肉毒桿菌毒素的定量的制作方法

專利名稱：肉毒桿菌毒素的定量的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種測定樣品中包含的突觸前神經(jīng)肌肉阻斷物質的量的方法。
測定樣品中包含的突觸前神經(jīng)肌肉阻斷物質的量通常通過測量該物質在小鼠或大鼠中的致死劑量LD50來實現(xiàn)。該方法目前特別用于測定活性肉毒桿菌毒素的量。這種LD50方法是殺死許多動物的代名詞。
本發(fā)明提供了一種相較于通常的LD50方法能挽救很多動物的生命的新方法。
因此，本發(fā)明提供了一種測定樣品中的突觸前神經(jīng)肌肉阻斷物質的量的方法，其包括以下步驟(i)測定誘導肌肉組織收縮所需的最小電壓Vm，所述的肌肉組織通過運動神經(jīng)與電刺激器相連接；(ii)添加包含突觸前神經(jīng)肌肉阻斷物質的樣品；(iii)以至少等于Vm的電壓以一定的時間間隔對肌肉組織進行電刺激；(iv)比較樣品誘導的效應與參考物質誘導的效應，從而測定樣品中突觸前神經(jīng)肌肉阻斷物質的量。
突觸前神經(jīng)肌肉阻斷物質在本申請中應該理解為能阻止和/或抑制與突觸前神經(jīng)肌肉活動相關的化學信息和信號的傳送的物質。突觸前神經(jīng)肌肉阻斷物質的例子為抑制乙酰膽堿(ACH)合成或釋放的物質；那些特別包括生物毒素(例如肉毒桿菌神經(jīng)毒素和銀環(huán)蛇毒素)和化學品(例如抑制ACH合成的宓膽堿或三乙基膽堿，抑制ACH釋放的氨基糖苷類抗生素或管箭毒堿和類似的化合物)。本發(fā)明優(yōu)選的突觸前神經(jīng)肌肉阻斷物質為肉毒桿菌神經(jīng)毒素和銀環(huán)蛇毒素(銀環(huán)蛇毒素中優(yōu)選的是α-銀環(huán)蛇毒素)。
本申請中肉毒桿菌神經(jīng)毒素(或肉毒桿菌毒素)是指肉毒桿菌神經(jīng)毒素復合物(不論A，B，C，D，E，F(xiàn)或者G型)以及高純度肉毒桿菌神經(jīng)毒素(不論A，B，C，D，E，F(xiàn)或G型)。肉毒桿菌毒素A型包括肉毒桿菌毒素A型的所有類型，包括A1，A2和A3。
肉毒桿菌神經(jīng)毒素復合物(無論是A，B，C，D，E，F(xiàn)還是G型)在本申請中應當理解為與至少另一個無毒的蛋白質結合的肉毒桿菌神經(jīng)毒素(無論是A，B，C，D，E，F(xiàn)還是G型)。
本申請中，高純度肉毒桿菌神經(jīng)毒素(無論是A，B，C，D，E，F(xiàn)還是G型)是指包括至少另一個蛋白質的復合物以外的肉毒桿菌神經(jīng)毒素(無論是A，B，C，D，E，F(xiàn)還是G型)。換句話說，除肉毒桿菌神經(jīng)毒素(A，B，C，D，E，F(xiàn)或G型)外，高純度肉毒桿菌神經(jīng)毒素(A，B，C，D，E，F(xiàn)或G型)不含顯著量的任何其它的梭菌屬來源的蛋白質。
本申請中，肌肉組織是指包含一條或多條肌肉纖維的肌纖維樣品。
優(yōu)選地，該肌肉組織浸于緩沖液例如生理緩沖液中。該緩沖液可包含能量來源。該能量來源可以是ATP能量來源，例如一種或多種下述物質ATP，糖例如葡萄糖和/或肌酸(包括磷酸肌酸)，脂肪酸，氨基酸，糖原和丙酮酸。特別地為了比較久的分析，該緩沖液可以充氧。
在一個優(yōu)選的實施方案中，該緩沖液是包含葡萄糖的充氧的生理緩沖液。
肌肉組織浸在其中的緩沖液優(yōu)選包含至少10mM的葡萄糖(例如，11mM)。還優(yōu)選，緩沖液是氧飽和的(例如，通過向緩沖液吹氧氣或95/5O2/CO2混合物)。此外，緩沖液優(yōu)選包含100到200mM的NaCl，1到5mM的KCl，10到15mM NaHCO3，0.5到2mM的MgCl2和1到5mM的CaCl2。緩沖液的pH優(yōu)選為大約7.4。
優(yōu)選地，該方法將是以至少等于超大電壓VSM的電壓進行步驟(iii)的電刺激。超大電壓應當理解為達到肌肉組織的最大的抽動反應的最小電壓。
根據(jù)本發(fā)明的第一個變體(后面稱為變體A)，誘導用于該方法階段(iv)的比較的作用是至肌肉組織癱瘓的時間(本申請中也稱為“壽命”)。根據(jù)亞變體，至癱瘓的時間可以基于(變體A1)肌肉收縮距離(一旦收縮距離等于零就實現(xiàn)癱瘓)或(變體A2)基于肌肉抽動頻率(一旦抽動頻率等于零就實現(xiàn)癱瘓)來確定。
根據(jù)本發(fā)明的另一個變體(后面稱為變體B)，誘導用于該方法階段(iv)的比較的作用為肌肉組織收縮速度的變化。
根據(jù)本發(fā)明的另一個變體(后面稱為變體C)，誘導用于該方法階段(iv)的比較的作用為肌肉組織收縮距離的變化。
根據(jù)本發(fā)明的另一個變體(后面稱為變體D)，誘導用于該方法階段(iv)的比較的作用為肌肉組織收縮力的變化。
根據(jù)本發(fā)明的更進一步的變體(后面稱為變體E)，誘導用于所述方法階段(iv)的比較的作用為肌肉組織的終板電位或小終板電位的變化。
本領域的技術人員可以使用變體A(包括它的亞變體)，B，C，D和E的組合，來改善獲得的結果的準確度。特別地，本領域的技術人員可以想到組合亞變體A1和亞變體A2。
優(yōu)選地，突觸前神經(jīng)肌肉阻斷物質為肉毒桿菌神經(jīng)毒素。特別地肉毒桿菌神經(jīng)毒素可以選自肉毒桿菌神經(jīng)毒素A型，肉毒桿菌神經(jīng)毒素B型和肉毒桿菌神經(jīng)毒素F型。更優(yōu)選地，肉毒桿菌神經(jīng)毒素選自肉毒桿菌神經(jīng)毒素A型和肉毒桿菌神經(jīng)毒素B型。在特別優(yōu)選的方式中，肉毒桿菌神經(jīng)毒素為肉毒桿菌神經(jīng)毒素A型，特別是肉毒桿菌神經(jīng)毒素A型復合物(如商業(yè)產(chǎn)品Dysport或Botox的活性成分)。
在一般的方式中，該方法在較低的濃度(例如0到100LD50單位/ml，優(yōu)選0到50或0到10LD50單位/ml)時更靈敏，而當樣品中存在高濃度的突觸前神經(jīng)肌肉阻斷物質時，它可能無效。因此，待測試的樣品優(yōu)選以能進行本發(fā)明方法的至少兩個或三個稀釋度(例如不稀釋，稀釋10倍和稀釋100倍)制備；那樣，還可以測定較高濃度的突觸前神經(jīng)肌肉阻斷物質。不過，可以如下所述提高前面描述的方法的靈敏性。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選執(zhí)行模式，肌肉組織由一塊獲自小鼠或大鼠的肋條肌肉組成。優(yōu)選地，該塊的大小為至少2mm×10mm。肌肉組織可以具有例如相當于肋條肌肉的2肋骨部分的大小。
根據(jù)本發(fā)明的更進一步優(yōu)選的執(zhí)行模式，每個電刺激總是施加電壓Vs，Vs至少等于誘導肌肉組織收縮所需的最小電壓Vm，Vs為除小于之外或等于稍微超過Vm的電壓?！吧晕⒊^Vm的電壓”可以是Vm加上3伏特，Vm加上2伏特或Vm加上1.5伏特。例如，應用的刺激電壓可以選為Vm加上1伏特。
本發(fā)明更進一步可能的特征包括使用攝像機結合視頻信號記錄器?？梢詫Ξa(chǎn)生的膠片進行分析，并精確評估突觸前神經(jīng)肌肉阻斷物質的作用。樣品中存在的突觸前神經(jīng)肌肉阻斷物質的量，可得自于與對參考物質觀察到的作用相比從樣品觀察到的作用。
或者，對于上面提及的變體D，用于測量肌肉組織收縮力的力位移探測換能器可以連接自動實時電子數(shù)據(jù)捕捉體系。
為了降低結果變異性，電刺激器以特定時間間隔發(fā)送選擇的電壓Vs，其每次都引起一定的作用。使用在這些條件下觀察到的平均作用可更準確測定樣品中存在的突觸前神經(jīng)肌肉阻斷物質的量。
一種增加該方法的靈敏度的方法在于執(zhí)行該方法比較久的一段時間，捕捉更多數(shù)據(jù)(例如至少5，10或30分鐘，以及直至1，2，4，8，12，24，48，72小時或甚至更長時間)。例如，對于該方法的變體D，可以進行該方法直到測量到肌肉組織收縮力以某種比例減少(例如，減少10，20 25，30，40，50，60，70，75，80或90％)。
為了執(zhí)行該優(yōu)選執(zhí)行模式，與前面闡明的更一般的方法相比，需要延長肌肉組織的壽命。
在一種旨在延長所述壽命的特別的方法中，以定期的方式提供氧氣和葡萄糖(或其它的ATP源)給肌肉組織。
達到該目的的一種方法是，每隔一定間隔更新包含葡萄糖(或其它的ATP源)的充氧的生理緩沖液浴，以更換消耗的氧氣和葡萄糖(或其它的ATP源)(其中所述的間隔優(yōu)選不少于1分鐘并不超過24小時，例如，每1，2，5，10，15或60分鐘)。另一種方法在于，使用其中不斷吹氧氣的浴液，其允許保持浴液中恒定的氧濃度；另外，可以每隔一定間隔添加葡萄糖(或其它的ATP源)來替換肌肉組織消耗的葡萄糖(或其它的ATP源)。
或者，可使用流通浴體系，其具有保持恒定的葡萄糖(或其它的ATP源)水平和任選地保持恒定的氧含量的優(yōu)點。在該體系中，包含葡萄糖(或其它的ATP源)的充氧的生理緩沖液在肌肉組織沉浸到其中的容器的一端泵入，并在另一端泵出。
延長肌肉組織壽命的其它方法包括使用降低樣品疲勞度的序列脈沖刺激。序列脈沖刺激是指持續(xù)時間ts的刺激，其通過期間沒有施加刺激的持續(xù)時間tp的時間間隔彼此分隔開。時間ts優(yōu)選為50μs到500ms，更優(yōu)選100μs到250ms，甚至更優(yōu)選100μs到1ms(例如，200μs或大約200μs)；時間tp優(yōu)選為0.1到10s，更優(yōu)選0.5到2s(例如，1s或大約1s)；ts/tp之比優(yōu)選為1∶2到1∶50000，更優(yōu)選1∶5到1∶20000，甚至更優(yōu)選1∶500到1∶10000(例如，大約1∶5000).
本發(fā)明還提供了一種測定樣品中突觸前神經(jīng)肌肉阻斷物質的中和抗體的量的方法，其包括以下步驟(i)測定誘導肌肉組織收縮所需的最低電壓Vm，所述的肌肉組織與電刺激器通過運動神經(jīng)相連接；(ii)添加包含突觸前神經(jīng)肌肉阻斷物質的中和抗體的待測樣品和確定量的所述突觸前神經(jīng)肌肉阻斷物質的混合物，所述的混合物已經(jīng)于0到45℃的溫度預孵育大約15到大約120分鐘；(iii)以至少等于Vm的電壓對肌肉組織以一定的時間間隔進行電刺激；(iv)比較混合物誘導的效應與確定量的所述突觸前神經(jīng)肌肉阻斷物質誘導的效應，從而測定樣品中突觸前神經(jīng)肌肉阻斷物質的中和抗體的量。
前面所述的測定樣品中突觸前神經(jīng)肌肉阻斷物質的量的方法的全部變體可作必要的修正適用于本發(fā)明測定樣品中突觸前神經(jīng)肌肉阻斷物質的中和抗體的量的方法。
術語“大約”指考慮值周圍的區(qū)間。如本專利申請中使用的，“大約X”指X減去X的10％到X加上X的10％的區(qū)間，優(yōu)選X減去X的5％到X加上X的5％的區(qū)間。
除非進行不同的定義，這里使用的所有技術和科學術語具有與本發(fā)明所屬領域的普通專業(yè)人員通常所理解的相同的含義。類似地，這里提到的所有出版物，專利申請，所有專利和所有其它的參考文獻都結合作為參考。
下面的實施例是為了舉例說明上述內(nèi)容的目的，決不能認為是對本發(fā)明范圍的限制。
附圖簡述

圖1顯示了根據(jù)實施例1所述的方法，采用不同的Dysport濃度(0，1，10和50U)以時間的函數(shù)測定的肋間大鼠制品的相對收縮距離。X軸顯示時間(s)，Y軸顯示距離(標準化到收縮原始大小)。
圖2顯示了根據(jù)實施例1所述的方法用不同的Dysport濃度(0，1，10和50U)從收縮距離測定的肋間大鼠制品的壽命。顯示的數(shù)據(jù)是平均值±sem，n＝4-5)。X軸顯示Dysport濃度時間(LD50單位/ml)，Y軸顯示時間(s)。
圖3表現(xiàn)了根據(jù)實施例1所述的方法用不同的Dysport濃度(0，1，10和50U)從抽動頻率測定的肋間大鼠制品的壽命。顯示的數(shù)據(jù)是平均值±sem，n＝4-5)。X軸顯示Dysport濃度時間(LD50單位/ml)，Y軸顯示時間(s)。
圖4顯示了在靜態(tài)浴槽裝備中連接到力位移探測換能器上的2肋骨組織切片。
圖5顯示了在靜態(tài)系統(tǒng)中利用實施例3的直接應用方法，對暴露于安慰劑或500，1000，1500或者3000U的毒素的2肋骨切片的最大抽動力測量值所用的時間(小時)(下面的實驗數(shù)n適用于安慰劑n＝4；500Un＝8；1000Un＝5；1500Un＝11)。誤差線說明了±S.E.M.。X軸顯示最大抽動力減少％，Y軸顯示時間(小時)。
圖6顯示了在靜態(tài)系統(tǒng)中利用實施例3的浸漬法，對暴露于安慰劑或3，6或者12U/ml毒素的2肋骨切片的最大抽動力測量值所用的時間(小時)(下面的實驗數(shù)n適用于安慰劑n＝3；3U/mln＝5；6U/mln＝2；12U/mln＝2)。誤差線說明了±S.E.M。X軸顯示最大抽動力減少％，Y軸顯示時間(小時)。
實施例在下述的實施例中，1 Speywood單位或1U相當于小鼠中肉毒桿菌毒素的中數(shù)腹膜內(nèi)LD50劑量。
實施例1包含肉毒桿菌毒素的樣品使用材料a)使用的緩沖溶液通過把下述物質稀釋于水中來制備改良的Ringers緩沖液，以下稱為“Lillies Ringers緩沖液”
NaCl 138.8mMKCl 4mMNaHCO312mMKH2PO41mMMgCl21mMCaCl22mM使用之前即刻添加葡萄糖(11mM)到前面制備的溶液中，并且吹95％O2與5％CO2的氣體混合物到緩沖溶液中以產(chǎn)生Lillies Ringers緩沖液。
以下提到的磷酸鹽緩沖鹽溶液(PBS)通過溶解Sigma提供的片劑來制備，當該片劑添加到200ml水中時，提供以下特征的緩沖液磷酸鹽緩沖液 0.01MKCl 0.0027MNaCl 0.137M25℃時的pH7.4b)組織分離Wistar大鼠(約重275g)通過暴露于CO2后(大約3min以誘導意識喪失)進行頸脫位來處死。從每個動物解剖出肋架，置于LilliesRingers緩沖液中，并轉運到實驗室(行程時間大約15min)。沿著脊柱小心解剖把肋架分解成兩個部分。在進行實驗程序之前把組織保存在充氧的緩沖液中。
c)測定誘導肌肉收縮所需的最小電壓Vm把每個肋間制品(半翼肋架)置于包含Lillies Ringers緩沖液的Petri培養(yǎng)皿。對于每個制品，仔細地解剖一條肋間神經(jīng)以展現(xiàn)大約1-2mm的神經(jīng)束。解剖后，制品在回到包含10ml充氧的LilliesRingers緩沖液的Petri培養(yǎng)皿中之前，可在新鮮充氧的LilliesRingers緩沖液中復蘇大約15-20分鐘。解剖出的肋間神經(jīng)然后通過抽吸電極與刺激器(Grass Instruments Model S48)連接，返回接觸電極置于培養(yǎng)基中。測定誘導肌肉收縮所需的最小電壓Vm。如果在10V以下不能實現(xiàn)刺激，解剖另一條神經(jīng)并且制品在繼續(xù)之前進行復蘇。
測定樣品中包含的肉毒桿菌毒素的量的方法神經(jīng)用脈沖電壓(5-9V，1Hz)進行刺激，選擇的電壓總是比達到刺激和肌肉收縮所需的閾值電壓Vm高1V。用裝備有連接到組合的TV/視頻信號記錄器的JVC TKC1481EG攝像機的Nikon SMZ800立體顯微鏡進行切片的圖像顯微檢查。
添加Dysport(有效成分肉毒桿菌毒素A型)到直接位于肋間制品(稍微浸沒于10ml的緩沖液內(nèi))上的PBS中。為了達到50Speywood單位(U)/ml的劑量，添加500U的毒素到培養(yǎng)皿中(10ml緩沖液)，以達到50U/ml的終濃度。為了達到10U/ml的劑量，添加100U到培養(yǎng)皿中以達到10U/ml的終濃度。為了達到1U/ml的劑量，添加10U到培養(yǎng)皿中以達到1U/ml的終濃度。至于安慰劑(其具有與Dysport相同的組成，除了缺乏肉毒桿菌毒素)，小瓶的全部內(nèi)含物(溶于0.2ml PBS中)都添加到培養(yǎng)皿中。
數(shù)據(jù)分析記錄的圖像片斷轉變?yōu)镸PEG文件。為了幫助隨后的分析，每個影片都剪切成2分鐘的分段，使用AdobePremiere5.1軟件使這些分段減慢到1/2它們的初速度。然后通過計數(shù)10s時間內(nèi)(對半速片斷為20s)的抽動次數(shù)來進行分析，并對該10s時間內(nèi)的抽動次數(shù)進行平均得到抽動頻率值。還可以通過用重疊比例尺(任意單位-標稱6-7點的尺)來播放影片而測定收縮距離，對數(shù)據(jù)進行平均來產(chǎn)生每個10s時間的收縮距離，或者把所述的距離與初始收縮距離進行比較。
重復實驗若干次(0U/mln＝5；1U/mln＝5；10U/mln＝4；50U/mln＝4)，并把結果進行平均。
結果從圖1可以看出，相對的收縮距離(也即存在毒素時的收縮距離除以缺乏毒素時的收縮距離)，作為Dysport濃度的函數(shù)，或多或少迅速降低。
從圖2還可以看出，其顯示了有關距離抽動壽命的結果(也即從添加毒素的時刻直到收縮距離變成零時那一點所需的時間)，可以觀察到作為Dysports濃度的函數(shù)的肌肉收縮距離的劑量依賴性減少。
抽動頻率壽命(也即從添加毒素的時刻直到收縮頻率變成零時那一點所需的時間)也是以圖3所示的劑量依賴性方式被Dysport減少。
實施例2包含α-銀環(huán)蛇毒素的樣品使用與實施例1中所述相同的方法，對α-銀環(huán)蛇毒素而不是Dysport以21uM的濃度進行測試(n＝3)。α-銀環(huán)蛇毒素制品的平均抽動壽命為225s(±sem 93，n＝3)和238s(±sem 93，n＝3)，分別從收縮距離和抽動頻率測定。
實施例3延長生命體系材料制備a)使用的緩沖溶液該實施例中使用的改良的Ringers緩沖液或“Lillies Ringers緩沖液”與實施例1中的相同。
把以下物質稀釋于1升水中來制備該實施例中使用的明膠磷酸鹽緩沖液(GPB)明膠 2gNaHPO4，2H2O 10gb)組織分離雄性Wistar大鼠(大約230-300g)通過暴露于CO2后(大約3分鐘以誘導意識喪失)進行頸脫位來處死。從動物解剖出肋架，置于Lillies Ringers緩沖液中，并轉運到實驗室(行程時間大約20分鐘)。沿著脊柱和胸骨小心解剖，把肋架分解成兩個部分。在進行實驗程序之前，將兩半肋架保存在大約300ml的連續(xù)充氧的LilliesRingers緩沖液中至少30分鐘。
c)測定誘導肌肉收縮所需的最小電壓Vm將一半肋架置于包含大約10ml的Lillies Ringers緩沖液的Petri培養(yǎng)皿中，并仔細地解剖肋間神經(jīng)以展現(xiàn)大約1-2mm的神經(jīng)束。該神經(jīng)然后通過抽吸電極與帶有置于培養(yǎng)基中的返回電極的刺激器(Grass Instruments Model S48)連接。測定了誘導肌肉收縮所需的最小電壓Vm。如果在10V(1Hz，200μsec持續(xù)時間)以下不能實現(xiàn)刺激，則解剖另一條神經(jīng)。將包含解剖出的神經(jīng)的2肋骨部分從半翼肋架解剖出來，確保盡可能多的剩余肌肉組織保留在2肋骨的任一側以便隨后連接到力位移探測換能器上。
d)連接到力位移探測換能器上參考圖4所示的靜態(tài)浴槽體系，3個金屬釘釘在2肋骨任一側的非-刺激肌肉組織上。2肋骨部分(5)的一側通過3個釘子連接到固定的底部(4)，同時另一側固定到自由的底部(8)。固定的底部牢固地夾緊在位，而自由底部通過大約4cm的棉線(7)連接到力位移探測換能器(1；Grass Instruments Model FT03)。固定的組織浸于大約500mlLillies Ringers緩沖液中，返回電極(2)置于緩沖液內(nèi)。解剖出的肋間神經(jīng)通過(陽性)抽吸電極(3)與刺激器相連。圖4中所示的體系還包括CO2/O2進氣口(6)。
測定樣品中包含的肉毒桿菌毒素的量的方法對2肋骨組織部分使用序列脈沖刺激(對于每個30秒階段的最初5秒為1脈沖/秒)以15V，200μsec持續(xù)時間，刺激大約90分鐘。
所需濃度的毒素在應用之前即刻在GPB中重新配制。通過2種方法中的一種進行毒素遞送A)直接應用-通過除去組織浴內(nèi)的一些緩沖液使2肋骨部分暴露于氣/液界面。使用Hamilton注射器，以點滴方式把毒素直接應用到暴露的組織上，使肌肉包被在毒素溶液中。組織更進一步地暴露15分鐘，以使其在用原始Ringers緩沖液覆蓋之前攝取毒素。如果必要，任何移出、解剖的神經(jīng)可以重新連接到抽吸電極上。
B)浸漬-使用Hamilton注射器，把毒素直接應用到非常接近(而不是直接加到其上)2肋骨部分的組織浴中。
從力位移探測換能器記錄的抽動力讀數(shù)，首先通過GrassInstruments AC/DC應變計放大器(Model P122)放大，然后使用GrassPolyVIEWTM軟件記錄信號。
數(shù)據(jù)分析從記錄的蹤跡，測定使初始最大抽動力測定值(在添加毒素/安慰劑之后)減少一定百分比所需的時間。重復實驗若干次(直接應用法安慰劑n＝4；500Un＝8；1000Un＝5；1500Un＝11；浸漬法安慰劑n＝3；3U/mln＝5；6U/mln＝2，12U/mln＝2)。由于當組織暴露于安慰劑和低水平毒素時的長壽命，抽動力減少90％處例示的值是基于假定恒速減少的數(shù)據(jù)外推得到的估計結果。
結果
A)直接應用法隨著時間，在所有樣品中都記錄到抽動力測定值的逐漸減少，包括添加安慰劑之后，如圖5中所見。在安慰劑暴露后，在超過大約12小時之后觀察到最大抽動力減少了50％。比較起來，在暴露于1500U毒素的那些組織樣品中抽動力更迅速地降低，在大約5小時后達到50％減少。
B)浸漬法如圖6中所看到的，在添加安慰劑之后記錄到抽動力測量值的減少，在大約20小時之后觀察到最大抽動力減少50％。把組織沉浸在3單位/ml的毒素溶液中進一步增加了抽動力減小的速度，在刺激13小時之后達到抽動力減少50％。在更高的毒素濃度，劑量依賴性反應仍然明顯。
可以看出，使用毒素遞送的直接應用和浸漬法，都觀察到可重復的劑量依賴性毒素-誘導的肌肉收縮抑制。
權利要求
1.一種測定樣品中突觸前神經(jīng)肌肉阻斷物質的量的方法，其包括以下步驟(i)測定誘導肌肉組織收縮所需的最小電壓Vm，所述的肌肉組織通過運動神經(jīng)連接到電刺激器上；(ii)添加包含突觸前神經(jīng)肌肉阻斷物質的樣品；(iii)以至少等于Vm的電壓，以一定的時間間隔對肌肉組織進行電刺激；(iv)比較樣品誘導的作用與參考物質誘導的作用，從而測定樣品中突觸前神經(jīng)肌肉阻斷物質的量。
2.權利要求1的方法，其中肌肉組織浸于緩沖液中。
3.權利要求2的方法，其中緩沖液是生理緩沖液。
4.權利要求2或3的方法，其中該緩沖液包括能量來源。
5.權利要求4的方法，其中的能量來源是ATP能量來源。
6.權利要求2到5中任一項的方法，其中緩沖液是充氧的。
7.權利要求2到6中任一項的方法，其中緩沖液是包含葡萄糖的充氧的生理緩沖液。
8.任一項前面權利要求的方法，其中權利要求1的步驟(iii)中的電刺激以至少等于超大電壓VSM的電壓進行。
9.任一項前面權利要求的方法，其中誘導的作用是至肌肉組織癱瘓的時間。
10.權利要求1到8中任一項的方法，其中誘導的作用是肌肉組織收縮速度的變化。
11.權利要求1到8中任一項的方法，其中誘導的作用是肌肉組織收縮距離的變化。
12.權利要求1到8中任一項的方法，其中誘導的作用是肌肉組織收縮力的變化。
13.權利要求1到8中任一項的方法，其中誘導的作用是肌肉組織的終板電位或小終板電位的變化。
14.任一項前面權利要求的方法，其中權利要求1的步驟(iii)中的電刺激包括持續(xù)時間ts的刺激，其通過期間不施加刺激的持續(xù)時間tp的時間間隔而彼此隔開，其中時間ts為50μs到500ms，時間tp為0.1到10s，ts/tp之比為1∶2到1∶50000。
15.任一項前面權利要求的方法，其中突觸前神經(jīng)肌肉阻斷物質是肉毒桿菌毒素。
16.權利要求15的方法，其中肉毒桿菌毒素選自肉毒桿菌毒素A型，肉毒桿菌毒素B型和肉毒桿菌毒素F型。
17.權利要求16的方法，其中肉毒桿菌毒素選自肉毒桿菌毒素A型和肉毒桿菌毒素B型。
18.權利要求17的方法，其中肉毒桿菌毒素是肉毒桿菌毒素A型。
19.權利要求1到14中任一項的方法，其中突觸前神經(jīng)肌肉阻斷物質是銀環(huán)蛇毒素。
20.權利要求19的方法，其中銀環(huán)蛇毒素是α-銀環(huán)蛇毒素。
21.一種測定樣品中針對突觸前神經(jīng)肌肉阻斷物質的中和抗體的量的方法，其包括以下步驟(i)測定誘導肌肉組織收縮所需的最小電壓Vm，所述的肌肉組織通過運動神經(jīng)連接到電刺激器上；(ii)添加包含針對突觸前神經(jīng)肌肉阻斷物質的中和抗體的待測樣品與確定量的所述突觸前神經(jīng)肌肉阻斷物質的混合物，所述混合物已經(jīng)于0到45℃的溫度預孵育大約15到大約120分鐘；(iii)以至少等于Vm的電壓，以一定的時間間隔對肌肉組織進行電刺激；(iv)比較混合物誘導的作用與確定量的所述突觸前神經(jīng)肌肉阻斷物質誘導的作用，從而測定樣品中針對突觸前神經(jīng)肌肉阻斷物質的中和抗體的量。
22.權利要求21的方法，其中誘導的作用是肌肉組織收縮力的變化。
23.權利要求21或22的方法，其中突觸前神經(jīng)肌肉阻斷物質是肉毒桿菌毒素。
24.權利要求23的方法，其中肉毒桿菌毒素是肉毒桿菌毒素A型。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種測定樣品中包含的突觸前神經(jīng)肌肉阻斷物質(特別是肉毒桿菌毒素)的量的方法。一方面，該方法包括以下步驟(i)測定誘導肌肉組織收縮所需的最小電壓V
文檔編號G01N33/94GK1751238SQ200480004686
公開日2006年3月22日 申請日期2004年2月20日 優(yōu)先權日2003年2月21日
發(fā)明者A·M·皮克特, R·A·夸克, R·M·弗朗斯, L·A·里卡爾頓-班克斯 申請人:伊普森有限公司