專利名稱：一種毛細管液相色譜柱及其制備方法
技術領域：
本發明涉及一種液相色譜柱及其制備方法，特別是關于一種毛細管液相色譜柱及其制備方法。
背景技術：
毛細管液相色譜(μ-HPLC)是一種高效、快速的分離分析方法，與常規液相色譜(HPLC)相比，具有總分離效能高，固定相、流動相和樣品消耗少，環境污染小，易與二級色譜系統和質譜等檢測器在線聯用等優點，在生化分析、醫藥等領域具有廣闊的應用前景，因此成為色譜領域的重要研究方向之一。近年來，μ-HPLC作為蛋白質混合物的高效分離方法，與二維凝膠電泳互為補充，在蛋白組學研究中正在發揮著極為重要的作用。毛細管色譜柱的制備方法一直是μ-HPLC的難點之一，篩板的制備又是其中的關鍵。
與常規液相色譜柱不同，由于毛細管液相色譜柱的柱體積小，色譜系統內存在的死體積對柱效的影響很大，因此，柱尾與引出管連接處的設計非常關鍵，如設計不當將導致樣品擴散，柱效降低。目前使用的毛細管液相色譜柱的柱尾設計主要有三種模式，第一種篩板3采用多孔聚四氟乙烯(如圖1所示)，將內徑小于毛細管柱1的石英毛細引出管4緊靠多孔篩板3，用環氧樹脂6將毛細管柱1和石英毛細引出管4連接起來。在引出管4的適當位置制備檢測窗口5，柱上檢測。這樣的連接方式不可避免地存在死區，樣品擴散至死區后由于滯留的原因，造成柱效降低。第二種制備篩板的方式與電色譜的篩板相似，通過燒結色譜填料的方法制備篩板，但是，這種制備篩板的技術不易掌握，篩板的孔徑很難控制均一，并且這類篩板與前一種篩板一樣，往往只能在柱端口制備，帶檢測窗口的引出管需要另外連接。第三種篩板采用多孔聚四氟乙烯或多孔不銹鋼材料，通過零死體積不銹鋼兩通連接柱體、篩板和引出管，但零死體積兩通不易加工。
發明內容
針對上述問題，本發明的目的是提供一種毛細管液相色譜柱及其制備方法。
為實現上述發明目的，本發明采取以下技術方案一種毛細管液相色譜柱，它包括一無需粘接的整根彈性石英毛細管，所述毛細管的中部設置有一由有機聚合物原位聚合形成的篩板，所述篩板一側的柱體內填充有采用高壓勻漿填充法填充的固定相，所述篩板另一側的引出管上，設置有將所述毛細管表面聚酰亞胺涂層燒掉2～3mm形成的檢測窗口。
所述毛細管內填充的固定相為正相液相色譜填料，或反相液相色譜填料，或離子交換填料，或體積排阻色譜填料中的一種。
所述毛細管的內徑為0.05～0.53mm。
一種制備上述毛細管液相色譜柱的方法，它包括以下步驟(1)選擇一內徑為0.05～0.53mm的彈性石英毛細管備用；(2)采用有機聚合物原位聚合方法在所述毛細管中形成色譜柱的篩板；(3)采用高壓勻漿填充法將液相色譜填料裝入所述篩板一側的毛細管柱體中，得到固定相；(4)將所述毛細管外壁的聚酰亞胺涂層燒掉2～3mm，在所述篩板另一側的毛細管上形成檢測窗口。
所述篩板的制備方法如下(1)采用雙官能團試劑對所述毛細管進行預處理；(2)將單體混合物與致孔劑按體積比2∶2～3混合；(3)再加入引發劑，超聲混合，并通入氮氣將所述反應混合溶液中的空氣除去；(4)將步驟(3)中得到的反應混合溶液通入步驟(1)預處理后的毛細管形成2～3mm長的一段液柱，并使其位于毛細管中制備篩板的位置，在所述液柱的兩端分別用空氣充滿，并用硅膠封住所述毛細管的兩端，在40～80℃水浴中反應18～24小時，完成聚合反應，形成多孔的篩板。
采用雙官能團試劑對所述毛細管進行預處理的步驟如下(1)將0.1M氫氧化鈉、水、丙酮依次通過毛細管；(2)通入氮氣，吹干毛細管；(3)將雙官能團試劑充滿經步驟(2)處理后的毛細管內，密封12小時；(4)清洗毛細管，氮氣吹干。
所述雙官能團試劑為30％的γ-甲基丙烯酸氧丙基三甲氧基硅烷。
所述單體混合物為甲基丙烯酸丁酯和雙甲基丙烯酸乙酯，其質量比為0.8～2∶1。
所述致孔劑為丙醇，丁二醇和水，其質量比為4～6∶3～5∶1。
所述引發劑為偶氮二異丁腈，其加入量為所述單體化合物質量的0.5～1％。
本發明由于采取以上設計，其具有以下優點1、本發明采用一根無須粘接的整根彈性石英毛細管制備液相色譜柱，既包含填充固定相的柱體，又包含篩板，引出管及檢測窗口，特別是引出管與柱體是一體的，不需另外連接，避免了死區的形成，死體積減少，從而提高了柱效。2、本發明采用有機聚合物原位聚合方法制備的篩板，其不但孔徑均一，而且可以在柱體的任何位置制備。3、本發明在制備篩板過程中由于引入雙官能團試劑對毛細管內壁進行處理，因此可以保證篩板能夠承受高壓而不會從毛細管中滑脫。4、本發明采用常規的勻漿法制備固定相，與干法和電動裝填相比，具有較高柱效，技術上也容易掌握。5、本發明的檢測窗口是通過將彈性石英毛細管外壁的聚酰亞胺涂層燒掉2～3mm形成的，因此制備容易。本發明毛細管液相色譜柱的制備方法簡單，特別適用于樣品量少的生物、醫藥、環境等樣品及用常規液相色譜難以分離的樣品的分離分析。
圖1是現有技術中膠粘接的毛細管液相色譜柱示意2是本發明的毛細管液相色譜柱結構示意3a～3d是制備篩板時將整體聚合混合物引入毛細管內的過程圖4是7種樣品在本發明毛細管液相色譜柱上分離的譜5是3種樣品在本發明毛細管液相色譜柱上分離的譜圖具體實施方式
如圖2所示，本發明的毛細管液相色譜柱，包括柱體1，固定相(填料)2，篩板3，引出管4，檢測窗口5，它們均存在于一整根無需粘接的彈性石英毛細管中。
本發明篩板制備方法包括以下步驟1、首先取一整根彈性石英毛細管，采用雙官能團試劑γ-甲基丙烯酸氧丙基三甲氧基硅烷處理石英毛細管內壁。該雙官能團試劑一端含烷氧基團，與毛細管的硅羥基反應；另一端含雙鍵，在單體聚合時參與聚合反應。
2、將單體混合物甲基丙烯酸丁酯和雙甲基丙烯酸乙酯(質量比0.8～2∶1)，及致孔劑正丙醇、丁二醇和水(質量比4～6∶3～5∶1)，按體積比2∶2～3在容器中混合。
3、加入偶氮二異丁腈作為引發劑，引發聚合反應，引發劑的加入量為上述單體混合物質量的0.5～1％。
4、超聲混合，通入氮氣將反應混合物的空氣除去；5、將聚合混合物壓入毛細管內(如圖3a所示)，在毛細管內形成一小段液柱12(如圖3b所示)，之后將空氣壓入毛細管中(如圖3c所示)，帶動液柱12向前移動直至液柱到達需要制備篩板的位置(如圖3d所示)，迅速用硅橡膠封柱毛細管柱的兩端，放在40～80℃水浴中加熱18～24小時，完成聚合反應，形成多孔的篩板3(如圖2所示)。
(6)用甲醇或乙腈等溶劑沖洗毛細管，除去殘留的致孔劑等有機物。
本發明的固定相采用高壓勻漿裝柱法填裝填料，具體方法是首先根據填料的性質不同，用適當的溶劑將填料制備成勻漿，超聲混勻，裝入勻漿罐中，用高壓泵在一定壓力(15～30MPa)下將勻漿液壓入毛細管柱1中；填料裝填到指定長度后，停泵，降壓。
本發明檢測窗口5的制備的采用以下方案在填好填料的篩板3另一側毛細管外壁上，將毛細管表面的聚酰亞胺涂層燒掉2～3mm，并用乙醇擦洗，用作檢測窗口5。
實施例一、本發明的毛細管液相色譜柱的制備1、毛細管柱的預處理取內徑為0.32mm，長為60cm的彈性石英毛細管，利用真空泵的負壓將0.1M氫氧化鈉溶液通過毛細管2小時，用水沖洗毛細管，直到pH為7，將為毛細管體積50倍的丙酮通過毛細管，用氮氣吹干2分鐘，取30％的γ-甲基丙烯酸氧丙基三甲氧基硅烷丙酮溶液充滿毛細管柱，兩端用硅橡膠密封12小時，用丙酮沖洗，氮氣吹干待用。
2、原位聚合篩板的制備將甲基丙烯酸丁酯、雙甲基丙烯酸乙酯按質量比1.3∶1混合形成單體混合物，再將致孔劑混合物正丙醇、1，4-丁二醇和水以質量比5∶4∶1混合形成致孔劑混合物，將單體混合物與致孔劑混合物以體積比2∶3混合在一起，再加入質量為聚合反應單體質量1％的偶氮二異丁腈，超聲混合均勻，在混合物中通入氮氣2分鐘以除去混合物中的氧氣。如圖3a～d所示，用一空管注射器7(內無液體)，插入帶聚四氟乙烯螺紋蓋8的棕色玻璃小瓶9，向小瓶9內壓縮氣體，使整體聚合混合物10壓入毛細管11(用雙官能團試劑處理過)，形成2mm聚合物液柱12。然后向上提毛細管11，使其脫離整體聚合混合物10溶液，再用空管注射器7向小瓶9內壓縮空氣，以將聚合物液柱12引入到毛細管11內需要制備篩板處，將毛細管11兩端用硅橡膠密封，放在60℃水浴中加熱20小時后取出，用甲醇沖洗毛細管柱。
3、固定相的填充取少量0.2g 5μmC18(十八烷基鍵合硅膠)，用1ml三氯甲烷配制成勻漿液，超聲混合均勻，裝入勻漿罐中，加壓至20Mpa，將填料裝入毛細管柱中，固定相2長20cm(如圖2所示)；4、檢測窗口的制備將篩板3另一側的引出管4外壁的聚酰亞胺涂層燒掉2～3mm形成檢測窗口5。
5、標樣測試結果取硫脲、苯、甲苯、萘、聯苯、菲、蒽的甲醇溶液200nl，流動相為甲醇/水(75/25)，流速為3μl/min，在254nm波長下，按照常規方法利用制備好的毛細管液相色譜柱分離，其結果如圖4所示。圖中各色譜峰的柱效依次為4.1，4.4，5.1，6.2，7.3，9.3萬塔板每米。
實施例二制備篩板時，將單體混合物甲基丙烯酸丁酯、雙甲基丙烯酸乙酯按質量比1.51∶1混合，其余的試劑用量同實施例一。篩板長度為3mm，內徑為0.32mm，毛細管長50cm，固定相長15cm，填充5μmC18其它同實施例一。
標樣測試結果取硫脲、甲苯和萘的甲醇溶液，在254nm波長下，利用制備好的毛細管高效液相色譜柱分離，其結果如圖5所示。流動相為甲醇/水(50/50)，流速為4μl/min。圖中各色譜峰的柱效依次為2.4，8.3，9.7萬塔板每米。
權利要求
1.一種毛細管液相色譜柱，它包括一無需粘接的整根彈性石英毛細管，所述毛細管的中部設置有一由有機聚合物原位聚合形成的篩板，所述篩板一側的柱體內填充有采用高壓勻漿填充法填充的固定相，所述篩板另一側的引出管上，設置有將所述毛細管表面聚酰亞胺涂層燒掉2～3mm形成的檢測窗口。
2.如權利要求1所述的毛細管液相色譜柱，其特征在于所述毛細管內填充的固定相為正相液相色譜填料，或反相液相色譜填料，或離子交換填料，或體積排阻色譜填料中的一種。
3.如權利要求1或2所述的毛細管液相色譜柱，其特征在于所述毛細管的內徑為0.05～0.53mm。
4.一種制備權利要求1或2或3所述的毛細管液相色譜柱的方法，它包括以下步驟(1)選擇一內徑為0.05～0.53mm的彈性石英毛細管備用；(2)采用有機聚合物原位聚合方法在所述毛細管中形成色譜柱的篩板；(3)采用高壓勻漿填充法將液相色譜填料裝入所述篩板一側的毛細管柱體中，得到固定相；(4)將所述毛細管外壁的聚酰亞胺涂層燒掉2～3mm，在所述篩板另一側的毛細管上形成檢測窗口。
5.如權利要求4所述的毛細管液相色譜柱的制備方法，其特征在于所述篩板的制備方法如下(1)采用雙官能團試劑對所述毛細管進行預處理；(2)將單體混合物與致孔劑按體積比2∶2～3混合；(3)再加入引發劑，超聲混合，并通入氮氣將所述反應混合溶液中的空氣除去；(4)將步驟(3)中得到的反應混合溶液通入步驟(1)預處理后的毛細管形成2～3mm長的一段液柱，并使其位于毛細管中制備篩板的位置，在所述液柱的兩端分別用空氣充滿，并用硅膠封住所述毛細管的兩端，在40～80℃水浴中反應18～24小時，完成聚合反應，形成多孔的篩板。
6.如權利要求5所述的毛細管液相色譜柱的制備方法，其特征在于，采用雙官能團試劑對所述毛細管進行預處理的步驟如下(1)將0.1M氫氧化鈉、水、丙酮依次通過毛細管；(2)通入氮氣，吹干毛細管；(3)將雙官能團試劑充滿經步驟(2)處理后的毛細管內，密封12小時；(4)清洗毛細管，氮氣吹干。
7.如權利要求5或6所述的毛細管液相色譜柱的制備方法，其特征在于所述雙官能團試劑為30％的γ-甲基丙烯酸氧丙基三甲氧基硅烷。
8.如權利要求5或6所述的毛細管液相色譜柱的制備方法，其特征在于所述單體混合物為甲基丙烯酸丁酯和雙甲基丙烯酸乙酯，其質量比為0.8～2∶1。
9.如權利要求5或6所述的毛細管液相色譜柱的制備方法，其特征在于所述致孔劑為丙醇，丁二醇和水，其質量比為4～6∶3～5∶1。
10.如權利要求5或6所述的毛細管液相色譜柱的制備方法，其特征在于所述引發劑為偶氮二異丁腈，其加入量為所述單體化合物質量的0.5～1％。
全文摘要
本發明涉及一種毛細管液相色譜柱及其制備方法，它包括一無需粘接的整根彈性石英毛細管，所述毛細管的中部設置有一由有機聚合物原位聚合形成的篩板，所述篩板一側的柱體內填充有采用高壓勻漿填充法填充的固定相，所述篩板另一側的引出管上，設置有將所述毛細管表面聚酰亞胺涂層燒掉2～3mm形成的檢測窗口。本發明的色譜柱是由整根毛細管制備而成，無須粘接，避免液流在死區內滯留造成柱效降低，本發明的制備方法簡單，特別適用于樣品量少的生物、醫藥、環境等樣品及用常規液相色譜難以分離的樣品的分離分析。
文檔編號G01N30/60GK1588041SQ200410077960
公開日2005年3月2日 申請日期2004年9月21日 優先權日2004年9月21日
發明者丁明玉, 馬繼平, 徐燕, 陳令新 申請人:清華大學