專利名稱：一種用于檢測sars抗體的免疫微球及其制備方法和用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種用于檢測SARS抗體的免疫微球，及其制備方法和用途。
背景技術：
SARS(嚴重急性呼吸綜合癥)冠狀病毒是一種新發現的冠狀病毒，其引起的這種新型疾病發病快，傳播速度快，若不及時診斷治療，病死率非常高。
目前在科研和臨床上常用的檢測方法是酶聯免疫法(ELISA)。使用酶聯免疫法(ELISA)檢測抗體，即將抗原包被酶標板上，加小牛血清或脫脂奶封閉，再加待測血清后溫育1小時，經反復沖洗后加酶標第二抗體，溫育，再沖洗多次后加顯色的底物。此法雖然敏感性和特異性很好，但是要完成全部試驗需要2小時以上。
而使用免疫微球法檢測抗體是一種簡便、快速的方法，只需1分鐘就可得到結果。該方法是將抗原偶聯或交聯到有機聚合物制備的微球上，制成免疫微球試劑來檢測抗體。但是現有的免疫微球試劑的制備方法，無論是物理或是化學方法，得到的免疫微球均不是通過共價鍵結合的，因此免疫微球本身很不穩定，受溫度和鹽濃度影響很大，容易造成假陽性的實驗誤差。
發明內容
本發明的目的在于克服現有酶聯免疫法不夠簡便、快速；而免疫微球法的免疫微球本身很不穩定，容易造成假陽性實驗誤差的缺陷，從而提供一種既可以快速、簡便的檢測，又很穩定的用于檢測SARS抗體的免疫微球。
本發明的另一目的在于提供一種所述的用于檢測SARS抗體的免疫微球的制備方法。
本發明的再一目的在于提供一種所述的用于檢測SARS抗體的免疫微球的用途。
本發明的目的是通過如下的技術方案實現的本發明提供的用于檢測SARS(嚴重急性呼吸綜合癥)抗體的免疫微球，其為以聚苯乙烯微球為內核，其表面的羧基通過多聚賴氨酸偶聯了作為抗原的SARS冠狀病毒S，N，M或E蛋白，所述的聚苯乙烯微球為表面直徑為200～900納米，其表面有羧基修飾。
本發明提供一種所述的用于檢測SARS抗體的免疫微球的制備方法，是采用化學偶聯法將SARS冠狀病毒S，N，M或E蛋白作為抗原偶聯到微球，包括如下的步驟1)將聚苯乙烯微球15～20mg/ml，用0.1～0.5M的pH8.8～9.8的碳酸鹽緩沖液洗滌后，重懸于0.01～0.05M的pH4～5的磷酸緩沖液，然后加入2～4mg/ml的碳二亞胺，于室溫反應完全后，離心，用0.1～0.5M的pH8.8～9.8的碳酸鹽緩沖液洗滌，重懸于0.01～0.05M的pH7.5～8.5的碳酸鹽緩沖液；所述的聚苯乙烯微球直徑為200～900納米，其表面有羧基修飾；2)向步驟1)得到的混合液中加入0.2～2.4mg/ml的多聚賴氨酸，于室溫反應完全；用0.1～0.5M的pH8.8～9.8的碳酸鹽緩沖液洗滌后，重懸于0.01～0.05M的pH4～5的磷酸緩沖液，然后加入2～4mg/ml的碳二亞胺，于室溫反應完全；用0.1～0.5M的pH8.8～9.8的碳酸鹽緩沖液洗滌，重懸于0.01～0.05M的pH7.5～8.5的碳酸鹽緩沖液；3)向步驟2)得到的混合液中加入作為抗原的SARS冠狀病毒S，N，M或E蛋白0.2～2.4mg/ml，于室溫反應完全；用0.1～0.5M的pH8.8～9.8的碳酸鹽緩沖液洗滌后，重懸于0.1～0.5M的pH8.8～9.8的碳酸鹽緩沖液；加入50～200微升0.25M乙酰胺，于室溫反應完全后，離心分出固體；4)重懸于1g/ml牛血清(BSA)和0.01～0.05M的pH7.5～8.5的碳酸鹽緩沖液，于室溫反應完全后，離心分出固體，得到用于檢測SARS抗體的免疫微球。
所述的SARS冠狀病毒S蛋白的氨基酸序列為MetPheIlePheLeuLeuPheLeuThrLeuThrSerGlySerAspLeuAspArgCysThrThrPheAspAspValGlnAlaProAsnTyrThrGlnHisThrSerSerMetArgGlyValTyrTyrProAspGluIlePheArgSerAspThrLeuTyrLeuThrGlnAspLeuPheLeuProPheTyrSerAsnValThrGlyPheHisThrIleAsnHisThrPheAspAsnProValIleProPheLysAspGlyIleTyrPheAlaAlaThrGluLysSerAsnValValArgGlyTrpValPheGlySerThrMetAsnAsnLysSerGlnSerValIleIleIleAsnAsnSerThrAsnValValIleArgAlaCysAsnPheGluLeuCysAspAsnProPhePheAlaValSerLysProMetGlyThrGlnThrHisThrMetIlePheAspAsnAlaPheAsnCysThr
PheGluTyrIleSerAspAlaPheSerLeuAspValSerGluLysSerGlyAsnPheLysHisLeuArgGluPheValPheLysAsnLysAspGlyPheLeuTyrValTyrLysGlyTyrGlnProIleAspValValArgAspLeuProSerGlyPheAsnThrLeuLysProIlePheLysLeuProLeuGlyIleAsnIleThrAsnPheArgAlaIleLeuThrAlaPheSerProAlaGlnAspThrTrpGlyThrSerAlaAlaAlaTyrPheValGlyTyrLeuLysProThrThrPheMetLeuLysTyrAspGluAsnGlyThrIleThrAspAlaValAspCysSerGlnAsnProLeuAlaGluLeuLysCysSerValLysSerPheGluIleAspLysGlyIleTyrGlnThrSerAsnPheArgValValProSerGlyAspValValArgPheProAsnIleThrAsnLeuCysProPheGlyGluValPheAsnAlaThrLysPheProSerValTyrAlaTrpGluArgLysLysIleSerAsnCysValAlaAspTyrSerValLeuTyrAsnSerThrPhePheSerThrPheLysCysTyrGlyValSerAlaThrLysLeuAsnAspLeuCysPheSerAsnValTyrAlaAspSerPheValValLysGlyAspAspValArgGlnIleAlaProGlyGlnThrGlyValIleAlaAspTyrAsnTyrLysLeuProAspAspPheMetGlyCysValLeuAlaTrpAsnThrArgAsnIleAspAlaThrSerThrGlyAsnTyrAsnTyrLysTyrArgTyrLeuArgHisGlyLysLeuArgProPheGluArgAspIleSerAsnValProPheSerProAspGlyLysProCysThrProProAlaLeuAsnCysTyrTrpProLeuAsnAspTyrGlyPheTyrThrThrThrGlyIleGlyTyrGlnProTyrArgValValValLeuSerPheGluLeuLeuAsnAlaProAlaThrValCysGlyProLysLeuSerThrAspLeuIleLysAsnGlnCysValAsnPheAsnPheAsnGlyLeuThrGlyThrGlyValLeuThrProSerSerLysArgPheGlnProPheGlnGlnPheGlyArgAspValSerAspPheThrAspSerValArgAspProLysThrSerGluIleLeuAspIleSerProCysSerPheGlyGlyValSerValIleThrProGlyThrAsnAlaSerSerGluValAlaValLeuTyrGlnAspValAsnCysThrAspValSerThrAlaIleHisAlaAspGlnLeuThrProAlaTrpArgIleTyrSerThrGlyAsnAsnValPheGlnThrGlnAlaGlyCysLeuIleGlyAlaGluHisValAspThrSerTyrGluCysAspIleProIleGlyAlaGlyIleCysAlaSerTyrHisThrValSerLeuLeuArgSerThrSerGlnLysSerIleValAlaTyrThrMetSerLeuGlyAlaAspSerSerIleAlaTyrSerAsnAsnThrIleAlaIleProThrAsnPheSerIleSerIleThrThrGluValMetProValSerMetAlaLysThrSerValAspCysAsnMetTyrIleCysGlyAspSerThrGluCysAlaAsnLeuLeuLeuGlnTyrGlySerPheCysThrGlnLeuAsnArgAlaLeuSerGlyIleAlaAlaGluGlnAspArgAsnThrArgGluValPheAlaGlnValLysGlnMetTyrLysThrProThrLeuLysTyrPheGly
GlyPheAsnPheSerGlnIleLeuProAspProLeuLysProThrLysArgSerPheIleGluAspLeuLeuPheAsnLysValThrLeuAlaAspAlaGlyPheMetLysGlnTyrGlyGluCysLeuGlyAspIleAsnAlaArgAspLeuIleCysAlaGlnLysPheAsnGlyLeuThrValLeuProProLeuLeuThrAspAspMetIleAlaAlaTyrThrAlaAlaLeuValSerGlyThrAlaThrAlaGlyTrpThrPheGlyAlaGlyAlaAlaLeuGlnIleProPheAlaMetGlnMetAlaTyrArgPheAsnGlyIleGlyValThrGlnAsnValLeuTyrGluAsnGlnLysGlnIleAlaAsnGlnPheAsnLysAlaIleSerGlnIleGlnGluSerLeuThrThrThrSerThrAlaLeuGlyLysLeuGlnAspValValAsnGlnAsnAlaGlnAlaLeuAsnThrLeuValLysGlnLeuSerSerAsnPheGlyAlaIleSerSerValLeuAsnAspIleLeuSerArgLeuAspLysValGluAlaGluValGlnIleAspArgLeuIleThrGlyArgLeuGlnSerLeuGlnThrTyrValThrGlnGlnLeuIleArgAlaAlaGluIleArgAlaSerAlaAsnLeuAlaAlaThrLysMetSerGluCysValLeuGlyGlnSerLysArgValAspPheCysGlyLysGlyTyrHisLeuMetSerPheProGlnAlaAlaProHisGlyValValPheLeuHisValThrTyrValProSerGlnGluArgAsnPheThrThrAlaProAlaIleCysHisGluGlyLysAlaTyrPheProArgGluGlyValPheValPheAsnGlyThrSerTrpPheIleThrGlnArgAsnPhePheSerProGlnIleIleThrThrAspAsnThrPheValSerGlyAsnCysAspValValIleGlyIleIleAsnAsnThrValTyrAspProLeuGlnProGluLeuAspSerPheLysGluGluLeuAspLysTyrPheLysAsnHisThrSerProAspValAspLeuGlyAspIleSerGlyIleAsnAlaSerValValAsnIleGInLysGluIleAspArgLeuAsnGluValAlaLysAsnLeuAsnGluSerLeuIleAspLeuGlnGluLeuGlyLysTyrGluGlnTyrIleLysTrpProTrpTyrValTrpLeuGlyPheIleAlaGlyLeuIleAlaIleValMetValThrIleLeuLeuCysCysMetThrSerCysCysSerCysLeuLysGlyAlaCysSerCysGlySerCysCysLysPheAspGluAspAspSerGluPro ValLeuLysGly ValLysLeuHisTyr Thr所述的SARS冠狀病毒N蛋白的氨基酸序列為MetSerAspAsnGlyProGlnSerAsnGlnArgSerAlaProArgIleThrPheGlyGlyProThrAspSerThrAspAsnAsnGlnAsnGlyGlyArgAsnGlyAlaArgProLysGlnArgArgProGlnGlyLeuProAsnAsnThrAlaSerTrpPheThrAlaLeuThrGlnHisGlyLysGluGluLeuArgPheProArgGlyGlnGlyValProIleAsnThrAsnSerGlyProAspAspGlnIleGlyTyrTyrArgArgAlaThrArgArgValArgGlyGlyAspGly
LysMetLysGluLeuSerProArgTrpTyrPheTyrTyrLeuGlyThrGlyProGluAlaSerLeuProTyrGlyAlaAsnLysGluGlyIleValTrpValAlaThrGluGlyAlaLeuAsnThrProLysAspHisIleGlyThrArgAsn ProAsnAsnAsnAlaAlaThrValLeuGlnLeuProGlnGlyThrThrLeuProLysGlyPheTyrAlaGluGlySerArgGlyGlySerGlnAlaSerSerArgSerSerSerArgSerArgGlyAsnSerArgAsnSerThrProGlySerSerArgGlyAsnSerProAlaArgMetAlaSerGlyGlyGlyGluThrAlaLeuAlaLeuLeuLeuLeuAspArgLeuAsnGlnLeuGluSerLysValSerGlyLysGlyGlnGlnGlnGlnGlyGlnThrValThrLysLysSerAlaAlaGluAlaSerLysLysProArgGlnLysArgThrAlaThrLysGlnTyrAsnValThrGlnAlaPheGlyArgArgGlyProGluGlnThrGlnGlyAsnPheGlyAspGlnAspLeuIleArgGlnGlyThrAspTyrLysHisTrpProGlnIleAlaGlnPheAlaProSerAlaSerAlaPhePheGlyMetSerArgIleGlyMetGluValThrProSerGlyThrTrpLeuThrTyrHisGlyAlaIleLysLeuAspAspLysAspProGlnPheLysAspAsnValIleLeuLeuAsnLysHisIleAspAlaTyrLysThrPheProProThrGluProLysLysAspLysLysLysLysThrAspGluAlaGlnProLeuProGlnArgGlnLysLysGlnProThrValThrLeuLeuProAlaAlaAspMetAspAspPheSerArg GlnLeuGlnAsnSer MetSerGlyAlaSer AlaAspSerThrGln Ala所述的SARS冠狀病毒M蛋白的氨基酸序列為MetAlaAspAsnGlyThrIleThrValGluGluLeuLysGlnLeuLeuGluGlnTrpAsnLeuValIleGlyPheLeuPheLeuAlaTrpIleMetLeuLeuGlnPheAlaTyrSerAsnArgAsnArgPheLeuTyrIleIleLysLeuValPheLeuTrpLeuLeuTrpProValThrLeuAlaCysPheValLeuAlaAlaValTyrArgIleAsnTrpValThrGlyGlyIleAlaIleAlaMetAlaCysIleValGlyLeuMetTrpLeuSerTyrPheValAlaSerPheArgLeuPheAlaArgThrArgSerMetTrpSerPheAsnProGluThrAsnIleLeuLeuAsnValProLeuArgGlyThrIleValThrArgProLeuMetGluSerGluLeuValIleGlyAlaValIleIleArgGlyHisLeuArgMetAlaGlyHisSerLeuGlyArgCysAspIleLysAspLeuProLysGluIleThrValAlaThrSerArgThrLeuSerTyrTyrLysLeuGlyAlaSerGlnArgValGlyThrAspSerGlyPheAlaAlaTyrAsnArgTyrArgIleGlyAsnTyrLysLeu AsnThrAspHisAla GlySerAsnAspAsn IleAlaLeuLeuVal Gln所述的SARS冠狀病毒E蛋白的氨基酸序列為
MetTyrSerPheValSerGluGluThrGlyThrLeuIleValAsnSerValLeuLeuPheLeuAlaPheValValPheLeuLeuValThrLeuAlaIleLeuThrAlaLeuArgLeuCysAlaTyrCysCysAsnIleValAsnValSerLeuValLysProThrValTyrValTyrSerArgValLysAsnLeu AsnSerSerGluGly ValProAspLeuLeu Val將此用于檢測SARS抗體的免疫微球依次分別用1％BSA、5％甘油、0.01％NaN3、0.01M的pH8.0的PBS緩沖液重懸，并用400w超聲波處理20秒，備用。
本發明提供一種所述的用于檢測SARS抗體的免疫微球的用途。該免疫微球可以作為檢測試劑檢測抗(SARS)抗體，其檢測方法如下將被測血清樣品滴在潔凈的玻片或透明塑料片上，加入本發明提供的用于檢測SARS抗體的免疫微球，其中，偶聯了作為抗原的SARS冠狀病毒S，N，M或E蛋白的免疫微球各占1/4，用竹簽、牙簽、塑料棒或其他物體攪拌，將待測樣品和免疫微球混勻并呈圓斑狀。
在黑色背景下，用肉眼或在顯微鏡下直接觀察凝集反應，并用下列符號記錄結果(-)無肉眼可見凝集顆粒；(+)肉眼可見細的凝集顆粒，背景混濁；(++)肉眼可見大的凝集顆粒，背景稍混濁；(+++)肉眼可見大而清晰凝集顆粒，背景清楚；(++++)肉眼可見大而清晰的凝集塊，背景清楚。
也可進行半定量測定抗體滴度，將被測血清倍比稀釋，按上法測定，以稀釋度為抗體滴度。
SARS病是一種嚴重的傳染性極強的烈性傳染病，需要快速、準確地進行診斷。本發明提供的用于檢測SARS(嚴重急性呼吸綜合癥)抗體的免疫微球是將基因重組的SARS冠狀病毒S，N，M，E蛋白通過化學方法偶聯到(乳膠)聚苯乙烯微球上。該免疫微球與現有技術相比，其有益效果為第一，準確性高。因為使用的基因工程重組抗原，其純度達到99％，為此，避免了PCR診斷試劑盒的假陽性的缺點；第二，快速。整個檢測過程僅需要數分鐘，避免了酶聯免疫診斷試劑盒需要數小時的費時的缺點；第三，經濟實用。檢測不需要任何儀器設備，適合廣大基層衛生防疫單位使用。
總之，該免疫微球能夠快速檢測血清抗SARS抗體，且敏感性和特異性均好。
圖1為免疫微球檢測SARS抗體左(陰性)，右(陽性)；圖2為免疫前、后兔血清與SARS CoV的基因重組蛋白免疫微球反應(40X)；其中A.免疫前兔血清；B.免疫后兔血清；圖3為正常人和病人血清與SARS CoV基因重組蛋白免疫微球反應；其中A.正常人血清(10X)；B.SARS病人血清(強反應(10X)；C.SARS病人血清(強反應40X)；D.SARS病人血清(1∶200稀釋40X)。
具體實施例方式
實施例1、偶聯了作為抗原的SARS冠狀病毒S蛋白的免疫微球的制備SARS冠狀病毒S蛋白抗原的制備及鑒定制備——用基因重組技術克隆、表達和純化SARS冠狀病毒S蛋白作為抗原用RT-PCR方法擴增SARS冠狀病毒S的基因片段，將該基因片段經測序證實基因序列正確無誤后，再將其克隆到表達載體如原核表達載體pQE30，或酵母表達載體pPICZαA，然后進行表達和蛋白純化。
鑒定——抗原純化后，通過以下試驗進行鑒定1)抗原蛋白含量測定取抗原1毫升用分光光度計測其蛋白含量，在其260nm和280nm處分別測OD值后，用公式280nmOdx1.45-260nmODx0.74即可計算抗原的蛋白含量1mg/ml左右；2)抗原蛋白純度測定取抗原20微升(含蛋白量5微克)走蛋白電泳即SDS-PAGE電泳，結果顯示為一條帶。
3)酶聯免疫試驗(ELISA)以2.5微克/毫升抗原200微升包被酶標微孔板，置4℃20小時后，棄去抗原包被液，加入5％小牛血清以封閉未被抗原包被的部分，置37℃1小時，經PBS-吐溫和PBS緩沖液洗滌后，加陽性病人血清，置37℃2小時，經PBS-吐溫和PBS緩沖液洗滌后加入最適工作濃度HRP標記的羊抗人IgG 200微升，置室溫2小時后，分別用PBS-吐溫和PBS緩沖液洗滌各3次，加入反應底物200微升，再495nm測定吸光度。
4)對照實驗用免疫微球10微升加入10微升抗體陽性血清和陰性血清，混勻后，陽性血清有凝集顆粒，陰性血清則無凝集。
免疫微球的制備1)將直徑為200納米的聚苯乙烯微球15mg/ml，用0.1M的pH8.8的碳酸鹽緩沖液洗滌3次后，重懸于0.01M的pH4的磷酸緩沖液，然后加入0.2mg/ml的碳二亞胺，置室溫上下搖動4小時，以12000轉/分離心10分鐘，用0.1M的pH8.8的碳酸鹽緩沖液洗滌3次，重懸于0.01M的pH7.5的碳酸鹽緩沖液；2)向步驟1)得到的混合液中加入0.1mg/ml的多聚賴氨酸，置室溫上下搖動12小時，用0.5M的pH8.8的碳酸鹽緩沖液洗滌3次，重懸于0.01M的pH4的磷酸緩沖液，然后加入0.2mg/ml的碳二亞胺，置室溫上下搖動4小時；用0.5M的pH8.8的碳酸鹽緩沖液洗滌3次，重懸于0.01M的pH7.5的碳酸鹽緩沖液；3)向步驟2)得到的混合液中加入作為抗原的SARS冠狀病毒S蛋白0.2mg/ml，置室溫上下搖動12小時，用0.1M的pH8.8的碳酸鹽緩沖液洗滌3次后，重懸于0.1M的pH8.8的碳酸鹽緩沖液；加入50微升0.25M乙酰胺封閉多聚賴氨酸上未被抗原結合的羧基部分，加入乙酰胺后，置室溫上下搖動30分，以13000轉/分離心10分鐘，分出固體；4)重懸于1g/ml牛血清(BSA)和0.015M的pH7.5的碳酸鹽緩沖液，置室溫上下搖動30分，離心分出固體，得到用于檢測SARS抗體的、偶聯了作為抗原的SARS冠狀病毒S蛋白的免疫微球。
將此用于檢測SARS抗體的免疫微球依次分別用1％BSA、5％甘油、0.01％NaN3、0.01M的pH8.0的PBS緩沖液重懸，并用400w超聲波處理20秒，備用。
實施例2、偶聯了作為抗原的SARS冠狀病毒N蛋白的免疫微球的制備SARS冠狀病毒N蛋白抗原的制備及鑒定制備——用基因重組技術克隆、表達和純化SARS冠狀病毒N蛋白作為抗原用RT-PCR方法擴增SARS冠狀病毒N的基因片段，將該基因片段經測序證實基因序列正確無誤后，再將其克隆到表達載體如原核表達載體pQE30，或酵母表達載體pPICZαA，然后進行表達和蛋白純化。
鑒定——抗原純化后，通過以下試驗進行鑒定1)抗原蛋白含量測定取抗原1毫升用分光光度計測其蛋白含量，在其260nm和280nm處分別測OD值后，用公式280nmOdx1.45-260nmODx0.74即可計算抗原的蛋白含量1mg/ml左右；2)抗原蛋白純度測定取抗原20微升(含蛋白量5微克)走蛋白電泳即SDS-PAGE電泳，結果顯示為一條帶。
3)酶聯免疫試驗(ELISA)以2.5微克/毫升抗原200微升包被酶標微孔板，置4℃20小時后，棄去抗原包被液，加入5％小牛血清以封閉未被抗原包被的部分，置37℃1小時，經PBS-吐溫和PBS緩沖液洗滌后，加陽性病人血清，置37℃2小時，經PBS-吐溫和PBS緩沖液洗滌后加入最適工作濃度HRP標記的羊抗人IgG 200微升，置室溫2小時后，分別用PBS-吐溫和PBS緩沖液洗滌各3次，加入反應底物200微升，再495nm測定吸光度。
4)對照實驗用免疫微球10微升加入10微升抗體陽性血清和陰性血清，混勻后，陽性血清有凝集顆粒，陰性血清則無凝集。
免疫微球的制備1)將直徑為200納米的聚苯乙烯微球15mg/ml，用0.1M的pH8.8的碳酸鹽緩沖液洗滌3次后，重懸于0.01M的pH4的磷酸緩沖液，然后加入0.2mg/ml的碳二亞胺，置室溫上下搖動4小時，以12000轉/分離心10分鐘，用0.1M的pH8.8的碳酸鹽緩沖液洗滌3次，重懸于0.01M的pH7.5的碳酸鹽緩沖液；2)向步驟1)得到的混合液中加入0.1mg/ml的多聚賴氨酸，置室溫上下搖動12小時，用0.1M的pH8.8的碳酸鹽緩沖液洗滌3次，重懸于0.01M的pH4的磷酸緩沖液，然后加入0.2mg/ml的碳二亞胺，置室溫上下搖動4小時；用0.1M的pH8.8的碳酸鹽緩沖液洗滌3次，重懸于0.01M的pH7.5的碳酸鹽緩沖液；3)向步驟2)得到的混合液中加入作為抗原的SARS冠狀病毒N蛋白0.2mg/ml，置室溫上下搖動12小時，用0.1M的pH8.8的碳酸鹽緩沖液洗滌3次后，重懸于0.1M的pH8.8的碳酸鹽緩沖液；加入50微升0.25M乙酰胺封閉多聚賴氨酸上未被抗原結合的羧基部分，加入乙酰胺后，置室溫上下搖動30分，以13000轉/分離心10分鐘，分出固體；4)重懸于1g/ml牛血清(BSA)和0.015M的pH7.5的碳酸鹽緩沖液，置室溫上下搖動30分，離心分出固體，得到用于檢測SARS抗體的、偶聯了作為抗原的SARS冠狀病毒N蛋白的免疫微球。
將此用于檢測SARS抗體的免疫微球依次分別用1％BSA、5％甘油、0.01％NaN3、0.01M的pH8.0的PBS緩沖液重懸，并用400w超聲波處理20秒，備用。
實施例3、偶聯了作為抗原的SARS冠狀病毒M蛋白的免疫微球的制備SARS冠狀病毒M蛋白抗原的制備及鑒定制備——用基因重組技術克隆、表達和純化SARS冠狀病毒M蛋白作為抗原用RT-PCR方法擴增SARS冠狀病毒M的基因片段，將該基因片段經測序證實基因序列正確無誤后，再將其克隆到表達載體如原核表達載體pQE30，或酵母表達載體pPICZαA，然后進行表達和蛋白純化。
鑒定——抗原純化后，通過以下試驗進行鑒定1)抗原蛋白含量測定取抗原1毫升用分光光度計測其蛋白含量，在其260nm和280nm處分別測OD值后，用公式280nmOdx1.45-260nmODx0.74即可計算抗原的蛋白含量1mg/ml左右；2)抗原蛋白純度測定取抗原20微升(含蛋白量5微克)走蛋白電泳即SDS-PAGE電泳，結果顯示為一條帶。
3)酶聯免疫試驗(ELISA)以2.5微克/毫升抗原200微升包被酶標微孔板，置4℃20小時后，棄去抗原包被液，加入5％小牛血清以封閉未被抗原包被的部分，置37℃1小時，經PBS-吐溫和PBS緩沖液洗滌后，加陽性病人血清，置37℃2小時，經PBS-吐溫和PBS緩沖液洗滌后加入最適工作濃度HRP標記的羊抗人IgG 200微升，置室溫2小時后，分別用PBS-吐溫和PBS緩沖液洗滌各3次，加入反應底物200微升，再495nm測定吸光度。
4)對照實驗用免疫微球10微升加入10微升抗體陽性血清和陰性血清，混勻后，陽性血清有凝集顆粒，陰性血清則無凝集。
免疫微球的制備1)將直徑為200納米的聚苯乙烯微球15mg/ml，用0.1M的pH8.8的碳酸鹽緩沖液洗滌3次后，重懸于0.01M的pH4的磷酸緩沖液，然后加入0.2mg/ml的碳二亞胺，置室溫上下搖動4小時，以12000轉/分離心10分鐘，用0.1M的pH8.8的碳酸鹽緩沖液洗滌3次，重懸于0.01M的pH7.5的碳酸鹽緩沖液；2)向步驟1)得到的混合液中加入0.1mg/ml的多聚賴氨酸，置室溫上下搖動12小時，用0.1M的pH8.8的碳酸鹽緩沖液洗滌3次，重懸于0.01M的pH4的磷酸緩沖液，然后加入0.2mg/ml的碳二亞胺，置室溫上下搖動4小時；用0.1M的pH8.8的碳酸鹽緩沖液洗滌3次，重懸于0.01M的pH7.5的碳酸鹽緩沖液；3)向步驟2)得到的混合液中加入作為抗原的SARS冠狀病毒M蛋白0.2mg/ml，置室溫上下搖動12小時，用0.1M的pH8.8的碳酸鹽緩沖液洗滌3次后，重懸于0.1M的pH8.8的碳酸鹽緩沖液；加入50微升0.25M乙酰胺封閉多聚賴氨酸上未被抗原結合的羧基部分，加入乙酰胺后，置室溫上下搖動30分，以13000轉/分離心10分鐘，分出固體；4)重懸于1g/ml牛血清(BSA)和0.015M的pH7.5的碳酸鹽緩沖液，置室溫上下搖動30分，離心分出固體，得到用于檢測SARS抗體的、偶聯了作為抗原的SARS冠狀病毒M蛋白的免疫微球。
將此用于檢測SARS抗體的免疫微球依次分別用1％BSA、5％甘油、0.01％NaN3、0.01M的pH8.0的PBS緩沖液重懸，并用400w超聲波處理20秒，備用。
實施例4、偶聯了作為抗原的SARS冠狀病毒E蛋白的免疫微球的制備SARS冠狀病毒E蛋白抗原的制備及鑒定制備——用基因重組技術克隆、表達和純化SARS冠狀病毒E蛋白作為抗原用RT-PCR方法擴增SARS冠狀病毒E的基因片段，將該基因片段經測序證實基因序列正確無誤后，再將其克隆到表達載體如原核表達載體pQE30，或酵母表達載體pPICZαA，然后進行表達和蛋白純化。
鑒定——抗原純化后，通過以下試驗進行鑒定1)抗原蛋白含量測定取抗原1毫升用分光光度計測其蛋白含量，在其260nm和280nm處分別測OD值后，用公式280nmOdx1.45-260nmODx0.74即可計算抗原的蛋白含量1mg/ml左右；2)抗原蛋白純度測定取抗原20微升(含蛋白量5微克)走蛋白電泳即SDS-PAGE電泳，結果顯示為一條帶。
3)酶聯免疫試驗(ELISA)以2.5微克/毫升抗原200微升包被酶標微孔板，置4℃20小時后，棄去抗原包被液，加入5％小牛血清以封閉未被抗原包被的部分，置37℃1小時，經PBS-吐溫和PBS緩沖液洗滌后，加陽性病人血清，置37℃2小時，經PBS-吐溫和PBS緩沖液洗滌后加入最適工作濃度HRP標記的羊抗人IgG 200微升，置室溫2小時后，分別用PBS-吐溫和PBS緩沖液洗滌各3次，加入反應底物200微升，再495nm測定吸光度。
4)對照實驗用免疫微球10微升加入10微升抗體陽性血清和陰性血清，混勻后，陽性血清有凝集顆粒，陰性血清則無凝集。
免疫微球的制備1)將直徑為200納米的聚苯乙烯微球15mg/ml，用0.1M的pH8.8的碳酸鹽緩沖液洗滌3次后，重懸于0.01M的pH4的磷酸緩沖液，然后加入0.2mg/ml的碳二亞胺，置室溫上下搖動4小時，以12000轉/分離心10分鐘，用0.1M的pH8.8的碳酸鹽緩沖液洗滌3次，重懸于0.01M的pH7.5的碳酸鹽緩沖液；2)向步驟1)得到的混合液中加入0.1mg/ml的多聚賴氨酸，置室溫上下搖動12小時，用0.1M的pH8.8的碳酸鹽緩沖液洗滌3次，重懸于0.01M的pH4的磷酸緩沖液，然后加入0.2mg/ml的碳二亞胺，置室溫上下搖動4小時；用0.1M的pH8.8的碳酸鹽緩沖液洗滌3次，重懸于0.01M的pH7.5的碳酸鹽緩沖液；3)向步驟2)得到的混合液中加入作為抗原的SARS冠狀病毒E蛋白0.2mg/ml，置室溫上下搖動12小時，用0.1M的pH8.8的碳酸鹽緩沖液洗滌3次后，重懸于0.1M的pH8.8的碳酸鹽緩沖液；加入50微升0.25M乙酰胺封閉多聚賴氨酸上未被抗原結合的羧基部分，加入乙酰胺后，置室溫上下搖動30分，以13000轉/分離心10分鐘，分出固體；4)重懸于1g/ml牛血清(BSA)和0.015M的pH7.5的碳酸鹽緩沖液，置室溫上下搖動30分，離心分出固體，得到用于檢測SARS抗體的、偶聯了作為抗原的SARS冠狀病毒E蛋白的免疫微球。
將此用于檢測SARS抗體的免疫微球依次分別用1％BSA、5％甘油、0.01％NaN3、0.01M的pH8.0的PBS緩沖液重懸，并用400w超聲波處理20秒，備用。
實施例5、用本發明提供的免疫微球檢測試劑檢測抗(SARS)抗體實驗方法
將被測血清樣品10微升滴在潔凈的玻片或透明塑料片上，加入5微升本發明提供的用于檢測SARS抗體的免疫微球，其中，實施例1～4制備的偶聯了作為抗原的SARS冠狀病毒S，N，M或E蛋白的免疫微球各占1/4，用竹簽、牙簽、塑料棒或其他物體攪拌，將待測樣品和免疫微球混勻并呈直徑1厘米的圓斑狀。
在黑色背景下，用肉眼或在顯微鏡下直接觀察凝集反應，并用下列符號記錄結果(-)無肉眼可見凝集顆粒；(+)肉眼可見細的凝集顆粒，背景混濁；(++)肉眼可見大的凝集顆粒，背景稍混濁；(+++)肉眼可見大而清晰凝集顆粒，背景清楚；(++++)肉眼可見大而清晰的凝集塊，背景清楚。
實驗樣品1)正常兔血清和分別免疫SARS病毒的S、N、M、E蛋白兔血清；2)正常人血清和SARS患者血清；實驗結果如圖2所示，在40倍顯微鏡下觀察，正常的兔血清與免疫微球呈陰性反應，可見均勻的微球顆粒；感染了SARS病毒的兔血清與免疫微球呈陽性反應，可見微球顆粒凝集呈塊。
如圖3所示，在10倍顯微鏡下觀察，正常人的血清與免疫微球(SARS CoV基因重組蛋白免疫微球是偶聯了SARS-S蛋白)呈陰性反應，可見均勻的微球顆粒；SARS病人的血清與免疫微球呈陽性反應，可見微球顆粒凝集呈塊。
對SARS患者樣品進行半定量測定抗體滴度，將被測血清倍比稀釋，按上法測定，以稀釋度為抗體滴度。觀察結果見圖3，其中，稀釋度為200倍時，仍為陽性(如圖1右圖)，稀釋度為1∶200時，呈陽性(如圖1左圖)，因此，該1∶200樣品的抗體滴度(即稀釋度)為1∶20。
SEQUENCE LISTING<110>中國科學院動物研究所<120>一種用于檢測SARS抗體的免疫微球及其制備方法和用途<130>FPI04040<150>CN 200410003420.1<151>2004-02-25<160>4<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1255<212>PRT<213>corona virus<400>1Met Phe Ile Phe Leu Leu Phe Leu Thr Leu Thr Ser Gly Ser Asp Leu1 5 10 15Asp Arg Cys Thr Thr Phe Asp Asp Val Gln Ala Pro Asn Tyr Thr Gln20 25 30His Thr Ser Ser Met Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Glu Ile Phe Arg35 40 45Ser Asp Thr Leu Tyr Leu Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Tyr Ser50 55 60Asn Val Thr Gly Phe His Thr Ile Asn His Thr Phe Asp Asn Pro Val65 70 75 80Ile Pro Phe Lys Asp Gly Ile Tyr Phe Ala Ala Thr Glu Lys Ser Asn85 90 95Val Val Arg Gly Trp Val Phe Gly Ser Thr Met Asn Asn Lys Ser Gln100 105 110Ser Val Ile Ile Ile Asn Asn Ser Thr Asn Val Val Ile Arg Ala Cys115 120 125Asn Phe Glu Leu Cys Asp Asn Pro Phe Phe Ala Val Ser Lys Pro Met130 135 140Gly Thr Gln Thr His Thr Met Ile Phe Asp Asn Ala Phe Asn Cys Thr145 150 155 160Phe Glu Tyr Ile Ser Asp Ala Phe Ser Leu Asp Val Ser Glu Lys Ser165 170 175Gly Asn Phe Lys His Leu Arg Glu Phe Val Phe Lys Asn Lys Asp Gly180 185 190Phe Leu Tyr Val Tyr Lys Gly Tyr Gln Pro Ile Asp Val Val Arg Asp195 200 205Leu Pro Ser Gly Phe Asn Thr Leu Lys Pro Ile Phe Lys Leu Pro Leu
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1.一種用于檢測SARS抗體的免疫微球，其為以聚苯乙烯微球為內核，其表面的羧基通過多聚賴氨酸偶聯了作為抗原的SARS冠狀病毒S，N，M或E蛋白，所述的聚苯乙烯微球為表面直徑為200～900納米，其表面有羧基修飾。
2.一種權利要求1所述的用于檢測SARS抗體的免疫微球的制備方法，是采用化學偶聯法將SARS冠狀病毒S，N，M或E蛋白作為抗原偶聯到微球，包括如下的步驟1)將聚苯乙烯微球15～20mg/ml，用0.1～0.5M的pH8.8～9.8的碳酸鹽緩沖液洗滌后，重懸于0.01～0.05M的pH4～5的磷酸緩沖液，然后加入2～4mg/ml的碳二亞胺，于室溫反應完全后，離心，用0.1～0.5M的pH8.8～9.8的碳酸鹽緩沖液洗滌，重懸于0.01～0.05M的pH7.5～8.5的碳酸鹽緩沖液；所述的聚苯乙烯微球直徑為200～900納米，其表面有羧基修飾；2)向步驟1)得到的混合液中加入0.2～2.4mg/ml的多聚賴氨酸，于室溫反應完全；用0.1～0.5M的pH8.8～9.8的碳酸鹽緩沖液洗滌后，重懸于0.01～0.05M的pH4～5的磷酸緩沖液，然后加入2～4mg/ml的碳二亞胺，于室溫反應完全；用0.1～0.5M的pH8.8～9.8的碳酸鹽緩沖液洗滌，重懸于0.01～0.05M的pH7.5～8.5的碳酸鹽緩沖液；3)向步驟2)得到的混合液中加入作為抗原的SARS冠狀病毒S，N，M或E蛋白0.2～2.4mg/ml，于室溫反應完全；用0.1～0.5M的pH8.8～9.8的碳酸鹽緩沖液洗滌后，重懸于0.1～0.5M的pH8.8～9.8的碳酸鹽緩沖液；加入50～200微升0.25M乙酰胺，于室溫反應完全后，離心分出固體；4)重懸于1g/ml牛血清(BSA)和0.01～0.05M的pH7.5～8.5的碳酸鹽緩沖液，于室溫反應完全后，離心分出固體，得到用于檢測SARS抗體的免疫微球。
3.一種權利要求1所述的用于檢測SARS抗體的免疫微球的用途，該免疫微球可以作為檢測試劑檢測抗SARS抗體。
全文摘要
本發明涉及一種用于檢測SARS抗體的免疫微球，及其制備方法和用途。該免疫微球是以表面有羧基修飾的聚苯乙烯微球為內核，其表面的羧基通過多聚賴氨酸化學偶聯了作為抗原的SARS冠狀病毒S，N，M或E蛋白。該免疫微球可以作為檢測試劑檢測抗SARS抗體。本發明提供的用于檢測SARS抗體的免疫微球與現有技術相比，其敏感性和特異性好，準確性高，避免了PCR診斷試劑盒的假陽性的缺點；整個檢測過程快速；檢測不需要任何儀器設備，經濟實用，適合廣大基層衛生防疫單位使用。
文檔編號G01N33/531GK1661372SQ20041007014
公開日2005年8月31日 申請日期2004年8月3日 優先權日2004年2月25日
發明者陳佺, 楊建國, 朱玉山, 顧瑩, 邢娟, 金海京, 王曉惠 申請人:中國科學院動物研究所