專利名稱：電化學定量聚合酶鏈式反應檢測芯片的制備和檢測方法
技術領域：
本發明涉及一種核酸定量聚合酶鏈式反應(PCR)芯片的電化學檢測技術，該新型的電化學PCR檢測芯片和檢測方法可用于生物科學和醫學領域中多種核酸的并行定量擴增檢測。
背景技術：
隨著生命科學的發展，基因組的研究逐漸深入，從基因水平上認識生命的差異、疾病發生、發展的規律、以及藥物與生命體的相互作用將成為可能。核酸序列信息的高通量檢測和分析技術將成為醫學等生命科學領域的核心技術之一。人們需要發展高通量、準確、低成本基因信息的檢測方法。近來，基因芯片技術越來越受到人們的重視。但是，目前基因芯片技術在臨床監測和診斷應用中尚存在瓶頸問題，嚴重影響其在生物學和醫學臨床中的實際應用。1)首先是定量檢測問題。目前的基因芯片技術，基因的PCR擴增過程與檢測過程是分開進行的，這樣不能準確定量地檢測基因的原始模板量。2)檢測對象需要進行多步處理，并且要進行熒光標記。檢測過程操作復雜，影響檢測的可靠性。另外熒光檢測需要較好的光學檢測系統支持，在臨床應用中成本較高。
因此，發展一種能夠實時定量檢測的基因芯片技術對芯片的臨床應用會是一個巨大的推動，以電化學檢測和PCR擴增相結合的技術是本芯片技術定量的關鍵，這必為生物芯片在生物醫學和生命科學等領域中廣泛應用奠定基礎。
發明內容
技術問題本發明的目的是提供一種可以實時定量檢測的電化學定量PCR檢測芯片的制備和檢測方法，可以實現多個核酸片段的定量檢測。
技術方案本發明提出了一種利用電化學方法定量檢測PCR過程的生物芯片技術，它是一種核酸的定量檢測技術。該技術的具體實施方案為(a)在固體載體的表面上制備一組電極微陣列，(b)在電極微陣列的電極上固定核酸捕獲的分子探針，(c)在固定有核酸捕獲的分子探針的電極區域制備一個能夠裝載液體的全封閉的微小腔體，腔體內可進行生化反應，腔體上有液體的注入口，(d)在固體載體的電極上接有連接電線，可與電化學檢測裝置相連接來對電極施加電壓或電流，以及電信號的采集，電化學檢測裝置是指在電極表面發生生物化學反應時能夠檢測其電流和電壓等變化的儀器，如恒電位儀。
所述的核酸捕獲的分子探針直接固定在電極的表面，或通過某種手臂分子“NH2，HS”的作用與電極表面結合。
所述的電化學定量聚合酶鏈式反應檢測芯片的檢測方法為a、把核酸、酶、脫氧核糖核苷酸、電化學活性物質等反應組分加入上述的電化學定量PCR芯片的全封閉的微小腔體中；b、將芯片置于一個可以進行溫度控制的大腔體中，進行PCR擴增反應c、通過恒電位儀來檢測電極表面的捕獲DNA探針分子上因為發生反應面產生的電流電壓的變化；d、PCR每循環一次或數次，就檢測一次電流電壓的變化通過檢測不同電極上PCR循環過程中的電流電壓的變化規律對多個基因進行PCR定量檢測。
PCR的反應組分中電化學活性物質為染料試劑、金屬粒子等具有電化學指示作用的物質。
PCR反應和檢測儀器是包括溫控系統、電信號檢測系統和芯片的引入和取出部件。該芯片檢測的對象可以是DNA、RNA、反轉錄cDNA(互補DNA)或是其他的核酸片斷。
技術效果本發明提出的電化學實時定量檢測PCR芯片技術具有以下特點1、該芯片最大的特點就是能夠進行核酸的定量檢測，是電化學技術和PCR技術相結合的核酸定量的新技術。
2、載體表面可以制備多個電極，在每個電極上制備特異性的核酸捕獲分子探針，而且芯片上可以進行多重的PCR，從而實現多個位點并行檢測，該體系檢測不會存在相互污染問題。
3、該定量檢測芯片是利用電化學方法對PCR擴增的過程進行檢測，不需要任何的熒光標記，降低了檢測成本，同時也避免了熒光檢測過程中選擇染料時受其激發波長范圍的影響等問題。
4、電化學方法檢測靈敏度高，可以對低拷貝的基因進行準確檢測，操作簡便，成本低。
本實時定量擴增的芯片技術，對生物芯片在生物科學和醫學臨床的定量檢測方面的應用開拓了廣闊的前景。
以下將結合附圖對本技術作進一步說明。
圖1、檢測芯片基底橫切面結構示意圖，圖2、檢測芯片縱切面結構示意圖，圖3、檢測芯片工作示意圖，圖4固定了探針的電極工作示意圖，圖5以50mv/s的速度掃描時檢測到的不同樣品循環伏安信號曲線，圖6電化學定量PCR的電信號隨著循環數變化的曲線。
以上的圖中有第一工作電極1、第二工作電極2、參比電極3、第三工作電極4、第四工作電極5、對電極6、固體載體7、溶液池8、對電極電連接線9、參比電極電連接線10、工作電極電連接線11、溶液池蓋12、電化學檢測儀13、溫度控制裝置14、電化學定量檢測芯片15、固定了探針的工作電極16、工作電極上的探針結合了擴增產物17、工作電極上的雜交產物結合了電活性物質18、擴增過程中不同循環時檢測的樣品的電化學信號曲線19、20、21。
具體實施例方式
該電化學定量PCR檢測芯片是由一個可以進行PCR擴增的帶有全封閉腔體的固體載體組成的。首先是在固體載體的表面制備電極微陣列，在電極區域有一定的空間用于液體存儲和反應，然后再制備用于對該固體載體進行全封閉的微小腔體，該腔體上有用于加樣的小孔。固體載體是由金屬、玻璃、硅片、塑料、陶瓷等能夠制備電極并且可以對其進行溫度控制的材料組成；載體表面的電極上固定待檢基因的捕獲分子探針，該分子探針可以直接固定在電極上，也可以通過某種手臂分子(NH2，HS等)的作用與電極表面特異性的結合。
還有一個能夠容納該電化學定量PCR檢測芯片的溫度控制裝置，該裝置能夠使固體載體表面上電極區域的液體進行PCR反應。
該電化學定量PCR檢測芯片還有一組電極連接線。該連接線與電化學檢測裝置相連接來對電極施加電壓或電流，以及電信號的采集；該連接線的制備不影響固體載體的全封閉。該電化學檢測裝置的特點是能夠同時進行多個電極信號的采集分析。
該芯片檢測過程是將待檢基因連同PCR反應體系和電化學檢測活性物質一起加入到芯片上的電極區域，封閉該芯片并且放入到溫度控制裝置里進行PCR反應，PCR反應的同時通過電化學檢測裝置進行相關的電壓、電流等的供應和電信號的采集。PCR過程中，產生的待檢基因片斷就會不斷的與捕獲探針形成雙鏈DNA，通過檢測電化學活性物質上的電化學信號隨著PCR進程的變化規律，就可以檢測特檢基因的擴增情況。PCR每循環一次或數次，就采集一次電化學信號；通過檢測不同電極上PCR循環過程中的電化學信號的變化規律來檢測多個基因的PCR定量檢測。PCR的反應組分中電化學活性物質為染料試劑、金屬粒子等具有電化學指示作用的物質。
實例1電化學與PCR結合檢測p16基因的甲基化狀態1、電極及其探針的制備在金電極上固定特異性的可以檢測甲基化狀態的探針。首先進行電極預處理，金電極經Piranha溶液、丙酮、無水乙醇依次浸泡0.5min，然后用0.05μm Al2O3磨墊拋光，超聲波清洗約1min，氮氣干燥。將金電極浸入含有100μg/ml HS2ssDNA的TE緩沖液中，于4℃放置12h，得到單鏈DNA修飾電極(HS2ssDNA/Au電極)。
2、PCR擴增待檢樣品DNA提取以后，將電化學指示劑加入其中，進行普通的PCR擴增。
3、擴增產物的檢測擴增產物與電極上的探針結合后，在電化學指示劑的作用下，用電化學儀在80mV的作用下進行檢測。每一個PCR循環，檢測一次，從面可以對相應的樣品中被檢DNA原始模板量的情況進行定量檢測。(試驗結果見圖5)實施2母體血漿中胎兒DNA的電化學PCR芯片檢測1、設計了幾組擴增檢測胎兒特異(Y染色體上特異的區段)的基因探針和引物序列，用普通的電泳法檢測篩選出了最佳的引物探針組合進行電化學實時檢測。
2、電極及胎兒DNA特異性的探針的制作固定方法同上3、樣品處理及PCR擴增首先從血漿樣品中提取純化出DNA，然后在合適的溫度循環下(94℃，30s-50℃，30s-72℃，30s)進行擴增，在每個PCR循環后用電化學儀采集相關的信號，并且進行處理，結果顯示胎兒DNA的隨著PCR循環數的增加而逐漸增加。(如圖6，a為陰性對照b、c、d、e為不同的樣品)
權利要求
1.一種電化學定量聚合酶鏈式反應檢測芯片的制備方法，其特征是制備的方法為(a)在固體載體的表面上制備一組電極微陣列，(b)在電極微陣列的電極上固定核酸捕獲的分子探針，(c)在固定有核酸捕獲的分子探針的電極區域制備一個能夠裝載液體的全封閉的微小腔體，腔體內可進行生化反應，腔體上有液體的注入口，(d)在固體載體的電極上接有連接電線，可與電化學檢測裝置相連接來對電極施加電壓或電流，以及電信號的采集，
2.根據權利要求1所述的電化學定量聚合酶鏈式反應檢測芯片的制備方法，其特征在于所述的核酸捕獲的分子探針直接固定在電極的表面，或通過某種手臂分子“NH2，HS”的作用與電極表面結合。
3.一種如權利要求1所述的電化學定量聚合酶鏈式反應檢測芯片的檢測方法，其特征是檢測方法為a、把核酸、酶、脫氧核糖核苷酸、電化學活性物質等反應組分加入上述的電化學定量PCR芯片的全封閉的微小腔體中；b、將芯片置于一個可以進行溫度控制的大腔體中，進行PCR擴增反應；c、通過恒電位儀來檢測電極表面的捕獲DNA探針分子上因為發生反應面產生的電流電壓的變化；d、PCR每循環一次或數次，就檢測一次電流電壓的變化；通過檢測不同電極上PCR循環過程中的電流電壓的變化規律對多個基因進行PCR定量檢測。
4.根據權利要求3所述的電化學定量聚合酶鏈式反應檢測芯片的檢測方法，其特征是PCR的反應組分中電化學活性物質為染料試劑、金屬粒子等具有電化學指示作用的物質。
全文摘要
電化學定量聚合酶鏈式反應檢測芯片的制備方法涉及一種核酸定量聚合酶鏈式反應芯片的電化學檢測技術，其制備的方法為在固體載體的表面上制備一組電極微陣列；在電極微陣列的電極上固定核酸捕獲的分子探針；在固定有核酸捕獲的分子探針的電極區域制備一個能夠裝載液體的全封閉的微小腔體；在固體載體的電極上接有連接電線，檢測方法為；把核酸、酶、脫氧核糖核苷酸、電化學活性物質等反應組分加入微小腔體中；將芯片置于一個可以進行溫度控制的大腔體中；通過恒電位儀來檢測電極表面的捕獲DNA探針分子上因為發生反應而產生的電流電壓的變化；通過檢測不同電極上PGR循環過程中的電流電壓的變化規律對多個基因進行PCR定量檢測。
文檔編號G01N27/26GK1605861SQ20041006571
公開日2005年4月13日 申請日期2004年11月15日 優先權日2004年11月15日
發明者陸祖宏, 葛芹玉, 劉全俊, 白云飛 申請人:東南大學