專利名稱：用于固相膜免疫分析方法流動(dòng)相的樣本處理制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種樣品處理制劑，尤指一種用于固相膜免疫分析方法流動(dòng)相的樣本處理制劑。
背景技術(shù)：
隨著全球生物安全戰(zhàn)略的廣泛實(shí)施，有關(guān)病原生物的快速診斷需求日益增強(qiáng)，同時(shí)快速診斷所要面對(duì)的檢測(cè)對(duì)象也更加復(fù)雜，包括人、動(dòng)植物樣品、食品，甚至是“白色粉末”等。固相膜免疫分析試驗(yàn)(Membrane-based immunoassay)，尤其是免疫層析技術(shù)由于具有簡(jiǎn)便、快速、高效、廉價(jià)，而且適用于大規(guī)模現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用等特點(diǎn)，近年來(lái)在病原檢測(cè)方面獲得了長(zhǎng)足的發(fā)展，各種新的生物標(biāo)記材料以及光學(xué)、電子檢測(cè)系統(tǒng)研究也不斷取得進(jìn)展并得到迅速應(yīng)用。然而，有關(guān)檢測(cè)對(duì)象樣品處理技術(shù)在固相膜免疫分析研究中并未得到同步發(fā)展，使得固相膜免疫分析技術(shù)在大顆?？乖蛷?fù)雜樣本檢測(cè)中面臨困難。
固相膜免疫分析試驗(yàn)是以膜為固相載體的免疫快速診斷技術(shù)，該項(xiàng)技術(shù)以多孔性的微孔濾膜為固相載體，含水介質(zhì)作為流動(dòng)相通過(guò)膜孔的毛細(xì)管作用誘導(dǎo)反應(yīng)物向固定在膜表面的結(jié)合對(duì)象傳遞，從而將未結(jié)合的反應(yīng)物與液-固界面上形成的復(fù)合物分離開(kāi)來(lái)，因此，固相膜免疫分析技術(shù)完成要依賴流動(dòng)相作為載體運(yùn)輸檢測(cè)對(duì)象。受固相膜孔徑等因素的限制，攜帶樣本的流動(dòng)相的表面張力以及其中的顆粒成分大小將會(huì)直接影響檢測(cè)結(jié)果。但是，目前國(guó)內(nèi)外有關(guān)免疫分析的研究主要集中在提高檢測(cè)系統(tǒng)的敏感性上，而作為載體流動(dòng)相應(yīng)用于免疫層析系統(tǒng)的樣本制劑僅限于檢測(cè)標(biāo)本液體(如尿樣)、普通緩沖液(溶解的固體對(duì)象如PBS緩沖液、生理鹽水等)或在普通緩沖液中添加作為封閉液使用的Tween20、牛血清白蛋白(BSA)緩沖液等。
而在固相膜免疫分析技術(shù)應(yīng)用于傳染病檢測(cè)時(shí)，其檢測(cè)對(duì)象主要可分為抗原和抗體兩大類。對(duì)于抗體檢測(cè)，固相膜免疫分析檢測(cè)對(duì)象特征相對(duì)同定；而對(duì)于抗原檢測(cè)，免疫層析面臨的檢測(cè)對(duì)象則要復(fù)雜得多，少數(shù)可以是可溶性的病原微生物分泌蛋白分子，如細(xì)菌毒素，多數(shù)則是病毒、細(xì)菌、寄生蟲(chóng)等顆粒性抗原對(duì)象，其大小從納米、微米到毫米級(jí)不等。由于免疫層析方法主要借助毛細(xì)作用，讓樣品在條狀纖維制成的膜上泳動(dòng)，其中的待測(cè)物與膜上一定區(qū)域的配體結(jié)合，通過(guò)酶促顯色反應(yīng)或者其它標(biāo)記物檢測(cè)，以便短時(shí)間得到直觀的結(jié)果。因此，顆粒性抗原的體積大小不僅會(huì)影響檢測(cè)對(duì)象在膜上地流動(dòng)，而且其空間結(jié)構(gòu)不可避免地會(huì)限制其與捕捉抗體地充分結(jié)合，因而會(huì)降低待測(cè)樣本的檢測(cè)靈敏度。而要提高檢測(cè)靈敏度則需要通過(guò)有效的化學(xué)制劑將其從顆粒上最大限度地解離、溶解并且不影響其與相應(yīng)抗體的后續(xù)結(jié)合，而目前作為載體流動(dòng)相應(yīng)用于免疫層析系統(tǒng)的樣本制劑無(wú)法滿足這一要求。
另外，如果檢測(cè)對(duì)象是復(fù)雜樣本中的病原微生物，如食品、組織樣本、土壤或白色粉末等，如何從復(fù)雜樣本中將顆粒性的待測(cè)抗原分離檢測(cè)而不受或最大限度減少樣本物質(zhì)的影響是個(gè)非常棘手的問(wèn)題，目前作為載體流動(dòng)相應(yīng)用于免疫層析系統(tǒng)的樣本制劑卻無(wú)法滿足上述要求，這也是當(dāng)前固相膜免疫分析方法應(yīng)用于病原微生物顆粒性抗原如細(xì)菌檢測(cè)的難點(diǎn)所在，嚴(yán)重限制了其在直接檢測(cè)病原微生物方面的應(yīng)用。
發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)上述問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于提供一種可提高固相膜免疫分析方法檢測(cè)復(fù)雜樣品的能力及其檢測(cè)敏感性、并可擴(kuò)大檢測(cè)復(fù)雜樣本顆粒性抗原的應(yīng)用范圍、原料來(lái)源容易、配制方法簡(jiǎn)便的用于固相膜免疫分析方法流動(dòng)相的樣本處理制劑。
為達(dá)到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)解決方案為一種用于固相膜免疫分析方法流動(dòng)相的樣本處理制劑，該制劑包括基礎(chǔ)緩沖液和Nonidet P40，其中，該基礎(chǔ)緩沖液的PH值在5.5-10之間，Nonidet P40的體積比含量在0.05％-3.5％之間。
進(jìn)一步，所述制劑還包括封閉劑。
進(jìn)一步，所述制劑還包括防腐劑。
進(jìn)一步，所述防腐劑可為疊氮鈉或硫汞撒或慶大霉素。
進(jìn)一步，所述基礎(chǔ)緩沖液為生物化學(xué)緩沖液或鹽溶液。
由于本發(fā)明的樣品處理制劑中包括有非離子表面活性劑NonidetP40，因此可有效解離奶粉、動(dòng)物組織、土壤等復(fù)雜樣品中的顆粒性抗原成分，使之在經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)單的離心或過(guò)濾方法處理后適合于固相膜免疫分析，從而提高固相膜免疫分析方法檢測(cè)復(fù)雜樣品的能力并擴(kuò)大檢測(cè)復(fù)雜樣本顆粒性抗原的應(yīng)用范圍；另外，優(yōu)化了溶液中的非離子表面活性劑Nonidet P40的濃度、樣品液的PH值后，應(yīng)用于顆粒性抗原的固相膜免疫分析方法，與現(xiàn)有常見(jiàn)流動(dòng)相相比較，同等條件下能夠提高細(xì)菌樣本檢測(cè)敏感性10倍以上，而且具有較低的檢測(cè)背景，使樣品在膜上流動(dòng)時(shí)無(wú)明顯阻滯現(xiàn)象出現(xiàn)。另外，該樣品制劑原料來(lái)源容易，配制方法簡(jiǎn)便，一個(gè)普通的技術(shù)人員在無(wú)特殊設(shè)備的條件下就可以完成配制工作。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明。
本發(fā)明用于固相膜免疫分析方法流動(dòng)相的樣本處理制劑，其配方如下實(shí)施例1以PBS緩沖液作為本發(fā)明的溶液基質(zhì)，將其PH值調(diào)整為8.0，配制成含以下成分的溶液Nonidet P40 3.5％(v/v)上述樣本處理制劑用于處理添加了鼠疫耶爾森氏菌的奶粉(每毫升樣本制劑加入約50mg奶粉)，混勻5-10分鐘后，8000rpm離心15秒，樣本上清液用檢測(cè)鼠疫菌的膠體金免疫層析方法和UCP(上轉(zhuǎn)磷光)免疫層析技術(shù)分別檢測(cè)。結(jié)果顯示，與用不同量的通用的Tween20溶液處理相比較，經(jīng)本實(shí)施例的樣品處理制劑作用后，對(duì)于膠體金試驗(yàn)檢測(cè)敏感性可提高5-10倍，對(duì)于上轉(zhuǎn)磷光標(biāo)記的免疫測(cè)定則可提高靈敏度10倍以上。用于已建立的炭疽桿菌UCP免疫層析方法檢測(cè)芽孢也可獲得類似的比較結(jié)果。
實(shí)施例2以PBS緩沖鹽溶液作為本發(fā)明的溶液基質(zhì)，將其PH值調(diào)整為7.5，配制成含以下成分的溶液Nonidet P40 1.0％(v/v)NaN3(疊氮鈉)0.05％(w/v)將上述樣本處理制劑處理鼠疫耶爾森氏菌，與通用的用同濃度的Tween20(v/v)、SDS(w/v)、去氧膽酸鹽(w/v)、Triton X-100(v/v)溶液來(lái)處理作比較，混勻5-10分鐘后，用以檢測(cè)鼠疫菌的UCP(上轉(zhuǎn)磷光)免疫層析技術(shù)檢測(cè)。比較結(jié)果顯示對(duì)于上轉(zhuǎn)磷光標(biāo)記的免疫測(cè)定，用本實(shí)施例的樣品制劑，具有更高的陽(yáng)性檢測(cè)值，可提高檢測(cè)靈敏度最低10倍以上。而且，在溶液基質(zhì)中加入重量含量為0.05％的NaN3，還可起到防腐的作用，使配制好的溶液不會(huì)變質(zhì)。
實(shí)施例3以PBS緩沖鹽溶液作為本發(fā)明的溶液基質(zhì)，將其PH值調(diào)整為5.5，配制成含以下成分的溶液Nonidet P40 0.5％(v/v)
NaN3(疊氮鈉)0.05％(w/v)BSA 1.0％(w/v)上述樣本處理制劑可用于現(xiàn)有的免疫層析方法或免疫滲濾試驗(yàn)，檢測(cè)處理如土壤、奶粉、肉骨粉、動(dòng)物組織、肉湯、血液等待檢樣品。加入該樣品處理制劑混勻5-10分鐘后，靜置或短暫離心或粗濾處理，以現(xiàn)有固相膜免疫分析試驗(yàn)檢測(cè)條插入，或取上清液或?yàn)V過(guò)物加樣適量，觀察檢測(cè)結(jié)果。檢測(cè)對(duì)象可依據(jù)試驗(yàn)?zāi)康牟煌兴鶇^(qū)別，可以是細(xì)菌、病毒、寄生蟲(chóng)或其它有意義的檢測(cè)配體成分；用該制劑進(jìn)行免疫層析或免疫滲濾檢驗(yàn)，可提高靈敏度10倍以上。而且，在溶液基質(zhì)中加入0.05％的NaN3，還可起到防腐的作用，使配制好的溶液不會(huì)變質(zhì)，并且加入封閉劑1.0％的BSA更可增強(qiáng)試劑的封閉性，提高檢測(cè)靈敏度。
實(shí)施例4以PBS緩沖液作為本發(fā)明的溶液基質(zhì)，將其PH值調(diào)整為8.5，配制成含以下成分的溶液Nonidet P40 0.05％(v/v)Tween20 1.5％(v/v)將上述樣本處理制劑用于處理添加了鼠疫耶爾森氏菌的淀粉(每毫升樣本制劑加入約50mg奶粉)，混勻5-10分鐘后，8000rpm離心15秒，將樣本上清液以檢測(cè)鼠疫菌的膠體金免疫層析方法和UCP(上轉(zhuǎn)磷光)免疫層析技術(shù)分別檢測(cè)。結(jié)果顯示，與用不同量的通用的Tween20溶液處理相比較，經(jīng)該樣品處理制劑作用后，膠體金試驗(yàn)檢測(cè)敏感性可提高5-10倍，對(duì)于上轉(zhuǎn)磷光標(biāo)記的免疫測(cè)定則可提高靈敏度10倍以上。以Tween20代替BSA同樣可增強(qiáng)試劑的封閉性，提高檢測(cè)靈敏度。
實(shí)施例5以TBS緩沖溶液作為本發(fā)明的溶液基質(zhì)，將其PH值調(diào)整為10，配制成含以下成分的溶液Nonidet P40 0.5％(v/v)NaN3(疊氮鈉)0.05％(w/v)BSA 1.0％(w/v)將上述樣本處理制劑處理添加了鼠疫耶爾森氏菌的奶粉，混勻5-10分鐘后，8000rpm離心15秒，分別以膠體金免疫層析方法和UCP(上轉(zhuǎn)磷光)免疫層析技術(shù)檢測(cè)條插入樣本上清液檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果表明，與用同濃度的通用的Tween20溶液處理相比較，對(duì)于膠體金試驗(yàn)檢測(cè)敏感性可提高5-10倍，對(duì)于上轉(zhuǎn)磷光標(biāo)記的免疫測(cè)定則可提高靈敏度10倍以上。對(duì)以面粉、土壤和肉末模擬添加鼠疫菌進(jìn)行處理可獲得同樣的結(jié)果。并且，配制好的溶液不會(huì)變質(zhì)，還可增強(qiáng)試劑的封閉性，提高檢測(cè)靈敏度。
實(shí)施例6
以Hepes緩沖溶液作為本發(fā)明的溶液基質(zhì)，將其PH值調(diào)整為10，配制含以下成分的溶液Nonidet P40 0.5％(v/v)硫汞撒0.05％(w/v)TritonX-100 1.0％(w/v)將上述樣本處理制劑處理添加了鼠疫耶爾森氏菌的奶粉，混勻5-10分鐘后，8000rpm離心15秒，分別以膠體金免疫層析方法和UCP(上轉(zhuǎn)磷光)免疫層析技術(shù)檢測(cè)條插入樣本上清液檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果表明，與用同濃度的通用的Tween20溶液處理相比較，對(duì)于膠體金試驗(yàn)檢測(cè)敏感性可提高5-10倍，對(duì)于上轉(zhuǎn)磷光標(biāo)記的免疫測(cè)定則可提高靈敏度10倍以上。對(duì)以面粉、土壤和肉末模擬添加鼠疫菌進(jìn)行處理可獲得同樣的結(jié)果。并且，加入防腐劑硫汞撒使配制好的溶液不會(huì)變質(zhì)，而1.0％的TritonX-100還可增強(qiáng)試劑的封閉性，提高檢測(cè)靈敏度。
實(shí)施例7以Hepes緩沖溶液作為本發(fā)明的溶液基質(zhì)，將其PH值調(diào)整為10，配制含以下成分的溶液Nonidet P40 0.5％(v/v)慶大霉素0.05％(w/v)TritonX-100 1.0％(w/v)將上述樣本處理制劑處理添加了鼠疫耶爾森氏菌的奶粉，混勻5-10分鐘后，8000rpm離心15秒，分別以膠體金免疫層析方法和UCP(上轉(zhuǎn)磷光)免疫層析技術(shù)檢測(cè)條插入樣本上清液檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果表明，與用同濃度的通用的Tween20溶液處理相比較，對(duì)于膠體金試驗(yàn)檢測(cè)敏感性可提高5-10倍，對(duì)于上轉(zhuǎn)磷光標(biāo)記的免疫測(cè)定則可提高靈敏度10倍以上。對(duì)以面粉、土壤和肉末模擬添加鼠疫菌進(jìn)行處理可獲得同樣的結(jié)果。并且，加入防腐劑硫汞撒同樣使配制好的溶液不會(huì)變質(zhì)，而1.0％的TritonX-100還可增強(qiáng)試劑的封閉性，提高檢測(cè)靈敏度。
另外，本發(fā)明樣本處理制劑中的基質(zhì)緩沖液為生物化學(xué)中常用的緩沖液或鹽溶液，可選自Tris緩沖液、Hepes緩沖液、磷酸鹽緩沖液、鹽酸鹽溶液、碳酸鹽緩沖液、硫酸鹽溶液、硼酸鹽緩沖液、醋酸鹽緩沖液等其中的一種或幾種的混合液；封閉劑可選自牛血清白蛋白(BSA)、Tween20、Triton X-100或PVA(15Kda)、PVP(33KDA)、PEG(20KDA)、Brij、凝膠、脫脂牛奶、、免疫球蛋白(IgG)、酪蛋白(Casein)等。
權(quán)利要求
1.一種用于固相膜免疫分析方法流動(dòng)相的樣本處理制劑，其特征在于該制劑包括基礎(chǔ)緩沖液和Nonidet P40，其中，該基礎(chǔ)緩沖液的PH值在5.5-10之間，Nonidet P40的體積比含量在0.05％-3.5％之間。
2.如權(quán)利要求1所述的用于固相膜免疫分析方法流動(dòng)相的樣本處理制劑，其特征在于所述制劑還包括封閉劑。
3.如權(quán)利要求2所述的用于固相膜免疫分析方法流動(dòng)相的樣本處理制劑，其特征在于所述制劑還包括防腐劑。
4.如權(quán)利要求3所述的用于固相膜免疫分析方法流動(dòng)相的樣本處理制劑，其特征在于所述防腐劑可為疊氮鈉或硫汞撒或慶大霉素。
5.如權(quán)利要求4所述的用于固相膜免疫分析方法流動(dòng)相的樣本處理制劑，其特征在于所述基礎(chǔ)緩沖液為生物化學(xué)緩沖液或鹽溶液。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種用于固相膜免疫分析方法流動(dòng)相的樣本處理制劑，該制劑包括基礎(chǔ)緩沖液和Nonidet P40，其中，該基礎(chǔ)緩沖液的pH值在5.5－10之間，Nonidet P40的體積比含量在0.05％－3.5％之間。由于本發(fā)明的樣品處理制劑中包括有非離子表面活性劑Nonidet P40，因此可有效解離奶粉、動(dòng)物組織、土壤等復(fù)雜樣品中的顆粒性抗原成分，使之在經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)單的離心或過(guò)濾方法處理后適合于固相膜免疫分析，從而提高固相膜免疫分析方法檢測(cè)復(fù)雜樣品的能力并擴(kuò)大檢測(cè)復(fù)雜樣本顆粒性抗原的應(yīng)用范圍；并且，優(yōu)化Nonidet P40的濃度、樣品液的pH值后，能夠提高細(xì)菌樣本檢測(cè)敏感性10倍以上。
文檔編號(hào)G01N1/28GK1619307SQ200410091168
公開(kāi)日2005年5月25日 申請(qǐng)日期2004年11月23日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月23日
發(fā)明者胡孔新, 王寶麟, 王大寧, 王靜, 姚李四, 李偉, 陳維娜 申請(qǐng)人:中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院