自體抗原篩選方法

專利名稱：自體抗原篩選方法
技術領域：
本發明提供了一種自體抗原篩選的方法，是指利用正常人抗體去除非專一性的抗原，再利用病患抗體獲得專一性的自體抗原，并結合質譜儀鑒定自體抗原的方法。
背景技術：
免疫系統若功能不健全，便會產生免疫性疾病，我們身體許多疾病的根本原因常可追究于免疫系統的功能不健全。一般可分為三種情況第一種是抵抗力降低，身體的免疫細胞活力下降，或生產免疫細胞的數量不足以抵抗入侵的細菌、病毒或霉菌，因此易被感染流行病，傷風、感冒、肺炎、腸炎甚至肝炎、愛滋病等，都屬于這一類；第二種的免疫不全是免疫系統反應過度，這種情況起因于入侵的物質并不是細菌而只是小花粉或是食物中大分子蛋白質，免疫系統就釋出大量的抗體加以對抗，而攻勢就發生在我們的細胞中，如此引起一連串的反應，也被稱為過敏癥，而這時候若果真有細菌，病毒，或霉菌這類真的病原來侵犯時，免疫系統已無余力抵抗了；第三種情況是免疫細胞攻擊自體的正常細胞，也就是自體免疫疾病，例如類風濕性關節炎，紅斑性狼瘡或皰疹等等，這種免疫系統疾病起因于病患本身免疫辨識系統發生問題，病患的免疫系統對于本身的某些物質會產生自體抗體(autoantibody)，進而破壞身體組織造成病痛。
目前已知，并非是只有自體免疫疾病才有自體抗體的存在，越來越多的相關研究指出人類對癌癥所發生的免疫反應，部分存在著腫瘤自體抗原(autoantigen)與人類自體抗體的情形，因此對于發現這些可以引起人體反應的腫瘤自體抗原在癌癥檢測、診斷或建立預后上有一定的方向和應用性，進而應用于疾病的免疫治療上。
利用西方點漬法(Western blotting)，以病患血清中的抗體和(癌)細胞株或病理組織萃取物反應來找出和病患有反應的物質，是常用于尋找自體抗原的方法，但由于電泳技術對極酸或極堿、極大或極小、表現量極少以及細胞膜蛋白質的靈敏度與再現性均不佳，使其在特定蛋白質分離純化與鑒定上有使用上的限制。在美國專利5723343中，利用后天副甲狀腺機能不足(AH)病患的血清(含有自體抗體)和新鮮的人類過多副甲狀腺細胞萃取物，利用免疫印跡法(immunoblotting)的方式篩選自體抗原，但因為缺乏與正常人的對照，專一性低，且病患的組織檢體相當有限，無法大量篩選而易有遺漏的自體抗原，發現自體抗原的機率較低。此外，此法直接由復雜的細胞萃取物中取下有反應的蛋白，再送入質譜儀分析，在自體抗原的鑒定方面因為樣品的高復雜度而造成困難，所以開發一套有系統、有效率的自體抗原篩選方法，便成為重要的課題。

發明內容
本發明提供一種利用病患體內的自體抗體來篩選自體抗原的方法，其利用自體抗體制備層析管柱，透過自體抗體與自體抗原間的親和性，搭配疾病所對應的(癌)細胞株或病理組織萃取物，達到建立篩選自體抗原的平臺系統。
本發明的目的在于提供一種自體抗原篩選方法，其利用正常人及病患的抗體去除非專一性的抗原，再利用該抗體獲得專一性的自體抗原。
本發明提供了一種自體抗原篩選方法，其包含以下步驟分別純化正常人及病患的抗體；將正常人及病患的抗體分別填充固定于不同管柱之中，制得正常人抗體管柱及病患抗體管柱；取一樣品；將樣品通入正常人抗體管柱；將通過正常人抗體管柱的樣品通入病患抗體管柱；將滯留于病患抗體管柱中的抗原由管柱中置換出來；鑒定病患抗體管柱純化所得的抗原。
本發明的上述方法先利用正常人的抗體管柱來去除非專一性抗原后，再通入病患的抗體管柱來得到和病患自體抗體具親和性的自體抗原，可使自體抗體辨識自體抗原的專一性得到提高，對后續的質譜鑒定也提供了較佳的分析條件。
前述純化正常人及病患的抗體是利用可捕捉抗體的親和力管柱，由正常人及病患人群的血清樣品中分別純化，得到正常人及病患的抗體；所述可捕捉抗體的親和力管柱為蛋白質G親和力管柱(Protein G affinity column)或蛋白質A親和力管柱(Protein A affinity column)，優選為蛋白質G親和力管柱(Protein G affinity column)。
所述抗體選自下列群組免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白G(IgG)或免疫球蛋白M(IgM)。
所述病患血清樣品為單一病患的血清樣品或復數病患血清的混合樣品。
所述抗體填充固定于管柱之中是將由血清純化出來的抗體與管柱中的化學官能基形成化學鍵結固定于管柱中；該化學官能基包含羥琥珀酰亞胺基(N-hydroxysuccinimide-、NHS-)、溴化氰基(CNBr-)或環氧基(Epoxy-)。
所述樣品為(癌)細胞株或病理組織的萃取物。
樣品通入管柱前也可進一步增加樣品前處理的步驟。
樣品通入正常人抗體管柱的目的，是藉由正常人抗體管柱捕捉移除樣品中非專一性的抗原；所述樣品通入病患抗體管柱的目的，是藉由病患抗體管柱辨識捕捉樣品中的自體抗原。
所述鑒定純化所得的抗原是指利用質譜技術進行的抗原的蛋白質定性或定量分析。
將來自(癌)細胞株或病理組織萃取物的樣品通入正常人抗體管柱時，可藉由正常人抗體的專一親和力將非專一性的抗原捕捉而滯留于管柱之中，通過管柱的樣品將不含非專一性抗原，這個程序其實可視為利用病患抗體管柱篩選檢體中自體抗原的樣品前處理，經移除樣品中非專一性的抗原，樣品組成便剩下特有的抗原，此時再將樣品通入含病患抗體的管柱中，藉由病患所具有的自體抗體來進一步篩選疾病相關的自體抗原。由于已先藉由正常人的血清抗體去除非專一性的抗原，所以利用病患的自體抗體篩選所得到的自體抗原會具有較高的專一性。
由病患抗體管柱中置換而出的自體抗原，利用質譜技術進行鑒定，所述鑒定是將質譜訊號透過數據庫比對，以取得自體抗原的信息。
本發明藉由結合免疫親和性層析法、疾病對應的細胞株，再搭配日趨成熟的蛋白質質譜鑒定技術構筑的自體抗原篩選方法，與現有技術相比具有更快速的篩選效率，由于細胞株可源源不絕地提供，因此不會有遺漏的自體抗體，發現自體抗原的機會可顯著提高，而本發明先利用正常人的抗體管柱來去除非專一性抗原后，再通入病患的抗體管柱來得到和病患自體抗體具親和性的自體抗原，不僅可使自體抗體辨識自體抗原的專一性提高，對后續的質譜鑒定也提供了較佳的分析條件，若使用復數病患血清混合的檢體，將具有加強自體抗原數量的效果(enriching high incidence ofautoantigen)，利用該方法發現的自體抗原，其與該疾病相關且共同存在于病患樣本中，這樣的自體抗原將更適合做為檢測的工具。


圖1本發明的自體抗原篩選方法的流程圖；圖2由血清純化自體抗體的流程圖；圖3制備含有自體抗體的管柱的流程圖；圖4本發明的由細胞萃取物中純化鑒定自體抗原的流程圖；圖5利用本發明自體抗原篩選方法進行肝硬化細胞萃取物篩選的正常人抗體管柱及病患抗體管柱的層析圖。其中上圖為正常人抗體管柱層析圖，下圖為病患抗體管柱的層析圖。
具體實施例方式
以下實施例用于進一步了解本發明的優點，并非用于限制本發明。
實施例1利用本發明的自體抗原篩選方法進行肝癌自體抗原的篩選血清純化自體抗體由血清純化自體抗體的步驟如圖2所示，將血清用鍵結緩沖液(bindingbuffer20mM PBS，pH 7.0)以1∶10的比例稀釋后，以0.45μm孔徑的濾膜過濾，避免后續層析步驟造成管柱堵塞；接著以10倍管柱體積的鍵結緩沖液，在1ml/min的流速下清洗Protein G親和力管柱，之后將前述經濾膜過濾的血清樣本以0.2ml/min的流速通入Protein G親和力管柱中，使抗體得以藉由與管柱的親和力滯留于管柱中；再取5-10倍管柱體積的鍵結緩沖液以1ml/min的流速清洗Protein G親和力管柱，移除血清樣品中不與管柱發生親和力鍵結的物質，然后取2-5倍管柱體積的洗脫緩沖液(elutionbuffer0.1M Glycine-HCl，pH 2.7)以1ml/min的流速將抗體自管柱中洗脫出并收集，收集抗體的試管中需預先加入60-200μl的Tris-HCl溶液(1M，pH 9.0)，最后將樣品置換于耦合緩沖液(coupling buffer0.2M NaHCO3，0.5M NaCl，pH 8.3)中，即完成血清中自體抗體(IgG)的純化。
由于本發明需要填充有正常人IgG及病患IgG的管柱各一，故需取正常人及病患血清分別進行前述純化步驟。
制備含有自體抗體的管柱制備含有自體抗體的管柱其步驟如圖3所示，取NHS-activated管柱一只，移除上端蓋子后滴一滴酸化溶液(acidification solution1mM HCl(需冰浴))以避免氣泡生成，接著將此管柱上端與注射器(syringe)或泵(pump)連接后移除下端扭轉處，再以2倍管柱體積的酸化溶液將管柱中的異丙醇清洗出來，重復此清洗步驟3次后，將含有自體抗體的樣品注入管柱中。前述的含有自體抗體的樣品由Protein-G親和力管柱純化血清得到的含有自體抗體的耦合緩沖液，經配制后成為總體積約為1倍管柱體積，濃度為0.5-10mg/ml。將前述含有自體抗體的樣品通入管柱后則將管柱密封，在25℃中反應15-30分鐘，或者在4℃中反應4小時，使抗體得以與管柱產生化學鍵結固定于管柱之中。
自體抗體與管柱完成鍵結反應后，先利用2倍管柱體積的封阻緩沖液(blocking buffer0.5M ethanolamine，0.5M NaCl，pH 8.3)洗脫管柱，重復此步驟3次，再利用2倍管柱體積的清洗緩沖液(washing buffer0.1Macetate，0.5M NaCl，pH 4)清洗管柱，同樣重復3次，接著再換回封阻緩沖液以2倍管柱體積洗脫管柱3次后，讓管柱反應15-30分鐘，使管柱中未鍵結自體抗體的官能基被封阻而失去活性，待封阻反應完成后以2倍管柱體積的清洗緩沖液清洗管柱，重復3次，接著以2倍管柱體積的封阻緩沖液洗脫管柱，重復3次，確保所有未鍵結自體抗體的官能基都能被封阻，再以2倍管柱體積的清洗緩沖液清洗管柱，重復3次后，最后以2-5倍管柱體積的一般中性pH緩沖液洗脫管柱后，完成含有自體抗體的管柱制備。由肝硬化細胞萃取物中純化鑒定自體抗原如圖4所示步驟，首先將移除培養基的肝硬化細胞(HepG2 C3A cells)2.68mg以冰浴的Tris saline溶液(50mM Tris pH 7.5，150mM NaCl，1.5mMPMSF，Phosphatase inhibitors)清洗兩次后，加入Triton Extraction溶液1ml(15Mm Tris pH 7.5，120mM NaCl，25mM KCl，2mM EGTA，0.1mMDTT，0.5％Triton X-100，10μg/ml leupeptin，0.5Mm PMSF，Phosphataseinhibitors)，置于4℃30分鐘，此時細胞開始分解釋出蛋白質，然后利用桌上型離心機于4℃以14,000rpm的轉速離心15分鐘，移除固態不溶的細胞結構，收集上層液進行后續的免疫親和層析。
經收集得到的細胞萃取液與鍵結緩沖液(binding buffer)以1∶10的比例稀釋后，利用0.45μm孔徑的濾膜過濾，以避免后續通入管柱后造成管柱的阻塞，而在將樣品注入具有抗體(IgG)的管柱前，需先以10倍管柱體積的鍵結緩沖液，在1ml/min的流速下清洗正常人及病患的抗體管柱，之后將前述經濾膜過濾的細胞萃取液以0.2ml/min的流速通入正常人抗體管柱中，再取5-10倍管柱體積的鍵結緩沖液以1ml/min的流速洗脫正常人抗體管柱，此時細胞萃取液中所含有的正常人抗體具辨識捕捉的抗原會滯留其中，此步驟的目的在于捕捉移除肝硬化細胞中非專一性的抗原(Non-specific antigen)，所以經管柱層析后的細胞萃取液中將不含非專一性的抗原；將此細胞萃取液收集導入病患抗體管柱，取5-10倍管柱體積的鍵結緩沖液以1ml/min的流速洗脫病患抗體管柱，此時肝硬化細胞萃取液中所具有的自體抗原將被管柱中病患的自體抗體所捕捉而滯留于管柱之中，如圖5所示，細胞萃取液通過正常人抗體管柱時，一般正常人抗體可辨識捕捉的抗原將被滯留于管柱中，而將不含前述正常人抗體可辨識捕捉的抗原的細胞萃取液導入病患抗體管柱時，只有病患抗體管柱可辨識捕捉的抗原被滯留于管柱之中，這些滯留于病患抗體管柱中的抗原，藉由2-5倍管柱體積的洗脫緩沖液(elution buffer)以1ml/min的流速將自體抗原由病患抗體管柱中洗脫出并收集，接著使用胰蛋白酵素(Trypsin)進行蛋白質水解反應，將被水解的自體抗原之勝肽以質譜技術進行分析，所得的圖譜可藉由數據庫比對獲知蛋白質的信息。
綜上所述，本發明利用病患體內的自體抗體來篩選自體抗原的方法，其以自體抗體制備層析管柱，透過自體抗體與自體抗原間的親和性，搭配疾病所對應的(癌)細胞株，達到建立篩選自體抗原的平臺系統，可應用于各種疾病以篩選出和該疾病相關的具特異性自體抗原(specific-autoantigen)，所篩選出的具特異性自體抗原對于疾病的檢測、診斷及免疫疾病的治療上應有很大的應用空間。
權利要求
1.一種自體抗原篩選方法，其中包含以下步驟分別純化正常人及病患的抗體；將正常人及病患的抗體分別填充固定于不同管柱之中，以制得正常人抗體管柱及病患抗體管柱；取一樣品；將樣品通入正常人抗體管柱；將通過正常人抗體管柱的樣品通入病患抗體管柱；將滯留于病患抗體管柱中的抗原由管柱中置換出來；及鑒定病患抗體管柱純化所得的抗原。
2.如權利要求1所述的自體抗原篩選方法，其中所述純化正常人及病患的抗體為利用可捕捉抗體的親和力管柱，由正常人及病患的血清樣品中分別純化得到的正常人及病患的抗體。
3.如權利要求2所述的自體抗原篩選方法，其中所述可捕捉抗體的親和力管柱為蛋白質G親和力管柱或蛋白質A親和力管柱。
4.如權利要求3所述的自體抗原篩選方法，其中所述可捕捉抗體的親和力管柱為蛋白質G親和力管柱。
5.如權利要求2所述的自體抗原篩選方法，其中所述抗體選自下列群組免疫球蛋白A、免疫球蛋白G或免疫球蛋白M。
6.如權利要求2所述的自體抗原篩選方法，其中所述病患的血清樣品為單一病患的血清樣品。
7.如權利要求2所述的自體抗原篩選方法，其中所述病患的血清樣品為復數個病患血清的混合樣品。
8.如權利要求1所述的自體抗原篩選方法，其中所述抗體填充固定于管柱之中是指血清純化出來的抗體與管柱中的化學官能基形成化學鍵結固定于管柱中。
9.如權利要求8所述的自體抗原篩選方法，其中所述化學官能基包含羥琥珀酰亞胺基、溴化氰基或環氧基。
10.如權利要求1所述的自體抗原篩選方法，其中所述樣品為(癌)細胞株或病理組織的萃取物。
11.如權利要求10所述的自體抗原篩選方法，其中所述樣品通入管柱前可進一步增加樣品前處理步驟。
12.如權利要求1所述的自體抗原篩選方法，其中所述鑒定純化所得的抗原是利用質譜技術進行蛋白質定性或定量分析。
13.如權利要求1所述的自體抗原篩選方法，其中所述將樣品通入正常人抗體管柱的目的，是藉由正常人抗體管柱捕捉移除非專一性的抗原。
14.如權利要求1所述的自體抗原篩選方法，其中所述將通過正常人抗體管柱的樣品通入病患抗體管柱的目的，是藉由病患抗體管柱辨識捕捉樣品中的自體抗原。
全文摘要
本發明提供了關于自體抗原篩選的方法，其先將疾病相關的(癌)細胞株或病理組織萃取物樣品注入填充有正常人抗體的管柱中去除樣品中非專一性的抗原，再將已去除非專一性抗原的樣品注入填充有病患抗體的管柱獲得專一性的自體抗原，并結合質譜技術鑒定自體抗原，以達到快速精確篩選疾病生物標記分子的目的。
文檔編號G01N1/34GK1796995SQ20041010152
公開日2006年7月5日 申請日期2004年12月21日 優先權日2004年12月21日
發明者曾錙翎, 鄭平福 申請人:財團法人工業技術研究院