專利名稱：核酸酶消化fret標記核酸探針檢測轉錄因子蛋白的制作方法
技術領域：
轉錄因子(transcription factor)是生物蛋白質組(proteomics)中一類負責基因表達調控(geneexpression regulation)的重要蛋白質，是基因表達調控通路(pathway)及網絡(network)的樞紐，是功能基因組(functional genomics)和蛋白質組研究的重要對象；許多疾病都與轉錄因子的異常表達(expression)及活化(activation)存在密切的關系，成為轉錄治療(transcriptional therapy)和藥物研究的重要靶點(drug target)。轉錄因子表達及活化程度的檢測分析是研究其功能的主要手段。本專利提出了一種檢測轉錄因子表達和活化水平的新方法，該方法將為是分子生物學(molecular biology)、功能基因組學、蛋白質組學及生物醫學(Biomedicine)領域中的轉錄因子相關研究提供一種新的檢測分析技術，可促進這些領域中轉錄因子相關的科學研究，以及在生物醫學領域中提供一種疾病相關轉錄因子的診斷技術、以及轉錄因子為靶點的藥物篩選(drug screening)技術。
背景技術：
轉錄因子蛋白是生物蛋白質組中一類負責基因表達調控的重要蛋白質，是基因表達調控通路及網絡的樞紐，是功能基因組和蛋白質組研究的重要對象；許多疾病都與轉錄因子的異常表達及活化存在密切的關系，成為轉錄治療和藥物研究的重要靶點。轉錄因子表達及活化程度的檢測分析是研究其功能的主要手段。因此，有關檢測分析轉錄因子表達及活化程度技術的研究一直受到科學界的重視。
分子生物學研究表明，在基因的上下文(context)存在一些發揮啟動(promote)、增強(enhance)或衰減(attenuate)基因轉錄作用的特定DNA序列，稱為順式作用元件(cis-actingelements)，如啟動子(promoter)、增強子(enhancer)、衰減子(attenuater)；轉錄因子蛋白是生物蛋白質組中一類特殊的蛋白質，這類蛋白質的細胞質中完成其翻譯(translation)后，在正常細胞功能狀態或細胞受到特定因子誘導下，進入細胞核，與基因組中的順式作用元件發生特異性識別結合，組成基因轉錄機器(transcription apparatus)，實現其基因表達的調控功能，稱為反式作用因子(trans-acting factors)。轉錄因子蛋白與順式作用元件組成基因轉錄機器的首要環節是轉錄因子蛋白中一些具有特殊結構轉錄因子直接與順式作用元件DNA序列發生序列特異性結合(sequence-specific binding)，完成基因轉錄機器組裝的第一步。因此，檢測分析轉錄因子表達及活化程度的技術主要建立在DNA/蛋白質相互作用這一層次，即運用含有順式作用元件的DNA為探針，探測轉錄因子的表達及活化。
時至目前，科學家們已經建立多種基于DNA/蛋白質相互作用這一層次的轉錄因子表達及活化程度的檢測分析技術。其中最經典的是電泳遷移率變動分析(Electrophoresis MobilityShiftAssay)，即凝膠遷移實驗(gel shift assay)。該技術一般是人工合成含有轉錄因子結合序列(consensus，binding sites)的雙鏈(double-stranded)寡核苷酸(oligonucleotides)，并用放射性同位素標記寡核苷酸，將標記寡核苷酸與含有轉錄因子蛋白的細胞或組織抽提物混合孵育一段時間后，進行自然聚丙烯酰胺凝膠電泳(native polyacrylamide gel eletrophoresis，PAGE)，分離游離(free DNA)和與蛋白質結合的DNA(retarded DNA)，在通過X-光底片暴光顯現與蛋白質結合的DNA(retarded DNA)，來反映轉錄因子表達及活化程度。這一技術目前仍非常有效地用于轉錄因子蛋白檢測分析。但存在放射性標記對實驗人員及環境危害的缺陷。因此，對這一技術后來進行了非放射性標記的改進。即用地高辛(digoxigenin，DIG)標記寡核苷酸，進行自然聚丙烯酰胺凝膠電泳，再將電泳產物轉印(blotting)到尼龍膜(nylon membrane)等介質上，依靠堿性磷酸酶或辣根過氧化物酶耦聯的DIG抗體和相應酶的生色(colorimetric)或發光(chemiluminescent)底物(substrate)，進行化學生色或發光檢測，來反映轉錄因子表達及活化程度。也有采用熒光(fluorescent)標記寡核苷酸進行電泳遷移率變動分析的改進技術。這些技術也能夠很好地用于轉錄因子蛋白檢測分析。但這些技術仍然存在自身的缺點，即它們雖然避免了經典放射性標記探針凝膠遷移實驗的缺點，但同時帶來實驗流程的復雜化和更多的影響因素，如尼龍膜實驗的高背景、轉引設備需求及實驗成本提高等問題。同時，這些改進技術從根本上未擺脫種凝膠遷移實驗的技術思想，無法克服凝膠遷移實驗對實驗樣品數量需求大、實驗耗時長、分析效率低等缺陷。
鑒于這些技術目前仍然存在的缺點，建立從技術思想角度上完全不同于凝膠遷移實驗的轉錄因子表達及活化檢測及分析技術是非常必要的。
熒光共振能量傳遞(fluorescence resonance energy transfer，FRET)也稱為“Frster能量傳遞”，是一種由供體(donor)向受體(acceptor)進行的無輻射、量子級激發能量傳遞的現象。它是指當一個熒光分子(即供體)受到激發時，能量向臨近的另一熒光基團(即受體)轉移的過程。但僅當受體與供體間的距離小于10nm且受體的吸收光譜和激發光譜有重疊時，FRET才能發生。并且隨著光譜重疊的增加，FRET的效率將增加，同時FRET可能發生的距離也將增加。熒光基團距離和空間取向的變化，會引起FRET效率的改變。
FRET依賴于兩熒光團間的距離R，FRET用來丈量裝配間距在10～80的蛋白質、膜和大分子間的距離。FRET提供了一種納米尺度的測量工具，使得用顯微鏡觀察納米水平的距離變化成為可能，為人們在活體中實時觀察生物大分子的相互作用提供了一個有效的方法。
利用FRET測定相互作用的分子間的距離時，使用如下計算。由供體向受體的能量轉移效率(E)定義為E＝R06/(R06+R6)；其中R為A、B間的距離，R0是一個由吸收和發射光譜計算來的常數。E可以從熒光強度(fluorescence intensity，F)計算出來，即E＝Fda/Fd，其中Fda＝受體存在時的熒光強度，Fd＝受體不存在時的熒光強度。一旦E已知，在R0知道的情況下，就可以從第一個方程式中計算出R。
FRET已經證實是所有熒光技術中最強大有力的技術之一。FRET幾乎可以用于所有形式的分析，并且可以使使用者監測發生在大分子距離(1-10nm)上的相互作用。因為能量傳遞依賴于R-6(R為供體和受體間的距離)，供體的壽命(lifetime)和量子產額(quantum yield)減少，而受體熒光增加或激活(sensitized)。當大多數FRET應用中，供體和受體染料(dyes)是不同的，在這些情況下，依靠受體的熒光發射或供體的熒光淬滅測定FRET。FRET中使用的染料必須存在光譜的重疊(spectral overlap)，如一般使用的FRET染料對(pairs of dyes，donor-acceptor pairs)Cy3/Cy5、Cy5/Cy5.5、CFP(cyan fluorescent protein)/YFP(yellowfluorescent protein)。使用這些類型的染料，可以檢測(examine)廣泛的分子相互作用(molecular interactions)，如酶分析(enzyme assays)、免疫分析(immunoassays)和其他結合事件(binding events)。
FRET最初也是最重要的應用之一是分子信標領域(molecular beacons)。分子信標就是可檢測溶液中特定核酸的寡核苷酸探針(oligonucleotide probes)。染料與淬滅劑(quencher)的緊密接近(close proximity)導致染料被能量傳遞所淬滅。
FRET已經被廣泛應用于眾多研究領域，包括1.蛋白質結構及構像(Structure and conformation of proteins)；2.蛋白質復合物空間分布和裝配(Spatial distribution and assembly ofprotein complexes)；3.受體/配體相互作用(Receptor/ligand interactions)；4.免疫分析(Immunoassays)；5.單分子相互作用(Probing interactions ofsingle molecules)；6.核酸的結構及構像(Structure and conformation of nucleic acids)；7.實時PCR分析和SNP檢測(Real-time PCR assays and SNP detection)；8.核酸雜交檢測(Detection of nucleic acid hybridization)；9.引物延伸分析檢測突變(Primer-extension assays for detecting mutations)；10.自動DNA測序(Automated DNA sequencing)；11.脂質分布及轉運(Distribution and transport of lipids)；12.膜融合分析(Membrane fusion assays)；13.膜電勢傳感(Membrane potential sensing)；14.生熒光蛋白酶底物(Fluorogenic protease substrates)；15.環-AMP及鋅指示劑(Indicators for cyclic AMP and zinc)。
FRET在DNA/蛋白質相互作用研究中的應用也已經受到重視，該技術已經成功用于研究DNA和蛋白質的相互作用，其中目前最主要的應用是研究蛋白質與DNA結合時，DNA結構的變化，如蛋白質結合導致的DNA彎曲(bending)。除了這一主流應用外，目前FRET在DNA結合/蛋白質檢測中的應用主要體現在下列兩種方式上。一是利用蛋白質將供體和受體標記的兩個DNA半位點拉合在一起，產生FRET作用，以檢測蛋白質的存在與否；二是利用蛋白質將供體標記的DNA和受體標記的蛋白質抗體拉合在一起，產生FRET作用，以檢測蛋白質的存在與否以及DNA/蛋白質相互作用。方法一的主要優點是檢測中只需要供體和受體標記的兩個DNA半位點就可以檢測蛋白質，實驗簡單高效，特異性良好；但存在DNA半位點設計的困難，并且將供體和受體標記插入到蛋白質結合位點中，可能會妨礙蛋白質的正常結合甚至不能結合，并且對那些DNA結合位點并不長的蛋白質來說，設計DNA半位點更加困難甚至不可能，即使可能，這樣的DNA半位點很難結合蛋白質。方法二不必設計DNA半位點，但需要制備蛋白質抗體，并且需要熒光標記抗體，而且最大的困難在于要設計和制備出通過蛋白質結合產生空間上足夠接近的供體(或受體)標記的抗體和受體(或供體)標記的DNA并不容易，甚至很難。
我們長期從事轉錄因子蛋白檢測技術及DNA和蛋白質相互作用的研究，并且已經建立了多種專利技術，如雙鏈DNA微陣列芯片技術(中國專利ZL02112780.8、02137945.9、03152881.3、03132206.9)、雙鏈核酸分子包被微孔板技術(200410041404.1、200410041403.7)。但我們注意到這些專利技術推廣應用面臨的一些問題，如高昂的芯片制備及使用成本等限制因素。由此，我們著力改進現有的轉錄因子蛋白檢測技術，希望建立一些更加有效的技術，推動相關技術的產業化和應用。本發明中，我們將熒光共振能量傳遞(FRET)技術和核酸酶保護實驗技術巧妙地結合在一起，建立了“核酸酶消化FRET標記核酸探針檢測轉錄因子蛋白”技術，用于檢測轉錄因子蛋白。
發明內容
(1)、發明目的本發明的目的是提供一種可簡便而高效的檢測轉錄因子表達和活化水平的新技術，便于依靠熒光顯微鏡、熒光定量PCR儀、熒光分光光度計等可進行熒光觀測、計量及分析的儀器，實現轉錄因子表達和活化水平的高效檢測分析。為分子生物學、功能基因組學、蛋白質組學及生物醫學等領域中的轉錄因子的相關研究提供一種新的實驗技術，促進這些領域中轉錄因子相關的科學研究，以及針對轉錄因子的臨床檢測和藥物篩選研究。
(2)、技術方案本專利提出了一種檢測轉錄因子表達和活化水平的新技術，即“核酸酶消化FRET標記核酸探針檢測轉錄因子蛋白”，運用該技術可以實現對轉錄因子(Transcription factors，TF)表達(expression)和活化(activation)水平的檢測分析。該技術的核心是將熒光共振能量傳遞(Fluorescence Resonance Energy Transfer，FRET)技術和鑒定轉錄因子蛋白DNA結合位點的核酸酶保護分析(Nuclease Protection Assay)技術巧妙地結合在一起，達到對轉錄因子蛋白以及其他DNA結合蛋白表達和活化水平的高效分析。
運用該技術分析轉錄因子表達及活化水平時，首先依據要檢測的轉錄因子蛋白的DNA結合位點的核苷酸序列，即共同基序(consensus)，以及FRET核酸探針的結構特征，設計并合成具有FRET功能的核酸探針，稱為“FRET標記核酸探針”；檢測時，若待檢溶液中存在轉錄因子蛋白，則轉錄因子蛋白就會與溶液中的FRET標記核酸探針發生序列特異性結合反應(sequence-specific binding)，形成“FRET標記核酸探針/轉錄因子蛋白”復合物(complex)。在這種復合物中，由于轉錄因子蛋白的結合對核酸探針上的FRET標記提供了空間保護，在核酸酶消化時，則核酸酶由于空間障礙而不能觸及并降解FRET標記的核苷酸，因此在熒光檢測時，存在FRET作用結果，而當待檢溶液中不存在轉錄因子蛋白時，裸露的FRET標記核酸探針就會受到核酸酶的攻擊，核酸酶對FRET標記核酸探針發生徹底降解，釋放出FRET標記的單核苷酸，因此在熒光檢測時，FRET作用喪失。
運用該技術檢測轉錄因子蛋白包括如下四個步驟①制備熒光標記的核酸探針；
②核酸探針與轉錄因子蛋白進行結合反應；③將核酸酶加入結合反應體系中進行酶切反應；④對反應體系進行熒光檢測。
制備熒光標記的核酸探針(Nucleic Acids Probes)是運用該技術檢測轉錄因子蛋白(Transcription factors，TF)的第一步，也是很重要的一步。為實現本技術檢測轉錄因子蛋白的功用，熒光標記核酸探針的設計和制備應滿足下列條件①核酸探針為兩條堿基序列(sequence)反向互補(reverse complementary)的單鏈核酸分子(single-stranded nucleic acid molecular)A和B復性(renaturation)形成的雙鏈核酸分子(double-stranded nucleic acid molecular)；②核酸分子A含有熒光標記的核苷酸(Fluorescein labeled nucleotide)，B含有相應的淬滅基團(quencher)或共振熒光(Resonant Fluorophore)標記核苷酸；③核酸分子A、B退火成核酸探針時，A和B的標記核苷酸空間距離接近，A的熒光分子(Fluorophore)受激發時可對B的淬滅基團或共振熒光(Resonant Fluorophore)發生熒光共振能量傳遞(FRET)；④核酸分子A、B退火(annealing)后形成的核酸探針上，含有轉錄因子蛋白可識別并與之結合的核苷酸序列(TF binding sites，consensus)；⑤核酸探針的FRET標記核苷酸對(FRET pairs)可處于兩個轉錄因子蛋白結合序列之間(flanked by two TF binding sites)，或處在一個轉錄因子蛋白結合序列附近(flankingone TF binding site)，或嵌入在一個較長的轉錄因子蛋白結合序列中(inlaying one TFbinding site)；核酸探針為兩條堿基序列反向互補的單鏈核酸分子A和B復性形成的雙鏈核酸分子。其中單鏈核酸分子A和B所含有的核苷酸數目可相同，也可不同；在A和B退火形成雙鏈核酸探針時，核酸探針的兩端可以都是粘性末端(stick ends)，也可以都是平末端(blunt end)，也可以是一端為粘性末端，另一端為平末端；當以粘性末端結尾時，可以是3′突出(protrude)，也可以是5′末端突出。
核酸探針的末端雖然可以表現為多種形式，但要依據檢測步驟③中選用的核酸酶的種類進行相應的設定，以便滿足不同酶對其作用底物DNA的結構要求，達到使用不同的酶和核酸探針都可以實現轉錄因子蛋白的檢測。本技術中使用的核酸酶為Bal31、exonuclease III、E.coli DNA Polymerase I、T4 phage DNA Polymerase、T7 phage DNA Polymerase、λphageexonuclease等核酸外切酶(exonuclease)，它們能從雙鏈DNA的3′或5′末端發生外切反應，逐個釋放單核苷酸(nucleotide)，降解DNA。當利用Bal31為實驗用核酸外切酶時，Bal31催化線性雙鏈DNA(linear duplex DNA)降解(degradation)為5′-單核苷酸(5′-mononucleotides)，線性雙鏈DNA被進行性地(progressively)從5′-和3′-末端降解；核酸探針的末端至少一端為平端或5′突出的粘末端；Bal31具有3′→5′的核酸外切酶活性。當利用exonuclease III為實驗用核酸外切酶時，核酸探針的末端至少一端為平端，或5′突出的粘末端，或突出3′突出14個核苷酸的粘末端，以便exonuclease III從3′羥基端逐一去除單核苷酸，降解(degradation)DNA。
雖然核酸探針的末端形式可以多樣，但為了提高核酸酶消化核酸探針DNA的效率、縮短檢測時間和保證檢測的準確性及精度，運用本技術進行轉錄因子檢測時，最好是線性雙鏈核酸探針DNA分子的兩端結構都滿足所選用的核酸酶對底物DNA的結構要求，以便核酸酶能夠從核酸探針DNA分子的兩端同時發生消化反應，在最短的反應時間內從核酸探針DNA分子上釋放出FRET標記核苷酸，使釋放出的熒光標記核苷酸在熒光檢測中受激發時，產生可以記錄的熒光信號。
FRET標記核酸探針是由單鏈核酸分子A和B退火后形成的線性(linear)雙鏈DNA分子。為了是核酸探針具有FRET功能，探針制備時，使單鏈核酸分子A含有熒光標記的核苷酸(Fluorescein labeled nucleotide)，稱為供體(donor)，如化學合成含有dT-氨基(dT-amino)的寡核苷酸，再用熒光素標記dT-氨基，則使單鏈核酸分子A含有熒光標記的核苷酸；標記核酸分子A所使用的熒光素可以為多種多樣的熒光素，如AMCA、FITC、FAM、TET、JOE、HEX、TAMRA、ROX、CY-3、CY-5等。
探針制備時，針對A所標記的熒光素，使單鏈核酸分子B含有相應的淬滅基團(quencher)或共振熒光(Resonant Fluorophore)標記的核苷酸，稱為受體(receptor)。當使用淬滅基團標記的核苷酸時，A標記的供體熒光素受激發時產生的熒光的釋放波長(emission wave)，應最大面積地重疊淬滅基團的吸收波長(absorbance wave)；如當A標記的熒光素FAM時，B可以標記淬滅基團DABCYL[4-(4[prime]-dimethylaminophenylazo)benzoic acid]，在FAM用484nm波長激發而釋放516nm波長的熒光時，由于DABCYL的吸收波長為453nm，正好覆蓋FAM的釋放波長，此時熒光能量被DABCYL吸收，轉化為熱釋放，而不產生熒光，即淬滅。單鏈核酸分子B的淬滅基團標記，也可以是先化學合成含有dT-氨基(dT-amino)的寡核苷酸，再用淬滅基團標記dT-氨基，則使單鏈核酸分子A含有淬滅基團標記的核苷酸；標記核酸分子B所使用的淬滅基團可以多種多樣，如常用的DABCYL、BHQ等。
當針對A所標記的供體熒光素而使用共振熒光標記單鏈核酸分子B時，標記B的熒光素分子(acceptor)的激發波長應最大程度地重疊供體熒光素分子的發射波長，而供體與受體的最大發射波長差距越大越好。此時，當供體受激發時，所釋放的熒光正好被受體吸收，受體因此受激發產生熒光。溶液中轉錄因子蛋白越多，受保護而不被核酸酶降解的核酸探針越多，此時用供體最大激發波長激發時，則在受體的最大釋放波長處檢測到越高的信號，而在供體的最大發射波長處檢測到越低的信號；相反，溶液中轉錄因子蛋白越少，受核酸酶降解的核酸探針越多，此時用供體最大激發波長激發時，則在受體的最大釋放波長處檢測到信號越低，而在供體的最大釋放波長處檢測到的信號越高。因此，當FRET標記核酸探針用兩種可發生FRET作用的熒光素分子標記時，可以既通過測定受體的信號增強(enhancement)完成蛋白質的檢測，也可以通過測定供體的信號淬滅(quenching)完成蛋白質的檢測，或者通過評定兩種信號間的比率(the ratiobetweentwo signals)完成蛋白質的檢測。比率信號(ratiometric signal)可能更加有用，因為它可能減少細微的人工產生的熒光信號(trivial artifacts)，比如在渾濁或吸收性介質(turbid or absorbing medium)中產生的非特異性淬滅(nonspecific quenching)。
當針對A所標記的熒光素而使用共振熒光標記的單鏈核酸分子B時，FRET標記核酸探針所含有的FRET供體-受體對(FRET donor-acceptor pairs)可以多種多樣，如FAM/TAMRA、TET/TAMRA、HEX/TAMRA、AMCA/fluorescien等。標記核酸探針的FRET供體-受體對選擇的依據是受體熒光分子的激發波長應最大程度地與供體熒光或非熒光分子的發射波長重疊，而供體熒光分子與受體熒光分子的最大釋放波長差距越大越好。如FAM的最大發射波長為521nm，TAMRA的最大激發波長為560nm，FAM的發射光譜和TAMRA激發光譜存在重疊；另外TAMRA的最大發射波長為582nm，與FAM的最大發射波長521nm間存在較大的差距，因此FAM-TAMRA可以構成一對FRET供體-受體對。
選擇好FRET供體-受體對只是制備FRET核酸探針的第一步，關鍵是要嚴格設計好供體-受體對在FRET核酸探針中的空間位置。因為FRET是一種距離依賴性的相互作用，僅當受體與供體間的距離小于10nm時，FRET才能發生。在制備FRET核酸探針時，不管所選擇的供體-受體對中受體為熒光分子還是非熒光的淬滅分子，攜帶供體的單鏈核酸A和攜帶受體的單鏈核酸B退火形成雙鏈線狀FRET核酸探針時，供體必須緊密靠近受體，如一般使用的acceptor-TAAT-donor。在受體與供體間的距離小于10nm的條件下，當供體受激發時，所發射的熒光正好被受體吸收，供體因此受激發發射熒光或淬滅熒光。
為了降低FRET標記核酸探針的制備成本，最好采用上述兩條堿基序列反向互補的單鏈核酸分子A和B復性形成的雙鏈核酸分子的途徑，此種情況下也非常有利于受體和供體的標記。但也可以在制備中將單鏈核酸分子A和B連接在一起形成一條核酸分子，通過鏈內復性形成發卡結構的雙螺旋核酸探針，在這種此發卡結構的核酸探針中，核酸酶一般只能從含有3′與5′端兩個自由末端的一端消化FRET標記核酸探針，因此會降低反應效率。這種發卡結構的核酸探針制備成本和難度都會提高，因此并不是本技術優先選用的FRET標記的核酸探針結構。
由于序列特異性DNA結合蛋白(如轉錄因子)與其靶DNA的相互作用一般發生在蛋白質和雙鏈核酸之間，因此用來檢測轉錄因子的DNA探針一般是雙鏈核酸分子，常用化學合成的兩條堿基序列反向互補的寡核苷酸退火制備DNA探針。此時，在合成的寡核苷酸上要加入轉錄因子蛋白的結合序列，一般為共同基序(consensus)。本技術中制備的FRET核酸探針也不例外，在設計和合成單鏈核酸分子A和B時，A、B的序列中嵌入特定轉錄因子蛋白的結合序列。例如，制備檢測轉錄因子蛋白p53的DNA探針時，在單鏈核酸分子A上嵌入序列5′-AGACATGCCTAGACATGCCT-3′，而在單鏈核酸分子B上嵌入序列3′-TCTGTACGGATCTGTACGGA-5′，A、B退火后形成的核酸探針上，則含有5′-AGACATGCCTAGACATGCCT-3′3′-TCTGTACGGATCTGTACGGA-5′序列，這正構成了轉錄因子蛋白p53的結合序列；再如制備檢測轉錄因子蛋白SP1的DNA探針時，在單鏈核酸分子A上嵌入序列5′-GGGGCGGGGC-3′，而在單鏈核酸分子B上嵌入序列3′-CCCCGCCCCG-5′，A、B退火后形成的核酸探針上，則含有5′-GGGGCGGGGC-3′3′-CCCCGCCCCG-5′序列，就構成了轉錄因子蛋白SP1的結合序列。轉錄因子蛋白的結合序列，除從自然生物基因組中鑒定發現的結合序列如共同基序(consensus)外，也可以是經體內外實驗篩選的轉錄因子蛋白對其有良好序列特異性結合親合性的核酸序列。轉錄因子蛋白的結合序列在制備的FRET核酸探針上一般應含有旁側序列(flanking sequence)，才能很好地與溶液中的轉錄因子蛋白識別結合，并且不同的轉錄因子蛋白對旁側序列長度的要求也不一定相同，在探針設計時，應注意在轉錄因子蛋白結合序列旁側添加有效長度的旁側序列。
由于運用本技術分析轉錄因子表達及活化水平，依靠的是將FRET技術和核酸酶保護分析技術巧妙地結合在一起，通過FRET標記核酸探針與轉錄因子蛋白發生結合形成“FRET標記核酸探針/轉錄因子蛋白”復合物時，轉錄因子蛋白對核酸探針上的FRET供體-受體對提供空間保護，從而免遭核酸酶降解而保持FRET功能，而那些未被轉錄因子蛋白保護的FRET供體-受體對被核酸酶降解，喪失FRET功能。因此將轉錄因子蛋白的有無與FRET標記核酸探針的核酸酶降解與否建立聯系，通過熒光分析FRET標記核酸探針的核酸酶降解情況，反映溶液中轉錄因子蛋白的有無及水平。正是由于這一機理，一個非常重要的問題就是嚴密安排FRET標記核酸探針上FRET供體-受體對與轉錄因子蛋白結合序列的空間位置，要確保溶液中轉錄因子蛋白結合到FRET標記核酸探針的轉錄因子蛋白結合序列時，轉錄因子蛋白對FRET供體-受體對提供充分的空間保護，避免遭受核酸酶的攻擊。
為了達到上述效果，FRET標記核酸探針上FRET供體-受體對(FRET pairs)和轉錄因子蛋白結合序列的位置可以有三種，一是FRET供體-受體對處于兩個轉錄因子蛋白結合序列之間(flanked by two TF binding sites)，即“轉錄因子蛋白結合序列——FRET供體-受體對——轉錄因子蛋白結合序列”；這種情況下，當兩個轉錄因子蛋白與FRET標記核酸探針上的兩個轉錄因子蛋白結合序列結合后，就很好地保護了處于兩個轉錄因子蛋白結合序列之間的那部分核酸序列，其中包括FRET供體-受體對，使這些核酸序列避免核酸酶的攻擊，即達到當轉錄因子蛋白與FRET標記核酸探針結合時，FRET供體-受體對不能夠被核酸酶降解，因而激發時產生熒光共振能量傳遞。二是FRET供體-受體對處于一個轉錄因子蛋白結合序列附近(flanking one TF binding site)，即“轉錄因子蛋白結合序列——FRET供體-受體對”；這種情況下，FRET供體-受體對與轉錄因子蛋白結合序列緊密相臨(close proximity)，使FRET供體-受體對處在轉錄因子蛋白結合后受保護的旁側序列中，不能夠被核酸酶降解。這種設計的依據是轉錄因子蛋白與其靶DNA結合時，除了轉錄因子蛋白與其DNA結合序列發生化學鍵結合反應如氫鍵外，轉錄因子蛋白還在空間上覆蓋了結合序列旁的一些核苷酸，這些核苷酸雖然不直接與轉錄因子蛋白發生結合，也不是轉錄因子蛋白DNA結合序列的一部分，但由于受到轉錄因子蛋白提供的空間蔭護，在核酸酶保護分析中也不能被核酸酶降解，而處在核酸酶足跡中(footprinting)。這種情況下減少了FRET標記核酸探針上轉錄因子蛋白的結合序列數，核酸探針可以縮短，降低制備成本，但由于FRET供體-受體對離轉錄因子蛋白結合序列太近，可能會對轉錄因子蛋白的結合產生影響。三是FRET供體-受體對嵌入在一個較長的轉錄因子蛋白結合序列中(inlaying one TF binding site)，即標記FRET供體-受體對的核苷酸本身是轉錄因子蛋白結合序列中的核苷酸，如嵌合FRET供體-受體對的轉錄因子p53的結合位點為5′-AGACATGCC AGACATGCCT-3′3′-TCTGTACGGA CTGTACGGA-5′序列，其中兩個 為FRET供體-受體對，如dT-Fluorescein和dT-Dabcyl；這種情況對那些DNA結合序列較長的轉錄因子蛋白最適宜，對于那些結合序列比較短的轉錄因子蛋白來說，則非常困難，甚至不可能，而且FRET的引入可能會對轉錄因子蛋白的結合產生影響。
相比較而言，本技術更偏好“轉錄因子蛋白結合序列——FRET供體-受體對——轉錄因子蛋白結合序列”這種模式的FRET標記核酸探針，這種情況下，兩個轉錄因子蛋白結合序列間的核苷酸數可以適當增加，以便轉錄因子蛋白的結合；FRET供體-受體對(FRET pairs)在上面第三種模式時，還受到轉錄因子蛋白結合序列中核苷酸種類的影響，不能夠人工隨意設置價廉高效的標記核苷酸如dT，因為某些轉錄因子蛋白結合序列中并不含有AT序列，但在第一種模式時，可以兩個轉錄因子蛋白結合序列間的無關核苷酸中任意設置價廉高效的標記核苷酸如acceptor-TAAT-donor，而不受轉錄因子蛋白結合序列中核苷酸種類的限制。另外，使用第一種模式時，可以設計FRET供體-受體對(FRET pairs)離轉錄因子蛋白結合序列足夠遠，從而避免第二種和第三種模式中，FRET供體-受體對對轉錄因子蛋白結合的影響。而且利用第三種模式時，可以非常方便的解決第三種模式中DNA結合序列較短的轉錄因子蛋白的探針設計困難，即第三種模式中FRET供體-受體對設計不受轉錄因子蛋白DNA結合序列的影響。
本技術中FRET標記核酸探針上的FRET供體-受體對的數量并不限制在數量為1個，轉錄因子蛋白結合序列的數量也并不限制在數量為1到2個。增加FRET供體-受體對的數量可以提高檢測的靈敏性，特別是采用第三種探針模式時，可以在兩個轉錄因子蛋白結合序列間的無關核苷酸中可以設置多個FRET供體-受體對，也可以設置成“轉錄因子蛋白結合序列——FRET供體-受體對——轉錄因子蛋白結合序列——FRET供體-受體對——轉錄因子蛋白結合序列”的形式，但為了縮短探針，降低成本，最好是一個探針上兩端各含一個轉錄因子蛋白結合序列，兩個轉錄因子蛋白結合序列間的無關核苷酸中設置多個FRET供體-受體對。在第二種探針模式中，可以在轉錄因子蛋白結合序列的兩端各設置一個到多個FRET供體-受體對。在第三種探針模式中，可以在探針設置多個轉錄因子蛋白結合序列，每個轉錄因子蛋白結合序列中含一個FRET供體-受體對。
本技術中當在一個核酸探針上設置多個FRET供體-受體對時，可以是多個“供體-受體”對，如“acceptor-TAAT-donor——acceptor-TAAT-donor——acceptor-TAAT-donor”等，也可以是一個供體配多個受體，只要每個受體與供體間的距離滿足FRET要求，如“受體——受體——供體——受體——受體”的情況。
本技術中核酸探針上設置的FRET供體-受體對，供體和受體可以處在兩條核酸鏈上，如上面設計的轉錄因子p53的結合位點5′-AGACATGCC AGACATGCCT-3＇3＇-TCTGTACGGA CTGTACGGA-5′序列( FRET供體-受體對)，也可以出現在同一條核酸鏈上，如把轉錄因子p53的結合位點設計為5′-GTCACAGACATGCCTAGACATGCCTTGCAGT GATACCAGACATGCCTAGACATGCCT-3′3′-CAGTGTCTGTACGGATCTGTACGGAACGTCAAACTATGGTCTGTACGGATCTGTACGGA-5＇序列，其中兩個 為FRET供體-受體對，如dT-Fluorescein-dT-Dabcyl。
本技術中用于檢測的轉錄因子蛋白為各種來源的轉錄因子蛋白，包括人工表達制備的轉錄因子蛋白、從細胞或組織裂解物中分離純化的轉錄因子蛋白和含有轉錄因子蛋白的細胞或組織抽提物。檢測中首先要在適宜反應溫度(如37℃)將核酸探針與轉錄因子蛋白在結合緩沖液中一起孵育適當時間，如20分鐘到半小時，其作用是轉錄因子蛋白與核酸探針在溶液中發生序列特異性識別并結合。結合反應體系中加入的核酸探針的量要適宜。檢測中可以在同一反應體系中加入檢測不同轉錄因子蛋白的核酸探針，以高通量檢測多種轉錄因子蛋白，但這種情況下，檢測不同轉錄因子蛋白的核酸探針所含有的FRET供體-受體對的檢測熒光波長要有區別，如“FAM-Dabcyl”和“CAMA-Dabcyl”，可分別用494nm和353nm激發，在520nm和422nm進行檢測，就可以獲得兩種核酸探針要檢測的轉錄因子蛋白信息。
在轉錄因子蛋白與核酸探針發生序列特異性結合后，將核酸酶反應液加入反應體系中，使核酸酶對核酸探針發生消化反應，徹底降解未與轉錄因子蛋白結合的核酸探針，使降解的核酸探針中的FRET供體-受體對分離，喪失FRET功能。消化核酸探針所使用核酸酶為核酸外切酶，如Bal31、exonuclease III、λphage exonuclease等，或具有核酸外切酶功能的其他酶，如具有3′→5′、5′→3′外切酶功能的E.coli DNA Polymerase I、T4phage DNA Polymerase、T7phage DNA Polymerase等核酸聚合酶。本技術中所使用核酸酶能從雙鏈DNA的3′或5′端一端發生外切反應，或同時從3′和5′發生端外切反應，從核酸探針上逐個釋放單核苷酸(nucleotide)，降解核酸探針。本技術優先選用那些價廉而反應效率高的核酸酶。
在核酸酶反應結束后，直接對反應體系進行熒光檢測，檢測可用熒光顯微鏡、熒光定量PCR儀、熒光分光光度計等可進行熒光觀測、計量及分析的儀器進行。使用熒光定量PCR儀可以實時觀察核酸酶酶切反應進展，進行反應動態分析；利用熒光分光光度計可以觀察到熒光光譜，當供體和受體都為FRET熒光分子標記時，可以非常有利地同時觀察供體和受體的激發光譜，便于用供-受體熒光比率測定蛋白質。
(3)、技術效果轉錄因子蛋白因負責基因表達的調控成為目前基因組和蛋白組研究所重視的一類重要蛋白質，而且許多疾病與轉錄因子異常表達及活化間存在的密的關系，引起了生物醫藥領域對轉錄因子研究的關注，轉錄因子已經成為轉錄治療和藥物研究的重要靶點。在這些背景下，有關轉錄因子功能檢測及分析的技術研究受到科學界的重視。多種基于DNA/蛋白質相互作用這一層次的轉錄因子檢測分析技術得到發展，如電泳遷移率變動分析。這一技術及相關的改進技術目前雖然有效地用于轉錄因子的檢測分析，但它們存在放射性標記對實驗人員及環境危害的缺陷、對實驗樣品數量需求大、實驗耗時長、分析效率低及難以高通量化獲取生物等缺陷。為了建立從技術思想角度上完全不同于凝膠遷移實驗的轉錄因子表達及活化檢測及分析技術，我們已經進行了諸多相關研究，并發展了一些新的技術，本發明提出的技術就是其中之一。利用本技術檢測轉錄因子蛋白的新方法，可以克服傳統檢測轉錄因子蛋白方法的一些重要缺陷，實現轉錄因子蛋白的高效分析。
本發明提出一種新的可高同量檢測轉錄因子蛋白的方法，即“核酸酶消化FRET標記核酸探針檢測轉錄因子蛋白”。這一技術即熒光共振能量傳遞(FRET)技術和核酸酶保護分析技術奇妙地結合在一起，利用非常簡便的實驗程序實現對轉錄因子蛋白的高效檢測分析。
利用本發明提出的技術檢測轉錄因子蛋白時，除最后的熒光檢測步驟外，經過簡單的三個實驗步驟就可以完成對轉錄因子蛋白的分析。在商業提供熒光標記的核酸探針時，本技術只經過一個一般只需30分鐘的結合反應和5到10分鐘的酶消化反應，就可以完成轉錄因子蛋白的檢測實驗。由于本技術實驗步驟簡單，同時可以檢測多種轉錄因子蛋白，因此具有較高實驗效率。
本發明提供了轉錄因子檢測新方法，可以借助多種檢測設備來進行，如熒光顯微鏡、熒光定量PCR儀、熒光分光光度計等可進行熒光觀測、計量及分析的儀器。由于這些儀器價值并不十分昂貴，已經在很多實驗室達到普及應用，因此極大地方便了本技術的推廣使用。而且利用不同的儀器，可以特征性地反映出實驗檢測分析的不同側面的特性，如使用熒光定量PCR儀可以實時觀察核酸酶酶切反應進展，進行反應動態分析；利用熒光分光光度計可以觀察到熒光光譜，當供體和受體都為FRET熒光分子標記時，可以非常有利地同時觀察供體和受體的激發光譜，便于用供-受體熒光比率測定蛋白質。
我們的研究及產品研發實驗已經證明，在普通實驗設備條件下，使用較小的資金消耗，就可以實現核酸探針的相關配套試劑的制備，從而生產出可投入到科研、醫療等產品應用場所能夠使用的試劑盒。因此，該技術將為分子生物學、功能基因組學、蛋白質組學等領域中的轉錄因子的相關研究提供一種新的實驗技術，促進這些領域中轉錄因子相關的科學研究。
本發明技術生產的轉錄因子蛋白檢測試劑盒，將在臨床輔助診斷和生物醫學中針對轉錄因子的藥物篩選研究具有非常重要的應用價值。例如，轉錄因子p53、NF-kB的表達及活化異常，在許多疾病中發揮的重要作用，因此成為臨床診斷中觀測的重要靶點，同時也是轉錄治療和藥物篩選重要靶點。
四
圖1核酸酶保護FRET核酸分子檢測轉錄因子蛋白原理示意圖a注解PBS蛋白質結合位點(Protein Binding Site)FS旁側序列(Flanking Sequence)D供體(Donor)A受體(Acceptor)TFB轉錄因子結合(Transcription Factor Binding)ND核酸酶降解(Nuclease Degrading)FD熒光檢測(Fluorescence Detection)圖2核酸酶保護FRET核酸分子檢測轉錄因子蛋白原理示意圖b注解PBS蛋白質結合位點(Protein Binding Site)FS旁側序列(Flanking Sequence)D供體(Donor)A受體(Acceptor)TFB轉錄因子結合(Transcription Factor Binding)ND核酸酶降解(Nuclease Degrading)FD熒光檢測(Fluorescence Detection)圖3FAM標記的供體寡核苷酸、Dabcyl標記的受體寡核苷酸以及供體和受體寡核苷酸混合、復性產物的熒光分析結果注解FFAM標記供體寡核苷酸(FAM)
DDabcyl標記受體寡核苷酸(Dabcyl)M供體、受體寡核苷酸混合物(Mixture)A供體、受體寡核苷酸混合物退火(Annealing)圖4核酸酶Bal31消化前后的FRET標記核酸探針熒光檢測注解N+FRET標記核酸探針+Bal31(Nuclease Bal31+)N-FRET標記核酸探針(Nuclease Bal31-)圖5核酸酶Bal31消化FRET標記核酸探針動態熒光檢測注解N+FRET標記核酸探針+Bal31(Nuclease Bal31+)N-FRET標記核酸探針(Nuclease Bal31-)圖6核酸酶Bal31消化NF-κB結合FRET標記核酸探針的熒光檢測注解1FRET標記核酸探針+Bal312轉錄因子蛋白+FRET標記核酸探針+Bal313FRET標記核酸探針圖7核酸酶Bal31消化不同濃度NF-κB結合FRET標記核酸探針的熒光檢測注解1FRET標記核酸探針+Bal312-5不同濃度轉錄因子蛋白+FRET標記核酸探針+Bal313FRET標記核酸探針五具體實施方式
此處僅以制備FAM/Dabcyl標記FRET核酸探針檢測轉錄因子蛋白NF-κB的實驗為例，說明本發明技術的具體實施方式
。
1、FRET標記核酸探針的設計及化學合成我們設計并由中國上海博亞生物技術有限公司(BIOASIA Biologic Technology Co.LTD.，Shanghai，China)合成如下兩條堿基序列反向互補的寡核苷酸，用于制備檢測NF-κB的FRET核酸探針FAM-strand5′...AGTTGAGGGGACTTTCCCGAA TCGGGGACTTTCCCAGGC...3′( dT-FAM)Dabcyl-strand3′...TCAACTCCCCTGAAAGGGCT AAGCCCCTGAAAGGGTCCG...5′( dT-Dabcyl)寡核苷酸中下劃線序列為NF-κB結合序列。
將寡核苷酸FAM-strand和Dabcyl-strand以100μM濃度溶解在TEN緩沖液(10mM Tris，1mM EDTA，0.1M NaCl，pH8.0)中；將寡核苷酸FAM-strand和Dabcyl-strand溶液等摩爾(molar)混合，95℃保溫10分鐘，緩慢冷卻到15～25℃，成為FRET標記核酸探針。用TEN緩沖液稀釋部分FRET核酸探針原液至濃度為5pmol/μl，4℃保存備用。
2、FRET標記核酸探針與轉錄因子蛋白NF-κB的結合將1μl轉錄因子NF-κB蛋白[rhNF-κB(p50)，E3770，Promega)]加入7μl 1×DNA結合緩沖液(10mM HEPES pH7.9，50mM KCl，2.5mM DTT，0.1mM EDTA，0.05％NP-40，10％Glycerol，5％fetal bovine serum)中，37℃孵育10分鐘，再加入2μl 5μM FRET標記核酸探針，37℃繼續孵育20分鐘。
3、核酸外切酶Bal31反應將5μl 2×反應緩沖液[40mM Tris-HCl(pH8.0at 25℃)，25mM CaCl2，25mM MgCl2，1.2mM NaCl]和0.2μl 4U/μl nuclease Bal31(MBI Fermentas，#EN0191)加入結合反應體系中，37℃孵育5～10分鐘。
4、熒光檢測若進行酶切動態分析，可將核酸酶Bal31反應溶液在檢測前加入結合反應體系中，使用熒光定量PCR如(RotorGene2000)進行酶切動態分析，此種情況下可以非常明確地了解到酶反應速度及達到平衡所需要的時間，確定最佳酶切溫度及時間等參數。若要進行熒光打譜，在核酸外切酶III反應結束后(一般5分鐘即可)，向核酸酶Bal31反應溶液中加入1μl 0.5MEDTA(pH8.0)終止核酸酶Bal31反應，臨檢測前向溶液中在加入100μl TEN緩沖液，將溶液轉入比色杯中，用LS 55(Perkin Elmer)熒光分光光度計在25℃測定熒光光譜。
在蛋白質濃度定量分析中，首先要用不同的已知濃度的蛋白質溶液進行上面的檢測分析，制作出“蛋白濃度-熒光”標準曲線，將待測蛋白溶液的熒光信號與標準曲線比較，就可以確定待測溶液中靶蛋白的濃度。
測定細胞或組織抽提物時，DNA結合緩沖液中應加入poly(dI-dT)或鮭魚精DNA等DNA，使細胞或組織抽提物與DNA結合緩沖液孵育10分鐘后，再加入FRET標記核酸探針，繼續孵育20分鐘后，進行酶切反應及熒光檢測。
權利要求
1.核酸酶消化FRET標記核酸探針檢測轉錄因子蛋白，提出了一種檢測轉錄因子蛋白的新方法，其特征在于運用該方法檢測轉錄因子蛋白包括如下四個步驟a)制備FRET標記核酸探針；b)FRET標記核酸探針與轉錄因子蛋白進行結合反應；c)將核酸酶加入結合反應體系中進行酶切反應；d)對反應體系進行熒光檢測。
2.根據權利要求1所述的核酸酶消化FRET標記核酸探針檢測轉錄因子蛋白，其特征在于步驟(a)準備的FRET標記核酸探針為兩條堿基序列反向互補的單鏈核酸分子A和B復性后形成的雙鏈核酸分子；
3.根據權利要求2所述的核酸分子A和B，其特征在于核酸分子A含有供體標記的核苷酸，核酸分子B含有相應的受體標記的核苷酸；
4.根據權利要求3所述的供體，其特征在于它是可產生熒光的化學基團、化學分子；
5.根據權利要求3所述的受體，其特征在于它可吸收供體發射的熒光，受體既可以是吸收供體發射的熒光后不再發射熒光的化學基團或化學分子，也可以是吸收供體發射的熒光后再發射熒光的化學基團或化學分子；
6.根據權利要求2所述的核酸分子A和B，其特征在于A和B退火形成核酸探針時，供體和受體標記的核苷酸存在足夠接近的空間距離，確保供體受激發時可對受體發生熒光共振能量傳遞(FRET)；
7.根據權利要求2所述的核酸分子A和B，其特征在于核酸分子A和B退火后形成的雙鏈核酸分子上，含有轉錄因子蛋白可識別并與之結合的核苷酸序列；
8.根據權利要求3所述的供體和受體標記的核苷酸，其特征在于它們在核酸探針上的位置可處于兩個轉錄因子蛋白結合序列之間，或處在一個轉錄因子蛋白結合序列附近，或嵌入在一個較長的轉錄因子蛋白結合序列中；
9.根據權利要求1所述的核酸酶消化FRET標記核酸探針檢測轉錄因子蛋白，其特征在于步驟(b)中與FRET標記核酸探針結合的轉錄因子蛋白，為各種來源的轉錄因子蛋白，包括人工表達制備的轉錄因子蛋白、從細胞或組織裂解物中分離純化的轉錄因子蛋白和含有轉錄因子蛋白的細胞或組織抽提物；
10.根據權利要求1所述的核酸酶消化FRET標記核酸探針檢測轉錄因子蛋白，其特征在于步驟(b)中FRET標記核酸探針與轉錄因子蛋白的結合，是轉錄因子蛋白與核酸探針間發生序列特異性識別并結合的過程；
11.根據權利要求1所述的核酸酶消化FRET標記核酸探針檢測轉錄因子蛋白，其特征在于步驟(c)中將核酸酶加入結合反應體系中進行的酶切反應，是核酸酶對核酸探針發生消化反應的過程；
12.根據權利要求1所述的核酸酶消化FRET標記核酸探針檢測轉錄因子蛋白，其特征在于步驟(c)中的核酸酶為Bal31和exonuclease III等具有核酸外切活性的核酸酶，它們能從雙鏈DNA的3′或5′發生外切反應，逐個釋放單核苷酸；
13.根據權利要求1所述的核酸酶消化FRET標記核酸探針檢測轉錄因子蛋白，其特征在于步驟(d)中對反應體系進行的熒光檢測，可用熒光顯微鏡、熒光定量PCR儀、熒光分光光度計等可進行熒光觀測、計量及分析的儀器。
全文摘要
轉錄因子是一類負責基因表達調控的重要蛋白質，是基因表達調控通路及網絡的樞紐，是功能基因組和蛋白質組研究的重要對象，也是轉錄治療和藥物研究的重要靶點。本發明提出了一種檢測轉錄因子表達和活化水平的新方法“核酸酶保護FRET核酸分子檢測轉錄因子蛋白”。運用該方法分析轉錄因子表達和活化水平包括如下步驟(a)制備熒光標記的核酸探針；(b)核酸探針與轉錄因子蛋白進行結合反應；(c)將核酸酶加入結合反應體系中進行酶切反應；(d)對反應體系進行熒光檢測反映轉錄因子蛋白表達和活化水平。
文檔編號G01N33/50GK1727895SQ200410041558
公開日2006年2月1日 申請日期2004年7月30日 優先權日2004年7月30日
發明者王進科 申請人:王進科, 南京新益華集團公司