專利名稱：中性紅摻雜的二氧化硅納米生物傳感器及其制備方法
技術領域：
本發明涉及一種新型的納米修飾生物傳感器及其制備方法，屬于生物傳感器技術和納米生物檢測技術領域。
背景技術：
生物傳感器能快速、準確和方便地測量血液、食品和發酵工業中葡萄糖、乳酸等含量而受到業內人士的關注。但是，目前已有的生物傳感器普遍存在著靈敏度不高、抗干擾性差和穩定性低及制造成本高的缺陷。例如中國專利申請“血液乳酸電化學傳感器”(申請號03128815.4)是由設有血樣測量工作區的基板、基板上依次覆有的工作電極和參比電極組成。基板(血樣測量工作區范圍內部)還覆有能夠與乳酸反應，并產生電子傳遞的酶試劑反應膜。酶試劑反應膜含有乳酸氧化酶、電子傳遞體、穩定劑和能使血樣快速滲透到反應膜內部與酶進行反應的親水高分子物質。由于電子傳遞體采用了鐵氰酸根，但鐵氰酸根水溶性好，易流失，使得傳感器的穩定性能受影響。從而測量結果的可信度被降低了。中國專利申請“全血葡萄糖生物傳感器”(申請號03129434.0)和“全血乳酸生物傳感器”(申請號03129433.2)提出了反應層由羧甲基纖維素CMC、修飾碳納米管(作為電子第二中介體)，鐵氰化鉀、乳酸氧化酶或葡萄糖氧化酶(作為電子第一中介體的試劑)、穩定劑、緩沖液制備成的生物傳感器，可用來測定血液中的乳酸、葡萄糖的含量。引入的電子第二中介體，碳納米管提高了傳感器的響應靈敏性，克服了鐵氰酸根流失造成穩定性差的缺陷。但是由于反應層是依次疊加在設有毛細孔的腔體內，因此它們的用酶量較高，使得傳感器的成本提高。
發明內容
本發明的目的是提供一種成本低廉、靈敏度高、抗干擾性好和穩定性高的納米修飾生物傳感器。本發明的另一個目的是公開其制備方法。
為了實現上述目的，本發明是這樣進行的傳感器包括工作電極、對電極和參比電極及溶液進、出口。其特點是工作電極由聚四氟乙烯板和貫穿該板的碳電極組成，碳電極底端設有引線，頂端修飾有酶試劑反應膜，酶試劑反應膜由核殼型的中性紅摻雜的二氧化硅(NR-SiO2)納米粒子和生物活性酶組成。工作電極上面依次設有薄層檢測池和對電極，并通過螺釘將工作電極、薄層檢測池和對電極固為一體。對電極由聚四氟乙烯板和貫穿該板的不銹鋼電極以及對電極引線組成。薄層檢測池是一片中間挖成通孔的聚四氟乙烯膜，池底是修飾有酶試劑反應膜的碳電極，池頂部是對電極上的不銹鋼電極與兩側對稱開設的液體進口孔和出口孔。液體進口孔直接與溶液進口管連接。液體出口孔通過接管與套管連接，套管內裝有參比電極，套管一側設有溶液出口管。
在碳電極上修飾的酶試劑反應膜中的生物活性酶可按不同檢測內容，選擇葡萄糖氧化酶(GOD)、乳酸氧化酶(LOD)、L-谷氨酸氧化酶(L-GLOD)或黃嘌呤氧化酶(XOD)。
本發明的納米生物傳感器制備方法的特點是在碳電極上修飾的酶試劑反應膜是先采用反相微乳液法制成核殼型NR-SiO2納米粒子，然后將核殼型NR-SiO2納米粒子修飾在碳電極頂端，形成納米NR-SiO2層，再將生物活性酶和牛血清白蛋白及其戊二醛交聯后修飾在納米NR-SiO2層上，自然干燥后制得。
具體步驟如下先將7.5mL的環己烷、1.8mL正己醇和1.77mL聚乙二醇辛基苯基醚(OP)混合均勻攪拌，然后緩慢加入300-400μL中性紅水溶液，室溫下均勻攪拌30-60min，然后緩慢地加入60-100μL的正硅酸四乙酯和濃度為30％體積比的30-60μL氨水，室溫下繼續充分攪拌反應12-24小時，形成納米粒子尺寸為20-100nm的呈三維二氧化硅網狀結構的NR-SiO2納米粒子；接著將上述NR-SiO2納米粒子修飾在碳電極頂端上，再將生物活性酶和牛血清白蛋白及戊二醛交聯后修飾在納米NR-SiO2層上，自然干燥后制得。
在碳電極上修飾了酶試劑反應膜后，還可以涂敷一層1％的Nafion甲醇溶液，形成一層抗陰離子干擾的Nafion膜，增強抗干擾性能。
本發明具有如下優點和效果1.由于本發明的工作電極上的碳電極頂端修飾的酶試劑反應膜是用核殼型NR-SiO2納米粒子進行修飾的，其核NR具有良好的導電性，且對生物活性酶具有催化作用，使其催化電流增大了3-9倍(不同生物活性酶，其催化效果的提高也不同)。因此本發明的傳感器的安培響應值是無納米修飾的傳感器的3-9倍。
2.由于本發明采用的NR-SiO2納米粒子尺寸為20-100nm，同時，該納米粒子的殼層SiO2具有良好的生物兼容性和生物親和性，且呈三維網狀結構，有效防止了核NR電子傳遞體的泄漏，顯著提高了核NR電子傳遞體的穩定性。因此保證了本發明的傳感器的穩定性。
3.由于本發明的生物傳感器采用了薄層檢測池，因此檢測時所需樣品量少。
4.由于本發明采用了NR-SiO2納米粒子，因此除了靈敏度和穩定性得到提高外，其線性范圍寬，可達到4個數量級以上，將最低檢測線降低到了2.0×10-7mol·L-1，可直接檢測含微量葡萄糖、乳酸等的溶液，例如腦滲析液等。
5.由于制備本發明的生物傳感器只需0.4個活力單位的葡萄糖氧化酶、0.2個活力單位的乳酸氧化酶、0.04個活力單位的L-谷氨酸氧化酶和0.05個活力單位的次黃嘌呤氧化酶。而通常，如專利申請號03129433.2和03129434.0乳酸和葡萄糖傳感器需1-2個活力單位的生物活性酶。因此制造成本低廉。
6.由于本發明的碳電極上修飾的酶試劑反應膜用的核殼型NR-SiO2納米粒子的制備采用了反相微乳液法，因此工藝簡單，操作方便，成本低，顆粒均勻且粒徑小，而且每次制備的納米粒子粒徑分布較窄。
圖1為本發明的生物傳感器的剖視圖；圖2為本發明的生物傳感器的對電極的俯視圖；圖3為本發明的生物傳感器的薄層檢測池的俯視圖；圖4為本發明的生物傳感器的工作電極的俯視圖；圖5為按本發明方法所制得的NR-SiO2納米粒子的TEM圖；圖6為本發明方法修飾酶試劑反應膜的流程示意圖；其中圖1固定圈1、溶液出口管2、參比電極3、對電極引線4、溶液進口管5、溶液進口孔6、對電極7、薄層檢測池8、工作電極9、碳電極引線10、螺釘11、定位孔12、溶液出口孔13、接管14、套管15。
圖2溶液進口孔13、溶液出口孔6、4個定位孔12、聚四氟乙烯板17、不銹鋼電極16。
圖34個定位孔12、通孔18、聚四氟乙烯膜19。
圖44個定位孔12、聚四氟乙烯板17、修飾了酶試劑反應膜的碳電極20。
具體實施例方式
請參閱圖1、2、3、4。傳感器包括工作電極9、對電極7和參比電極3及溶液進、出口管5和2構成。參比電極3為飽和甘汞電極。其特點是，工作電極9由聚四氟乙烯板(又稱絕緣性Teflon基材)17和貫穿該板17的碳電極20組成，碳電極20底端設有引線10，頂端修飾有酶試劑反應膜，酶試劑反應膜由核殼型中性紅摻雜的二氧化硅納米粒子和生物活性酶組成。工作電極9上面依次設有薄層檢測池8和對電極7，各自的厚度分別為12mm、0.15mm和12mm，并且四周均開有4個定位孔12，通過螺釘11穿入定位孔12將工作電極9、薄層檢測池8和對電極7三者固為一體。對電極7由聚四氟乙烯板17和貫穿該板17的不銹鋼電極16以及對電極引線4組成。薄層檢測池8是一片中間挖成直徑為8mm的通孔18的聚四氟乙烯膜19，池底是修飾有酶試劑反應膜的碳電極20，池頂部是對電極7上的不銹鋼電極16與兩側對稱開設的液體進口孔6和出口孔13，由此形成體積為9.66μL薄層檢測池8。液體進口孔6直接與溶液進口管5連接。液體出口孔13通過固接在對電極7上的接管14與套管15螺紋連接。套管15內裝有參比電極3，套管15一側設有溶液出口管2。檢測樣品時，可通過微管道與傳感器外部的流動注射儀的微進樣器連接。打開溶液進、出口管5和2，則待測液體是流動相，若關閉溶液進、出口管，待測液體是非流動相的。啟動與工作電極9、對電極7和參比電極3連接的電分析儀，可檢測到血液或腦滲析液或其他溶液中的葡萄糖或乳酸或L-谷氨酸或次黃嘌呤的濃度變化的安培信號，按照相應的工作曲線，就能得到其含量。
本發明的碳電極20上修飾的酶試劑反應膜的生物活性酶是按不同檢測內容，選擇相應的葡萄糖氧化酶(GOD，from Aspergillus niger，EC 1.1.3.4.150000 units/g)、乳酸氧化酶(LOD，from Pediococcus species，37U/mg)、L-谷氨酸氧化酶(L-GLOD，EC 1.4.3.11，from Streptomyces sp.，10.8U/mg)或黃嘌呤氧化酶(XOD，EC 1.1.3.22，Grade I from Buttermilk，1 U(mgProtein)-1，34.7mg Protein mL-1)。這些酶均可市售購得。
本發明的中性紅摻雜的二氧化硅納米生物傳感器制備方法，其特點是碳電極20上修飾酶試劑反應膜的步驟是先采用反相微乳液法制成核殼型NR-SiO2納米粒子，然后將核殼型NR-SiO2納米粒子修飾在碳電極20頂端，形成納米NR-SiO2層，再將生物活性酶和牛血清白蛋白(BSA)及其戊二醛交聯后修飾在納米NR-SiO2層上，自然干燥后制得。還可以在上述自然干燥后制得的酶試劑反應膜端面上再涂敷一層1％的Nafion甲醇溶液，形成一層抗陰離子干擾的Nafion膜，可進一步增強本發明傳感器的抗干擾性能。
下面4個實施例是四種不同酶試劑反應膜的制備方法。
實施例1用于檢測葡萄糖含量的本發明的葡萄糖傳感器的制備方法。
先采用反相微乳液法，將7.5mL環己烷，1.8mL正己醇和1.77mL聚乙二醇辛基苯基醚(OP)混合均勻攪拌30min，表面活性劑OP可換成TritonX-100等，維持水和表面活性劑的摩爾比(W＝10)。然后緩慢加入400μL1×10-2mol·L-1的中性紅水溶液，室溫下均勻攪拌反應30min，形成穩定的油包水體系。再向該體系中緩慢地加入60-100μL正硅酸四乙酯(TEOS)和濃度為30％體積比的30-60μL氨水(NH3·H2O)，室溫下繼續充分攪拌反應24h。維持水和TEOS的摩爾比(W＝10)。在油包水的微乳液合成的核殼納米顆粒過程中，在氨水的催化下，TEOS逐漸水解，并發生縮聚反應，形成二氧化硅的網狀結果，其整個過程的方程式如下水解反應縮聚反應 成核反應
反應完成后，向體系中加入15mL丙酮，使納米顆粒從油包水的體系中分離沉淀出來，然后離心分離，在離心管底部可以看到有淺棕紅色的沉淀形成。棄去上層清夜，用無水乙醇和水分別洗滌沉淀數次，充分除去表面活性劑OP和納米顆粒表面上吸附的中性紅獲得核殼型NR-SiO2納米粒子。經TEM表征，此時的NR-SiO2的粒徑為50±4nm。請參閱圖5。將上述的納米顆粒用2mL pH 6.9的磷酸緩沖溶液(PBS)分散后進行下一步表面修飾。
請參閱圖6，將核殼型NR-SiO2納米粒子修飾在碳電極20上，形成納米NR-SiO2層，再將生物活性酶和BSA及戊二醛交聯后修飾在納米NR-SiO2層上。在室溫條件下置于陰暗處自然晾干，得到工作電極9。生物活性酶和BSA及戊二醛交聯工藝如下先將10mg BSA和0.1mg的GOD溶解于100μL 0.1mol·L-1(pH 6.9)的磷酸緩沖溶液中配制成酶溶液。然后將25％的戊二醛與磷酸緩沖液以1∶4的體積比混合配制成5％的戊二醛溶液。取出20μL戊二醛溶液與酶溶液，迅速混合，制成混合酶溶液。吸取15μL該混合酶液與10μL NR-SiO2磷酸緩沖液混合均勻后，將1μL該溶液滴涂在修飾了NR-SiO2層的碳電極20上，制成碳電極上修飾的酶試劑反應膜。也可以最后在酶試劑反應膜表面涂敷1μL1％的Nafion甲醇溶液，自然晾干，使本發明的傳感器增強了抗干擾性能。
上述方法制成的NR-SiO2納米修飾的葡萄糖傳感器，其電流響應值是相同條件下無納米修飾時制備的傳感器的5倍。經測試，該傳感器的線性范圍為1.0×10-6~1.0×10-2mol·L-1，最低檢測限達5.0×10-7mol·L-1，相關系數(r)為0.9979。將該葡萄糖傳感器保存在4℃的PBS中，在1個月內表現出良好的穩定性和重復性。
實施例2檢測乳酸的傳感器的制備方法。
在制備NR-SiO2納米粒子時，改變1×10-2mol·L-1的中性紅水溶液的量為300μL，其他制備及處理過程同實施例1。經TEM表征，此時的NR-SiO2的粒徑為20±4nm(參閱圖5)。
生物活性酶和BSA及戊二醛交聯方法，除了將10mg BSA和0.4mg LOD溶解于100μL 0.1mol·L-1(pH 6.9)的磷酸緩沖溶液中配制成酶溶液不同于實施例1外，其余制備步驟與實施例1相同。修飾過程也同實施例1。
經測試，該NR-SiO2納米修飾生物傳感器對乳酸的電流響應值是相同條件下無納米修飾時制備的傳感器的2.3倍。經測試，該傳感器的線性范圍為1.0×10-6~1.0×10-2mol·L-1，最低檢測限達5.0×10-7mol·L-1，相關系數(r)為0.9978。將該乳酸傳感器保存在4℃的PBS中，在20天內表現出良好的穩定性和重復性。
實施例3 L-谷氨酸傳感器的制備在制備NR-SiO2納米粒子時，改變攪拌反應時間為12h，其他制備及處理過程同實施例1。經TEM表征，此時的NR-SiO2的粒徑為40±5nm。
生物活性酶和BSA及戊二醛交聯工藝，除了將10mg BSA和0.2mg L-GOD溶解于100μL 0.1mol·L-1(pH 6.9)的磷酸緩沖溶液中配制成酶溶液，是與實施例1不同的，其余工藝均與實施例1相同。經測試，該NR-SiO2納米修飾生物陣列傳感器對谷氨酸的電流響應值是相同條件下無納米修飾時制備的傳感器的8.3倍。經測試，該傳感器的線性范圍為5.0×10-7~1.0×10-2mol·L-1，最低檢測限達2.0×10-7mol·L-1，相關系數(r)為0.9982。將該谷氨酸傳感器保存在4℃的PBS中，在15天內表現出良好的穩定性和重復性。
實施例4次黃嘌呤傳感器的制備在制備NR-SiO2納米粒子時，攪拌反應時間24h，其他同實施例1。然后，再向該體系中緩慢地加入100-150μL TEOS和60-100μL NH3·H2O，其他制備及處理過程同實施例1。經TEM表征，此時的NR-SiO2的粒徑為100±5nm。
生物活性酶和BSA及戊二醛交聯工藝，除了將10mg BSA和5μL X O D溶解于100μL 0.1mol·L-1(pH 6.9)的磷酸緩沖溶液中配制成酶溶液，是與實施例1不同的，其余工藝均與實施例1相同。其它修飾過程也同實施例1。經測試，該NR-SiO2納米修飾生物陣列傳感器對次黃嘌呤的電流響應值是相同條件下無納米修飾時制備的傳感器的4倍。經測試，該傳感器的線性范圍為5.0×10-7~1.0×10-3mol·L-1，最低檢測限達2.0×10-7mol·L-1，相關系數(r)為0.9973。將該次黃嘌呤傳感器保存在4℃的PBS中，在40天內表現出良好的穩定性和重復性。
權利要求
1.中性紅摻雜的二氧化硅納米生物傳感器，包括工作電極(9)、參比電極(3)和對電極(7)及溶液進口管(5)和出口管(2)，其特征在于工作電極(9)由聚四氟乙烯板(17)和貫穿板(17)的碳電極(20)組成，碳電極(20)底端設有碳電極引線(10)，頂端修飾酶試劑反應膜；酶試劑反應膜由核殼型中性紅摻雜的二氧化硅納米粒子和生物活性酶組成；工作電極(9)的上面依次設有薄層檢測池(8)和對電極(7)，并通過螺釘(11)將工作電極(9)、薄層檢測池(8)和對電極(7)固為一體；對電極(7)由聚四氟乙烯板(17)和貫穿該板(17)的不銹鋼電極(16)以及對電極引線(4)組成；薄層檢測池(8)是一片中間挖成通孔(18)的聚四氟乙烯膜(19)，池底是修飾有酶試劑反應膜的碳電極(20)，池頂部是對電極(7)上的不銹鋼電極(16)與兩側對稱開設的液體進口孔(6)和出口孔(13)，液體進口孔(6)直接與溶液進口管(5)連接；液體出口孔(13)通過固接在對電極7的接管(14)與套管(15)連接，套管(15)內裝有參比電極(3)，套管(15)一側設有溶液出口管(2)。
2.根據權利要求1所述的中性紅摻雜的二氧化硅納米生物傳感器，其特征在于所述的在碳電極(20)上修飾的酶試劑反應膜中的生物活性酶是按不同檢測內容，選擇葡萄糖氧化酶、乳酸氧化酶、L-谷氨酸氧化酶或黃嘌呤氧化酶。
3.中性紅摻雜的二氧化硅納米生物傳感器制備方法，其特征在于碳電極(20)上修飾的酶試劑反應膜是先將采用反相微乳液法制成的核殼型NR-SiO2納米粒子修飾在碳電極(20)頂端，形成納米NR-SiO2層，然后將生物活性酶和牛血清白蛋白及其戊二醛交聯后修飾在納米NR-SiO2層上，自然干燥后制得；具體步驟如下先將7.5mL的環己烷、1.8mL正己醇和1.77mL聚乙二醇辛基苯基醚混合均勻攪拌，然后緩慢加入300-400μL中性紅水溶液，室溫下均勻攪拌30-60min，再緩慢地加入60-100μL的正硅酸四乙酯和濃度為30％體積比的30-60μL氨水，室溫下繼續充分攪拌反應12-24小時，形成粒子尺寸為20-100nm的呈三維二氧化硅網狀結構的NR-SiO2納米粒子；接著將上述NR-SiO2納米粒子修飾在碳電極(20)頂端表面上，再將生物活性酶和牛血清白蛋白及戊二醛交聯后修飾在納米NR-SiO2層上，自然干燥后制得。
4.根據權利要求3所述的中性紅摻雜的二氧化硅納米生物傳感器制備方法，其特征在于在碳電極(20)上修飾了酶試劑反應膜后，還可以涂敷一層1％的Nafion甲醇溶液。
全文摘要
本發明涉及一種納米生物傳感器及制備方法。該傳感器的工作電極(9)由碳電極(20)上修飾核殼型NR－SiO
文檔編號G01N27/327GK1588026SQ20041005262
公開日2005年3月2日 申請日期2004年7月8日 優先權日2004年7月8日
發明者金利通, 張芬芬, 萬巧, 王曉麗, 李陳鑫, 朱自強, 鮮躍仲, 張文 申請人:華東師范大學