybridomasANewDimensioninBiologicalAnalysis，EditedbyRogerH.Kennett，etal.，PlenumPress，1980；和U.S.4,172,124，并入此處作參考。另外，產生具有“人類化(humanized)”抗體不同組合的嵌合體抗體分子的方法在本領域中是熟知的，并且包括將鼠可變區和人恒定區組合在一起(Cabily，etal.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，813273，1984)，或通過移植鼠抗體互補決定區(CDRs)至人構架上完成(Riechmann，etal.，Nature332323，1988)。在一個實施方案中，所述抗體結合選自但不限于SEQIDNOs18-20的人原肌球蛋白一個區域的至少一部分。反義化合物術語“反義化合物”涵蓋與原肌球蛋白mRNA分子的至少一部分互補(IzantandWeintraub，Cell361007-15，1984；IzantandWeintraub，Science229(4711)345-52，1985)并能夠干擾轉錄后事件如mRNA翻譯的DNA或RNA分子。互補于原肌球蛋白編碼mRNA的至少大約15個連續核苷酸的反義寡聚體是優選的，因為它們可以很容易地合成并且當被導入產生原肌球蛋白的靶細胞時與較大分子比較不可能引起問題。反義方法的應用是本領域熟知的(Marcus-Salcura，Anal.Biochem.172289，1988)。優選的反義核酸應包括與SEQIDNO7或SEQIDNO8所列出的編碼氨基酸序列的序列的至少15個連續核苷酸互補的核苷酸序列。催化核酸術語催化核酸(catalyticnucleicacid)是指DNA分子或含有DNA的分子(本領域中也稱為脫氧核酶(DNAzyme))或RNA或含有RNA的分子(也稱為核酶(ribozyme))，所述分子特異性地識別獨特的底物并催化該底物的化學修飾。催化核酸中的核酸堿基可以是堿基A、C、G、T和U，及其衍生物。這些堿基的衍生物是本領域所熟知的。典型地，催化核酸含有一個特異識別靶核酸的反義序列和一種核酸切割的酶活性(本文中也稱為“催化結構域”)。為獲得特異性，優選的核酶和脫氧核酶應包括與編碼原肌球蛋白同工型的序列的至少大約12-15個連續核苷酸互補的核苷酸序列。本發明中特別有用的核酶類型是錘頭狀核酶(HaseloffandGerlach1988，Perrimanetal.，1992)和發夾狀核酶(hairpinribozyme)(Shippyetal.，1999)。本發明的核酶和編碼核酶的DNA可以用本領域所熟知的方法進行化學合成。核酶還可通過與一個RNA聚合酶啟動子(例如T7RNA聚合酶啟動子或SP6RNA聚合酶啟動子)可操縱地連接的DNA分子制備(其轉錄時產生RNA分子)。因此，本發明還提供了一個編碼本發明的核酶的核酸分子，即DNA或cDNA。當所述載體還含有一個與所述DNA分子可操縱連接的RNA聚合酶啟動子時，所述核酶可通過與RNA聚合酶及核苷酸溫育在體外合成。在另一個實施方案中，所述DNA可被插入一個表達盒(expressioncassette)或轉錄盒(transcriptioncassette)中。在合成之后，所述RNA分子可以通過連接到一個能穩定所述核酶并使其可以抗RNA酶的DNA分子上來修飾。另外，所述核酶可被修飾為磷硫類似物(phosphothioanalog)以用于脂質體送遞系統。這一修飾也使核酶具有對核酸內切酶活性的抗性。RNA抑制劑dsRNA對于特異地抑制獨特蛋白的產生是尤其有用的。盡管不希望受限于理論，Dougherty和Parks(Curr.Opin.CellBiol.7399(1995))已經提出了一個dsRNA可以用于降低蛋白產量的機制模型。此模型最近被Waterhouseetal.修改并擴展(Proc.Natl.Acad.Sci.9513959(1998))。該技術基于存在含有具有與感興趣的基因的mRNA基本相同的序列的dsRNA分子，在此情況下所述mRNA是一個編碼原肌球蛋白的mRNA。方便地，所述dsRNA可以在重組載體或宿主細胞中由一個單一開放閱讀框產生，其中有義及反義序列側翼是無關序列，其使有義和反義序列能夠雜交生成dsRNA分子，與無關序列一起形成一個環結構。針對原肌球蛋白的適當dsRNA分子的設計和生成是本領域技術人員力所能及的，特別是考慮到Dougherty和Parks(1995，見上)、Waterhouseetal.(1998，見上)、WO99/32619、WO99/53050、WO99/49029和WO01/34815。如本文所用，術語“小干擾RNA(smallinterferingRNA，siRNA)”和“RNAi”是指同源雙鏈RNA(dsRNA)，其特異地靶定一個基因產物，從而導致無效(null)表型或亞效(hypomorphic)表型。特別地，所述dsRNA包括兩個衍生自編碼PAC-1的靶RNA并具有自身互補性的短核苷酸序列，以便其可以退火并推測其在轉錄后水平干擾靶基因的表達。RNAi分子被描述于Fireetal.，Nature391，806-811，1998，并被綜述于Sharp，Genes&Development，13，139-141，1999。優選的siRNA分子包括與靶mRNA中大約19-21個連續核苷酸相同的核苷酸序列。優選地，所述靶序列是TPM1或TPM3基因的外顯子1b。如本文所示，優選的針對原肌球蛋白編碼區的siRNA包括一段21個核苷酸的序列，如SEQIDNO16或SEQIDNO17所示。對于根據SEQIDNOS16和17列出的示范性siRNA產生包括一個莖環結構的siRNA，有義和反義鏈被放置以便它們位于一個間插環序列(interveningloopsequence)的側翼。優選的環序列應該是為本領域技術人員所熟知的。小分子抑制劑可以測定大量有機分子調節免疫系統的能力。例如，在本發明一個實施方案中，適當的有機分子可以選自一個化學文庫，其中化學物質分別被測定，或者選自組合化學文庫，其中多個化合物一起被測定，然后去重疊(deconvolute)以確定并分離活性最強的化合物。這類組合化學文庫的代表性例子包括那些如下所描述的Agrafiotisetal.，″Systemandmethodofautomaticallygeneratingchemicalcompoundswithdesiredproperties，″U.S.Pat.No.5,463,564；Armstrong，R.W.，″Synthesisofcombinatorialarraysoforganiccompoundsthroughtheuseofmultiplecomponentcombinatorialarraysyntheses，″WO95/02566；Baldwin，J.J.etal.，″Sulfonamidederivativesandtheiruse，″WO95/24186；Baldwin，J.J.etal.，″Combinatorialdihydrobenzopyranlibrary，″WO95/30642；Brenner，S.，″Newkitforpreparingcombinatoriallibraries.″WO95/16918；Chenera，B.etal.，″Preparationoflibraryofresin-boundaromaticcarbocycliccompounds，″WO95/16712；Ellman，J.A.，″Solidphaseandcombinatorialsynthesisofbenzodiazepinecompoundsonasolidsupport，″U.S.Pat.No.5,288,514；Felder.E.etal.，″Novelcombinatorialcompoundlibraries，″WO95/16209；Lerner.R.etal.，″Encodedcombinatorialchemicallibraries.″WO93/20242；Pavia，M.R.etal.，″Amethodforpreparingandselectingpharmaceuticallyusefulnon-peptidecompoundsfromastructurallydiverseuniversallibrary″WO95/04277；Summerton，J.E.和D.D.Weller，″Morpholino-subunitcombinatoriallibraryandmethod，″U.S.Pat.No.5,506,337；Holmes，C.，″MethodsfortheSolidPhaseSynthesisofThiazolidinones，Metathiazanones，andDerivativesthereof，″WO96/00148；Phillips，G.B.和G.P.Wei，″Solid-phaseSynthesisofBenzimidazoles，″Tet.Letters374887-90，1996；Ruhland，B.etal.，″Solid-supportedCombinatorialSynthesisofStrueturallyDiverse.beta.-Lactams，″J.Amer.Chem.Soc.111253-4，1996；Look，G.C.etal.，″TheIdentificationofCyclooxygenase-1Inhibitorsfrom4-ThiazolidinoneCombinatorialLibraries，″BioorgandMed.Chem.Letters6707-12，1996。候選化合物可以是有機分子，優選地是具有分子量大于100小于大約2500道爾頓的小有機化合物。優選的小分子小于2000、或小于1500、或小于1000、或小于500道爾頓。候選試劑包括對于和蛋白質結構性相互作用(尤其是氫鍵作用)必需的功能基團，并且典型地包括至少一個胺、羰基、羥基或羧基，優選地包括至少所述功能性化學基團中的兩個。候選試劑通常包括被一或多個上述功能基團取代的環狀碳(cyclicalcarbon)或雜環結構和/或芳族或多芳族結構(polyaromaticstructure)。候選試劑還可以從包括糖、脂肪酸、類固醇、嘌呤、嘧啶、其衍生物、結構類似物或組合的生物分子中發現。在一個實施方案中，本發明包括在原始及分級分離的(fractionated)天然產物提取物的文庫中篩選小分子化學多樣性(chemodiveristy)，以檢測具有生物活性的化合物作為潛在候選物以進一步研究。在本發明的一個實施方案中，所述候選化合物得自一個基因文庫、低分子量化合物文庫(如ChemBridgeResearchLaboratories的低分子量化合物文庫)、細胞提取物、微生物培養上清液、細菌細胞組分等的表達產物。在一個獨特的實施方案中，所述候選化合物得自一種腸致病性大腸桿菌(EPEC)菌株的提取物。篩選原肌球蛋白激動劑/拮抗劑基于原肌球蛋白極化分布的篩選方案一種候選化合物抑制原肌球蛋白功能的能力的篩選方法的一個例子可以包括分析所述化合物對細胞中原肌球蛋白極化分布的作用。例如，表達一種標記的感興趣的原肌球蛋白同工型的細胞可被暴露于候選化合物并且監控所述原肌球蛋白同工型極化分布的喪失。所述標記的原肌球蛋白同工型可通過例如表達一個包括連接到一種熒光化合物(如綠色熒光蛋白(GFP))上的原肌球蛋白的融合構建體在細胞中產生。本領域技術人員應當了解其它可檢測標記也可用于此篩選測定。或者，細胞樣品也可以暴露于一種候選化合物，感興趣的原肌球蛋白同工型分布可由抗體染色確定。基于原肌球蛋白表達的篩選方案一種候選化合物抑制原肌球蛋白表達的能力的篩選方法的一個例子可以包括下述步驟(i)使一種候選化合物接觸能夠表達原肌球蛋白的細胞，(ii)測量與所述候選化合物接觸的細胞中原肌球蛋白的表達量，并且將此表達量與相應的對照細胞(未接觸被研究的物質)中原肌球蛋白表達量(對照表達量)對比，及(iii)選擇一種相比于對照表達量(基于上述步驟(ii)的結果)，顯示原肌球蛋白表達量降低的候選化合物。本篩選方法所用細胞可以是任何能夠表達原肌球蛋白的細胞，與天然和重組基因之間的區別無關。并且，所述原肌球蛋白的來源并沒有被特別限制。所述細胞可以取自人，或取自人之外的其它哺乳動物如小鼠，或取自其它生物體。合適的人類細胞的例子是造血細胞，包括肥大細胞。并且，也可以用含有包括編碼原肌球蛋白的核酸序列的表達載體的轉化細胞。允許所述候選化合物接觸能夠表達原肌球蛋白的細胞的條件沒有限制，但是其優選地選自不會殺死適用細胞，并且可以表達原肌球蛋白基因的培養條件(溫度、pH、培養物組成等等)。術語“降低”不僅是指與對照表達量相比，還包括根本沒有原肌球蛋白表達的情況。特別地，這包括原肌球蛋白表達量基本上為零的情況。原肌球蛋白表達量可以通過測量一個原肌球蛋白基因(mRNA)表達量或通過測量所產生的原肌球蛋白量來評估。另外，測量原肌球蛋白量的方法不僅是一種直接測量基因(mRNA)表達量或所產生的蛋白質量的方法，也可以是任何反映這些的方法。特別地，為測量原肌球蛋白表達量(檢出及測定)，原肌球蛋白mRNA的表達量可通過DNA陣列或眾所周知的方法如Northern印跡方法測量，其還可以通過用具有與應用的原肌球蛋白mRNA核苷酸序列互補的核苷酸序列的寡核苷酸的RT-PCR方法測量。另外，原肌球蛋白蛋白質的量可以通過使用如用抗原肌球蛋白抗體的Western印跡等眾所周知的方法測量。測量原肌球蛋白表達量(檢出及測定)可以通過測量從標記基因衍生來的蛋白質活性來完成，所述測量使用已被導入了包括所述標記基因如連接到原肌球蛋白基因上的報道基因(例如熒光素酶基因、氯霉素乙酰轉移酶基因、β-葡糖醛酸糖苷酶基因、β-半乳糖苷酶基因和水母發光蛋白基因)的融合基因的細胞系來完成。或者，原肌球蛋白表達可以在遺傳工程化的細胞中測量，其中一個報道序列通過同源重組被導入原肌球蛋白基因，從而該基因表達的原肌球蛋白產物被所述報道物(reporter)標記。基于原肌球蛋白與其一或多個結合配偶體的結合的篩選方案在一個實施方案中，原肌球蛋白激動劑或拮抗劑通過篩選干擾原肌球蛋白與原肌球蛋白結合配偶體結合的候選化合物鑒別。一個合適的原肌球蛋白結合配偶體的例子是肌動蛋白。標準固相ELISA測定方式對于鑒別蛋白-蛋白相互作用的拮抗劑是特別有用的。根據本實施方案，一個結合配偶體(例如肌動蛋白絲)被固定在固體基質例如一個多針陣列(arrayofpolymericpins)或玻璃支持物(glasssupport)上。方便地，固定化的結合配偶體是一個包括谷胱苷肽S-轉移酶(GST)的融合多肽(例如CAP-肌動蛋白融合體)，其中GST部分協助所述蛋白質在固相支持物上的固定化。溶液中的第二個結合配偶體(例如原肌球蛋白)與固定化的蛋白質建立物理聯系以形成一個蛋白質復合物，此復合物通過使用針對第二個結合配偶體的抗體檢出。所述抗體通常用熒光分子標記或與一個酶(例如辣根過氧化物酶綴合，或者使用可結合第一個抗體的標記的第二個抗體。方便地，第二個結合配偶體以一個具有FLAG或寡組氨酸(oligo-histidine)肽標簽或其它合適的免疫原性肽的融合多肽形式表達，其中抗所述肽段標簽抗體被用于檢出所述結合配偶體。另外，寡HIS標簽標記的蛋白質復合物可以通過其與鎳-NTA樹脂(Qiagen)的結合檢出，或者FLAG標記的蛋白質復合物可以通過其與FLAGM2親和凝膠(FLAGM2AffinityGel，Kodak)的結合檢出。對于本領域技術人員顯而易見的是本文所述測定形式可用于樣品的高通量篩選，例如用結合的肽或融合蛋白的微陣列(microarray)。一種如USPatentNo.6,316,223所描述的雙雜交測定也可用于鑒別干擾原肌球蛋白與其一個結合配偶體結合的化合物。此系統的基本機制與酵母雙雜交系統類似。在所述雙雜交系統中，結合配偶體在哺乳動物宿主細胞中表達為兩個不同的融合蛋白。調整標準雙雜交篩選用于本發明，第一個融合蛋白由一個與一個結合配偶體融合的DNA結合結構域組成，第二個融合蛋白由一個與另一個結合配偶體融合的轉錄激活結構域組成。DNA結合結構域結合一個控制一或多個報道基因表達的操縱基因(operator)序列。轉錄激活結構域通過結合配偶體之間的功能性相互作用作用于啟動子。接下來，轉錄激活結構域與細胞基本轉錄系統相互作用，從而激活報道基因表達，報道基因的表達是可以測定的。調節結合配偶體之間的蛋白-蛋白相互作用的候選生物活性試劑通過其與宿主細胞溫育時調節報道基因轉錄的能力來鑒別。拮抗劑會阻止或降低報道基因表達，而激動劑會增強報道基因表達。在小分子調節物的情況下，這些小分子被直接加入細胞培養基中并測定報道基因的表達。另一方面，肽調節物可以表達自轉染進宿主細胞的核酸并測定報道基因的表達。事實上，可在被轉染的細胞中篩選完整的肽文庫。另外，例如Vidaletal.，Proc.NatlAcad.SciUSA93，10315-10320，1996所描述的反向雙雜交篩選(reversetwohybridscreens)可被用來鑒別拮抗劑分子。反向雜交篩選不同于上述正向篩選，其利用一個逆選擇報道基因(counter-selectablereportergene)例如CYH2或LYS2來對蛋白-蛋白相互作用進行選擇。細胞存活或生長在所述逆選擇報道基因產物的非毒性底物存在下降低或停止，該非毒性底物被所述基因產物轉變為毒性化合物。因而，若細胞中不發生本發明的蛋白-蛋白相互作用，例如存在所述相互作用的拮抗劑，則該細胞可以在所述底物存在的情況下存活，因為該底物不會被轉變為毒性化合物。例如，結合肌動蛋白的原肌球蛋白的一部分/片段表達為DNA結合結構域與如GAL4的DNA結合結構域的融合體；肌動蛋白結合原肌球蛋白的部分被表達為合適的轉錄激活結構域融合多肽(例如與GAL4轉錄激活結構域融合)。所述融合多肽被表達在酵母中，與URA3逆選擇報道基因可操縱地連接，其中URA3的表達需要GAL4的DNA結合結構域與轉錄激活結構域的物理聯系。此物理聯系可通過例如將報道基因表達置于一個包含GAL4可結合的核苷酸序列的啟動子控制之下達到。表達此報道基因的細胞在尿嘧啶和5-氟乳清酸(5-FOA)存在下不能生長，因為5-FOA被轉變為毒性化合物。候選肽抑制劑被表達于此類細胞文庫中，其中在尿嘧啶和5-FOA存在下能夠生長的細胞被保留進行進一步分析，例如分析編碼候選肽抑制劑的核酸。拮抗所述相互作用的小分子通過在所述小分子存在的情況下溫育細胞并且選擇在尿嘧啶和5-FOA存在下能夠生長或存活的細胞來確定。另外，還可以應用一個如Karinetal.的U.S.PatentNo.5,776,689所描述的蛋白質募集系統(proteinrecruitmentsystem)。在標準蛋白質募集系統中，細胞中的蛋白-蛋白相互作用通過一種非轉錄因子的效應蛋白向特異細胞器的募集來檢測。所述效應蛋白移位至該細胞器后，所述效應蛋白激活一個位于該細胞器的報道分子，其中所述報道分子的激活可通過例如細胞生存力檢出，提示存在蛋白-蛋白相互作用。更特異地，蛋白質募集系統的組分包括編碼包含所述效應蛋白和一個結合配偶體(例如肌動蛋白或其一部分)的第一個融合蛋白的第一個可表達核酸，以及編碼包含一個細胞器定位結構域和另一個結合配偶體(例如原肌球蛋白或其一部分)的第二個融合蛋白的第二個可表達核酸分子。同時還需要內源效應蛋白活性缺陷或缺失的一個細胞系或細胞株(例如酵母細胞或其它非哺乳動物細胞)，從而在沒有所述蛋白-蛋白相互作用時，所述報道分子不表達。作為結合配偶體相互作用的結果，融合多肽之間形成一個復合物，從而通過細胞器定位結構域(例如細胞膜定位結構域、細胞核定位結構域、線粒體膜定位結構域等等)的介導來指導所述復合物移位至合適的細胞器，所述效應蛋白接下來激活報道分子。此類蛋白質募集系統基本上可用于任何類型細胞，包括例如哺乳動物細胞、鳥類細胞、昆蟲細胞及細菌細胞，并可以使用多種效應蛋白/報道分子系統。例如，進行一種基于酵母細胞的測試，其中原肌球蛋白與其一或多個結合配偶體的相互作用導致鳥嘌呤核苷酸交換因子(GEF或C3G)募集進細胞膜，其中GEF或C3G激活報道分子，如Ras，從而導致細胞存活，否則細胞在特定培養條件下無法存活。對于此方法合適的細胞包括例如釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)cdc25-2細胞，其只有在有功能的GEF表達時能在36℃生長(Petitjeanetal.，Genetics124，797-806，1990)。GEF移位至細胞膜由一個細胞膜定位結構域協助。Ras的激活通過例如用已有的商品化檢測試劑盒和/或試劑測量細胞中環AMP水平檢出。為檢出本發明的蛋白-蛋白相互作用的拮抗劑，在待測化合物存在或在一個候選肽拮抗劑在細胞中表達或不表達的情況下進行兩次溫育。在候選化合物或候選肽存在的情況下，降低的細胞存活或生長提示所述肽或化合物是原肌球蛋白和其一或多個結合配偶體相互作用的拮抗劑。一種“反向(reverse)”蛋白質募集系統也被考慮，其中細胞被改變的存活或被改變的生長取決于所述蛋白-蛋白相互作用被所述候選化合物或候選肽的破壞。例如，在GEF存在下，可應用組成型表達活化的Ras的NIH3T3細胞，其中缺少細胞轉化提示蛋白質復合物被一種候選化合物或肽破壞。相反，在GEF存在下，組成型表達活化的Ras的NIH3T3細胞具有被轉化的表型(Aronheimetal.，Cell.78，949-961，1994)。在另一個實施方案中，通過調整盤狀瓊脂擴散檢測(plateagardiffusionassay)來測試小分子干擾原肌球蛋白與其一或多個結合配偶體的結合的能力，所述盤狀瓊脂擴散檢測被描述于VidalandEndoh，TIBS17，374-381，1999，并入此處作參考。在本發明一個優選的實施方案中，所述原肌球蛋白結合配偶體選自calponin(Childsetal.BBA.112141-46，1992)、癌胚抗原細胞粘附分子1(Cancinoembryonicantigencelladhesionmolecule1，CEACAM1)(Schumannetal.，J.BiolChem.276(50)47421-33，2001)、內抑制素(endostatin)(MacDonaldetal.J.Biol.Chem.276，25190-25196，2001)、Enigma(Guyetal.FEBSletters101973-1984，1999)、凝溶膠蛋白(優選地是亞結構域2)(KoepfandBurtnickFEBS309(1)56-58，1992)、S100A2(Gimonaetal.J.CellSci.110611-621，1997)及肌動蛋白。在一個進一步的優選的實施方案中，所述原肌球蛋白結合配偶體是肌動蛋白。基于肌球蛋白ATP酶活性的篩選方案在經過調整的基于原肌球蛋白與其一或多個結合配偶體結合的篩選方案中，所述方法包括加入肌球蛋白至反應混和物中并檢測肌球蛋白ATP酶活性。例如，一種原肌球蛋白同工型可與肌動蛋白絲和特異的肌球蛋白一起溫育。接下來在候選化合物存在的情況下測量肌球蛋白ATP酶活性。在通常條件下，原肌球蛋白抑制肌球蛋白ATP酶活性。因而，與原肌球蛋白作用并阻止此抑制活性的化合物會引起肌球蛋白ATP酶活性增加。可以選擇這些化合物用于進一步的篩選和/或定性。可以在不存在原肌球蛋白或存在一種不合適的原肌球蛋白同工型的情況下進行適當的陽性對照反應以消除抗肌球蛋白效應(anti-myosineffects)。可調整以適用于本發明的確定肌球蛋白ATP酶活性的方法應該是本領域技術人員所熟知的。這些測定的例子被描述于Zhaoetal.，Biochem.Biophys.ResCommun.267(1)77-79，2000；Westraetal.，ArchivesofPhysiologyandBiochemistry109316-322，2001；和Drottetal.，BiochemJ.264191-8，1989。治療方法由本發明的方法鑒別出的原肌球蛋白激動劑或拮抗劑可被治療性地用于由細胞表面蛋白異常插入、保留或功能而引起的疾病。術語“治療性”或如本文中與本發明的原肌球蛋白激動劑或拮抗劑所共同使用的，表示預防性和治療性的施用。因而，原肌球蛋白激動劑/拮抗劑可給予高危患者以減輕一種疾病的可能性和/或嚴重性，或給予已經明確患病的患者。人或其它物種可用原肌球蛋白功能的激動劑或拮抗劑處理的疾病或狀況包括但不限于囊性纖維化、多發性硬化、多囊腎病、病毒感染、細菌感染、再灌注損傷、門克斯病(Menkesdisease)、威爾遜病(Wilson’sDisease)、糖尿病、肌強直性營養不良、癲癇或心境障礙如抑郁、雙相性精神障礙或情緒惡劣性障礙。給藥方式在所述候選化合物是一種低分子量化合物、肽或蛋白質如抗體的形式時，此物質可被配制進普通藥物組合物(藥物制劑)中，所述藥物組合物通常用于此類形式，而且這些組合物可通過口服給藥或非胃腸給藥。一般來說，可以應用下列劑型和給藥方式劑型包括下列代表性的形式如固體制劑(例如片劑、丸劑、粉劑、細粉劑(finepowders)、顆粒(granules)、及膠囊和液體制劑，例如溶液、懸浮液、乳劑、糖漿、及酏劑(elixirs))。這些劑型可根據給藥途徑歸類為所述口服劑型或多種非胃腸劑型如透鼻(transnasal)制劑、透皮(transdermal)制劑、直腸(rectal)制劑(栓劑)、舌下(sublingual)制劑、陰道(vaginal)制劑、注射劑(靜脈內、動脈內、肌內、皮下、皮內)和滴注劑(dripinjections)。例如口服制劑，其可以是例如片劑、丸劑、粉劑、細粉劑、顆粒、膠囊、溶液、懸浮液、乳劑、糖漿等等，直腸和陰道制劑包括片劑、丸劑、膠囊、以及其它。透皮制劑不一定僅僅是液體制劑如洗液(lotion)，還可以是半固體制劑如乳膏(cream)、油膏(ointment)及其它。注射劑可被制成可用的形式如溶液、懸浮液和乳劑，同時作為載體(vehicle)，無菌水、水-丙二醇、緩沖液、及0.4重量％濃度鹽水可以作為例子。這些以此類液體形式存在的注射劑可被冷凍或凍干。通過凍干獲得的產物可用蒸餾水即時恢復成注射劑等形式并給藥。上述藥物組合物(藥物制劑)形式可以通過以本領域已確立的方式配制所述具有原肌球蛋白抑制作用的化合物和一種藥物可接受的載體來制備。所述藥物可接受的載體包括多種賦形劑、稀釋劑、填充劑、膨脹劑(extenders)、粘合劑(binders)、崩解劑(disintegrators)、潤濕劑、潤滑劑、分散劑及其它。其它本領域通常使用的添加劑也可以配制。取決于所要生產的藥物組合物的形式，這些添加劑可以正確地選自多種穩定劑、殺真菌劑、緩沖液、增稠劑(thickeners)、pH控制劑(pHcontrolagents)、乳化劑、助懸劑(suspendingagents)、防腐劑、矯味劑(flavors)、著色劑(colors)、等張調節劑(tonicitycontrol或isotonizingagents)、螯合劑和表面活性劑及其它。任何一種形式的所述藥物組合物可通過一種適合目標疾病、靶器官及其它因素的途徑給藥。例如，可以靜脈內給藥、動脈內給藥、皮下給藥、皮內給藥、肌內給藥或通過氣道給藥。還可以直接對染病組織局部給藥或甚至口服給藥或直腸給藥。所述藥物組合物的給藥劑量和給藥時間表根據劑型、疾病或其癥狀、患者年齡及體重及其它因素變化，無法用概括性術語描述。根據成年人的日均活性成分的量，通常的劑量可以在大約0.0001mg至大約500mg的范圍內，優選地在大約0.001mg至大約100mg的范圍內，此藥量可以每日一次給藥，或每日分成幾次給藥。當具有原肌球蛋白抑制活性的物質形式是多核苷酸如一種反義化合物時，所述組合物可以一種基因療法(genetherapy)藥物或預防性藥物形式提供。近年來已有一定數量關于應用多種基因的報告，并且基因療法現在已是一種確認的技術。基因療法藥物可通過將目標多核苷酸導入載體或用載體轉染合適的細胞來制備。對一個患者的給藥方式大致可分為兩種模式，即適用于(1)應用一種非病毒載體的情況的模式及適用于(2)應用一種病毒載體的情況的模式。對于分別應用一種病毒載體作為所述載體的情況和應用一種非病毒載體作為所述載體的情況，制備基因療法藥物的方法和給藥方法都在一些涉及實驗方案的書里詳細描述(例如″BessatsuJikkenIgaku，IdenshiChiryo-no-Kosogijutsu(SupplementtoExperimentalMedicine，FundamentalTechniquesofGeneTherapy)，Yodosha.1996；BessatsuJikkenIgakuIdenshiDonyu&HatsugenKaisekiJikken-ho(SupplementtoExperimentalMedicineExperimentalProtocolsforGeneTransfer&ExpressionAnalysis)，Yodosha，1997；JapaneseSocietyforGeneTherapy(ed.)IdenshiChiryoKaihatsuKenkynHandbook(ResearchHandbookforDevelopmentofGeneTherapies)，NTS，1999等)。當應用一種非病毒載體時，可以應用任何能表達所述抗原肌球蛋白核酸的表達載體。合適的例子包括pCAGGS(Gene108，193-200(1991))、pBK-CMV、pcDNA3.1和pZeoSV(Invitrogen，Stratagene)。轉移一個多核苷酸至患者體內可通過將目標多核苷酸以常規方式插入一個此類非病毒載體(表達載體)并將得到的重組表達載體給藥完成。如此，目標多核苷酸可被導入患者細胞或組織中。更特別地，將所述多核苷酸導入細胞的方法包括磷酸鈣轉染(共沉淀)技術和利用一個玻璃微管的DNA(多核苷酸)直接注射方法及其它方法。將一個多核苷酸導入組織的方法包括利用內型脂質體(internaltypeliposome)或靜電型脂質體(electrostatictypeliposome)的多核苷酸轉移技術、HVJ-脂質體技術、改進的HVJ-脂質體(HVJ-AVE脂質體)技術、受體介導的多核苷酸轉移技術、包括用微粒槍(particlegun)將所述多核苷酸與載體(金屬微粒)一起轉移進入細胞的技術、裸露DNA(naked-DNA)直接轉移技術、及利用帶正電聚合體的轉移技術及其它。合適的病毒載體包括衍生自重組腺病毒和逆轉錄病毒的載體。例子包括衍生自DNA或RNA病毒，如去毒逆轉錄病毒(detoxicatedretrovirus)、腺病毒、腺伴隨病毒(adeno-associatedvirus)、皰疹病毒、痘苗病毒、痘病毒、脊髓灰質炎病毒、新培斯病毒(sindbisvirus)、仙臺病毒(Sendaivirus)、SV40、人免疫缺陷病毒(HIV)等的載體。特別的，腺病毒載體眾所周知具有遠遠高于其它病毒載體的感染效率，從這個角度看，腺病毒載體被優選地應用。將多核苷酸轉移進入患者體內可通過將目標多核苷酸導入一個此類病毒載體并用此獲得的重組病毒感染所希望的細胞完成。通過此方式，所述目標多核苷酸可被導入細胞。將如此制備的基因療法藥物給予患者的方法包括將所述基因療法藥物直接導入體內的體內(invivo)技術和包括從人體提取某些細胞、將所述基因療法藥物體外(invitro)導入細胞內并將所述細胞重新植回人體的回體(exvivo)技術(NikkeiScience，April，1994issue，20-45；PharmaceuticalsMonthly，36(1)，23-48，1994；SupplementtoExperimentalMedicine，12(15)，1994；JapaneseSocietyforGeneTherapy(ed.)ResearchHandbookforDevelopmentofGeneTherapies，NTS，19991)。對用于預防或治療一種本發明涉及的炎癥性疾病，所述藥物被優選地通過體內技術導入體內。當應用所述體內方法時，所述藥物可以通過一種適合目標疾病、靶器官等的途徑給藥。例如其可以例如靜脈內給藥、動脈內給藥、皮下給藥或肌內給藥，或可以直接對染病組織局部給藥。所述基因療法藥物可以根據所述給藥途徑以多種藥物形式提供。例如在一種可注射形式的情況下，一種注射劑可以通過已經確立的過程制備，例如通過在一種溶劑中溶解所述活性組分多核苷酸，所述溶劑例如一種緩沖液，例如PBS、生理鹽水、或無菌水，然后如果需要則進行過濾除菌，并且將所述溶液注入無菌小瓶(sterilevitals)。如果需要，此注射劑可與普通載體等一起提供。在脂質體如HVJ-脂質體的情況下，所述藥物可以多種包裹在脂質體中的制劑形式被提供，這些形式如懸浮液、冷凍制劑和離心濃縮的冷凍制劑。進一步地，為了所述基因可以更容易地定位在染病位點附近，可以制備一種釋釋(sustained-release)制劑(例如一種微丸(minipellet))并置于染病位點，或所述藥物可以通過滲透泵(osmoticpump)等持續逐漸給予染病位點。所述基因療法藥物的多核苷酸內容可以根據待治療疾病、患者年齡和體重及其它因素正確地調整，但是對于每一個多核苷酸，通常的劑量大約是0.0001至大約100mg，優選地大約0.001至大約10mg。此藥量優選地每隔幾天或幾個月給予。在本說明書全文中，詞語“包括(comprise)”或其變體應理解為暗示包含所闡明的元素、整數或步驟，或元素組、整數組或步驟組，但不排除任何其它元素、整數或步驟，或元素組、整數組或步驟組。已被包括進本發明說明書的任何文件、法令(acts)、材料、設備、文章等等僅是為了提供本發明的上下文。其不應視為允許任何或全部這些材料在本申請的每一條權利要求的優先權日之前即已在澳大利亞存在并被視為形成涉及本發明領域中的現有技術的一部分或普遍知識。現在本發明將由下列實施例闡明，但是這些實施例不以任何方式限制本發明。實驗細節材料及方法試劑和抗體細胞松弛素D、毛喉素、6-甲氧基喹啉鎓1-乙酸乙酯(6-Methoxyquinolinium1-aceticacidethylester，MQAE)、諾考達唑、四甲基聯苯胺、1，4-二氮雜二環[2.2.2.]辛烷(DABCO)、聚-D-賴氨酸和1％膠原蛋白購自Sigma(St.Louis，MO，U.S.A.)。Lipofectin試劑和反義寡核苷酸購自Invitrogen(Mulgrave，Vic，Australia)。Jasplakinolide購自BioScientific(Gymea，N.S.W.，Australia)。氯氮藍四唑(Nitrobluetetrazoliumchloride，NBT)和5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸p-甲苯胺鹽(BCIP)、組織培養基和試劑購自LifeTechnologies(Mulgrave，Vic，Australia)。雙辛可寧酸(bicinchoninicacid，BCA)蛋白檢測試劑盒購自Pierce(RockfordIL，U.S.A.)。Thermanox蓋玻片和細胞培養玻片(glasschamberslides)購自Medos(MtWaverley，Vic，Australia)。組織培養塑料制品購自Interpath(MorrisvilleNorthCarolina，U.S.A.)。WesternLighteningTM化學發光試劑(chemiluminescencereagent)購自PerkinElmerLifeSciencesInc(Boston，MA，U.S.A.)。羅丹明紅X(RhodamineRedX)綴合物和羅丹明山羊抗-綿羊IgG購自JacksonImmunoresearch(WestGrove，PA，U.S.A)。辣根過氧化物酶(HRP)抗-小鼠和抗-兔IgG購自AmershamLifeSciences(Buckinghamshire，U.K.)。小鼠Tm單克隆抗體311和異硫氰酸熒光素(FITC)-驢抗小鼠二級抗體購自SigmaAldrich(St.Louis，MO，U.S.A.)。Tm抗體CG3受贈于J.C.Lin(Univ.ofIowa，Iowa，U.S.A.)。CFTR抗體(MA1-935)購自AffinityBioreagentsInc.(Golden，CO，USA)。C末端特異性小鼠抗人單克隆CFTR抗體購自BioScientific(Gymea，N.S.W.，Australia)。細胞培養人T84結腸癌細胞被接種至兩塊包被有聚-D-賴氨酸和1％膠原蛋白的細胞培養玻片、24或96孔板或蓋玻片上。所述T84細胞得自AmericanTissueCultureLaboratory(60代)和受贈于KimBarrett(SanDiego，U.S.A.)(20代)。在本研究過程中，它們分別被亞培養80和30代。T84細胞用Lietal的方法培養(Lietal.，1999，Infection&Immunity67，5938-5945)。處理后，T84細胞的生存力用錐蟲藍排除測定(trypanblueexclusionassay)評估。處理后，用PBS輕輕漂洗T84單細胞層并用1％錐蟲藍染色10分鐘，立即用相差顯微術(phasecontrastmicroscopy)檢測。處理的和對照單細胞層通過在隨機視野中的吸收錐蟲藍的細胞計數對比。免疫熒光分析細胞在含有2％胎牛血清(FBS)的磷酸鹽緩沖液(PBS)中漂洗，然后用4％多聚甲醛固定。用100％甲醇進行透化處理，在-80℃冷凍20分鐘。細胞與初級和二級抗體在室溫溫育1小時，每次溫育之后用含有2％FBS的PBS漂洗3次10分鐘。將蓋玻片蓋在有抗脫色(anti-fade)劑DABCO的載玻片上。熒光顯微術用共聚焦激光掃描顯微鏡(LeicaMicrosystems，Wetzler，Germany)63倍油鏡檢測熒光。熒光團的分布用在488nm掃描FITC和568nm掃描羅丹明檢測，用8行平均值消除噪聲。圖像取自垂直(xz)和水平(xy)平面。水平平面的圖像通過重疊從細胞頂端區域到基底區域每1μm取樣的切片構建。Tm抗體染色的像素強度(pixelintensity)在由共聚焦顯微術獲得的圖像上測量。測量通過穿過單細胞層頂端區域和穿過中央區域進行，并將測量值進行平均以得到各個單細胞層的平均像素強度。抗體染色在各個單細胞層內的分別被描述為該單細胞層頂端區域平均像素強度與中央區域平均像素強度的比率。為確定αf9d和311抗體染色的相對分布，αf9d和311的所述頂端中央平均像素強度比率在共染色的單細胞層中用對成對樣品的Studentt-檢驗對比。組織學樣品的抗體染色大鼠十二指腸組織學樣品在4％多聚甲醛鹽溶液中固定，并在4℃保存于70％乙醇中直到在石蠟中包埋。切片在二甲苯中脫蠟(dewax)并在梯度乙醇(100％，100％，70％，水)中逐步再水合(rehydrate)。抗原提取通過在1x檸檬酸鹽緩沖液(10x檸檬酸鹽緩沖液5g/LEDTA，2.5g/LTris堿及3.2g/L檸檬酸三鈉；pH8.0)中煮沸樣品，微波爐強加熱12分鐘，然后冷卻進行。樣品在PBS中漂洗兩次，用含10％血清的PBS封閉10分鐘。然后加入初級抗體，在室溫過夜。在加入二級抗體之前，樣品在PBS中漂洗兩次5分鐘。加入二級抗體1小時，然后在PBS中漂洗樣品一次5分鐘，在堿性磷酸鹽緩沖液(10ml的0.1MtrispH9.5，5ml的1MMgCl和2ml的5MNaCl)中漂洗一次5分鐘。接著加入含有NBT和BCIP的底物，40至60分鐘后在PBS中漂洗樣品一次5分鐘。接著將樣品用核快紅對比染色1分鐘，然后用蒸餾水漂洗2次，在梯度升高的乙醇(70％，100％，100％，100％)中脫水，用二甲苯澄清并用蓋玻片蓋好。在單細胞層形成過程中用jasplakinolide、細胞松弛素和諾考達唑處理細胞用胰蛋白酶/EDTA將上皮細胞單細胞層進行胰蛋白酶消化并離心得到細胞沉淀。然后在含有1μMjasplakinolide、20μM細胞松弛素D或33μM諾考達唑的培養基中重懸細胞，并接種至聚-D-賴氨酸和膠原蛋白包被的細胞培養玻片。接下來在接種10分鐘后固定并染色正在生長的單細胞層。諾考達唑對微管的作用被抗β微管蛋白抗體染色并與未處理的細胞對比確認。成熟T84細胞單細胞層用含有20μM細胞松弛素D的培養基處理3小時后固定并染色。接下來進行如上所述的免疫熒光分析。反義寡核苷酸針對Tm5a和Tm5b的反義及無義硫代磷酸寡核苷酸(phosphorothioatedoligonucleotides)序列分別是5’-CACCGCCUCCAGCGAGCT(SEQIDNO14)和5’-GCTCCAGCCACGCCGACT(SEQIDNO15)。它們根據人αTMfast基因的外顯子1b序列設計(Novyetal.，1993，CellMotility&theCytoskeleton25，267-281)。T84`細胞單細胞層在蓋玻片上、細胞培養玻片中或24孔板中生長至鋪滿。所述寡核苷酸以根據生產商指導的2μM濃度與10μg/mlLipofectin試劑一起加入。所述T84細胞單細胞層接下來在37℃，5％CO2條件下與所述寡核苷酸溫育24小時，然后它們被用于需要寡核苷酸預處理的實驗中。原肌球蛋白同工型的免疫印跡分析蛋白質用Wessel和Flugge的方法(WesselandFlugge，1984)從T84細胞中提取。Western印跡如所描述的方法進行(Percivaletal.，2000，CellMotility&theCytoskeleton47，189-208)。簡要說來，蛋白質用15％低bis丙烯酰胺凝膠的SDS-PAGE分級分離，轉移至聚偏二氟乙烯(polyvinylidenedifluoride)膜并用Tm抗體探察。結合的抗體用HRP綴合的山羊抗兔或山羊抗小鼠IgG檢出。條帶用WesternLighteningTM化學發光試劑和x-射線底片曝光檢出。蛋白質表達用Western印跡自顯影上的蛋白質條帶強度，通過電腦程序MolecularAnalyst(Version1.5，BioRadLaboratories，CA，U.S.A.)測量。蛋白質條帶強度以每個獨立實驗中對照組蛋白質條帶強度進行標準化的蛋白質條帶強度表示。為了確定處理的效果，標準化的蛋白質條帶強度通過單側Studentt-檢驗與不存在的理論值1對比。MQAE氯離子外向通量測定在24或96孔板上培養的T84細胞單細胞層在含有10mMMQAE的培養基中溫育16小時。接下來用氯離子緩沖液(2.4mMNa2HPO4，0.6mMNaH2PO4，1mMK2SO4，1mMMgSO4，3.4mMKCl，124.6mMNaCl，1mMCaCl2，10mM葡萄糖和10mMHEPES)漂洗所述單細胞層3次。T84細胞單細胞層通過與含有10μM毛喉素的氯離子緩沖液溫育用毛喉素刺激10分鐘，然后去掉氯離子緩沖液，換為含有10μM毛喉素的無氯離子的緩沖液(2.4mMNa2HPO4，0.6mMNaH2PO4，1mMK2SO4，1mMMgSO4，3.4mMKNO3，1mMCa(NO3)2，124.6mMNaNO3，10mM葡萄糖和10mMHEPES)，立即用熒光平板讀數器(fluorescenceplatereader)進行可重復的熒光測量(激發，λ-360nm；發射λ-460nm)。每30至60秒進行一次測量，持續15分鐘。氯離子外向通量測量表示為基線和特定時間點之間的熒光百分數增加。熒光百分數增加在實驗內被標準化為該實驗中對照組平均熒光百分數增加。為了確定處理的效果，所述標準化的熒光百分數增加在組間對比。兩組的對比通過Studentt-檢驗進行。酶聯表面CFTR檢測培養在膠原蛋白包被的蓋玻片上的T84細胞單細胞層在含有10μM毛喉素或只是在氯離子緩沖液中在37℃，5％CO2條件下溫育30分鐘，然后在4℃下用4％多聚甲醛固定20分鐘。所述T84細胞單細胞層首先與CFTR(MA1-935)抗體(Walkeretal.，1995)(1∶500稀釋)溫育1小時，然后與HPR抗-小鼠IgG(1∶1000稀釋)溫育。T84細胞單細胞層在每一次溫育之前用含有10％FBS的PBS封閉10分鐘并在每次溫育之后用PBS漂洗4次。接下來將載玻片放入干凈的24孔板并與500μl的3’3’5’5’-四甲基聯苯胺溫育30分鐘。將每個孔的上清液轉移至比色杯并用BeckmanDU650分光光度計測定655nm的吸收值。初級抗體陰性對照的655nm吸收值同樣被測定，此值被從初級抗體陽性單細胞層的吸收值中減去以測定此單細胞層的測定結果。CFTR表面表達被表示為655nm測定的吸收值，對于每個獨立實驗中的對照組平均吸收值標準化。為了確定處理的效果，標準化的655nm吸收值在組間對比。兩組的對比通過Studentt-檢驗進行。實施例1原肌球蛋白基因表達及T84細胞中的抗體特異性Tm蛋白質由4個不同基因編碼。本研究所用抗體能夠檢測產生自3個Tm基因的特異的同工型。這些基因的外顯子/內含子結構示于圖1。αf9d抗體檢測Tm1、2、3、5a、5b和6(Schevzovetal.，1997，Molecular&CellularNeurosciences8，439-454)。311抗體檢測αf9d抗體檢測到的Tm的一個亞類(subset)，即Tm1、2、3、和6。CG3抗體檢測Tm5NM1-11(Novyetal.，1993，CellMotility&theCytoskeleton25，267-281；Dufouretal.，1998，JournalofBiologicalChemistry273，18547-18555)。人成纖維細胞中，311抗體可檢出3個條帶，條帶在40、36和34kDa可見，分別相應于Tm6、2和3(圖2A)。在T84細胞中，311抗體只檢出了40和34kDa的條帶，相應于Tm6和3(圖2A)。αf9d抗體在T84細胞中檢出4個條帶，其中有相應于Tm6和3在40和34kDa可見的條帶，和一條30kDa的雙條帶，相應于Tm5a和5b(圖2B)。CG3抗體只在30kDa檢出一個條帶，相應于共遷移的Tm5NM同工型(圖2C)。實施例2T84細胞單細胞層表達Tm5a和Tm5b的極化分布為確定T84細胞中分散微絲群體的分布，用每一種抗體染色的8個單細胞層都用共聚焦顯微術檢測了垂直和水平平面。代表性的圖像示于圖3。檢出Tm3、5a、5b和6的αf9d抗體顯示在細胞頂極具有明顯的染色(圖3A)。然而，識別Tm3和6的311抗體則顯示在同樣細胞中從細胞頂極到基底極具有更均一的分布(圖3C)。這種不同的染色模式只能用存在被αf9d檢出但不被311檢出的兩種同工型(即Tm5a和Tm5b)的高度極化分布解釋。因此我們的結論是Tm5a和Tm5b在頂端表面高度富集。對Tm5NM1-11染色的抗體CG3分布于整個細胞(圖3E)。在取自水平平面的上皮細胞單細胞層切片中，αf9d(圖3B)和311(圖3D)的分布顯示與側面細胞膜相關，細胞質中可見極少量的染色。CG3顯示位于細胞核周圍的細胞質中(圖3F)。αf9d和311抗體染色的相對分布的定量分析示于圖3G，其確認了上述定性差異。αf9d抗體的頂端與中央像素強度平均比值顯著高于311抗體(3.88±0.60相比于1.64±0.23；p＜0.001)。實施例3特異微絲群體的極化分布隨大鼠十二指腸上皮細胞分化變化。為確定T84細胞中觀察到的Tm同工型分布是否不同于在小囊及絨毛胃腸上皮細胞進行體內觀察所見，6個大鼠十二指腸組織樣品對Tm同工型染色并用明視場顯微術檢測。代表性切片示于圖4。αf9d抗體染色顯示小囊上皮中的擴散染色(圖4C箭頭)。在更加分化的絨毛上皮中該染色高度富集在頂端區域但是也在整個細胞質中可見(圖4D箭頭)。311抗體(Tm3和6)在小囊上皮中稀疏染色(圖4E)。在絨毛上皮中，藍色染色可見于細胞核上一個環形區域(圖4F)。CG3抗體染色(Tm5NM1-11)顯示與αff9d抗體所見相似的分布。在小囊上皮細胞中，染色擴散至整個細胞(圖4G)，但是在絨毛上皮細胞中染色高度富集于頂端區域(圖4H)。在主要位于小囊中的杯形細胞中，染色擴散至特有的粘蛋白泡(mucinousvacuole)外(圖4G)。這些結果表明Tm同工型在更加分化的絨毛上皮細胞中極化，但是在相對較弱分化的小囊上皮細胞中不極化。重要的是，十二指腸絨毛上皮細胞中αf9d抗體和311抗體染色的相對分布提示Tm5a和Tm5b在體內以相同于其在T84細胞模型中的極化方式極化。實施例4特異微絲群體的極性分布發生于單細胞層形成的早期階段αf9d染色極化分布發生的時間順序在T84細胞接種后10分鐘、1、2和24小時檢測。每一時間點進行3次實驗。Tm同工型的表達通過對提取自接種后1、2、4、24小時及7天收集的T84細胞的蛋白質進行Western印記檢測。每一時間點進行3次實驗。代表性共聚焦顯微圖像示于圖5。在T84細胞懸浮液中，αf9d、311和CG3(圖6A、6B和5I，箭頭所示及數據未顯示)抗體染色是外周形(circumferential)的。接種后10分鐘(5A-C)，T84細胞普遍地形成細胞-細胞接觸和細胞-玻片接觸。對于全部抗體，在此初始時間點，在細胞-玻片接觸部位發生減弱的染色，盡管染色對于311和CG3抗體要比對于αf9d更明顯。進一步地，αf9d抗體染色似乎限于游離面(freesurface)而311抗體染色更多地位于細胞-細胞接觸位置。相反，CG3抗體染色更均勻地分布在游離面和細胞-細胞接觸位置。經過一段時間后，αf9d染色分布基本上沒有變化(5E、H和K)，還是染色富集于游離面(反映Tm5a和Tm5b)同時有低水平的類似于311的擴散染色(反映Tm6和Tm3)。相反，311抗體染色分布(5D、G和J)和CG3抗體染色分布(5F、I和L)都更加均勻分布于整個細胞，包括所有表面及細胞質。相對于接種后24小時和7天收集的細胞，Western印記分析揭示接種后2和4小時收集的T84細胞具有略微增加的Tm6和5a表達(圖5N)。這些同工型的水平變化不可能是由于αf9d和311抗體染色的改變。因而這些同工型分布的改變很可能是這些蛋白質靶向(targeting)改變的結果。實施例5Tm5a和Tm5b的早期極化分布不涉及絲轉換并且不依賴于微管對于微絲極化發展的可能機制通過在接種中進行細胞骨架的藥物處理來研究。用jasplakinolide穩定肌動蛋白絲，用細胞松弛素D將肌動蛋白絲片段化，及用諾考達唑破壞微管。這些藥品在鋪板前10分鐘應用于懸浮液中的T84細胞。細胞在鋪板后10分鐘檢測。在接種之前用jasplakinolide預處理T84細胞改變了細胞形態。所述T84細胞與未處理的細胞(圖5A)相比具有變平的外觀(圖6A)。在用jasplakinolide預處理的T84細胞中，在接種后10分鐘αf9d(圖6B)和311(圖6A)抗體染色的分布與對照T84細胞(5A和5B)相似。αf9d抗體分布留在頂端，然而311抗體分布顯示在細胞-細胞接觸位置更加顯著。在接種之前用用細胞松弛素D預處理T84細胞防止了細胞-玻片粘連，未獲得圖像。然而，用細胞松弛素D處理已建立的單細胞層消除了αf9d染色的極化分布提示其維持需要完好的肌動蛋白細胞骨架(圖6F)。在接種之前用諾考達唑預處理T84細胞改變了細胞形態。所述T84細胞從具有彎曲表面(圖5A)變成具有不規則外形(圖6C)。在接種10分鐘后諾考達唑處理的T84細胞中αf9d(圖6D)抗體染色分布與未處理的T84細胞相似。311抗體染色與αf9d抗體染色相似，其富集于頂端表面并且在細胞與玻片接觸位置的染色很弱(圖6C)。β微管蛋白染色確認諾考達唑破壞了正常微管結構(數據未列出)。這些結果提示Tm5a和Tm5b的早期極化不涉及絲轉換(filamentturnover)，因為肌動蛋白穩定劑jasplakinolide不影響極化的早期發展。另外，Tm5a和Tm5b的極化發生時，完整的微管并不是所要求的，盡管微管被諾考達唑破壞。然而，微管可能參與Tm3和Tm6再定位至細胞-細胞接觸位置或它們在此位置的穩定。實施例6Tm5a和Tm5b與插入膜的CFTR共定位，但不與包含在亞頂小泡(sub-apicalvesicles)中的CFTR共定位。用CFTR抗體染色T84細胞(圖7B)表現了可變的CFTR表達。可見兩種形式的CFTR。一些細胞顯示了顯著的頂端染色，CFTR在頂膜上突出。CFTR還可作為位于細胞質中的較小的點被觀察(圖7B，箭頭)，顯示其位于一種小泡樣結構中。與αf9d抗體共染色揭示了典型的在頂端富集的極化表觀，以及突出于周圍頂端表面的非常強的頂端染色的位置。這些高度富集的αf9d染色位置與CFTR摻入膜的位置同時發生(圖7C)。因此Tms表現為摻入一個與CFTR相關的結構中。全部CFTR膜染色位置都與這些αf9d染色較強的位置相關。然而，不是所有αf9d染色較強的位置都顯示顯著的CFTR染色的事實提示αf9d抗體染色與CFTR可以插入的位置相關。αf9d抗體不與包含在細胞質小泡樣(vesicle-like)結構中的CFTR共定位。實施例7Tm5a和Tm5b反義寡核苷酸改變T84細胞單細胞層中αf9d的頂端染色強度以前的研究顯示細胞松弛素D誘導的肌動蛋白絲破壞增加了通過CFTR的氯離子流(Pratetal.，1995，AmericanJournalofPhysiology268，C1552-C1561)，并且我們觀察到了細胞松弛素D還破壞αf9d染色的極化分布(圖6F)。因此我們認為被與CFTR共定位的αf9d標記的肌動蛋白絲可能抑制通過CFTR的氯離子分泌。為了驗證此猜想，我們用反義寡核苷酸或混雜的無義對照處理T84細胞單細胞層。Western印跡分析顯示暴露于所述寡核苷酸24小時后，Tm5a和Tm5b水平有實質下降(圖8D)。相對于無義寡核苷酸處理，反義寡核苷酸處理引起Tm5a和Tm5b水平平均下降54±13％(p＝0.02)。用反義寡核苷酸處理T84培養物消除了αf9d染色的極化分布，其主要地均勻分布于整個細胞(圖8B)。相反，無義寡核苷酸基本上對αf9d染色的分布沒有影響(圖8A)。反義寡核苷酸誘導的染色再分布通過頂端表面αf9d染色像素強度的降低也可以佐證。同樣用這些寡核苷酸平行處理的T84細胞單細胞層顯示，對比于用無義寡核苷酸處理的培養物，用反義寡核苷酸處理的培養物中頂端像素強度降低(圖8E)。這與用αf9d抗體檢出的極化Tm水平降低是一致的。總之，用αfast基因外顯子1b的反義寡核苷酸處理會引起αf9d抗體頂端染色的顯著下降。這些結果同時確認了未處理的T84細胞單細胞層中顯著的頂端αf9d抗體染色是由于Tm5a和Tm5b的極化分布所致。實施例8Tm5a和Tm5b反義寡核苷酸增加CFTR表面表達和氯離子外向通量Tm5a和Tm5b水平的反義下降和αf9d染色極化分布的消除提供了一個機會來評估這些分子在CFTR表面表達中的作用。這揭示了反義寡核苷酸處理對比與無義寡核苷酸對照增長50％(1.49±0.78相對于1±0.42；p＜0.001)。這提示Tm5a和Tm5b的存在是CFTR插入頂膜或CFTR保留在膜中的障礙。CFTR表面表達的增加也可以通過反義寡核苷酸處理的細胞中的氯離子外向通量增加佐證。總的來說，是用2μM反義寡核苷酸處理24小時的21個T84細胞單細胞層與用2μM無義寡核苷酸處理24小時的21個T84細胞單細胞層比較。在反義和無義寡核苷酸處理后，進行MQAE氯離子外向通量檢測，結果示于圖9B。在10μM毛喉素刺激15分鐘后，用反義寡核苷酸處理的T84細胞單細胞層與用無義寡核苷酸處理的T84細胞單細胞層相比，具有顯著升高的相對熒光測量值(1.47±0.41相對于1±0.36；p＜0.001)。實施例9微管破壞對于T84細胞單細胞層的CFTR表面表達無影響Tms反義寡核苷酸處理對于CFTR表面水平和氯離子外向通量的影響沒有被微管的破壞佐證。將T84細胞與諾考達唑一起溫育沒有能夠引起CFTR表面表達(圖10A)或氯離子外向通量(圖10B)的任何顯著改變。我們認為這些參數在短時間條件下進行測試對于微絲的破壞敏感，而對于微管系統不敏感。這很好地符合了肌動蛋白絲相對于微管在調節小泡(vesicle)所運物質插入頂膜或其保留中所具有更重要的作用。實施例10腸致病性大腸桿菌(EPEC)感染對于肌動蛋白細胞骨架的影響在澳大利亞土著群體兒童中，所患胃腸炎中多達17％是腸致病性大腸桿菌(EPEC)導致的。其引起腹瀉的機制還不清楚，但是升高的氯離子分泌已經在動物模型中被提示。我們已經在前面說明，在細胞培養模型中，EPEC感染引起上皮細胞中氯離子通過CFTR氯離子通道的分泌減少，并且誘導原肌球蛋白5a和5b同工型在上皮細胞的細胞骨架中再分布。這些原肌球蛋白的功能還不清楚，但是我們已經說明它們在頂膜中與CFTR氯離子通道共定位。本實驗的目標就是研究EPEC感染改變氯離子通過CFTR氯離子通道分泌的機制。生長于膠原蛋白包被的24孔板或塑料蓋片上的培養的T84結腸癌細胞單細胞層被用作胃腸上皮模型。溫育用EPEC接種6-9小時的單細胞層(104生物體/孔)用作EPEC感染模型并與HB101(非致病性對照)對比。反義寡核苷酸用來降低原肌球蛋白5a和5b的表達，免疫比色測試(immuno-colourimetricassay)用來評估CFTR表面表達，細胞內MQAE熒光被用來評估氯離子外向通量。實驗結果顯示相比于HB101，EPEC感染導致CFTR表達升高(平均升高153％；95％CI100％，205％；p＜0.001)但是氯離子分泌減少(平均減少37％；95％CI8％，66％；p＝0.014)。原肌球蛋白5a和5b的再分布可能是在EPEC感染下CFTR插入頂膜增加的原因。含有絲的原肌球蛋白5a和5b可能產生CFTR在胃腸上皮細胞頂膜中插入或保留的障礙。在膜CFTR增加情況下氯離子分泌減少提示EPEC還可以抑制CFTR氯離子通道功能。在EPEC感染中可能發生腹瀉作為一種在表面表達增加的情況下CFTR功能恢復的反跳現象(reboundphenomenon)。這些結果提示EPEC含有能夠抑制Tm5a和Tm5b的定位或功能的化合物。因而EPEC可能是可用于本文所描述的篩選測定的物質的有用來源。討論在建立上皮細胞極性中的原肌球蛋白同工型分選伴隨著特異化的功能性結構域的產生，極化的發展對于正常上皮細胞功能是必需的。上皮細胞極化過程的中心是蛋白質分選(sorting)、轉運及插入膜，這些過程使得結構域具有它們的功能(Yeamanetal.，1999，PhysiologicalReviews79，73-98)。細胞骨架，尤其是肌動蛋白微絲系統在此過程中的功能還不清楚。肌動蛋白細胞骨架結構域的迅速生成提出了這樣一種可能性，即細胞骨架極化可能是功能性極性，尤其是蛋白質向特異膜結構域分選和移動發展所必需的。本發明的發現進一步支持了微絲在上皮細胞極性發展和膜蛋白極性化的運輸中的作用。我們發現特異的Tm同工型在單細胞層發展過程中迅速極化。同樣的同工型還被發現可以調節CFTR插入頂膜和/或其在頂膜中的保留。同工型分選機制與細胞骨架相互作用的藥物被廣泛用于研究細胞過程。通過應用這些技術，我們可以研究上皮細胞能夠迅速對微絲進行分選的機制。在單細胞層的發展中，Jasplakinolide(一種阻止肌動蛋白絲分解和轉換(turnover)的藥物)沒有影響Tm5a和Tm5b的早期極化。在成熟單細胞層中，細胞松弛素D(一種分解肌動蛋白絲的藥物)破壞Tm5a和Tm5b的極化分布。因而我們可以得出結論，完整的微絲是Tm同工型極化發展和維持此極性所必需的。另外Tm同工型形成一種更高層次結構的一部分而不是以分離的分子形式存在，所述結構包括肌動蛋白絲。我們的研究發現Tm同工型的分選發生得非常迅速。在10分鐘之內，特異的Tm同工型已在其分布中被極化。其他研究者也發現Tm和肌動蛋白結構和組成的變化在細胞結構發展的早期發生。在Temm-Groveetal的研究中，特異的Tm同工型定位在微注射進上皮細胞15分鐘后就會發生(Temm-Groveetal.，1998，CellMotility&theCytoskeleton40，393-407)。他們發現Tm5迅速定位于相鄰細胞之間的粘合帶(adhesionbelt)。其他研究分析了表達水平和時間的關系。在成纖維細胞中，Tm5NM同工型表達水平在細胞周期中5小時增加2倍(Percivaletal.，2000，CellMotility&theCytoskeleton47，189-208)。在培養的肝細胞中，F肌動蛋白量在細胞與胞外基質粘著30分鐘內增加20倍(Mooneyetal.，1995，JournalofCellScience108，2311-2320)。在發育中的神經元，Tm5mRNA發現定位于軸突隆起(axonalhillock)，從而形成神經元極性的一個早期標記(Hannanetal.，1995，Molecular&CellularNeurosciences6，397-412)。因而我們的結論是多種類型的細胞能夠通過增加細胞骨架蛋白表達或在細胞內轉運完整蛋白質來迅速改變其細胞骨架結構。這些發現提示Tm涉及細胞附著和極化發展的早期過程。Tm5a和Tm5b在調節CFTR功能上的作用不希望受限于理論，至少有3種可能的機制解釋Tm5a和Tm5b在cAMP刺激引起的反應中是如何限制CFTR插入進頂膜的。第一，Tm5a和Tm5b可能作為一種物理障礙阻止小泡向上皮細胞頂端表面運動。如果被清除，那么小泡運動將更自由，并且接下來插入膜的CFTR增長將是不可避免的。第二，Tm5a和Tm5b可能不是作為一種影響小泡運動的功能性障礙，但是可能是一種對于小泡沿著肌動蛋白絲運動的抑制性控制機制。所述小泡沿著肌動蛋白絲運動是一個主動過程，其需要肌動蛋白和肌球蛋白相互作用，Tm5a和Tm5b可能抑制這一相互作用。如果這就是實際情況，可以預期Tm5a和Tm5b在頂端區域的存在抑制CFTR小泡向頂膜的運輸。相反，預期Tm5a和Tm5b的去極化將增加CFTR向頂膜的運輸。最后，Tm5a和Tm5b相關的微絲可能涉及表面蛋白的細胞內吞循環過程。一項Gottlieb等人的研究發現微絲在上皮細胞頂膜的蛋白質內吞中有作用(Gottliebetal.，1993，JournalofCellBiology120，695-710)。在他們的觀察中，他們猜想肌動蛋白微絲形成一種機械化學發動機(mechanochemicalmotor)的一部分，所述機械化學發動機被用于微絨毛膜組分向微絨毛之間的空間移動，或為將膜凹陷轉變為內吞小泡提供動力。如果涉及這些過程的微絲含有Tm5a和Tm5b，那么清除Tm5a和Tm5b將引起不能從頂膜內吞蛋白質如CFTR。我們關于Tm5a和/或Tm5b調節CFTR插入到或保留在頂膜的發現進一步有助于增加證據證明Tm同工型具有不同功能。已知存在有超過40種Tm同工型(Lees-Miller和Helfinan，1991，Bioessays13，429-437；Pittengeretal.，1994，CurrentOpinioninCellBiology6，96-104)(Dufouretal.，1998，JournalofBiologicalChemistry273，18547-18555)。支持存在不同功能的是關于不同Tms給予肌動蛋白微絲不同機械化學性質的知識。例如，Tm同工型對于肌動蛋白的不同結合親和力引起肌動蛋白微絲穩定性的不同作用(Pittengeretal.，1994，CurrentOpinioninCellBiology6，96-104)。進一步的證據來自于Percival等人的工作，他們發現Tm5NM給予肌動蛋白微絲更強的細胞松弛素D抗性(Percivaletal.，2000，CellMotility&theCytoskeleton47，189-208)。其他人已經發現特異的Tm同工型增加了肌動蛋白絲的剛性(rigidity)(Kojimaetal.，1994，ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica91，12962-12966)。當被插入肌動蛋白微絲后，Tms影響肌動蛋白和其他肌動蛋白結合蛋白的相互作用。例如，高分子量Tms可以抵抗肌動蛋白結合蛋白凝溶膠蛋白的切割活性(Ishikawaetal.，1989，JournalofBiologicalChemistry264，7490-7497)。我們的發現有助于正在增多的支持Tms在特異細胞功能方面具有作用的證據。我們的結論是Tm同工型在胃腸上皮細胞中是分隔開的，并且能夠調節重要的細胞功能。上述參考的全部文獻全文并入本公開。本領域技術人員應了解如在特定實施方案中所顯示的那樣，可以對本發明作出如寬泛描述的大量變體和/或修飾而不背離本發明的精神或范圍。因而現有實施方案在所有方面應被認為是示范性的而非限制性的。序列表<110>皇家亞力山大兒童醫院<120>細胞表面蛋白質的調節<130>502300<150>AU2003901316<151>2003-03-21<160>20<170>PatentInversion3.1<210>1<211>1265<212>DNA<213>Homosapiens<400>1ggcacgagggaggaatgcggtcgcccccttgggaaagtacatatctgggagaagcaggcg60gctccgcgctcgcactcccgctcctccgcccgaccgcgcgctcgccccgccgctcctgct120gcagccccagggcccctcgccgccgccaccatggacgccatcaagaagaagatgcagatg180ctgaagctcgacaaggagaacgccttggatcgagctgagcaggcggaggccgacaagaag240gcggcggaagacaggagcaagcagctggaagatgagctggtgtcactgcaaaagaaactc300aagggcaccgaagatgaactggacaaatattctgaggctctcaaagatgcccaggagaag360ctggagctggcagagaaaaaggccaccgatgctgaagccgacgtagcttctctgaacaga420cgcatccagctggttgaggaagagttggatcgtgcccaggagcgtctggcaacagctttg480cagaagctggaggaagctgagaaggcagcagatgagagtgagagaggcatgaaagtcatt540gagagtcgagcccaaaaagatgaagaaaaaatggaaattcaggagatccaactgaaagag600gcaaagcacattgctgaagatgccgaccgcaaatatgaagaggtggcccgtaagctggtc660atcattgagagcgacctggaacgtgcagaggagcgggctgagctctcagaaggccaagtc720cgacagctggaagaacaattaagaataatggatcagaccttgaaagcattaatggctgca780gaggataagtactcgcagaaggaagacagatatgaggaagagatcaaggtcctttccgac840aagctgaaggaggctgagactcgggctgagtttgcggagaggtcagtaactaaattggag900aaaagcattgatgacttagaagacgagctgtacgctcagaaactgaagtacaaagccatc960agcgaggagctggaccacgctctcaacgatatgacttccatgtaaacgttcatccactct1020gcctgcttacaccctgccctcatgctaatataagtttctttgcttcacttctcccaagac1080tccctcgtcgagctggatgtcccacctctctgagctctgcatttgtctattctccagctg1140accctggttctctctcttagcatcctgccttagagccaggcacacactgtgctttctatt1200gtacagaagctcttcgtttcagtgtcaaataaacactgtgtaagctaaaaaaaaaaaaaa1260aaaaa1265<210>2<211>1044<212>DNA<213>Homosapiens<400>2tgctgctctcctcccgctccgtcctcctcgcctgccaccggtgcacccagtccgctcacc60cagcccagtccgtccggtcctcaccgcctgccggccggcccaccccccaccgcaggccat120ggacgccatcaagaagaagatgcagatgctgaagctggacaaggagaacgccatcgaccg180cgccgagcaggccgaagccgacaagaagcaagctgaggaccgctgcaagcagctggagga240ggagcagcaggccctccagaagaagctgaaggggacagaggatgaggtggaaaagtattc300tgaatccgtgaaggaggcccaggagaaactggagcaggccgagaagaaggccactgatgc360tgaggcagatgtggcctccctgaaccgccgcattcagctggttgaggaggagctggaccg420ggcccaggagcgcctggctacagccctgcagaagctggaggaggccgagaaggcggctga480tgagagcgagagaggaatgaaggtcatcgaaaaccgggccatgaaggatgaggagaagat540ggaactgcaggagatgcagctgaaggaggccaagcacatcgctgaggattcagaccgcaa600atatgaagaggtggccaggaagctggtgatcctggaaggagagctggagcgctcggagga660gagggctgaggtggccgagagccgagccagacagctggaggaggaacttcgaaccatgga720ccaggccctcaagtccctgatggcctcagaggaggagtattccaccaaagaagataaata780tgaagaggagatcaaactgttggaggagaagctgaaggaggctgagacccgagcagagtt840tgccgagaggtctgtggcaaagttggagaaaaccatcgatgacctagaagagaccttggc900cagtgccaaggaggagaacgtcgagattcaccagaccttgaccagaccctgctggaact960caacaacctgtgagggccagccccacccccagccaggctatggttgccaccccaacccaa1020taaaactgatgttactagcctctc1044<210>3<211>2089<212>DNA<213>Homosapiens<400>3ggcacgaggggaggcaggaaccggagcgcgagcagtagctgggtgggcaccatggctggg60atcaccaccatcgaggcggtgaagcgcaagatccaggttctgcagcagcaggcagatgat120gcagaggagcgagctgagcgcctccagcgagaagttgagggagaaaggcgggcccgggaa180caggctgaggctgaggtggcctccttgaaccgtaggatccagctggttgaagaagagctg240gaccgtgctcaggagcgcctggccactgccctgcaaaagctggaagaagctgaaaaagct300gctgatgagagtgagagaggtatgaaggttattgaaaaccgggccttaaaagatgaagaa360aagatggaactccaggaaatccaactcaaagaagctaagcacattgcagaagaggcagat420aggaagtatgaagaggtggctcgtaagttggtgatcattgaaggagacttggaacgcaca480gaggaacgagctgagctggcagagtcccgttgccgagagatggatgagcagattagactg540atggaccagaacctgaagtgtctgagtgctgctgaagaaaagtactctcaaaaagaagat600aaatatgaggaagaaatcaagattcttactgataaactcaaggaggcagagacccgtgct660gagtttgctgagagatcggtagccaagctggaaaagacaattgatgacctggaagataaa720ctgaaatgcaccaaagaggagcacctctgtacacaaaggatgctggaccagaccctgctt780gacctgaatgagatgtagaacgccccagtcccaccctgctgctgctcctccctctgaccc840agactccgcctgaggccagcctgcgggaagctgacctttaactgagggctgatctttaac900tgg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<213>Artificialsequence<220><223>Oligonucleotide<400>16gauccggagccugcaggaguu21<210>17<211>21<212>RNA<213>Artificialsequence<220><223>Oligonucleotide<400>17cuccugcaggcuccggaucuu21<210>18<211>9<212>PRT<213>Artificialsequence<220><223>Fragmentoftheproteinencodedbyexon1bofhumanTm5aandTm5b<400>18SerLeuGluAlaValArgArgLysIle15<210>19<211>9<212>PRT<213>Artificialsequence<220><223>Fragmentoftheproteinencodedbyexon1bofhumanTm5aandTm5b<400>19SerLeuGlnGluGlnAlaAspAlaAla15<210>20<211>9<212>PRT<213>Artificialsequence<220><223>Fragmentoftheproteinencodedbyexon1bofhumanTm5aandTm5b<400>20ArgGluLeuAspHisGluArgLysLeu1權利要求1.一種篩選調節細胞表面蛋白質活性的化合物的方法，所述方法包括確定在候選化合物存在時原肌球蛋白的活性或細胞定位，其中與所述化合物不存在時對比，所述化合物存在時改變的原肌球蛋白活性或細胞定位提示所述化合物調節細胞表面蛋白質活性。2.根據權利要求1的方法，其中所述化合物存在時改變的原肌球蛋白細胞定位提示所述化合物增加細胞表面蛋白質活性。3.一種篩選調節細胞表面蛋白質活性的化合物的方法，所述方法包括確定在候選化合物存在時原肌球蛋白的表達水平，其中與所述化合物不存在時對比，所述化合物存在時改變的原肌球蛋白表達提示所述化合物調節細胞表面蛋白質活性。4.根據權利要求3的方法，其中所述化合物存在時降低的原肌球蛋白表達提示所述化合物增加細胞表面蛋白質活性。5.一種篩選調節細胞表面蛋白質活性的化合物的方法，所述方法包括測量在候選化合物存在時原肌球蛋白與其一個結合配偶體的結合，其中與所述化合物不存在時對比，所述化合物存在時改變的原肌球蛋白與其結合配偶體的結合水平提示所述化合物調節細胞表面蛋白質活性。6.根據權利要求5的方法，其中所述化合物存在時降低的原肌球蛋白與其結合配偶體的結合水平提示所述化合物增加細胞表面蛋白質活性。7.根據權利要求5或權利要求6的方法，其中所述原肌球蛋白結合配偶體選自calponin、CEACAM1、內抑制素、Enigma、凝溶膠蛋白(優選亞結構域2)、S100A2、及肌動蛋白。8.根據權利要求7的方法，其中所述原肌球蛋白結合配偶體是肌動蛋白。9.根據權利要求1-8任一項的方法，其中所述細胞表面蛋白選自轉運蛋白、通道、受體、生長因子、抗原、信號傳導蛋白和細胞粘著蛋白。10.根據權利要求9的方法，其中所述蛋白是轉運蛋白或通道。11.一種篩選治療囊性纖維化的治療性化合物的方法，所述方法包括確定在候選化合物存在時原肌球蛋白的活性或細胞定位，其中與所述化合物不存在時對比，所述化合物存在時改變的原肌球蛋白活性或細胞定位提示所述化合物對于治療囊性纖維化是有用的。12.權利要求11的方法，其中所述化合物存在時改變的原肌球蛋白細胞定位提示所述化合物對于治療囊性纖維化是有用的。13.一種篩選治療囊性纖維化的治療性化合物的方法，所述方法包括確定在候選化合物存在時原肌球蛋白的表達水平，其中與所述化合物不存在時對比，所述化合物存在時改變的原肌球蛋白表達提示所述化合物對于治療囊性纖維化是有用的。14.根據權利要求13的方法，其中所述化合物存在時降低的原肌球蛋白表達提示所述化合物對于治療囊性纖維化是有用的。15.一種篩選治療囊性纖維化的治療性化合物的方法，所述方法包括測量在候選化合物存在時原肌球蛋白與其一個結合配偶體的結合，其中與所述化合物不存在時對比，所述化合物存在時改變的原肌球蛋白與其結合配偶體的結合水平提示所述化合物對于治療囊性纖維化是有用的。16.根據權利要求15的方法，其中所述化合物存在時降低的原肌球蛋白與其結合配偶體的結合水平提示所述化合物對于治療囊性纖維化是有用的。17.根據權利要求15或權利要求16的方法，其中所述原肌球蛋白結合配偶體選自calponin、CEACAM1、內抑制素、Enigma、凝溶膠蛋白(優選亞結構域2)、S100A2、及肌動蛋白。18.根據權利要求17的方法，其中所述原肌球蛋白結合配偶體是肌動蛋白。19.根據權利要求1-18任一項的方法，其中所述方法進一步包括配制被鑒別的化合物用于對人或非人類動物進行給藥。20.一種調節蛋白質在細胞表面膜中的插入或保留的方法，所述方法包括給予細胞一種調節原肌球蛋白表達、定位或活性的藥劑。21.根據權利要求20的方法，其中通過給予所述細胞原肌球蛋白拮抗劑而增加所述蛋白質在細胞表面膜中的插入或保留。22.根據權利要求20或權利要求21的方法，其中所述蛋白質選自轉運蛋白、通道、受體、生長因子、抗原、信號傳導蛋白和細胞粘著蛋白。23.根據權利要求22的方法，其中所述轉運蛋白是囊性纖維化跨膜傳導調節蛋白(CFTR)。24.一種調節分子轉運進細胞或轉運出細胞的方法，所述方法包括給予細胞一種調節原肌球蛋白表達、定位或活性的藥劑。25.根據權利要求24的方法，其中通過給予所述細胞原肌球蛋白拮抗劑來增加所述分子轉運進細胞或轉運出細胞。26.根據權利要求24或權利要求25的方法，其中所述分子選自電解質、水、單糖和離子。27.一種治療或預防個體由于細胞表面膜蛋白異常插入、保留或活性而引起的疾病的方法，所述方法包括給予所述個體一種調節原肌球蛋白表達、定位或活性的藥劑。28.根據權利要求20-27任一項的方法，其中所述細胞是非肌細胞。29.根據權利要求28的方法，其中所述細胞是神經元細胞或上皮細胞。30.根據權利要求29的方法，其中所述上皮細胞是胃腸上皮細胞。31.根據權利要求27的方法，其中所述由于細胞表面膜蛋白異常插入或活性而引起的疾病選自囊性纖維化、多發性硬化、多囊腎病、病毒感染、細菌感染、再灌注損傷、門克斯病、威爾遜病、糖尿病、肌強直性營養不良、癲癇和心境障礙如抑郁、雙相性精神障礙或情緒惡劣性障礙。32.一種治療或預防個體囊性纖維化的方法，所述方法包括給予所述個體一種調節原肌球蛋白表達、定位或活性的藥劑。33.根據權利要求1-32任一項的方法，其中所述原肌球蛋白是由一個選自TPM1、TPM2、TPM3及TPM4的基因所編碼的同工型。34.根據權利要求33的方法，其中所述原肌球蛋白同工型選自TM1、TM2、TM3、TM4、TM5、TM5a、TM5b、TM6、Tm5NM-1、Tm5NM-2、Tm5NM-3、Tm5NM-4、Tm5NM-5、Tm5NM-6、Tm5NM-7、Tm5NM-8、Tm5NM-9、Tm5NM-10和Tm5NM-11。35.根據權利要求34的方法，其中所述原肌球蛋白同工型包括由TPM1基因外顯子1b編碼的氨基酸序列(SEQIDNO11)或由TPM3基因外顯子1b編碼的氨基酸序列(SEQIDNO12)。36.根據權利要求34的方法，其中所述原肌球蛋白同工型是TM5a或TM5b。37.根據權利要求20-36任一項的方法，其中所述藥劑是原肌球蛋白拮抗劑，所述拮抗劑選自肽、原肌球蛋白的抗體、小有機分子、原肌球蛋白編碼mRNA的反義化合物、抗原肌球蛋白催化性分子如核酶或脫氧核酶、及一種靶向原肌球蛋白表達的dsRNA或小干擾RNA(RNAi)分子。38.根據權利要求37的方法，其中所述原肌球蛋白拮抗劑是針對原肌球蛋白編碼mRNA的反義化合物、催化性分子或RNAi分子。39.根據權利要求37的方法，其中所述原肌球蛋白拮抗劑是特異地針對TPM1基因外顯子1b(SEQIDNO7)或TPM3基因外顯子1b(SEQIDNO8)的反義化合物、催化性分子或RNAi分子。40.根據權利要求37的方法，其中所述原肌球蛋白拮抗劑是靶向序列AGCTCGCTGGAGGCGGTG(SEQIDNO13)的反義化合物、催化性分子或RNAi分子。41.根據權利要求37的方法，其中所述原肌球蛋白拮抗劑是包含序列CACCGCCUCCAGCGAGCT(SEQIDNO14)的反義化合物。42.一種評估一個個體對由于細胞表面膜蛋白異常插入、保留或活性而引起的疾病的易感性的方法，所述方法包括確定在所述個體的原肌球蛋白基因中存在突變的步驟。43.一種評估一個個體對由于細胞表面膜蛋白異常插入、保留或活性而引起的疾病的易感性的方法，所述方法包括分析所述個體的細胞中原肌球蛋白的極化分布。全文摘要本發明涉及篩選調節細胞表面蛋白質活性的化合物的方法。本發明涉及一種調節蛋白質插入或保留在細胞表面膜上的方法，所述蛋白質如囊性纖維化跨膜傳導調節蛋白(CFTR)。本發明還涉及由細胞表面膜蛋白的異常插入或活性引起的疾病的診斷與治療或預防的方法，所述疾病如囊性纖維化。文檔編號G01N33/68GK1761472SQ200480007736公開日2006年4月19日申請日期2004年3月22日優先權日2003年3月21日發明者杰奎琳·多爾比－佩恩,愛德華·歐洛克林,彼得·岡寧申請人:皇家亞力山大兒童醫院