專利名稱：：用于檢測副溶血弧菌的耐熱性溶血素相關溶血素基因的檢測試劑的制作方法
技術領域：
：本發明涉及一種用于在臨床檢驗、公共衛生、食品檢查和食物中毒檢驗中檢測副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)的檢測試劑。
背景技術：
：副溶血弧菌通常被認為是一種導致感染性食物中毒的致病微生物。從腸胃炎患者中分離的副溶血弧菌之95％或甚至更多為在Wagatsuma培養基上表現溶血活性的神奈川現象陽性菌株，與之不同，從魚類和水中分離的菌株99％都是神奈川現象陰性。因此，人們認為在致病副溶血弧菌和神奈川現象之間存在密切聯系。隨后，這種神奈川現象的出現被確定為是由于副溶血弧菌向細菌細胞外釋放耐熱性溶血素(thermostabledirecthemolysin，TDH)所引起的，這導致對副溶血弧菌作為致病因子的關注的提升。目前TDH基因已知存在TDH1至TDH5五種類型。更近來，從一種盡管是神奈川現象陰性但顯示致病性的微生物株系中，鑒定出一種具有相似于TDH的堿基序列且具有部分共同抗原性的溶血素(TDH-相關溶血素[TRH])。目前該TRH基因已知存在TRH1和TRH2兩種類型。盡管涉及在擴增培養或分離培養之后評價神奈川現象以檢測和鑒定副溶血弧菌的方法是已知的，但就檢測的靈敏度、快捷性和簡便性而言，優選對副溶血弧菌基因或來自所述基因的RNA中存在的特定序列進行擴增后檢測該序列的方法。在檢測系統的自動化方面特別優選恒溫下擴增靶核酸的方法。已經報道了一種檢測和鑒定副溶血弧菌的方法，其中在比較低的溫度(41℃)下特異性擴增來自TRH1或TRH2基因的RNA(日本未審專利公開2001-258569和2001-340087和2001-340088)。在此方法中使用RNA擴增法，其中以來自所述TRH1或TRH2基因的特定RNA序列為模板，通過RNA依賴型DNA聚合酶，使用具有與所述特定序列互補的序列的第一引物和具有與所述特定序列同源的序列的第二引物制備cDNA而形成雙鏈RNA-DNA，其中第一引物或第二引物在5’末端被添加了一段RNA聚合酶的啟動子序列，通過核糖核酸酶H降解雙鏈RNA-DNA中的RNA，從而獲得單鏈DNA，以所述的單鏈DNA作為模板，通過DNA依賴型DNA聚合酶合成具有啟動子序列的雙鏈DNA，其能轉錄成由前述RNA序列或該RNA序列的互補序列組成的RNA，其中所述的雙鏈DNA在RNA聚合酶存在下生成RNA轉錄產物，所述的RNA轉錄產物作為模板用于隨后的通過RNA依賴型DNA聚合酶的cDNA合成中。然而，前述方法存在如下問題。首先，該方法的靈敏度低。根據日本未審專利公開.2001-340087，其中僅指出起始RNA量為至少103拷貝時檢測TRH1RNA的數據，而是否可以檢測到起始RNA量小于103拷貝(例如，102拷貝)時的TRH1RNA并不清楚。根據日本未審專利公開.2001-340088，其中僅指出起始RNA量為至少103拷貝時檢測TRH2RNA的數據，而是否可以檢測到起始RNA量小于103拷貝(例如，102拷貝)時的TRH2RNA并不清楚。第二個問題是現有技術中從未報道過既能夠檢測TRH1又能夠檢測TRH2的任何試劑，而這是實際應用時所需要的。例如，根據日本未審專利公開.2001-340087，能夠檢測起始RNA量為至少103拷貝的TRH1RNA的試劑檢測不到TRH2。此外，根據日本未審專利公開.2001-340088，能夠檢測起始RNA量為至少103拷貝的TRH2RNA的試劑檢測不到TRH1。第三，沒有關于檢測速度的任何數據。日本未審專利公開.2001-340087和2001-340088僅公開了自反應開始30分鐘后獲得的電泳圖譜，而反應速度不清楚。因此，本發明的目的在于提供具有優良的靈敏性和速度、能夠檢測副溶血弧菌TRH1和TRH2的TRHRNA檢測試劑。
發明內容為了開發一種用于檢測副溶血弧菌耐熱性溶血素相關溶血素(TRH)RNA的更靈敏和更快捷的檢測試劑，經過深入研究，本發明的發明人開發了一種能夠在20分鐘內、102拷貝的起始RNA量下檢測TRH1或TRH2的試劑。本發明涉及一種用于檢測存在于樣品中的副溶血弧菌TRH基因的檢測試劑，其被用于使用包括以下步驟的RNA擴增程序的檢測方法中使用來自所述TRH基因的RNA的一段特定序列，即，所述RNA的至少部分序列，作為模板，通過RNA依賴型的DNA聚合酶，應用具有與所述特定序列互補的序列的第一引物和具有與所述特定序列同源的序列的第二引物，生成cDNA，從而形成雙鏈RNA-DNA，其中第一引物或第二引物的序列在其5’末端被添加了RNA聚合酶的啟動子序列；通過核糖核酸酶H降解所述雙鏈RNA-DNA中的RNA部分，從而產生單鏈DNA；和以所述的單鏈DNA作為模板，通過DNA依賴型的DNA聚合酶，合成具有所述啟動子序列的雙鏈DNA，該DNA能轉錄成由所述RNA特定序列或互補于所述的RNA特定序列的序列組成的RNA；其中，雙鏈DNA在RNA聚合酶存在下合成RNA轉錄產物，所述的RNA轉錄產物作為模板用于隨后的通過RNA依賴型DNA聚合酶的cDNA合成中；所述的試劑包括，第一引物，其為由SEQ.IDNo.2所示序列中至少10個連續堿基組成的寡核苷酸，或者在由SEQ.IDNo.2所示序列中至少10個連續堿基組成的寡核苷酸中缺失、替換或添加一個或多個核苷酸后能特異性結合到所述特定序列的寡核苷酸，或者在高嚴格條件下可以與由SEQ.IDNo.2所示序列中至少10個連續堿基組成的寡核苷酸雜交的、能特異性結合到所述特定序列的寡核苷酸；和第二引物，其為由SEQ.IDNo.1所示序列中至少10個連續堿基組成的寡核苷酸，或者在由SEQ.IDNo.1所示序列的至少10個連續堿基組成的寡核苷酸中缺失、替換或添加一個或多個核苷酸后能特異性結合所述特定序列之互補序列的寡核苷酸，或者在高嚴格條件下可以與由SEQ.IDNo.1所示序列中至少10個連續堿基組成的寡核苷酸雜交的、能特異地結合到所述特定序列之互補序列上的寡核苷酸。高嚴格條件指諸如在以下實施例中給出的在44℃溫度，60mMTris、17mM氯化鎂、100-130mM氯化鉀和1mMDTT存在下進行雜交的雜交條件。優選的，上述的第一引物可以是由SEQ.IDNo.2所示的序列組成的寡核苷酸，上述的第二引物可以是由SEQ.IDNo.1所示的序列組成的寡核苷酸。此外，在打算檢測與TRH基因來源的RNA互補的RNA時，具有自5’末端到3’末端序列倒轉時與上述的第一引物互補的序列的寡核苷酸應被用作第一引物，具有自5’末端到3’末端序列倒轉時與上述的第二引物互補的序列的寡核苷酸應被用作第二引物。優選的，上述RNA擴增程序在一段剪切寡核苷酸存在下進行，該寡核苷酸可在上述特定序列的5’末端剪切上述靶RNA，并且具有互補于與所述特定序列的5’末端相鄰和重疊的區域的序列。所述的寡核苷酸優選為由SEQ.IDNo.4，5或6所示的序列組成的寡核苷酸。更優選的，上述的RNA擴增程序在一段標記有嵌入熒光染料的寡核苷酸的存在下進行，而副溶血弧菌耐熱性溶血素相關溶血素的檢測通過測量反應溶液的熒光強度來進行。這里，所述寡核苷酸的序列與mRNA轉錄產物的至少部分序列互補，在所述寡核苷酸與所述RNA轉錄產物發生互補結合的情況下，與沒有復合物形成時比較，反應溶液的熒光性質發生改變。優選的，上述的寡核苷酸由SEQ.IDNo.3所示序列中的至少10個連續堿基組成。以下提供本發明的詳細說明。附圖簡述圖1顯示在實施例1中用到的每個寡核苷酸沿著擴增區域所在的位置。圖中堿基編號根據文獻(Appl.Environ.Microbiol.，58，2449-2457(1992))給出。圖2(A)顯示實施例2中從10拷貝/檢測到107拷貝/檢測的起始TRH1RNA量生成RNA時熒光強度比率隨著反應時間的增強，(B)顯示由初始RNA量的對數值和上升時間而獲得的校準曲線。“陰性對照”指的是使用稀釋劑代替RNA的樣品。在大約15分鐘反應時間時可以檢測到起始RNA量為102拷貝/檢測時的TRH1RNA，并且也觀測到起始RNA量和上升時間之間的相關性。圖3(A)顯示實施例2中從10拷貝/撿測到107拷貝/檢測的起始TRH2RNA量生成RNA時熒光強度比率隨著反應時間的增強，(B)顯示由初始RNA量的對數值和上升時間而獲得的校準曲線。“陰性對照”指的是使用稀釋劑代替RNA的樣品。在大約19分鐘反應時間后可以檢測到起始RNA量為103拷貝/檢測時的TRH2RNA，并且也觀測到起始RNA量和上升時間之間的相關性。實現本發明的最佳方式以下提供了本發明的詳細說明。在本發明中，盡管序列表中列出的全長堿基序列能被用作第一和第二引物，但是由于大約10個堿基就足以特異性結合到特定核酸序列或其類似物上，因此也可以使用每個序列中的至少10個連續堿基的組合。本發明的擴增程序包括NASBA方法，3SR方法或，例如，在日本未審專利公開2000-014400中記載的RNA檢測方法(TRC方法)，其通過反轉錄酶和RNA聚合酶的協同作用(通過在反轉錄酶和RNA聚合酶可以協同作用的條件下使它們反應)來擴增TRH1和TRH2RNA。這里，盡管對溫度沒有特別限定，但優選35至50℃。在本申請上述發明的一個方面中，必須在特定序列的5’端剪切靶RNA。以這種方式剪切靶RNA的一種優選方法優選由如下步驟組成通過添加具有與特定序列5’末端相鄰和重疊的區域互補的序列的寡核苷酸(剪切寡核苷酸)，用核糖核酸酶H或類似物剪切靶RNA。所述寡核苷酸優選是由SEQ.IDNo.4，5或6所示的序列組成的寡核苷酸。為了抑制3’末端的延伸反應，在所述剪切寡核苷酸中，3’末端羥基基團優選被化學修飾，例如，被胺化。盡管可以利用已知的核酸檢測方法檢測上述核酸擴增方法中得到的擴增產物，但在這個方法的一個優選方面，上述核酸擴增優選在標記有嵌入熒光染料的寡核苷酸存在下進行，并隨后測量反應溶液的熒光性質的改變。在所述寡核苷酸中，嵌入熒光染料通過接頭結合到該寡核苷酸的磷原子上，因此與靶核酸(互補核酸)形成雙鏈的嵌合劑部分嵌入雙鏈部分中，導致了熒光性質的變化，從而導致了本方法不需要分離來進行分析的特征(Ishiguro，T.etal.(1996)NucleicAcidRes.24(24)4992-4997)。被所述寡核苷酸結合的序列可以是對于TRHRNA而言特異的任一序列，并且盡管對此沒有具體限定，但優選由SEQ.IDNo.3所示的序列中至少10個連續堿基組成的序列或其互補序列。另外，所述寡核苷酸3’末端的羥基基團優選被化學修飾(例如通過添加羥基乙酸)，從而抑制因使用這段寡核苷酸作為引物而可能出現的延伸反應。這樣，在恒溫下利用單個步驟，在單管中能快速和高靈敏地擴增和檢測副溶血弧菌的TRH1和TRH2RNA，從而有助于自動化應用。盡管以下通過實施例對本申請的發明提供了更詳細的解釋，但本發明并不限于這些實施例。實施例實施例1比較表1和圖1所示(a)至(j)組合在副溶血弧菌的TRHRNA的擴增效率方面的差異。(1)一份含有副溶血弧菌TRH1和TRH2RNA的第1至610位堿基(RNA的堿基編號參照Nishibuchi，等，ApplEnviron.Microbiol.，58，2449-2457(1992))的標準RNA樣品(616個堿基)，通過在260nm下紫外吸收來定量，然后用RNA稀釋劑(10mMTris-HCl緩沖液(pH8.0)，1mMEDTA，5mMDTT，0.5U/μlRNase抑制劑(TakaraBio))稀釋到103拷貝/5μl。對照組(陰性對照)僅用到了稀釋劑。(2)具有以下組成的20μl反應溶液被分裝到0.5mlPCR管中(GeneAmp薄壁反應管，AppliedBiosystem)，之后在管中加入5μl上述的RNA樣品。此外，預備溶液以將第一引物、第二引物和剪切寡核苷酸按照表1所示方式組合。反應溶液的組成(所示的濃度是在30μl終反應溶液體積中的濃度)60mMTris-HCl緩沖液(pH8.6)17mM氯化鎂130mM氯化鉀(除了組合(j)中為100mM)6URNase抑制劑1mMDTTdATP，dCTP，dGTP和dTTP各0.25mM3.6mMITPATP，CTP，GTP和UTP各3.0mM0.16μM剪切寡核苷酸1.0μM第二引物1.0μM第一引物25nM標記有嵌入染料的寡核苷酸(YO-TRH-S-G，SEQID.No.3；在距5’末端第5位的“C”和第6位的“A”之間標記有嵌入熒光染料，其3’末端的羥基基團被乙二醇基團修飾)13％DMSO用于調整體積的蒸餾水(3)上述反應溶液在44℃溫育5分鐘后，加入5μl具有下示組成并在44℃預熱2分鐘的酶溶液。酶溶液組成(顯示的值表示30μl終反應溶液體積中的值)2.0％山梨糖醇3.6μg牛血清白蛋白142UT7RNA聚合酶(Invitrogen)6.4UAMV反轉錄酶(TakaraBio)用于調整體積的蒸餾水(4)隨后，在44℃下溫育時，用配有溫度控制功能并能直接測量試管的熒光分光光度計，在470nm的激發波長和520nm的熒光波長下，隨著時間的變化測量每個PCR管中的反應溶液。(5)表2顯示每一個寡核苷酸組合得到的“上升時間”結果(熒光比率增長到陰性對照樣品的平均值再加上3個標準差之和的1.2倍時所需的時間)。由于不管使用(a)到(j)中任一組合，都在15分鐘內檢測出TRH1和TRH2RNA，表明這些組合中用到的寡核苷酸對于檢測副溶血弧菌的TRHRNA是有效的。表1表1顯示實驗體系中用到的第一引物、第二引物和剪切寡核苷酸的組合，以及使用這些組合擴增的特異性條帶的長度。對于每一寡核苷酸組合，圖1顯示了寡核苷酸在副溶血弧菌的TRHRNA中的定位和擴增區域。在剪切寡核苷酸堿基序列的3’末端，羥基基團被胺化。第二引物堿基序列中距5’末端的第1位的“A”到第22位的“A”的區域是T7啟動子區域，隨后的從第23位的“G”到第28位的“A”的區域是增強子序列。剪切寡核苷酸TR-S22(SEQ.IDNo.4，堿基編號33至54)TR-S26(SEQ.IDNo.5，堿基編號29至54)TR-S30(SEQ.IDNo.6，堿基編號25至54)第二引物TR-F23(SEQ.IDNo.7，堿基編號50至72)TR-F26(SEQ.IDNo.8，堿基編號50至75)TR-F29(SEQ.IDNo.9，堿基編號50至78)第一引物TR-R21(SEQ.IDNo.10，堿基編號225至245)TR-R24(SEQ.IDNo.11，堿基編號225至248)TR-R27(SEQ.IDNo.2，堿基編號225至251)TR-R20+11(SEQ.IDNo.12，堿基編號236至255)表2表2顯示用表1所示的寡核苷酸組合，以103拷貝/檢測來測定TRH1和TRH2RNA所得到的結果。所有在表1中所示的寡核苷酸組合都在15分鐘內檢測到TRH1和TRH2RNA。實施例2使用表1中所示的組合(j)檢測不同起始拷貝數的副溶血弧菌TRH1和TRH2RNA。(1)類似于實施例1中的副溶血弧菌TRH1和TRH2RNA使用RNA稀釋劑(10mMTris-HCl(pH8.0)，1mMEDTA，5mMDTT，0.5U/μlRNase抑制劑(TakaraBio))稀釋到107拷貝/5μl至10拷貝/5μl。對照組(陰性對照)僅用了稀釋劑。(2)具有以下組成的20μl反應溶液被分裝到PCR管中(體積0.5mL，GeneAmp薄壁反應管，AppliedBiosystem)，之后添加5μl上述RNA樣品。反應溶液組成(所示濃度是在30μl終反應溶液體積中的濃度)60mMTris-HCl緩沖液(pH8.6)17.85mM氯化鎂100mM氯化鉀6URNase抑制劑1mMDTTdATP，dCTP，dGTP和dTTP各0.25mM3.6mMITPATP，CTP，GTP和UTP各3.0mM0.16μM剪切寡核苷酸(TR-S26，SEQ.IDNo.5，其3’末端的羥基基團被胺化)1.0μM第二引物(TR-F26，SEQ.IDNo.8)1.0μM第一引物(TR-R20+11，SEQ.IDNo.12)25nM標記有嵌入染料的寡核苷酸(YO-TRH-S-G，SEQID.No.3；在距5’末端的第5位的“C”和第6位的“A”之間標記有嵌入熒光染料，其3’末端的羥基基團被乙二醇基團所修飾)13％DMSO用于調整體積的蒸餾水(3)上述反應溶液在44℃溫育5分鐘后，加入5μl具有下示組成并在44℃預熱2分鐘的酶溶液。酶溶液組成(顯示的值表示針對30μl最終反應溶液體積的值)2.0％山梨糖醇3.6μg牛血清白蛋白142UT7RNA聚合酶(Invitrogen)6.4UAMV反轉錄酶(TakaraBio)用于調整體積的蒸餾水(4)隨后，當在44℃下溫育時，用配有溫度控制功能并能直接測量試管的熒光分光光度計，在470nm的激發波長和520nm的熒光波長下，隨著時間變化測量每個PCR管中的反應溶液。圖2(A)和3(A)顯示將加入酶的時間設定為0分鐘時，樣品的熒光強度比率(預定時間的熒光強度值÷背景熒光強度值)隨時間的變化。另外，圖2(B)和3(B)顯示就起始RNA量的對數值和“上升時間”(熒光比率增長到陰性對照樣品的平均值再加上3個標準差之和的1.2倍時所需的時間)之間的關系而得到的結果。此外，起始RNA量的范圍是從10拷貝/檢測到107拷貝/檢測。根據圖2和3，在約15分鐘內檢測到102拷貝的TRH1RNA，而對于TRH2RNA，在約19分鐘內檢測到103拷貝。此外，由于在約20分鐘內，該組合可檢測到甚至起始量為103拷貝/檢測的TRH1和TRH2RNA，故與現有技術中的方法(日本未審專利公開2001-340087和2001-340088)相比，可以更快地和更靈敏地同時進行TRH1和TRH2RNA的檢測。工業實用性按照上述的解釋，本發明的檢測方法有助于同時高靈敏地檢測副溶血弧菌的TRH1和TRH2RNA。本發明的寡核苷酸不局限于序列表中列出的(具有22至30個堿基)序列，而是可以為由這些序列中至少10個連續堿基構成的序列。這是因為明顯地，在相對較低的溫度(優選44℃)條件下，約10個堿基的堿基序列就足以確保引物或探針對靶核酸的特異性。本領域技術人員應理解盡管已經結合具體的實施方案和實施例對本發明進行了如上描述，但本發明不必局限于此，許多其它的實施方式、實施例和用途，修飾以及由這些實施方式、實施例、用途擴展的內容都可以在不背離本申請的發明范圍的情況下實現。序列表<110>東曹株式會社(TOSOHCorporation)<120>用于檢測副溶血弧菌的耐熱性溶血素相關溶血素基因的檢測試劑<130>1033908<160>12<210>1<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>TR-F29-T7<400>1actctactttgctttcagtttgctattgg29<210>2<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>TR-R27<400>2ttttctttttatgtttcggtttgtcca27<210>3<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>YO-TRH-S-G<400>3gattcagtttttattgttgtatttcta27<210>4<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>TR-S22<400>4agagttttagtttcataattaa22<210>5<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>TR-S26<400>5agagttttagtttcataattaatcct26<210>6<211>30<212>DNA<213>TR-S30<220><223><400>6agagttttagtttcataattaatcctttat30<210>7<211>51<212>DNA<213>TR-F23<220><223><400>7aattctaatacgactcactatagggagaactctactttgctttcagtttgc51<210>8<211>54<212>DNA<213>TR-F26<220><223><400>8aattctaatacgactcactatagggagaactctactttgctttcagtttgctat54<210>9<211>57<212>DNA<213>TR-F29<220><223><400>9aattctaatacgactcactatagggagaactctactttgctttcagtttgctattgg57<210>10<211>21<212>DNA<213>TR-R21<220><223><400>10ttttatgtttcggtttgtcca21<210>11<211>24<212>DNA<213>TR-R24<220><223><400>11tctttttatgtttcggtttgtcca24<210>12<211>20<212>DNA<213>TR-R20+11<220><223><400>12atggttttctttttatgttt20權利要求1.一種用于檢測樣品中存在的副溶血弧菌耐熱性溶血素相關溶血素(TRH)基因的檢測試劑，該檢測試劑被用于使用RNA擴增程序的檢測方法中，所述RNA擴增程序包括以下步驟以一段來自所述TRH基因的RNA的特定序列作為模板，通過RNA依賴性DNA聚合酶，應用具有與所述特定序列互補的序列的第一引物和具有與所述特定序列同源的序列的第二引物，生成cDNA，由此形成雙鏈RNA-DNA，其中第一引物或第二引物在其5’末端添加了RNA聚合酶的啟動子序列；通過核糖核酸酶H降解所述雙鏈RNA-DNA中的RNA部分，從而生成單鏈DNA；和以所述的單鏈DNA作為模板，通過DNA依賴性DNA聚合酶，合成具有所述啟動子序列的雙鏈DNA，其中所述雙鏈DNA能轉錄為由所述特定RNA序列或者所述特定RNA序列的互補序列組成的RNA；其中，該雙鏈DNA在RNA聚合酶的作用下生成RNA轉錄產物，所述RNA轉錄產物作為模板用于隨后通過RNA依賴性DNA聚合酶合成cDNA；所述的試劑包括，第一引物，其是由SEQ.IDNo.2所示序列的至少10個連續堿基組成的寡核苷酸，或者是從SEQ.IDNo.2所示序列的至少10個連續堿基組成的寡核苷酸中缺失、替換或添加一個或多個核苷酸后能特異性結合到所述特定序列上的寡核苷酸；和第二引物，其是由SEQ.IDNo.1所示序列的至少10個連續堿基組成的寡核苷酸，或者是從SEQ.IDNo.1所示序列的至少10個連續堿基組成的寡核苷酸中缺失、替換或添加一個或多個核苷酸后能特異性結合到所述特定序列的互補序列上的寡核苷酸。2.權利要求1所述的檢測試劑，其中第一引物是由SEQ.IDNo.2所示的序列組成的寡核苷酸。3.權利要求1或2所述的檢測試劑，其中第二引物是由SEQ.IDNo.1所示的序列組成的寡核苷酸。4.權利要求1至3中任一項的檢測試劑，其中RNA擴增程序在剪切寡核苷酸存在下進行，剪切寡核苷酸具有與所述特定序列的5’末端相鄰和重疊的區域互補的序列，并在所述特定序列的5’末端剪切所述靶RNA；其中所述的寡核苷酸是由SEQ.IDNo.4，5或6所示的序列組成的寡核苷酸。5.權利要求1至4中任一項的檢測試劑，其中RNA擴增程序在標記有嵌入熒光染料的寡核苷酸存在下進行，并且通過測定反應溶液的熒光強度來檢測副溶血弧菌的耐熱性溶血素相關溶血素；其中，所述寡核苷酸的序列互補于mRNA轉錄產物的至少部分序列，并且在所述寡核苷酸與所述RNA轉錄產物發生互補結合的情況下，與沒有生成復合物的情況比較，反應溶液的熒光性質發生變化。6.權利要求5所述的檢測試劑，其中標記有嵌入熒光染料的寡核苷酸由SEQ.IDNo.3所示序列的至少10個連續堿基組成。全文摘要本發明涉及一種檢測試劑，其用于在特異性擴增TRH1和TRH2RNA的擴增程序中檢測耐熱性溶血素相關溶血素(TRH)基因，該試劑包括具有與來自TRH基因的RNA的特定序列互補的序列的第一引物，以及具有與所述特定序列同源的序列的第二引物。文檔編號G01N33/53GK1637152SQ20041009052公開日2005年7月13日申請日期2004年9月3日優先權日2003年9月5日發明者益田升佳,堀江隆一,保川清申請人:東曹株式會社