專利名稱：以納米金為報告系統的病原體快速檢測基因芯片的制作方法
技術領域：
本實用新型涉及一種以納米金為報告系統的病原體快速檢測基因芯片。
技術背景病原體的快速檢測和鑒定對于感染性疾病的診斷和治療具有重要的意義。傳統的細菌分離、培養及生化反應，已遠遠不能滿足對各種病原微生物的診斷以及流行病學的研究。現在的細菌學研究已從一般的功能水平深入到分子生物學水平，以分子生物學為基礎的細菌鑒定方法能夠大大縮短檢測時間，提高檢測靈敏度和特異性，同時分子生物學方法主要以微生物的基因為檢測靶標，對微生物進行基因分型，這樣就能夠克服以微生物表型特征為基礎檢測方法的缺點和影響因素，從根本上對微生物進行鑒別和特征分型。
基因芯片技術是近年來發展起來的一項新的核酸檢測實驗技術，具有快速、敏感、高效、高通量等優點。納米金是指直徑為納米范圍的金顆粒或含金的化合物，其化學性質穩定，可標記于蛋白和核酸。同時，它具有與銀反應后形成比原來體積大106倍的黑色顆粒，可以用肉眼觀察或用普通記錄裝置如照相、掃描記錄的特點，近年來受到了科研人員的重視，特別是用不具備吸附能力離散的納米金作為信號報告分子的應用則是近年生物信號檢測中的一個重要進展。
發明的內容本實用新型的目的是提供一種將納米放大技術與基因芯片技術相結合，能快速、準確地檢測和鑒定病原體的具有一定通量的、操作簡便、適合臨床使用的以納米金為報告系統的病原體快速檢測基因芯片。
為達到上述目的，本實用新型采取以下措施該芯片包括固相載體、連接分子、核酸探針；連接分子通過共價鍵結合于固相載體表面而修飾載體；核酸探針包括病原體特異性寡核苷酸探針、陽性對照探針、陰性對照探針；其中5’端經修飾的寡核苷酸探針可與連接分子以共價鍵結合于固相載體表面；芯片上的探針可與用納米金標記的待檢核酸雜交結合，利用能與納米金標記中的金屬顆粒發生金屬相反應的金屬試劑與已雜交結合在芯片上的核酸上標記的納米金屬反應，獲得便于進行普通光學檢測的放大雜交信號。為保證檢測可靠性，采用與人類和微生物無任何同源性的植物基因為陽性對照和陰性對照，陽性對照植物基因與樣品并行處理，用于監測待檢樣品的制備、標記、雜交、顯色及檢測過程，陰性對照用于檢測雜交信號是否正確，空白對照用于檢測芯片制備是否正常。
在上述固相載體上設有5’端經修飾的寡核苷酸探針包括(1)金黃色葡萄球菌探針(2)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌mecA基因探針(3)大腸埃希菌探針(4)銅綠假單胞菌探針(5)表皮葡萄球菌探針(6)腦膜炎奈瑟氏菌探針(7)化膿性鏈球菌探針(8)肺炎鏈球菌探針(9)傷寒沙門氏菌探針
(10)腸球菌探針(11)白色念珠菌探針(12)乙肝病毒探針(13)丙肝病毒探針(14)陽性對照植物基因探針(15)陰性對照植物基因探針。
本實用新型的優點(1)快速病原體特異性基因片段擴增只需2小時，核酸標記及基因芯片雜交也僅需8～10小時，而傳統的細菌分離、培養及生化反應的鑒定方法至少需要3～4天，縮短了診斷時間。
(2)特異以公認的種、型特異性基因片段為各病原體核酸標志，針對其設計特異性寡核苷酸探針，利用生物信息學技術對探針各參數進行評估，計算機模擬篩選，并利用反向膜雜交技術對探針進行篩選和驗證。
(3)敏感最低檢測值可達100fM，同目前常用的熒光素cy3為報告分子的方法相比，其靈敏度要高出50倍。
(4)準確采用一段與微生物無任何同源性的植物基因為陽性對照，與樣品并行處理，對檢測進行全程監控，芯片上還加入了陰性對照及空白對照，從而對芯片檢測實施系統監控，確保檢測的可靠性和準確性。
(5)實用適用于臨床常見感染標本的檢測，包括血、腦脊液、尿液、胸水、腹水、膿液等，設備要求低，檢測結果可以用肉眼或普通光學儀器記錄，適合普通實驗室開展。
本實用新型的制作方法(1)各病原體特異性核酸片段擴增引物5’端巰基(SH)修飾。
(2)特異性寡核苷酸探針5’端氨基修飾。
(3)基因芯片陣列的設計采用計算機輔助設計，芯片材料采用玻璃片、硅片、尼龍膜、硝酸纖維膜，這些材料已被證明可行并在國內外普遍應用于基因芯片片基。
(4)低密度基因芯片的制備采用探針預先合成后再用點樣儀點于片基上的方法，探針固定采用氨基化探針與醛基活化的玻璃片共價結合的方法。
(5)核酸的標記采用直徑為1.4nm的單順丁烯二乙酰亞胺修飾的納米金(monomaleimido-gold)，該納米微粒在pH6.0-7.0、含20mM NaH2PO4、150mMNaCL、1mM EDTA的緩沖液中，能和游離的巰基反應生成穩定的共價結合物，使核酸標記上納米金顆粒。
(6)雜交信號檢測方法納米金顆粒與銀反應后可形成比原來體積大106倍的黑色顆粒，可以用肉眼觀察或用普通記錄裝置如照相、掃描記錄。
圖1是以納米金為報告系統的病原體快速檢測基因芯片示意圖，包括1固相載體，2病原體特異性寡核苷酸探針，3陽性對照探針，4陰性對照探針，5空白對照探針。
圖2是以納米金為報告系統的病原體快速檢測基因芯片結構示意圖，包括1固相載體，2病原體特異性寡核苷酸探針，6連接分子。
圖3是以納米金為報告系統的病原體快速檢測基因芯片檢測結構示意圖，包括1固相載體，2病原體特異性寡核苷酸探針，6連接分子，7納米金標記待檢靶核酸，8納米金顆粒，9銀顆粒。
權利要求1.一種以納米金為報告系統的病原體快速檢測基因芯片，其特征是該芯片包括固相載體、連接分子、陣列排列的核酸探針；連接分子通過共價鍵結合于固相載體表面而修飾載體；核酸探針包括病原體特異性寡核苷酸探針、陽性對照探針、陰性對照探針；其中病原體特異性寡核苷酸探針的5’端經修飾后可與連接分子以共價鍵結合于固相載體表面；芯片上的探針可與用納米金標記的待檢核酸雜交結合，利用能與納米金標記中的金屬顆粒發生金屬相反應的金屬試劑與已雜交結合在芯片上的核酸上標記的納米金屬反應，獲得便于進行普通光學檢測的放大雜交信號。
2.根據權利要求1所述的以納米金為報告系統的病原體快速檢測基因芯片，其特征在于在上述固相載體上陣列設有的病原體特異性寡核苷酸探針包括(1)金黃色葡萄球菌探針，(2)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌mecA基因探針，(3)大腸埃希菌探針，(4)銅綠假單胞菌探針，(5)表皮葡萄球菌探針，(6)腦膜炎奈瑟氏菌探針，(7)化膿性鏈球菌探針，(8)肺炎鏈球菌探針，(9)傷寒沙門氏菌探針，(10)腸球菌探針，(11)白色念珠菌探針，(12)乙肝病毒探針，(13)丙肝病毒探針。
3.根據權利1、2要求所述的以納米金為報告系統的病原體快速檢測基因芯片，在所述固相載體上的核酸探針陣列中設置有空白點。
4.根據權利1、2要求所述的以納米金為報告系統的病原體快速檢測基因芯片，其特征在于所說的固相載體為玻片、硅片、尼龍膜、硝酸纖維膜。
專利摘要一種以納米金為報告系統的病原體快速檢測基因芯片，其特征是芯片包括固相載體、連接分子、核酸探針；連接分子通過共價鍵結合于固相載體表面；核酸探針包括病原菌特異性寡核苷酸探針、陽性對照探針、陰性對照探針；其中5’端經修飾的寡核苷酸探針可與連接分子以共價鍵結合于固相載體表面；芯片上的探針可與用納米金標記的待檢核酸雜交結合，利用能與納米金標記中的金屬顆粒發生金屬相反應的金屬試劑與已雜交結合在芯片上的核酸上標記的納米金屬反應，獲得便于進行普通光學檢測的放大雜交信號。由于芯片上加入了陽性對照、陰性對照及空白對照，對芯片檢測實施系統監控，確保檢測的可靠性和準確性。具有快速、特異性好、靈敏度高等特點。
文檔編號G01N31/00GK2699290SQ20042003444
公開日2005年5月11日 申請日期2004年4月20日 優先權日2004年4月20日
發明者周元國, 魯衛平, 顧大勇, 王 華 申請人:中國人民解放軍第三軍醫大學野戰外科研究所