專利名稱：飼料中碘化酪蛋白的測定方法
技術領域：
本發明涉及一種碘化酪蛋白的測定方法，特別是一種采用催化動力學分光光度法，測定飼料中微量碘化酪蛋白的方法。
背景技術：
甲狀腺素是動物甲狀腺分泌的重要激素，其生理功能是全面提高基礎代謝，對于調節機體三大物質代謝，維持機體的正常生長發育及能量代謝都起著廣泛而重要的作用。碘化酪蛋白是一種人工合成的蛋白質同化類激素，是甲狀腺素T3和T4的前驅物質，經腸道消化吸收后具有類似T3和T4的生理功能。該制品由美國農業技術開發公司首先研制成功，曾經被美國藥品和食品管理局(FDA)批準作為一種飼料添加劑使用，以50-200mg/Kg的量添加于飼料中可作為生長促進劑，促進幼畜生長發育，增加瘦肉比例，提高泌乳量，增加產蛋率，但也引起動物體況下降，死亡率上升，受孕率降低，產仔數下降等一系列病變狀況。鑒于畜禽肉制品中這種類激素的殘留問題及上述毒副作用，美國FDA已于1999年撤消碘化酪蛋白的畜藥許可。碘化酪蛋白的生產工藝簡單，成本低廉，網上隨處可見推銷廣告，可以想像碘化酪蛋白已應用于畜禽養殖業的廣泛程度，因此迫切需要發展快速、簡易、準確的碘化酪蛋白檢測技術。
碘化酪蛋白是一種不均一的混合物，直接測定困難大。國內外檢測碘化酪蛋白或碘化酪蛋白中碘化氨基酸的含量曾有活體動物實驗——蝌蚪變態實驗和琢鼠服用碘化酪蛋白耗氧量測定法、二向薄層色譜法、衍生氣相色譜法、高效液相色譜法和液相色譜-質譜聯等方法。前兩者因系活體生物學檢測，個體差異難以控制，僅能定性且不穩定，后幾種則需使用昂貴復雜儀器，樣品需要復雜的前處理，而且需要專業的技術人員，很難遏制量大面廣的濫用此類激素現狀。因此，目前急需一種技術簡單、成本低廉、快速、監控樣品量大，適宜篩選工作、特異性高，靈敏度符合要求的檢測方法。
發明內容
本發明的目的在于提供一種飼料中碘化酪蛋白的測定方法，即利用碘催化砷鈰反應的原理，建立一種技術簡易、成本低廉、快速和靈敏度高的飼料中碘化酪蛋白的檢測方法。
由于碘催化高鈰離子還原，在一定濃度范圍內，高鈰離子褪色程度和碘離子濃度成正相關，其催化動力學方程如下Ln([Ce4+]bt/[Ce4+]t)＝Kc[As3+]*[I+]t因[As3+]/[Ce4+]＞7.5時，反應符合一級動力學模式，反應速率與砷離子的濃度無關，由此上述方程式可以進一步改寫為Ln([Ce4+]bt/[Ce4+]t)＝K[I+]t，其中K＝Kc[As3+]若反應時間固定，則在體系中其它因素恒定條件下，Ln([Ce4+]bt/[Ce4+]t)與是碘離子的濃度成正比，因而可以用于定量分析微量碘的含量。又據比爾定律有吸光度A＝K[Ce4+]，則上式進一步改寫為Ln(A0/At)＝K[I+]t，由此可以得出吸光度與碘離子濃度成正比。
根據上述原理，本發明采用如下技術方案一種飼料中碘化酪蛋白的測定方法，其特征在于，該方法的具體步驟如下a.工作曲線的繪制首先配制濃度在0.04μg/ml～0.5μg/ml范圍內的一系列碘化鉀的標準工作溶液，并分別移取0.2ml碘化鉀的標準溶液置于10ml的具刻度比色管中，再依次加入0.01mol/l的亞砷酸1.68ml、2.5mol/l的硫酸4ml和蒸餾水4ml，混勻，在20℃-30℃溫度下溫浴15分鐘，同時將0.002mol/L硫酸高鈰銨溶液同溫溫浴，15分鐘后迅速將0.78ml的硫酸高鈰銨溶液依次加入至各比色管中，加蒸餾水至刻度混勻，控制水浴反應時間為15-20分鐘，以蒸餾水為參比，用1ml的比色皿在317nm波長處依次測定比色管中各溶液的吸光度，記為At；同時，測定裝有蒸餾水的空白管在317nm波長處的吸光度，記為A0；然后繪制出Ln(A0/At)-碘離子濃度C的關系曲線；根據該關系曲線，可求出曲線方程；b.飼料樣品的準備飼料經粉碎后，以無水乙醇為提取液，用索氏提取器提取直至索氏提取器內液體呈無色，取出樣品包，在70℃烘干；倒入燒杯中，用pH值為4.7的乙酸-乙酸鈉緩沖液洗滌樣品包，離心分離，分離上清，再加入的乙酸-乙酸鈉緩沖液洗滌，離心分離，分離上清，再合并上清；以1ml上清加入100μl的濃度為100％(W/V)的三氯乙酸進行沉淀，合并沉淀并烘干；轉移到瓷坩堝中，以碳酸鉀固定碘，硫酸鋅助灰化助熔進行樣品灰化處理，過濾坩堝中內容物，再用熱水洗滌濾渣，將濾液和洗液收集到100ml的容量瓶中，并加蒸餾水定容到刻度，搖勻，此液待測；
c.飼料中碘化酪蛋白的測定取0.2ml上述待測液于10ml具刻度比色管中，按步驟a的方法，測定該待測液的吸光度At，以及空白的吸光度A0，然后計算出Ln(A0/At)，將該Ln(A0/At)值代入上述的曲線方程，即可求出對應的碘離子的濃度，根據溶液中碘離子的濃度，計算飼料中碘化酪蛋白的量。
試劑用量優化選取亞砷酸、硫酸和硫酸高鈰三個因素進三因素三水平的正交優化。從非催化反應發生程度和吸光度大小化反應發生的程度和吸光度大小兩個方面進行考查，發現砷酸對非催化反應和吸光度影響都很小；砷鈰和吸光度影響都有很小，砷鈰反應符合一級動力學的前提是亞砷酸濃度遠大于酸高鈰濃度，我們選用亞砷酸的用量為0.01mol/L1.680ml；硫酸高鈰對吸光度影響最大，考慮到儀器靈敏度、測定線性范圍的寬度，故選用0.002mol/L0.780ml；硫酸高鈰在弱酸性及堿性條件下會沉淀析出，隨硫酸濃度的增加，吸光度增大，當大于0.6mol/l時趨于穩定，又硫酸對磷酸引起的吸收波長向短波移動有糾正作用，故選用2.5mol/L硫酸4ml。
反應溫度與反應時間在確定的最佳試劑用量條件下，分別改變反應溫度和時間進行實驗，結果表明在低溫下，反應緩慢，標準曲線斜率小
靈敏度低當反應溫度過高時，反應速度加快，靈敏度太高，操作不易控制，產生的誤差大。所以反應溫度選用范圍為20℃～30℃，反應時間范圍為25分鐘～20分鐘。
同現有技術相比，本發明方法具有如下顯而易見的特點和突出的優點1.本方法中樣品經過索氏抽提、等電點沉淀和三氯乙酸沉淀，除去了干擾的有機碘和無機碘化物，使樣品中的碘僅以碘化蛋白形式存在，因此使用本方法測定樣品中的蛋白碘含量，回收率高，相對偏差小。采用本發明方法與以不含碘化酪蛋白的飼料及加入準確量的碘化酪蛋白的飼料為樣品，采用本發明方法進行回收實驗。結果列于下表1表1 碘化酪蛋白加標回收分析結果(n＝3)
注 1上海強大農業發展有限公司仔豬前期配合飼料；2上海市北洲城糧油食品有限公司生長肥豬前期配合飼料
3上海飛帆飼料有限公司生長肥豬前期配合飼料4上海市北洲城糧油食品有限公司瘦肉型豬配合飼料根據上表結果表明，其測定結果令人滿意。
2.繪制的標準工作曲線具有較高的精密度，相對標準偏差僅為7.5％。
3.本發明方法的碘離子的檢出限度為0.03μg/ml，靈敏度高。
4.本發明方法操作簡單，成本低，，是一種切實可行的檢測方法。
圖1是本發明方法建立的工作曲線圖，即Ln(A0/At)-碘離子濃度C的關系曲線。
圖2是5種不同組份溶液190～500nm波長范圍的吸收光譜曲線圖。其中，1——硫酸高鈰銨+硫酸；2——硫酸高鈰銨+硫酸+亞砷酸；3——硫酸高鈰銨+硫酸+亞砷酸+碘化鉀(10min)；4——硫酸高鈰銨+硫酸+亞砷酸+碘化鉀(11min)；5——硫酸+亞砷酸+碘化鉀。
具體實施例方式1.吸收波長的確定首先在5支10ml具刻度比色管中配置一系列不同組分的溶液，1-0.002mol/L硫酸高鈰銨0.78ml+2.5mol/l的硫酸4ml；2-0.002mol/L硫酸高鈰銨0.78ml+2.5mol/l的硫酸4ml+0.01mol/l的亞砷酸1.68ml；3-0.002mol/L硫酸高鈰銨0.78ml+2.5mol/l的硫酸4ml+0.01mol/l的亞砷酸1.68ml+0.1μg/ml碘化鉀0.2ml(10min)；4-0.002mol/L硫酸高鈰銨0.78ml+2.5mol/l的硫酸4ml+0.01mol/l的亞砷酸1.68ml+0.1μg/ml碘化鉀0.2ml(11min)；5--2.5mol/l的硫酸4ml+0.01mol/l的亞砷酸1.68ml+0.1μg/ml碘化鉀0.2ml，加水至刻度混勻，用UV-260紫外可見分光光度計在190～500nm波長范圍進行光譜掃描，可得到上述5種樣品的吸收光譜曲線，參見圖2。從該光譜曲線中可知，樣品5在此掃描范圍內幾乎無吸收，其它吸收曲線的最大吸收均在317nm，且形狀相似，說明吸收變化是單純由硫酸高鈰銨的濃度變化引起；其中樣品1、2的吸收曲線，說明在沒有碘離子的催化作用，砷鈰之間反應微弱；樣品3、4的吸收曲線說明碘能催化砷鈰反應，所以選取317nm作為測定波長。
2.儀器與試劑的準備(1)UV-260紫外-可見分光光度計(日本島津公司)；752型紫外光柵分光光度計(上海精密儀器有限公司)
(2)取0.1380g碘化鉀，經120℃干燥2小時，于干燥器中冷卻至室溫的碘化鉀溶解于水，定容至100ml，配制成1mg/ml的碘標準貯備液，待用。
(3)取三氧化二砷0.9892g，加熱溶解于10ml 1mol/l的NaoH，加入5ml 2.5mol/l的硫酸并定容至100ml，配制成0.1mol/l的亞砷酸溶液。臨用前適當稀釋成0.01mol/L的亞砷酸溶液，即為工作液；(4)取硫酸鈰銨3.3431g用1.25mol/l的硫酸定容到250ml，配制成0.02mol/l硫酸鈰銨溶液。臨用前用1.25mol/l的硫酸適當稀釋成0.002mol/L的硫酸鈰銨溶液，即為工作液。
實施例一現將具體實施例敘述如下，其具體步驟為1.工作曲線的繪制將上述配置好的1mg/ml的碘標準，分別稀釋成0.05μg/ml、0.1μg/ml、0.2μg/ml、0.3μg/ml、0.4μg/ml、0.5μg/ml200μl的標準溶液，取其中0.2ml置于6支10ml具刻度比色管中，再依次加入0.01mol/l的亞砷酸1.68ml、2.5mol/l的硫酸4ml和水4ml，混勻，在30℃溫度下溫浴15分鐘，同時將0.002mol/L硫酸高鈰銨溶液同溫溫浴，15分鐘后迅速將0.78ml的硫酸高鈰銨溶液依次加入至各比色管中，加水至刻度混勻，控制水浴反應時間為20分鐘，在317nm波長處以水為參比依次測定比色管中各溶液的吸光度，記為At；同時，測定以蒸餾水替代標準品，其它同上的空白管在317nm波長處的吸光度，記為A0；然后繪制出Ln(A0/At)-碘離子濃度C的關系曲線按實驗方法操作，繪制標準曲線，參見圖1；實驗表明碘離子濃度在0.05μg/ml～0.5μg/ml范圍內與Ln(A0/At)呈線性關系，回歸方程為Ln(A0/At)＝2.6038 C-0.0078，R2＝0.9995；以0.3μg/m200μl的標準液重復11次實驗以測定工作曲線的精密度，相對標準偏差為7.6％；方法的檢出限為0.03μg/ml(S/＝3，表示的是空白樣品經11次測定的標準偏差)。
2.試樣制備準確稱取經充分粉碎的樣品飼料1g，用索氏提取器(100ml的無水乙醇)提取直至索氏提取器內液體呈無色，取出樣品包70℃烘干，倒入400ml的燒杯中，用乙酸-乙酸鈉緩沖液(pH＝4.7)溶解，6000r.p.m離心10分鐘，分離上清，再加入100ml的乙酸-乙酸鈉緩沖液洗滌沉淀，離心，合并上清，以1ml上清加入100μl的三氯乙酸(100％W/V)進行沉淀，合并上述沉淀并烘干，轉移到瓷坩堝中，以碳酸鉀固定碘，硫酸鋅助熔進行樣品灰化處理，過濾坩堝中內容物，多次用熱水洗滌濾渣，將濾液和洗液收集到100ml的容量瓶中，并定容到刻度，搖勻，此液待測。
3.飼料中碘化酪蛋白的測定
(1)色測定取0.2ml上述待測液于10ml具刻度比色管中，按工作曲線繪制的方法，測定該待測液在317nm波長處的吸光度At＝0.528，空白管0.794；(2)計算分別計算出Ln(A0/At)，其值分別為0.407，將計算出的Ln(A0/At)值代入回歸方程Ln(A0/At)＝2.6038 C-0.0078，即可得到對應的碘離子的濃度分別為0.16μg/ml100ml待測樣品碘含量(μg/g)＝0.16μg/ml*100ml＝16μg由于碘化酪蛋白為混合物，市場上各商品碘化酪蛋白中含碘量并不一致，一般在8％左右，此處為便于計算，以8％計，即可計算該飼料中碘化酪蛋白的含量為碘化酪蛋白含量＝碘含量/8％＝16μg/8％＝200μg即1g飼料中碘化酪蛋白含量＝200μg/g即200ppm蛋白質中的碘化主要發生在酪氨酸上，從而使碘化蛋白具有類似甲狀腺素生理作用(生成T2、T3、T4)或作為體內合成甲狀腺素直接前體(MIT、DIT)。并非只有碘化酪蛋白具有類似甲狀腺素作用，碘化蛋白只要碘化達到一定程度，均有此作用。通過測定蛋白碘化的存在，來監測飼料中碘化酪蛋白非法添加，是一種切實可行的方法。
權利要求
1.一種飼料中碘化酪蛋白的測定方法，其特征在于，該方法的具體步驟如下a.工作曲線的繪制首先配制濃度在0.04μg/ml～0.5μg/ml范圍內的一系列碘化鉀的標準工作溶液，并分別移取0.2ml碘化鉀的標準工作溶液置于10ml的具刻度比色管中，再依次加入0.01mol/l的亞砷酸1.68ml、2.5mol/l的硫酸4ml和蒸餾水4ml，混勻，在20℃-30℃溫度下溫浴15分鐘，同時將0.002mol/L硫酸高鈰銨溶液同溫溫浴，15分鐘后迅速將0.78ml的硫酸高鈰銨溶液依次加入至各比色管中，加蒸餾水至刻度混勻，控制水浴反應時間為15分鐘-20分鐘，以蒸餾水為參比，用1ml的比色皿在317nm波長處依次測定各比色管中各溶液的吸光度，記為At；同時，測定裝有蒸餾水的空白管在317nm波長處的吸光度，記為A0；然后繪制出Ln(A0/At)-碘離子濃度C的關系曲線，根據該關系曲線，可求出曲線方程；b.飼料樣品的準備飼料經粉碎后，以無水乙醇為提取液，用索氏提取器提取直至索氏提取器內液體呈無色，取出樣品包，在70℃烘干；倒入燒杯中，用pH值為4.7的乙酸-乙酸鈉緩沖液洗滌樣品包，離心分離，分離上清，再加入的乙酸-乙酸鈉緩沖液洗滌，離心分離，分離上清，再合并上清；以1ml上清加入100μl的濃度為100％(W/V)的三氯乙酸進行沉淀，合并沉淀并烘干；轉移到瓷坩堝中，以碳酸鉀固定碘，硫酸鋅助熔進行樣品灰化處理，過濾坩堝中內容物，再用熱水洗滌濾渣，將濾液和洗液收集到100ml的容量瓶中，并加蒸餾水定容到刻度，搖勻，此液待測；c.飼料中碘化酪蛋白的測定取0.2ml上述待測液于10ml具刻度比色管中，按步驟a的方法，測定該待測液的吸光度At，以及空白吸光度A0，然后計算出Ln(A0/At)，將該Ln(A0/At)值代入上述的曲線方程，即可求出對應的碘離子的濃度，根據溶液中碘離子的濃度，計算飼料中碘化酪蛋白的量。
全文摘要
本發明涉及一種飼料中碘化酪蛋白的測定方法。該方法包括如下步驟碘離子催化鈰銨反應的標準工作曲線的繪制，飼料樣品的準備以及飼料中碘化酪蛋白的測定，本方法中飼料樣品經過索氏抽提、等電點沉淀和三氯乙酸沉淀，除去了干擾的有機碘和無機碘化物，使樣品中的碘僅以特有的有機結合碘碘化蛋白形式存在，因此使用本方法測定樣品中的蛋白碘含量，回收率高，相對偏差小。而且該方法操作簡單，成本低，靈敏度高，是一種切實可行的檢測方法。
文檔編號G01N21/31GK1609595SQ200410054319
公開日2005年4月27日 申請日期2004年9月7日 優先權日2004年9月7日
發明者胡建軍, 陳宇光 申請人:上海大學