專利名稱:陰陽離子毛細管電泳電導檢測芯片的制作方法
技術領域:
本實用新型屬生物檢測技術領域,具體涉及一種陰陽離子毛細管電泳電導檢測芯片。
背景技術:
自從1990年A.Manz[1]等首次提出微型全分析系統(μ-TAS)以來,作為一個跨學科的新領域,其目標是借助微機電加工(MEMS)技術與生物技術實現化學分析系統從試樣處理到檢測的整體微型化、集成化與便攜化,是目前分析儀器發展的重要方向與前沿。微流控芯片則以微管道網絡為結構特征,是當前微全分析系統發展的重點。作為微流控分析系統的一個重要分支,毛細管電泳芯片技術以其高效、快速、試劑用量少、低耗及集成度高等優點引起了國內外分析和生命科學界有關專家的廣泛關注,在臨床診斷、藥物分析、法醫、環境檢測和軍事等領域顯示了良好的應用前景,各種新的微流控芯片和檢測技術層出不窮。
芯片毛細管電泳主要使用玻璃和聚合物芯片[2],玻璃芯片加工技術要求高,需專用的設備,難以采用模具大批量生產,價格比較昂貴,限制了其應用。于是聚合物芯片得到了發展,其中聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)和聚二甲基硅氧烷(PDMS)是兩種常用的聚合物[3]。聚合物芯片的制作主要采用注塑、印模和澆鑄等技術,但制作出來的塑料芯片上的毛細管槽有變形現象,與設計值有一定差異,且同種芯片間的重現性不佳。單體注模直接生產聚合物芯片技術,將有芯片微流結構的硅片或金屬陽膜制成模具,再將聚合物單體如甲基丙烯酸甲酯等注入其中引發聚合,脫模后即可制作成芯片,具有方法簡便、原料成本低廉,重現性好等優點,適合大批量生產。由于芯片上的微流通道尺寸微小,需要高靈敏度的檢測手段,芯片毛細管電泳多采用激光誘導熒光檢測,但對非熒光或不易衍生的物質就需使用其他檢測技術,如電化學和質譜檢測等。質譜檢測儀器昂貴,不易微型化,于是靈敏度較高的電化學檢測技術得到了發展。電化學檢測死體積小、靈敏度高、電極及控制儀器小巧易集成。自從1998年A.T.Woolley[4]首次報道芯片毛細管電泳電化學技術以來,該技術得到了國內外專家的廣泛重視,開發新型的毛細管電泳芯片以及新型的電導檢測電極有重要意義。
無機和有機陰陽離子的同時分離分析在臨床診斷、生物醫學研究、環境監測和食品分析工業在線分析等領域有重要意義,目前尚不能進行陰離子和陽離子的芯片毛細管電泳同時分離分析,兩類離子需要分別進行分析。
參考文獻[1]Manz A,Graber N,Widmer HM.Sens.Actuators B 1990,1,244-248. Verpoorte E.Electrophoesis 2002,23,(6)77-712. Becker H,Locascio,LE.Talanta 2002,5(6),2(6)7-287. Woolley AT,Lao,K,Glazer AN,Mathies RA.Anal.Chem.1998,70,(6)84-(6)88.
發明內容
本實用新型的目的在于提出一種操作簡便、線性范圍寬、重現性好、靈敏度高、樣品用量少的高通量的陰陽離子同時分析毛細管電泳電導檢測芯片。
本實用新型提出的陰陽離子毛細管電泳電導檢測芯片,由本體聚合聚甲基丙烯酸甲酯毛細管電泳芯片1和移動式非接觸電導檢測電極2構成,可以進行陰陽離子雙向同時進樣、同時分離和同時檢測,其結構見圖1所示。其中,毛細管電泳芯片1中間位置橫貫有分離毛細管4,分離毛細管4的兩端內側設置有兩根進樣毛細管5,成十字交叉形式;分離毛細管4的兩端設有緩沖溶液孔7和10,兩根進樣毛細管5的一端(如圖1中的上端)分別設有緩沖溶液孔3和(6),兩根進樣毛細管5的另一端(如圖1中的下端)分別設有樣品溶液孔8和9,導電檢測電極2設置于毛細管電泳芯片中間部位,與分離毛細管4垂直。電導檢測電極2由電極基片13、金屬膜電極對14、U形夾11和銅絲12構成,其結構如圖2所示。金屬膜電極對14直接制作于電極基片13上,電極兩端分別成U形彎曲,使電極對14粘在電極基片13的上、下兩面。其中,電極基片13的一側的兩電極固定在電極基片13的中線位置,另一側的兩電極末端分別由導電膠15與細銅絲12連接;兩個U形夾11粘在電極基片13的兩端,使電導檢測電極對14與毛細管電泳芯片1的上表面緊密接觸并可以沿分離毛細管4方向移動;金屬膜電極對14通過細銅絲12與電導儀連接。
本實用新型中,分離毛細管4和進樣毛細管5的寬度為40-100μm,深度為15-30μm,分離毛細管4的長度為6-10cm,進樣毛細管5的長度為0.8-2cm。其緩沖溶液孔3、6、7和10以及樣品溶液孔8和9的直徑為1-3mm。毛細管電泳芯片1的長度為70-110mm,寬度為18-30mm,厚度為1.5-2.5mm。毛細管電泳芯片1材料為聚甲基丙烯酸甲酯。
本實用新型中,電導檢測電極的金屬膜電極14的寬度為0.6-1mm,長度為20-30mm,電極基片13的長度為20-30mm,寬度為8-12mm,厚度為0.8-1.2mm。該金屬膜電極對14為條狀,相互平行,平行距離為0.6-0.8mm。
本實用新型設計的陰陽離子毛細管電泳電導檢測芯片的制作方法如下采用計算機輔助設計軟件設計芯片的如圖1所示雙十字交叉毛細管通道和溶液連接孔,采用高分辨率(大于3000dpi)激光照排系統在透明薄膜上打印成掩膜負片,掩膜上的微流通道寬度為40-100μm,溶液連接孔直徑1-3mm,其中分離毛細管4和進樣毛細管5和溶液孔3、6、7、8、9和10(圖1)為透明,剩余部分為黑色。陰陽離子雙向進樣毛細管電泳芯片設計圖的正像見圖1(不包括電導檢測電極2)。在經氧化處理的硅片(p型,厚500μm,直徑4英寸,晶向<100>,表面二氧化硅氧化層厚100nm)通過旋轉涂膜技術涂覆一層負性光刻膠(如SU-8光刻膠),然后蓋上掩膜(含設計的芯片毛細管微流結構),經紫外線曝光和烘烤處理后,用配套顯影劑浸泡處理,分別在丙酮和異丙醇中洗去未部曝光部分(毛細管和溶液孔以外的區域)的光刻膠層,然后于烘箱中烘使毛細管通道和溶液連接孔部分曝光的光刻膠硬化,于稀HF-NH4F溶液蝕去硅片表面未部曝光部分的SiO2層,然后于50-70℃用40%KOH水溶液(含5%異丙醇)刻蝕裸露的硅片約1小時,即制成硅片陽模。將有毛細管凸槽的硅片一面與一塊平板玻璃夾緊一中間鏤空為芯片尺寸的矩形的鋁板(約2mm厚),構成芯片模具。在甲基丙烯酸甲酯中溶解15-20%的聚甲基丙烯酸甲酯粉末以增加粘度,與一定量引發劑如安息香甲醚(0.1%-0.2%)混合,將該混合物中注入模具中,采用紫外線引發聚合。同時將相應液體混合物注模于縫隙約為100μm的平板玻璃間聚合,脫模后得到相同材料的蓋膜。將毛細管電泳芯片基片水浴超聲脫模,通道末端鉆孔(溶液連接孔3、(6)、7、8、9和10見圖1,孔徑1-3mm)用于連接溶液,通過熱壓或溶劑法將一層蓋膜粘在毛細管電泳芯片基片上,即得芯片成品。有蓋膜的一面為芯片上表面,將與配套的移動式非接觸電導檢測電極2直接接觸。電導檢測電極2的制作方法為將鋁膜(或其他金屬膜)剪切成條狀電極(寬0.(6)-1mm,長20-30mm),通過粘合劑(如快速固化環氧樹脂)按照圖2示粘在一長方形的透明硬塑料基片13(如聚苯乙烯片,長20-30mm,寬8-12mm,厚0.8-1.2mm)的兩側,電極在塑料片的兩端分別有一個U形彎曲(圖2(c)和(d)),使電極對14可以粘在電極基片13的上下兩面。一面的兩電極端固定在塑料片13的中線位置(圖2(b)),要求電極條平行且兩電極間的平行距離為0.(6)-0.8mm,之所以沒有將兩電極直接平行安置,是因為將電極粘在塑料片中線兩側可降低電極對14間的寄生電容。塑料片13另一側兩電極末端分別用導電膠15與細銅絲12連通,銅絲12用于電極對14與電導儀連接。將兩個聚氯乙烯(PVC)薄片(長20mm,寬10mm,厚0.2-0.3mm)熱壓制成的U形夾子11用粘合劑粘在含電極對塑料片13的兩端,即制得毛細管電泳芯片移動式非接觸電導檢測電極2。
本實用新型的操作過程和測試結果如下圖2(b)示含電極對的電導檢測電極下表面與毛細管電泳芯片的上表面在U形夾11的作用下緊密接觸,由于芯片蓋膜很薄(厚100μm),當離子通過蓋膜下面的毛細管流經電導電極對14時,電導電極對14間的電導將上升,從而達到檢測的目的。由于電極對14與緩沖液和樣品不接觸,避免電極粘污,使分析重現性大大提高。芯片的操作為將含陰陽離子的相同樣品溶液填充于樣品溶液孔8和9中,先在樣品溶液孔8和樣品溶液孔9間施加進樣電壓1-2秒,其中一個孔8與高壓負極相連,另一個孔9與高壓正極相連,將陽離子樣品區帶和陰離子樣品區帶通過電泳遷移經兩個進樣毛細管5引入分離通道(分離毛細管)4,陽離子區帶進入右邊十字交叉處的內側,陰離子樣品區帶進入左邊十字交叉處的內側,然后在緩沖溶液孔7和緩沖溶液孔10間施加分離電壓,其中緩沖溶液孔7與高壓負極相連,緩沖溶液孔10與高壓正極相連,在高壓電場的作用下,陽離子從右側的進樣十字交叉處向左側遷移,而陰離子從左側的進樣十字交叉處向右側遷移,移動式非接觸電導檢測電極2獲得最佳檢測位置,從而完成對陰陽離子的同時進樣、同時分離和同時檢測,大大提高分離效率和容量。此外,通過改變進樣方式該陰陽離子毛細管電泳電導檢測芯片還可以單獨用于陰離子或陽離子的分析,如在樣品溶液孔9和緩沖溶液孔7間施加進樣電壓,樣品溶液孔9接高壓正極,僅陽離子從右邊十字交叉處被引入分離毛細管4;如在樣品溶液孔10和緩沖溶液孔8間施加進樣電壓,樣品溶液孔10接高壓負極,僅陰離子從左邊十字交叉處被引入分離毛細管4,分離方式同上。
本實用新型的陰陽離子毛細管電泳電導檢測芯片操作簡便、重現性好、靈敏度高、線性范圍寬、樣品用量少,可同時分離檢測陰陽離子,分析效率高。具體可見下述的測試實驗結果使用上述陰陽離子毛細管電泳電導檢測芯片,采用雙向陰陽離子同時進樣,獲得的0.1mMCH3NH3+、NH4+、Na+、Cl-、NO3-和ClO4-的電泳圖譜見3(A)。采用正極單向進樣獲得的0.1mMCH3NH3+、NH4+和Na+的電泳圖譜見3(B),采用負極單向獲得的0.1mM Cl-、NO3-和ClO4-三種陰離子的電泳圖譜見3(C),測試條件為分離電壓為+1000V,進樣電壓為+500V,進樣時間為1s,緩沖溶液為20mM 2-嗎啉乙磺酸(MES)-20mM組氨酸(pH(6).1),電導檢測波形為正弦波(頻率為200kHz,峰-峰電壓幅度為10V,非接觸式移動電導檢測電極2與右側正極十字交叉的距離為2.7cm。對上述測定的陰陽離子的線性范圍為0.01-5mM,檢測下限在5-8μM范圍內,10次測定0.1mM NH4+、Na+、Cl-和ClO4-的峰信號的相對標準偏差分別為4.2%、3.9%、4.8%和4.0%,表明該陰陽離子毛細管電泳電導檢測芯片線性范圍寬且重現性良好,高效快速,在(6)0秒內就可完全分離并同時檢測六種陰陽離子,可用于實際樣品的測定。
圖1為本實用新型的平面結構圖。
圖2為本實用新型中移動式非接觸電導檢測電極結構圖,其中圖2(a)為電導檢測電極的上表面圖示,圖2(b)為電導檢測電極的下表面圖示,圖2(c)為電導檢測電極2的剖面圖示,圖2(d)為安置在電泳芯片1上的電導檢測電極2的剖面圖示。
圖3為本實用新型陰陽離子毛細管電泳電導檢測芯片分離檢測三種陽離子和三種陰離子的電泳圖譜。其中圖3(A)為本實用新型同時分離檢測三種陽離子和三種陰離子的電泳圖譜,圖3(B)和圖3(C)為本實用新型分別分離檢測三種陽離子和三種陰離子的電泳圖譜。
圖中標號1為毛細管電泳芯片,2為移動式非接觸電導檢測電極,3為緩沖溶液孔,4為分離毛細管,5為進樣毛細管,(6)和7均為緩沖溶液孔,8和9均為樣品溶液孔,10為緩沖溶液孔,11為U形PVC夾,12為細銅絲,13為電極基片,14為金屬膜電極對,15為導電膠,a、b、c、d、e和f分別為濃度為0.1mM的CH3NH3+、NH4+、Na+、Cl-、NO3-和ClO4-。
具體實施方式
下面通過實施例和附圖進一步描述本實用新型1、陰陽離子雙向進樣毛細管電泳芯片的制作(A)電泳芯片的設計采用Adobe Illustrator 10.0軟件設計芯片的毛細管通道和溶液連接孔,采用高分辨率(3(6)00dpi)激光照排系統在聚酯透明薄膜上打印成掩膜負片,掩膜上的微流通道寬度為50μm,溶液連接孔為直徑2mm的圓孔,其中微流通道(分離毛細管4和進樣毛細管5)和溶液孔3、(6)、7、8、9和10(圖1)為透明,剩余部分為黑色。陰陽離子雙向進樣毛細管電泳芯片設計圖的正像4見圖1(不包括電導檢測電極2)。分離微流通道4長7.(6)cm,進樣微流通道5長1cm,其中毛細管4和5交叉點到最近的三個溶液連接孔的距離均為0.5cm。
(B) 硅負片及芯片模具的制作在經氧化處理的硅片(p型,厚500μm,直徑4英寸,晶向<100>,表面二氧化硅氧化層厚100nm)通過旋轉涂膜技術(轉速3000rpm,40秒)涂覆一層負性光刻膠(SU-8光刻膠),于(6)5℃烘箱中烘40分鐘(前烘),然后蓋上掩膜(含設計的芯片毛細管微流結構),用石英玻璃板(1.5-2mm)壓緊,于紫外線下曝光30min(3(6)5nm,45W),于(6)5℃烘箱中烘25分鐘(曝光后烘),用SU-8配套顯影劑浸泡處理90秒后,分別在丙酮和異丙醇中漂洗20秒以洗去未部曝光部分(毛細管和溶液孔以外的區域)的光刻膠層,然后于150℃烘箱中烘10分鐘(后烘)使硅片上毛細管通道和溶液連接孔部分曝光的光刻膠硬化,將硅片浸于0.5M HF-0.5M NH4F溶液3.5分鐘將硅片表面的SiO2層蝕去,然后于(6)0℃用40%KOH水溶液(含5%異丙醇)刻蝕裸露的硅片約1小時(刻蝕速度為0.35μm/分鐘),形成陽膜的突出毛細管通道和溶液孔結構部分,硅片未刻蝕部分表面的光刻膠在刻蝕過程中會自動脫落,光刻膠下的二氧化硅層不會被40%KOH水溶液刻蝕而保護二氧化硅層下的硅結構,即得制成硅片陽模。將有毛細管凸槽的硅片一面與一塊平板玻璃夾緊一中間鏤空為芯片尺寸的矩形的鋁板(約2mm厚),即成芯片模具。
(C)注模和聚合在聚合物單體甲基丙烯酸甲酯中溶解15-20%的聚甲基丙烯酸甲酯粉末以增加粘度,與一定量引發劑安息香甲醚(0.15%)混合,將該混合物中注入模具中,采用紫外線(3(6)5nm,(6)W)引發聚合。同時將相應液體混合物注模于縫隙為100μm的平板玻璃間聚合,脫模后得到相同材料的蓋膜。在室溫下,完全聚合時間約為3-(6)小時。
(D)脫模和覆膜將芯片基片(6)0℃水浴超聲脫模,微流通道末端鉆孔(溶液連接孔3、(6)、7、8、9和10見圖1,孔徑2mm)用于連接溶液,然后通過熱壓(108℃/10分鐘)或溶劑法(氯仿)將一層蓋膜粘在毛細管基片上,即得芯片成品。有蓋膜的一面為芯片上表面。毛細管電泳芯片1的長度為8.5mm,寬度為2.2mm,厚度為2mm。
2、毛細管電泳芯片移動式非接觸電導檢測電極的制作將10μm厚鋁膜(或其他金屬膜)剪切成條狀電極(寬0.8mm,長24mm),通過快速固化環氧樹脂按照圖2示粘在一長方形的透明硬塑料片13(如聚苯乙烯片,長23mm,寬8mm,厚1mm)的兩側,電極在塑料片的兩端分別有一個U形彎曲(圖2(c)和(d)),使電極4可以粘在塑料片13的上下兩面。一面的兩電極端固定在塑料片13的中線位置(圖2(b)),要求電極條平行且兩電極間的平行距離為0.(6)-0.8mm,沒有將兩電極直接平行安置,是因為將電極粘在塑料片中線兩側可降低電極對的寄生電容。塑料片另一側兩電極末端分別用導電膠15與直徑100μm的銅絲12連通,銅絲12用于電極對14與電導儀連接。將兩個聚氯乙烯(PVC)薄片(長20mm,寬10mm,厚0.2-0.3毫米)熱壓制成的U形夾子11用快速固化環氧樹脂粘在含電極對塑料片13的兩端,即制得毛細管電泳芯片移動式非接觸電導檢測電極2。
權利要求1.一種陰陽離子毛細管電泳電導檢測芯片,其特征在于由本體聚合聚甲基丙烯酸甲酯毛細管電泳芯片(1)和移動式非接觸電導檢測電極(2)構成,其中,毛細管電泳芯片(1)中間位置橫貫有分離毛細管(4),分離毛細管(4)的兩端內側設置有兩根進樣毛細管(5),成十字交叉形式;分離毛細管(4)的兩端設有緩沖溶液孔(7)和(10),兩根進樣毛細管(5)的一端分別設有緩沖溶液孔(3)和(6),兩根進樣毛細管(5)的另一端分別設有樣品溶液孔(8)和(9),導電檢測電極(2)設置于毛細管電泳芯片中間部位,與分離毛細管(4)垂直;電導檢測電極(2)由電極基片(13)、金屬膜電極對(14)、U形夾(11)和銅絲(12)構成;金屬膜電極對(14)直接制作于電極基片(13)上,電極兩端分別成U形彎曲,使電極對(14)粘在電極基片(13)的上、下兩面;其中,電極基片(13)的一側的兩電極固定在電極基片(13)的中線位置,另一側的兩電極末端分別由導電膠(15)與細銅絲(12)連接;兩個U形夾(11)粘在電極基片(13)的兩端,使電導檢測電極對(14)與毛細管電泳芯片(1)的上表面緊密接觸并可以沿分離毛細管(4)方向移動;金屬膜電極對(14)通過細銅絲(12)與電導儀連接。
2.根據權利要求1所述的檢測芯片,其特征在于分離毛細管(4)和進樣毛細管(5)的寬度為40-100μm,深度為15-30μm,分離毛細管(4)的長度為6-10cm,進樣毛細管(5)的長度為0.8-2cm。
3.根據權利要求1所述的檢測芯片,其特征在于緩沖溶液孔(3)、(6)、(7)和(10)以及樣品溶液孔(8)和(9)的直徑為1-3mm。
4.根據權利要求1所述的檢測芯片,其特征在于該金屬膜電極對(14)為條狀,相互平行,平行距離為0.6-0.8mm。
5.根據權利要求1所述的檢測芯片,其特征在于電導檢測電極的金屬膜電極(14)的寬度為0.6-1mm,長度為20-30mm,電極基片(13)的長度為20-30mm,寬度為8-12mm,厚度為0.8-1.2mm。
專利摘要本實用新型涉及一種陰陽離子毛細管電泳電導檢測芯片。該芯片系統由雙十字交叉聚甲基丙烯酸甲酯毛細管電泳芯片和移動式非接觸電導檢測電極構成,可進行陰陽離子雙向同時進樣、同時分離和同時檢測。采用光刻與化學濕法蝕刻相結合的技術制作硅片陽模,將聚合物單體甲基丙烯酸甲酯與引發劑混合,注入模具中紫外光引發本體聚合制作毛細管電泳芯片。配套的移動式非接觸電導檢測電極為一對制作在塑料薄片上的條狀金屬薄膜電極。該檢測系統操作簡便、重現性好、靈敏度高、線性范圍寬、樣品用量少,可對陰陽離子同時進行分離和檢測,分析效率高。可用于臨床診斷、生命科學研究、環境監測、食品分析和工業在線分析等領域中陰陽離子的高通量分析。
文檔編號G01N27/447GK2729722SQ20042009040
公開日2005年9月28日 申請日期2004年9月23日 優先權日2004年9月23日
發明者陳剛, 楊芃原, 張魯雁 申請人:復旦大學