專利名稱：檢測單核苷酸多態性的光纖表面等離子體波核酸傳感器系統及檢測方法
技術領域：
本發明涉及一種將表面等離子體波共振效應與光纖技術結合在一起的新型光纖核酸傳感器系統，它可應用于人類基因組研究單核苷酸多態性(SNP)。
背景技術：
表面等離子體波共振(以下簡稱SPR)效應是一種發生在金屬與電介質界面上的物理光學現象，它對附著在金屬表面電介質的折射率變化非常敏感。基于該效應的生物傳感技術已廣泛應用于免疫學、藥物篩選等多個生化研究領域。
隨著人類基因組精確序列圖的完成，人類基因組研究的重點已進入后基因組時代，其主要內容之一就是建立以單核苷酸多態性(single nucleotidepolymorphism，SNP)為代表的脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)序列變異的系統目錄。我國正在構建和研究中華民族基因組單核苷酸多態性(SNP)系統目錄。
人類基因組由30億個單核苷酸組成。人類基因組DNA序列中最常見的變異形式就是單核苷酸多態性(以下簡稱SNP)，即在其DNA序列上的某些特定的位置出現不同的堿基。SNP是廣泛分布于人類全基因組中穩定的多態位點，代表了不同個體之間最大的遺傳差異。不同人群間的SNP等位基因頻率可以有相當大的差別，某些SNP甚至還呈現群體專一性。對SNP及其突變的研究已經成為當今的生命科學領域的研究熱點。
目前，應用最為廣泛的研究SNP、發現突變位點的方法主要是依靠對基因的核苷酸序列測定，即測序的方法。將目標基因組用聚合酶鏈反應-單鏈構象多態性(PCR-SSCP)方法獲得擴增產物，對產物分析測序再與公共數據庫中的序列比對。測序法只能發現少量SNP，低頻率的SNP往往不能發現。隨著分子生物學實驗技術的發展，有許多新技術應用于SNP研究。以分子雜交為基礎衍生了很多相關的技術，如位點特異性探針的應用、Tagman實驗、分子燈塔(molecularbeacons)技術、Minisequencing等等。但由于這些方法讀需要熒光標記以及專門的分析儀器，大規模地發現和篩選SNP的可行性較差。其他一些檢測SNP的方法也只能發現SNP所在的區域，但不能確定SNP的具體定位和特征。
由于SPR測定技術屬于一種可以在表面上示蹤生物分子特性以及相互作用的方法，具有實時、無須標記、原位跟蹤動力學表面過程的能力，對樣品本身無損傷等優點，并可獲得許多其他方法難以獲得的動力學數據。近兩年來，國外有些研究組開始試圖應用SPR技術來研究SNP。
美國Wilson于2002年在Science著文“Tech Sight.Analyzingbiomolecular interactions”，利用帶有探針分子的SPR傳感器來檢測SNP。美國Oldenburg等于2002年10月在Anal Biochem(分析生物化學)發表研究報告，用SPR方法和微陣列芯片雜交技術檢測人乳腺癌基因BRCA1的SNP。德國Behrensdorf等于2002年在Nucleic Acids Res(核酸研究)發表研究報告，制備DNA探針芯片，用SPR方法通過熒光標記探針的雜交成功地快速檢測了p53基因(目前研究最多的腫瘤抑制基因)不同外顯子的單堿基突變位點，即多態性，適合于SNP的大規模篩查。日本Nakatan等于2001年在Nat Biotechnol(自然生物技術)發表研究報告，用SPR方法檢測HSP70-2基因的G-G單堿基錯配。
目前國內外研究開發的大多是基于棱鏡結構的SPR傳感器。如1983年，瑞典LINKOPING理工學院應用物理實驗室Liedberg等首先將其用于IgG與其抗原抗體之間特異性相互作用的檢測，并由BIAcore公司開發出SPR傳感器。此后SPR傳感器的研究與改進迅速發展，SPR傳感器及以BIACORE為代表的商品SPR傳感器在生物醫學中的應用也日益廣泛。在國內，也有許多單位對棱鏡表面等離子體波傳感器進行研究。如中國科學院電子學研究所、長春應用化學研究所、動物研究所及清華大學等都對這種傳感器在生物、化學及生化檢測等方面的應用進行了研究，并取得了一定的成果。
隨著研究工作的不斷深入，以棱鏡耦合為基礎的Kretschmann模型也顯現出傳感部分體積較大，不適合遠程遙測場合以及SPR信號易受到機械結構、光源波動等外界因素影響的缺點。為解決這些問題，1993年美國華盛頓大學R.C.Jorgenson和Yee提出將光纖纖芯作為激發SPR效應的載體，采用金作為金屬膜層增覆在纖芯表面研制了光纖表面等離子體波傳感器。我們在對這種新型光纖傳感結構進行大量研究的基礎上，采用特殊的鍍膜工藝在光纖SPR探頭金屬薄膜表層再增覆上一層SNP特異性探針固定膜，制成光纖表面等離子體波核酸傳感器。
發明內容
目前應用最為廣泛的研究SNP、發現突變位點的方法主要是依靠對基因的核苷酸序列測定，即測序的方法。由于這些方法都需要熒光標記以及專門的分析儀器，大規模地發現和篩選SNP的可行性較差，并只能發現SNP所在的區域，而無法確定SNP的具體定位和特征，本發明的目的在于克服以上缺點。同時由于采用了光纖纖芯作為SPR效應的激發基體和傳感部分，因此它又可避免棱鏡結構的SPR傳感系統顯現出的傳感部分體積較大，不適合遠程遙測場合以及SPR信號易受到機械結構、光源波動等外界因素影響的缺點。
本發明檢測單核苷酸多態性的光纖表面等離子體波核酸傳感器系統包括寬帶光源經P型偏振片與Y型光纖耦合器的輸入端相連，Y型光纖耦合器的輸出端通過耦合器接頭連于傳感光纖，該光纖末端可以是終端反射式光纖表面等離子體波核酸傳感器探頭，或者是分布式光纖表面等離子體波核酸傳感器探頭，Y型光纖耦合器的反射端連于與計算機相連的光譜儀。
終端反射式光纖表面等離子體波核酸傳感器探頭包括纖芯、位于光纖芯端面的微反射鏡、光纖芯表面的金屬層，涂覆在金屬層表面的SNP特異性探針固定膜。
分布式光纖表面等離子體波核酸傳感器的組成是在同一根光纖上可以制備多個在線反射式光纖表面等離子體波核酸傳感器探頭，該光纖的末端設置為終端反射式光纖表面等離子體波核酸傳感器探頭。
本發明采用相對光譜檢測方法，在測量時，首先將輸入光譜信號作為基準信號保存，接著將光纖表面等離子體波核酸傳感器探頭置于待測樣本試液中，得到反射回的表面等離子體波共振光譜信號，再將該光譜信號與基準信號比較，從而獲得表面等離子體波共振光譜共振波長的精確值。
本發明的有益效果是采用可以在表面上測試生物分子特性以及相互作用的SPR技術，利用SPR效應對環境介質折射率變化分辨率高、響應快、高通量、敏感、特異、簡便、對樣品本身無損傷等優點，并可獲得許多其他方法難以獲得的動力學數據；同時由于采用了光纖作為傳感基體，又具有抗電磁干擾能力強、耐高壓、耐腐蝕、傳感探頭尺寸小、可實現分布式測量以及遠程遙測監控等優點；通過簡化傳感系統結構且采用相對光譜檢測技術，可提高測量精度，克服光強測量易受光源不穩定影響的缺點。
圖1是檢測單核苷酸多態性的光纖表面等離子體波核酸傳感器系統組成示意圖。
圖2是Y型光纖耦合器示意圖。
圖3是終端反射式光纖表面等離子體波核酸傳感器探頭示意圖。
圖4是分布式光纖表面等離子體波核酸傳感器探頭示意圖。
圖5是在線反射式光纖表面等離子體波核酸傳感器探頭示意圖。
上述圖中的標號名稱1.寬帶光源，2.P型偏振片，3.Y型光纖耦合器，4.耦合器接頭，5.傳感光纖，6.終端反射式光纖表面等離子體波核酸傳感器探頭，7.光譜儀，8.計算機，9.在線反射式光纖表面等離子體波核酸傳感器探頭，61.纖芯，62.金屬層，63.微反射鏡，64.SNP特異性探針固定膜，10.包層，11.涂覆層。
具體實施例方式由圖1可知，本發明檢測單核苷酸多態性的光纖表面等離子體波核酸傳感器系統的具體組成是，寬帶光源1(可采用LG150型寬帶光源)經P型偏振片2，將S偏振光濾去，僅使P偏振光耦合進入Y型光纖耦合器3(如圖2所示)的輸入端，傳播到Y型光纖耦合器3的輸出端，再通過耦合器接頭4，經過傳感光纖5傳播到終端反射式光纖表面等離子體波核酸傳感探頭6，與待測樣本中的核酸分子相互作用產生表面等離子體波共振效應，在經過探頭6中的纖芯端面的微反射鏡作用后形成反射光線通過Y型光纖耦合器3的反射端進入光譜儀7(可采用EPP2000型光譜儀)，再經過計算機8處理輸出反射光強度與光波長之間的關系曲線，從而實現了整個測量光路部分的全光纖化。
圖3是終端反射式光纖表面等離子體波核酸傳感器探頭示意圖。它包括纖芯61、纖芯61端面的微反射鏡63、纖芯61表層的金屬層62以及金屬層62外層的SNP特異性探針固定膜64。
在金屬表層用分子自組裝技術化學修飾覆蓋氨丙基三乙氧基硅烷，將所設計的可檢測單核苷酸多態性的特異性靶DNA探針用雙功能偶聯劑以共價偶聯法結合到金屬表層，再引入生物素一親和素放大系統，與待測樣本中的DNA分子實現互補結合。通過檢測共振波長的變化情況實現對樣本中DNA分子的SNP的識別與檢測。
表面等變化離子共振技術可以定性的判斷兩分子之間是否有相互作用，比較一種分子與其他分子之間相互作用的強弱，也可以實時定量的測定分子間相互作用的親和力參數(平衡常數)和動力學參數(速率常數)，甚至熱力學參數(反應的焓)。該技術利用了物理光學的原理，在研究兩分子相互作用時，將一種分子固定在SPR傳感探頭表面，而另一種分子的溶液流過其表面，兩種分子的結合會使傳感片表面的折射率改變，因此可以檢測兩分子間的相互作用。
圖4是分布式光纖表面等離子體波核酸傳感器探頭示意圖。它的具體組成是在同一根光纖纖芯61的不同位置涂覆一層不同類型的金屬層62，在不同類型金屬層62外側再增覆一層SNP特異性探針固定膜64組成如圖5所示的在線反射式光纖表面等離子體波核酸傳感器探頭9。因此在同一根光纖上可以同時設置多個在線反射式光纖表面等離子體波核酸傳感器探頭9，并將該光纖的末端加工為終端反射式光纖表面等離子體波核酸傳感器探頭6。
根據SPR光譜輸出特性，通過在光纖纖芯的不同位置涂覆不同類型的金屬層(金或銀)和SNP特異探針固定膜構成可對SNP實現多位點探測的分布式光纖表面等離子體波核酸傳感器。當這些SPR傳感段處于不同在測試環境或介質中時，不同的待測核酸分子與特異性探針會發生不同的互補結合，從而引起各個SPR傳感器附近折射率的變化，這就會在同一根光纖上多處激發表面等離子體波共振效應。通過對傳感器輸出SPR光譜的不同共振波長的檢測，可以得到分布式檢測的信號。
相對光譜檢測方法當光纖SPR傳感探頭的結構一定時，發生表面等離子體波共振時刻的光波長即共振波長直接和金屬表層環境介質的折射率相關。每次檢測時，通過考察共振波長移動的情況，就能夠獲知被測量生物分子的情況。
光譜檢測方法較光強檢測方法具有更高的測量精度與分辨率，且不易受到環境因素如供電電源不穩等的影響。
在測量時，首先將輸入光譜信號作為基準信號保存，接著將光纖SPR傳感探頭置于待測環境中，得到反射回的SPR光譜信號，再將該信號與基準信號比較，從而獲得SPR光譜共振波長的精確值。
權利要求
1.一種檢測單核苷酸多態性的光纖表面等離子體波核酸傳感器系統，包括寬帶光源(1)經P型偏振片(2)與Y型光纖耦合器(3)的輸入端相連，Y型光纖耦合器的輸出端(3)通過耦合器接頭(4)連于傳感光纖(5)，該傳感光纖(5)末端可以是終端反射式光纖表面等離子體波核酸傳感器探頭(6)，或者是分布式光纖表面等離子體波核酸傳感器探頭，Y型光纖耦合器的反射端連于與計算機相連的光譜儀(7)，其特征在于所述終端反射式光纖表面等離子體波核酸傳感器探頭由纖芯(61)、位于纖芯(61)端面的微反射鏡(63)、纖芯(61)表層的金屬層(62)以及金屬層(62)外側的SNP特異性探針固定膜(64)所組成；所述分布式光纖表面等離子體波核酸傳感器探頭的具體組成是，在同一根光纖纖芯(61)上可以制備多個在線反射式光纖表面等離子體波核酸傳感器探頭(9)，該光纖的末端設置為終端反射式光纖表面等離子體波核酸傳感器探頭(6)。
2.一種檢測單核苷酸多態性的光纖表面等離子體波核酸傳感器系統的檢測分析方法，其特征在于采用相對光譜檢測方法，即在測量時，首先將輸入光譜信號作為基準信號保存，接著將光纖表面等離子體波核酸傳感器置于待測樣本試液中，得到反射回的表面等離子體波共振光譜信號，再將該光譜信號與基準信號比較，從而獲得表面等離子體波光譜共振波長的精確值。
全文摘要
一種涉及檢測單核苷酸多態性的光纖表面等離子體波核酸傳感器系統及檢測方法。其系統包括寬帶光源(1)、P型偏振片(2)、Y型光纖耦合器(3)、耦合器接頭(4)、傳感光纖(5)、終端反射式光纖表面等離子體波共振生物傳感器探頭(6)、光譜儀(7)以及計算機(8)組成。本發明中采用終端反射式光纖表面等離子體波核酸傳感器探頭和分布式光纖表面等離子體波核酸傳感器探頭實現單核苷酸多態性檢測。本傳感器系統采用相對光譜檢測方法，獲得表面等離子體波共振光譜共振波長的精確值。本發明具有無須標記、對樣品本身無損傷等優點，并可獲得動力學數據，可克服現有技術中光強測量易受光源和機械結構波動影響的缺點。
文檔編號G01N21/25GK1598538SQ20041004152
公開日2005年3月23日 申請日期2004年7月28日 優先權日2004年7月28日
發明者梁大開, 齊名, 曾捷, 崔英霞, 湯林, 虞偉 申請人:南京航空航天大學