專利名稱：酶法測定鋅離子含量的方法及鋅離子診斷試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及酶法測定血清、血漿等樣品中鋅離子含量的方法，以及應用該方法配制而成的鋅離子診斷試劑盒，屬于醫學檢驗測定技術領域。
背景技術：
鋅元素與生物的生長發育有關，具有重要的生理功能、營養作用和臨床診療意義。測定血清中鋅離子含量及Cu2+/Zn2+比值，對評價機體鋅元素的營養狀況和診療許多疾病均具有重要的實用價值。
現有技術中鋅離子的測定方法有絡合滴定法、熒光光度法、比色法、極譜法、原子吸收分光光度法、陽極溶出伏安法和中子活化法等。絡合滴定法耗時費力，標本用量大，特異性低；熒光光度法操作簡單，但需要具備熒光光度計；極譜法中，單掃描示波極譜儀操作簡便，特異性較好，一些實驗室采用這種小型儀器檢測鋅離子；陽極溶出伏安法是利用沉積在電極上的鋅溶出之后，檢測其陽極電流強度，該電流強度與鋅的濃度成正比；原子吸收分光光度法(AAS法)，具有特異性高(干擾小)、檢出限低(樣品量少)、精密度好(CV≤3.6％)、回收率高(達到99％)、準確度高等優點，能夠最為準確地分析樣品中鋅元素的含量，其操作方法也比較簡單，但儀器價格十分昂貴。
相對而言比色法應用較為普遍。該方法檢測鋅離子快速、靈敏度高，能夠得到與AAS法近似的結果，但操作步驟較為復雜。比色法一般都要加入鹽酸胍或者三氯醋酸等物質，使鋅離子及其它金屬離子從蛋白結合物中釋放出來；加入氰化物作掩蔽劑，使其絡合除了鋅離子之外的其它金屬離子；加入水合氯醛作為暴露劑，并避免氰化物與鋅離子絡合，使鋅離子能夠特異地與吡啶偶氮酚類化合物反應顯色。常用的顯色劑及其與鋅離子絡合后在最大吸收峰的摩爾吸光系數(單位L·mol-1·cm-1)為1-(2-吡啶偶氮)-2-萘酚，56,000；1-[(5-氯-2-吡啶)偶氮]-2-萘酚，69,000；4-(2-吡啶偶氮)間苯二酚，84,000；2-(5-溴-2-吡啶偶氮)-5-二乙基氨基酚，120,000；2-(5-溴-2-吡啶偶氮)-5-(N-n丙基-N-3-磺化丙氨基)酚，130,000。
酶法測定鋅離子是近年來發展起來的新方法。該方法操作最為方便、易于自動化，且價格低廉、特異性高、精密度好，是非常適合國情、應用前景十分看好的一種檢測方法。但是，應用不同的檢測試劑和測試路線，檢測的靈敏度、檢測結果的準確性會有很大差別，直接影響到該方法的使用與推廣，這正是人們在該領域內不斷研究、發展和創新的原因所在。
發明內容
本發明的目的是提供一種酶法測定鋅離子含量的方法，以及應用該方法配制而成的鋅離子診斷試劑盒。采用該試劑盒中的試劑，能夠利用紫外/可見光分析儀或者半自動/全自動生化分析儀對血漿、血清等樣品中鋅離子的含量進行快速、準確測定，以便推廣使用酶法檢測鋅離子的方法以及相應的診斷試劑盒，使該領域內檢測手段得到進一步豐富和發展。
為實現本發明的目的之一，一種酶法測定鈉離子含量的方法，采用以下步驟進行首先，將需要測定的樣品與含有4-硝基酚磷酸和堿性磷酸酶的試劑混勻，使之發生以下反應，
然后，將反應混合物置于紫外/可見光分析儀或者半自動/全自動生化分析儀下，檢測主波長405nm的吸光度的上升速度，進而測算出樣品中鋅離子的含量。
測定過程中，被測樣品與試劑的使用比例按體積控制在1∶10～1∶500，反應溫度控制在20℃～50℃，反應時間控制在2～30分鐘，檢測時設定副波長在505nm以上。
實現本發明另外一個目的——鋅離子診斷試劑盒，可以是由以下成分組成的單劑緩沖液 40～200mmol/l，4-硝基酚磷酸 1～50mmol/l，堿性磷酸酶 4000～60000U/l，穩定劑/試劑總體積 10～80％。
也可以將以上單劑中的成分進行組合配制成雙劑，使試劑更為穩定，比如 雙劑配方不僅僅限于上述表中所列，其中試劑I和試劑II中成分可以互換，從而形成多種配方。
以上配制鋅離子診斷試劑盒時，選擇緩沖液的基本要求是PH值在6.0～11.0范圍之內，可以是“三羥甲基氨基甲烷～鹽酸(Tris-HCl)緩沖液”、“三乙醇胺(Triethanolamine)緩沖液”、“2-氨基-2-甲基-1-丙醇(2-Amino-2-methyl-1-propanol)緩沖液”、“咪唑～鹽酸(Imidazole-HCl)緩沖液”、“雙甘氨肽(Glycylglycine)緩沖液”、“檸檬酸～檸檬酸鈉緩沖液”、“巴比妥鈉～鹽酸緩沖液”、“碳酸鈉～碳酸氫鈉緩沖液”、“硼酸～硼砂緩沖液”、“甘氨酸～氫氧化鈉緩沖液”、“硼砂～氫氧化鈉緩沖液”、“磷酸(Phosphate)緩沖液”或者“磷酸鹽(Phosphate-Sodium Chloride，PBS)緩沖液”中的至少一種，但緩沖液的選擇范圍并不受這些列舉所限制。
此外，為減少各試劑成分之間的交叉影響、保持試劑的穩定性，以便長期儲存，以上單劑、雙劑的試劑I/試劑II當中通常加入穩定劑，其用量約占所在試劑總體積的10～80％(或者濃度在10～50mmol/l范圍之內)。用作穩定劑的物質可以是乙二醇、丙二醇、甘油、硫酸銨、硫基乙醇、葡萄糖、腺苷二磷酸、牛血清白蛋白、碳酸鹽、膽酸鹽、葡聚糖、乙二胺四乙酸、黃素腺嘌呤二核苷酸、黃素單核苷酸、谷氨酸鹽、還原型谷胱甘肽、乳糖、甘露醇、丁二酸鹽或者氯化鈉中的至少一種，但選擇范圍同樣不受這些列舉所限制。
研究表明，從測定結果的準確性和配制成本的經濟性兩方面綜合考慮，無論是單劑還是雙劑，如下配方成分關系的診斷試劑盒較為理想，也是本發明的優選方案緩沖液 80～120mmol/l，4-硝基酚磷酸 5～15mmol/l，堿性磷酸酶 14000～30000U/l，穩定劑/試劑總體積 20～50％。
本發明應用堿性磷酸酶反應比色法，在鋅離子的激活下，堿性磷酸酶酶解4-硝基酚磷酸(4-Nitrophenyl Phosphate)成為4-硝基酚和磷酸根。4-硝基酚在405nm有吸收峰，從而使得405nm處的吸光度上升，反應所引起的吸光度變化與樣品中鋅離子的含量成正比。這樣，通過在固定時間間隔內測定主波長405nm處吸光度的上升速度，便能定量反映出樣品中鋅離子的含量。
本發明技術方案的突出的實質性特點和顯著的進步主要表現在(1)本發明完全利用酶學方法，酶解反應具有特異性高的特點，通過鋅離子激活堿性磷酸酶的特性，定量反映出被測樣品中鋅離子的含量，測試結果準確，不受樣品中是否存在其它金屬離子的影響；(2)參與酶反應的成分都是外加的，不受內、外源物質的污染，測試過程精確度高；(3)該方法簡便、易操作，可快速得到檢測結果，而且反應是在緩沖液條件下進行，不會污染環境；(4)該方法在普通紫外/可見光分析儀或者半自動/全自動生化分析儀上便可快速檢測，不需要特殊或額外儀器，測試成本低廉，便于行業內推廣應用；(5)應用本發明提供的測定方法可以制成液態試劑、干粉試劑、干試劑等多種形式的試劑，主要用于測定人體和其它動物體內鋅離子的含量，也可以結合稀釋、濃縮等輔助手段來測定其它樣品中的鋅離子；(6)本發明提供的液態鋅離子診斷試劑盒，穩定性好，存在于其中的各種成分的三維空間結構保持完整，很好地保證了應用測試效果。配成雙劑以后，能夠進一步降低各成分之間的交叉影響，檢測結果更加可信，試劑更為穩定，可以長時間儲存。
具體實施例方式
下面結合具體實施例對本發明技術方案作進一步說明。這些例子僅是一些應用范例，不能理解為對本發明權利要求保護范圍的一種限制。
實施例一(單劑)按以下成分和用量配制鋅離子診斷試劑盒雙甘氨肽緩沖液 80mmol/l，4-硝基酚磷酸 5mmol/l，堿性磷酸酶 14000U/l，乙二醇 50％(占試劑總體積)。
在全自動生化分析儀(日立-7080)上設定溫度37℃、反應時間10分鐘、測試主波長405nm、測試副波長505nm以上，被測鋅離子樣品與試劑的體積比例為1∶25，反應方向為正反應(吸光度上升，下同)。
加入樣品和配成的單劑，兩者在分析儀內部自動混勻，檢測、記錄405nm吸光度的上升情況。根據速率法、終點法等方法，對照相應的標準曲線測算出樣品中鋅離子的含量。對同一批樣品多次重復以上過程，測試結果重復性好、精確度高。
實施例二(雙劑例之一)按以下成分和用量配制鋅離子診斷試劑盒試劑I——咪唑～鹽酸緩沖液 100mmol/l，4-硝基酚磷酸 10mmol/l，甘油 50％(占試劑I總體積)；試劑II——咪唑～鹽酸緩沖液 100mmol/l，堿性磷酸酶 20000U/l，乙二醇 50％(占試劑II總體積)。
在全自動生化分析儀(日立-7080)上設定溫度30℃、反應時間15分鐘、測試主波長405nm、測試副波長505nm以上，被測鋅離子樣品與試劑I和試劑II的總體積之比為1∶25，試劑I與試劑II的用量之比為4∶1，反應方向為正反應。
先加入樣品和試劑I，5分鐘之后加入試劑II，三者在分析儀內部自動混勻，檢測、記錄405nm吸光度的上升情況。根據速率法、終點法等方法，對照相應的標準曲線測算出樣品中鋅離子的含量。對同一批樣品多次重復以上過程，測試結果重復性好、精確度高。
實施例三(雙劑例之二)按以下成分和用量配制鋅離子診斷試劑盒
試劑I——咪唑～鹽酸緩沖液 100mmol/l，堿性磷酸酶 25000U/l，甘油 50％(占試劑I總體積)；試劑II——咪唑～鹽酸緩沖液 100mmol/l，4-硝基酚磷酸 12mmol/l，丙二醇 20mmol/l。
在全自動生化分析儀(日立-7080)上設定溫度37℃、反應時間10分鐘、測試主波長405nm、測試副波長505nm以上，被測鋅離子樣品與試劑I和試劑II的總體積之比為1∶25，試劑I與試劑II的用量之比為4∶1，反應方向為正反應。
先加入樣品和試劑I，5分鐘之后加入試劑II，三者在分析儀內部自動混勻，發生以下原理性反應
檢測、記錄405nm主波長吸光度的上升情況。根據速率法、終點法等方法，對照相應的標準曲線測算出樣品中鋅離子的含量。對同一批樣品多次重復以上過程，測試結果重復性好、精確度高。
總之，實驗證明采用本發明的測定方法，完全可以通過紫外/可見光分析儀或者半自動/全自動生化分析儀器，測定出樣品的中鋅離子的含量，測試靈敏度高、精確度好，不受樣品中是否存在其它金屬離子的影響，也不受內、外源物質的污染。而且，本發明提供的鋅離子診斷試劑盒，穩定性好，長時間存放之后仍然能夠準確檢測各種類型樣品中鋅離子的含量。
權利要求
1.一種酶法測定鋅離子含量的方法，包括以下步驟①將待測樣品與含有4-硝基酚磷酸和堿性磷酸酶的試劑混勻，使之發生以下反應，②將反應混合物置于紫外/可見光分析儀或者半自動/全自動生化分析儀下，檢測主波長405nm的吸光度的上升速度，測算出樣品中鋅離子的含量。
2.根據權利要求1所述的酶法測定鋅離子含量的方法，其特征在于待測樣品與試劑的使用比例按體積控制在1∶10～1∶500。
3.根據權利要求1或2所述的酶法測定鋅離子含量的方法，其特征在于反應溫度控制在20℃～50℃，反應時間控制在2～30分鐘，檢測時設定副波長在505nm以上。
4.一種鋅離子診斷試劑盒，盒中試劑由以下成分組成緩沖液40～200mmol/l，4-硝基酚磷酸 1～50mmol/l，堿性磷酸酶4000～60000U/l，穩定劑/試劑總體積 10～80％。
5.根據權利要求4所述的鋅離子診斷試劑盒，其特征在于所述緩沖液的PH范圍是6.0～11.0。
6.根據權利要求5所述的鋅離子診斷試劑盒，其特征在于所述緩沖液是“三羥甲基氨基甲烷～鹽酸緩沖液”、“三乙醇胺緩沖液”、“2-氨基-2-甲基-1-丙醇緩沖液”、“咪唑～鹽酸緩沖液”、“雙甘氨肽緩沖液”、“檸檬酸～檸檬酸鈉緩沖液”、“巴比妥鈉～鹽酸緩沖液”、“碳酸鈉～碳酸氫鈉緩沖液”、“硼酸～硼砂緩沖液”、“甘氨酸～氫氧化鈉緩沖液”、“硼砂～氫氧化鈉緩沖液”、“磷酸緩沖液”或者“磷酸鹽緩沖液”中的至少一種。
7.根據權利要求4所述的鋅離子診斷試劑盒，其特征在于所述穩定劑為乙二醇、丙二醇、甘油、硫酸銨、硫基乙醇、葡萄糖、腺苷二磷酸、牛血清白蛋白、碳酸鹽、膽酸鹽、葡聚糖、乙二胺四乙酸、黃素腺嘌呤二核苷酸、黃素單核苷酸、谷氨酸鹽、還原型谷胱甘肽、乳糖、甘露醇、丁二酸鹽或者氯化鈉中的至少一種。
8.權利要求4～7中任意一種鋅離子診斷試劑盒，其特征在于所述試劑配成單劑或雙劑。
全文摘要
本發明涉及酶法測定鋅離子含量的方法及鋅離子診斷試劑盒。發明應用堿性磷酸酶反應比色法，在鋅離子的激活下，堿性磷酸酶酶解4－硝基酚磷酸生成4－硝基酚，通過檢測405nm主波長吸光度的上升速度，定量反映出樣品中鋅離子的含量。該方法特異性高，不受樣品中其它金屬離子的影響，也不受內、外源物質的污染，測試結果精確、準確性好。將診斷試劑盒制成雙劑可減少各成分的交叉影響，保持試劑的穩定性，便于長期儲存。該方法在普通紫外/可見光分析儀或者半自動/全自動生化分析儀上便可快速檢測，不需要特殊或額外儀器，測試成本低廉，便于行業內推廣應用。
文檔編號G01N21/31GK1786695SQ200410066189
公開日2006年6月14日 申請日期2004年12月10日 優先權日2004年12月10日
發明者王爾中 申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司