專利名稱：一種檢測肉毒毒素的免疫層析試紙及其制備方法
技術領域：
本發明涉及一種肉毒毒素的檢測試紙及其制備方法，特別涉及一種檢測肉毒毒素的免疫層析試紙及其制備方法。
背景技術：
肉毒毒素(Botulinum toxins)是肉毒梭狀芽孢桿菌(Clostridium botulinum)在無氧條件下產生的外毒素，是天然物質中毒力最強的嗜神經毒素。根據抗原性的不同分為A-G7個型，其中A、B、E型主要引起人類中毒，而且以A型肉毒毒素毒力最強，C型則主要引起動物中毒。肉毒毒素作為經典的生物戰劑，被列入國際禁止生物武器公約核查清單。9.11以后，又被美國列為最有可能用于進行生物恐怖活動的生物劑。
肉毒毒素檢測最經典的方法是小鼠致死及中和試驗，目前仍是最敏感、可信的方法。但該方法比較繁瑣和耗時，不適于現場和臨床使用。
分子生物學和免疫學檢測是另外的兩類方法，前者有基因探針和PCR，用于檢測肉毒梭菌；后者包括放射免疫、反向血凝、反向乳膠凝集、酶聯免疫吸附(ELISA)等方法，用于檢測肉毒毒素，表1為不同免疫學方法檢測肉毒毒素的比較(Szilagyi M，Rivera VR，Neal D，Merrill GA，Poli MA Development of sensitive colorimetriccapture elisas for Clostridium botulinum neurotoxin serotypes A and B.Toxicon2000 Mar；38(3)381-9)。
表1.不同免疫學方法檢測肉毒毒素的比較檢測方法可檢測物敏感性 特異性放射免疫血清樣品＞20ng/ml100％反向血球凝集污染食物10ng/ml ＞90％反向乳膠凝集污染食物4-8ng/ml酶聯免疫吸附污染食物5ng/ml另外，不同標本用不同方法檢測肉毒毒素的敏感性也有差別，如表2顯示小鼠致死試驗和ELISA在檢測不同標本中的差異同一份生薯條標本中，小鼠致死實驗檢測出肉毒毒素104MLD/g，而ELISA測出5×105MLD/g；熟薯條中分別為106MLD/g和105MLD/g；嘔吐物測出結果是一致的，均為100MLD/g，而培養上清又分別為105MLD/ml和104MLD/ml，說明這些方法的敏感性受標本類型的影響(Ferreira JL，Eliasberg SJ，Harrison MA，Edmonds P.Detection of preformed type A botulinal toxin in hashbrown potatoes by using the mouse bioasssay and a modified ELISA test.J AOACInt 2001 Sep-Oct；84(5)1460-4)。
表2.小鼠致死試驗和ELISA在檢測不同標本中肉毒毒素的差異標本類型小鼠致死實驗(MLD)ELISA(MLD)生薯條 1×1045×104熟薯條 106105嘔吐物 102102培養上清1071041ng肉毒毒素相當5×105MLD(最小致死量)發明內容本發明的目的是提供一種檢測肉毒毒素的免疫層析試紙。
本發明所提供的檢測肉毒毒素的免疫層析試紙，包括吸水紙墊、緊密連接于所述吸水紙墊的包被有抗肉毒抗體的纖維膜、緊密連接于所述纖維膜上的含有抗肉毒抗體的免疫金膠體探針的金標墊和緊密連接于所述金標墊的樣品墊。
為了使用更加方便，所述吸水紙墊的下面還緊密連接有背板。背板的材料優選的是塑料。
本發明的另一個目的是提供制備上述檢測肉毒毒素的免疫層析試紙的方法。
本發明所提供的制備檢測肉毒毒素的免疫層析試紙的方法，包括以下步驟1)制備抗肉毒抗體；將抗肉毒抗體溶液噴到纖維膜上，室溫晾干，然后將其粘貼在吸水紙墊上；2)制備抗肉毒抗體的免疫膠體金探針溶液；將玻璃纖維膜或樹脂浸泡到該免疫膠體金探針溶液，得到金標墊，干燥后粘貼在步驟1)得到的粘貼在吸水紙墊上的噴有抗肉毒抗體的纖維膜上；3)在步驟2)中的金標墊上面再粘貼樣品墊，得到檢測肉毒毒素的免疫層析試紙。
為了使用更加方便，所述吸水紙墊的下面還粘貼有背板。
在本發明所提供的檢測肉毒毒素的免疫層析試紙及其制備方法中，所述抗肉毒抗體按如下方法制備皮下多點注射家兔(2ml/只)毒素0.25mg+福氏完全佐劑免疫，10天后追加免疫，共追加2次，末次追加后10天抽血。
而抗肉毒抗體的免疫金膠體探針的制備方法如下1)將0.01％HAuCl4水溶液，加熱煮沸，每100ml HAuCl4溶液進行如下操作攪動下加入1.5ml的1％檸檬酸三鈉水溶液，直到液體顏色穩定成葡萄酒紅色，得到膠體金溶液；2)確定最低偶聯抗體濃度調節膠體金溶液pH9.0，將抗肉毒抗體稀釋為不同濃度，分別取5ul、10ul、15ul、20ul、25ul加入到1ml膠體金溶液中，混勻后于室溫下放置5min，加入10％NaCl水溶液0.1ml，混勻，靜置，10-20min后觀察液體顏色，膠體金溶液顏色不變時所含最少抗體量，為穩定1ml膠體金溶液所需最低偶聯抗體量；3)將120％上述最低偶聯抗體量的抗肉毒抗體加入到50ml膠體金溶液中，混勻后得到抗肉毒抗體的免疫膠體金探針溶液。
在實際應用中，所述纖維膜為硝酸纖維膜，寬度控制在2.5-3mm為宜；所述金標墊的材料為玻璃纖維膜、聚脂等，寬度為5-7mm；所述樣品墊為玻璃纖維膜，寬度為20-30mm。
A型肉毒對人具有極強的神經毒性，經口的絕對致死量約為0.3mg。利用本發明所研制的膠體金ICA檢測試紙檢測肉毒，非專業人員按照說明書即可操作，標本處理簡單，5分鐘內觀察結果，最少可檢出A型肉毒2ng/ml，檢測靈敏度不受標本來源的影響。該肉毒毒素免疫檢測試紙具有簡便性、敏感性、特異性和快速性的優點，適于臨床和現場使用。
具體實施例方式
實施例1、檢測肉毒毒素的免疫層析試紙的制備材料氯金酸(HAuCl4·4H2O)，分析純，上海試劑一廠；檸檬酸三鈉(Na3C6H5O7·2H2O)，分析純，北京化工廠；A型肉毒，蘭州生物制品研究所，110U/支；牛血清白蛋白(BSA)，分析純，進口分裝聚乙二醇(PEG)，分析純，進口分裝硝酸纖維膜，購于美國Millipore公司，HF B 504；玻璃纖維膜，購于南京雙威實業公司；1、制備抗肉毒抗體皮下多點注射家兔(2ml/只)毒素0.25mg+福氏完全佐劑免疫，10天后追加免疫，共追加2次，末次追加后10天抽血。
2、制備免疫膠體金探針1)將HAuCl4配制成0.01％水溶液，取100ml加熱至沸騰，攪動下準確加入1.5ml的1％檸檬酸三鈉(Na3C6H5O7·2H2O)水溶液，液體顏色穩定成葡萄酒紅色，即得到膠體金溶液。
2)確定最低偶聯抗體濃度調節膠體金溶液pH9.0，將抗肉毒抗體稀釋為不同濃度，分別取5ul、10ul、15ul、20ul、25ul加入到1ml膠體金溶液中，混勻后于室溫下放置5min，加入10％NaCl水溶液0.1ml，混勻，靜置，10-20min后觀察液體顏色，膠體金溶液顏色不變時所含最少抗體量，即為穩定1ml膠體金所需抗體的最低濃度。
3)將120％上述最低偶聯抗體量的抗肉毒抗體加入到50ml膠體金溶液中，混勻后即得免疫膠體金探針溶液。
3、膠體金顆粒與免疫金探針的電鏡觀察于透射電鏡下，可見膠體金顆粒呈圓形或橢圓形，大小均勻一致，計數100個金顆粒，顆粒直徑約為25nm；膠體金偶聯抗體后，可見金顆粒外圍有明顯的低電子密度暈圈，表面吸附有蛋白。結果表明，按照以上技術路線制備的膠體金顆粒和免疫金探針合格。
4、檢測肉毒毒素的免疫層析試紙的制備檢測肉毒毒素的免疫層析試紙由吸水紙墊、硝酸纖維膜、金標墊和玻璃纖維膜樣品墊四部分組成。
用濃度為0.01M，pH7.0-pH7.5的PBS稀釋抗肉毒抗體到7mg/ml，用BioDot公司XYZ3000點樣儀噴到2.5mm寬的NC膜上，室溫晾干，然后將其用雙面膠粘貼在吸水紙墊上；將5-7mm寬的玻璃纖維膜浸泡到制備好的免疫膠體金探針溶液中制備成金標墊，4℃放置30min，-50℃冷凍抽干后，將該金標墊用雙面膠粘貼在上述包被有抗肉毒抗體的硝酸纖維膜上，再在該金標墊上面用雙面膠粘貼25mm寬的玻璃纖維膜樣品墊，最后將它們用雙面膠粘貼在塑料背板上，按所需大小切割，即為檢測肉毒毒素的免疫層析試紙，加干燥劑后密封保存。
實施例2、肉毒檢測試驗1、ICA試紙檢出A型肉毒的敏感性以蘭州生物制品研究所生產的精制注射用A型肉毒為標準，經生理鹽水有限稀釋后，作為樣品檢測液，取肉毒ICA檢測試紙，分別浸入不同肉毒濃度樣品檢測液中，2分鐘后開始觀察結果，15分鐘觀察終止。結果報告出現1條紅色(對照)沉淀線為陰性，即無A型肉毒檢出；出現2條紅色(樣品和對照)沉淀線為陽性，即有A型肉毒檢出。
本發明所提供的肉毒ICA試紙可檢出20U/ml，即20LD50(約2ng/ml)。文獻報道，ELISA方法檢測A型肉毒純品的敏感性為100DLM(最小致死量)，ICA試紙有更高的敏感性。
2、ICA檢測試紙對B型和E型肉毒的檢出以及與A型和B型腸毒素的交叉反應將粗制的B型和E型肉毒毒素，以及金黃色葡萄球菌A型和B型腸毒素稀釋成不同濃度100ug/ml、50ug/ml、25ug/ml、12.5ug/ml、6.25ug/ml，用ICA試紙檢測，結果表明，該試紙能檢測出少于10ug/ml B型和E型肉毒，并且不與A型腸毒素(168ug/ml)和B型腸毒素(50ug/ml)交叉。
引起人類中毒的A、B、E型肉毒中，A型占95％以上，各型肉毒間存在交叉抗原，我們在ICA試紙制備中采用的是抗肉毒多抗，所以除能檢出A型肉毒外，還能檢出B型和E型肉毒，這也是臨床和現場檢測所需要的。
3、模擬標本中的肉毒檢測選用幾種常見肉毒中毒食品，如火腿腸、腐乳、豆豉、蘑菇、牛奶和普通肉湯培養基等用于制備模擬標本。先分別稱取火腿腸、腐乳、豆豉和蘑菇各2g，土壤1g，搗碎置容器中，加入5ml無菌生理鹽水，充分攪拌混勻，靜置沉淀，牛奶1∶4稀釋，普通肉湯用原液。每種樣品一式4份，1份取上清用作陰性對照，其他3份分別加入濃度為32ng/ml、16ng/ml、8ng/ml的A型肉毒，作為模擬陽性標本。
ICA試紙檢測模擬標本中A型肉毒的結果如表1所示。除土壤標本需離心外，其它標本按上述采樣及處理后，可直接用于檢測，ICA試紙檢測的特異性不受標本來源的影響；從表中可以看出，檢測腐乳敏感性為4ng/g，火腿腸、蘑菇為8ng/g，豆豉為16ng/g，檢測牛奶、血清和普通肉湯分別為128ng/ml、64ng/ml和16ng/ml。
表1.ICA試紙檢測模擬標本中A型肉毒處理方法陰性對照 32ng/ml 16ng/ml 8ng/ml火腿腸 2g+5ml生理鹽水 - +- -腐乳 2g+5ml生理鹽水 - ++ -豆豉 2g+5ml生理鹽水 - ++ -蘑菇 2g+5ml生理鹽水 - +- -牛奶 1∶4稀釋 - +- -血清 1∶2稀釋 - +- -普通肉湯 原液 - ++ -土壤 1g+5ml生理鹽水 - ++ -
權利要求
1.一種檢測肉毒毒素的免疫層析試紙，包括吸水紙墊、緊密連接于所述吸水紙墊的包被有抗肉毒抗體的纖維膜、緊密連接于所述纖維膜上的含有抗肉毒抗體的免疫金膠體探針的金標墊和緊密連接于所述金標墊的樣品墊。
2.根據權利要求1所述的檢測肉毒毒素的免疫層析試紙，其特征在于所述吸水紙墊的下面還緊密連接有背板。
3.根據權利要求1所述的檢測肉毒毒素的免疫層析試紙，其特征在于所述抗肉毒抗體按如下方法制備皮下多點注射毒素0.25mg+福氏完全佐劑免疫，10天后追加免疫，共追加2次，末次追加后10天抽血。
4.根據權利要求1所述的檢測肉毒毒素的免疫層析試紙，其特征在于所述抗肉毒抗體的免疫金膠體探針按如下過程制備1)將0.01％HAuCl4水溶液，加熱煮沸，每100ml HAuCl4溶液進行如下操作攪動下加入1.5ml的1％檸檬酸三鈉水溶液，直到液體顏色穩定成葡萄酒紅色，得到膠體金溶液；2)確定最低偶聯抗體濃度調節膠體金溶液pH9.0，將抗肉毒抗體稀釋為不同濃度5ul、10ul、15ul、20ul、25ul，分別取加入到1ml膠體金溶液中，混勻后于室溫下放置5min，加入10％NaCl水溶液0.1ml，混勻，靜置，10-20min后觀察液體顏色，膠體金溶液顏色不變時所含最少抗體量，為穩定1ml膠體金溶液所需最低偶聯抗體量；3)將120％上述最低偶聯抗體量的抗肉毒抗體加入到50ml膠體金溶液中，混勻后得到抗肉毒抗體的免疫膠體金探針溶液。
5.根據權利要求1或2所述的檢測肉毒毒素的免疫層析試紙，其特征在于所述纖維膜為硝酸纖維膜、醋酸纖維膜；所述金標墊的材料為玻璃纖維膜、樹脂；所述樣品墊為玻璃纖維膜。
6.一種制備檢測肉毒毒素的免疫層析試紙的方法，包括以下步驟1)制備抗肉毒抗體；將抗肉毒抗體溶液噴到纖維膜上，室溫晾干，然后將其粘貼在吸水紙墊上；2)制備抗肉毒抗體的免疫膠體金探針溶液；將玻璃纖維膜或樹脂浸泡到該免疫膠體金探針溶液，得到金標墊，干燥后粘貼在步驟1)得到的粘貼在吸水紙墊上的噴有抗肉毒抗體的纖維膜上；3)在步驟2)中的金標墊上面再粘貼樣品墊，得到檢測肉毒毒素的免疫層析試紙。
7.根據權利要求6所述的制備檢測肉毒毒素的免疫層析試紙的方法，其特征在于所述吸水紙墊的下面還粘貼有背板。
8.根據權利要求6或7所述的制備檢測肉毒毒素的免疫層析試紙的方法，其特征在于所述抗肉毒抗體按如下方法制備皮下多點注射毒素0.25mg+福氏完全佐劑免疫，10天后追加免疫，共追加2次，末次追加后10天抽血。
9.根據權利要求6或7所述的制備檢測肉毒毒素的免疫層析試紙的方法，其特征在于所述抗肉毒抗體的免疫金膠體探針按如下過程制備1)將0.01％HAuCl4水溶液，加熱煮沸，每100ml HAuCl4溶液進行如下操作攪動下加入1.5ml的1％檸檬酸三鈉水溶液，直到液體顏色穩定成葡萄酒紅色，得到膠體金溶液；2)確定最低偶聯抗體濃度調節膠體金溶液pH9.0，將抗肉毒抗體稀釋為不同濃度，分別取5ul、10ul、15ul、20ul、25ul加入到1ml膠體金溶液中，混勻后于室溫下放置5min，加入10％NaCl水溶液0.1ml，混勻，靜置，10-20min后觀察液體顏色，膠體金溶液顏色不變時所含最少抗體量，為穩定1ml膠體金溶液所需最低偶聯抗體量；3)將120％上述最低偶聯抗體量的抗肉毒抗體加入到50ml膠體金溶液中，混勻后得到抗肉毒抗體的免疫膠體金探針溶液。
10.根據權利要求6或7所述的制備檢測肉毒毒素的免疫層析試紙的方法，其特征在于所述纖維膜為硝酸纖維膜、醋酸纖維膜；所述金標墊的材料為玻璃纖維膜、樹脂；所述樣品墊為玻璃纖維膜。
全文摘要
本發明公開了一種檢測肉毒毒素的免疫層析試紙及其制備方法。本發明所提供的檢測肉毒毒素的免疫層析試紙，包括吸水紙墊、緊密連接于所述吸水紙墊的包被有抗肉毒抗體的纖維膜、緊密連接于所述纖維膜上的含有抗肉毒抗體的免疫金膠體探針的金標墊和緊密連接于所述金標墊的樣品墊。為了使用方便，所述吸水紙墊的下面還緊密連接有背板。利用本發明所提供的免疫層析試紙檢測肉毒，非專業人員按照說明書即可操作，標本處理過程簡單，5分鐘內觀察結果，最少可檢出A型肉毒2ng/ml，檢測靈敏度不受標本來源的影響。該肉毒毒素免疫檢測試紙具有簡便性、敏感性、特異性和快速性的優點，適于臨床和現場使用。
文檔編號G01N33/531GK1632587SQ20041006935
公開日2005年6月29日 申請日期2004年7月19日 優先權日2004年7月19日
發明者端青, 左庭婷, 鄭玉玲, 姜永強 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院微生物流行病研究所