精液白細胞群染色定量檢測試劑、試劑盒及其檢測方法

專利名稱：精液白細胞群染色定量檢測試劑、試劑盒及其檢測方法
技術領域：
本發明涉及一種體外診斷用試劑、試劑盒及其檢測方法，具體涉及精液白細胞群染色定量檢測試劑、試劑盒及其檢測方法。
背景技術：
男性生殖道感染為男性不育的重要病因，占男性不育的4％～10％。近年來，隨著性傳播疾病的蔓延，同時由于亞臨床和隱性感染的增多，對男性生殖道感染的實驗室診斷就顯得特別重要。白細胞精子癥是指精液中白細胞密度超過1×106/ml。
通過染色法檢測精液內白細胞主要有白細胞過氧化物酶法和酶免組化染色這兩種方法。白細胞過氧化物酶法是WHO推薦的用于白細胞精子癥標準檢測方法之一，操作相對簡便，只能檢測精液內多形核中性粒細胞，對淋巴細胞、單核/巨噬細胞不能檢出。酶免組化染色也是WHO推薦方法，此方法是利用白細胞表面共同抗原CD45檢測精液內白細胞，由于CD45抗原是白細胞所特有的，因此此方法是檢測白細胞精子癥最準確的方法，現有的酶免組化染色試劑中顯色底物極不穩定，需即用即配，十分不便。

發明內容本發明要解決的技術問題是提供性能穩定，顯色特異的精液白細胞群染色定量檢測試劑及其制備方法。
為實現上述目的，本發明采用的一種技術方案是，一種精液白細胞群染色定量檢測試劑，包括1)第一抗體A種動物抗人CD45的IgG型單克隆抗體；2)第二抗體B種動物抗A種動物IgG的IgG類抗體；3)酶結合物A種動物的IgG型抗體與辣根過氧化物酶(HRP)復合物；
4)底物A3-氨基-9-乙基卡巴唑(AEC)。
上述檢測試劑的具體保存形式可以是1)第一抗體凍干粉含A種動物抗人CD45單克隆抗體的凍干粉；；2)第二抗體凍干粉含B種動物抗A種動物的IgG抗體的凍干粉；；3)酶結合物溶液含A種動物的IgG與辣根過氧化物酶復合物的緩沖液；4)底物A溶液含3-氨基-9-乙基卡巴唑、二甲基甲酰胺的醋酸鹽緩沖液。
所述底物A溶液中各成分的含量優選3-氨基-9-乙基卡巴唑4～6％、二甲基甲酰胺2～3％。
上述檢測試劑中的A種動物優選鼠，B種動物優選兔。
本發明采用的再一種技術方案是，一種精液白細胞群染色定量檢測試劑盒，包括上述各種試劑。
所述試劑盒還可進一步包括5)特制玻片涂有耐酸、疏水性涂料印有染色窗的玻片。
本發明并提供利用上述試劑、試劑盒進行精液白細胞定量檢測的方法。一種方法包括以下步驟，1)制作精液樣本涂片，待其干燥后對細胞進行固定；2)在樣本上覆以反應量的第一抗體，適溫孵育使樣本中白細胞上的CD45抗原與第一抗體充分反應，洗去未反應物質；3)再覆以反應量的第二抗體，適溫孵育使已與CD45抗原結合的第一抗體與第二抗體充分反應，洗去未反應物質；4)再加入反應量的酶結合物，適溫孵育使已與第一抗體結合的第二抗體與酶結合物充分反應，洗去未反應物質；5)再加入反應量的顯色底物，所述顯色底物含底物A與氧化劑，適溫孵育使顯色底物充分反應、沉淀，洗去未反應物質；6)觀察記錄檢測結果。
另一種方法包括以下步驟，1)制作精液樣本涂片，待其干燥后對細胞進行固定；2)以含單糖0.9～1.1％、氯化鈉25～35mM、酪蛋白0.15～0.25％的去離子水溶液復溶第一、第二抗體凍干粉；3)在樣本上覆以反應量的復溶后的第一抗體凍干粉，適溫孵育使樣本中白細胞上的CD45抗原與第一抗體充分反應，洗去未反應物質；4)再覆以反應量的復溶后的第二抗體凍干粉，適溫孵育使已與CD45抗原結合的第一抗體與第二抗體充分反應，洗去未反應物質；5)再加入含有反應量的酶結合物的酶結合物溶液，適溫孵育使已與第一抗體結合的第二抗體與酶結合物充分反應，洗去未反應物質；6)再加入反應量的顯色底物溶液，所述顯色底物溶液含底物A溶液與氧化劑，適溫孵育使顯色底物充分反應、沉淀，洗去未反應物質；7)觀察記錄檢測結果。
上述檢測方法中所述精液樣本涂片可以用特制玻片制作，所述特制玻片為涂有耐酸、疏水性涂料印有染色窗的玻片。
上述檢測方法中在所述觀察記錄檢測結果步驟之前，還可以用蘇木精染液對樣本中的精子細胞進行染色。
采用本發明提供的技術方案，有如下優點1)使用3-氨基-9-乙基卡巴唑進行顯色，底物性能穩定。與現有試劑相比，原底物快速紅溶液極不穩定，2～8℃放置只能穩定1周的時間，而本方法中的3-氨基-9-乙基卡巴唑溶液2～8℃放置至少能穩定1年，利于儲存，大大方便了使用；2)使用特制涂有染色窗的玻片，節省試劑、便于操作，適于批量檢測；3)在白細胞染色后結果觀察前對精子細胞染異色，使得白細胞與精子細胞顏色對比更加鮮明，結果讀取更加容易。
說明書附圖

圖1是用本發明試劑的一種優選方案進行精液白細胞檢測的結果照片。
具體實施方式下面對本發明作進一步的詳細說明。
實施例一、一種精液白細胞群染色定量檢測試劑，包括1、第一抗體鼠抗人CD45的IgG型單克隆抗體；2、第二抗體兔抗鼠IgG的IgG抗體；3、酶結合物鼠IgG抗原與辣根過氧化物酶(HRP)的復合物4、底物A3-氨基-9-乙基卡巴唑(AEC)。
上述試劑中第一抗體用于與白細胞表面的CD45抗原結合，IgG-HRP復合物通過第二抗體與第一抗體結合，AEC用于與HRP反應完成最終的顯色步驟。因此只要第一抗體中的提供抗體的動物與第二抗體中的被抗動物和酶結合物中的提供抗原的動物保持一致就可以了，可以是牛、羊、馬等等。
實施例二、一種精液白細胞群染色定量檢測試劑，包括1、第一抗體凍干粉含鼠抗人CD45的IgG型單克隆抗體的凍干粉；2、第二抗體凍干粉含兔抗鼠IgG的IgG抗體的凍干粉；3、酶結合物溶液含鼠IgG抗原與辣根過氧化物酶的復合物的Tris-HCl緩沖液；4、底物A溶液含3-氨基-9-乙基卡巴唑4～6％、二甲基甲酰胺2～3％的醋酸鹽緩沖液；5、特制玻片(4孔/塊)涂有耐酸、疏水性涂料印有直徑為0.8mm的染色窗的玻片。
本實施例與實施例一相比，兩種抗體采用凍干粉的形式，并將IgG-HRP復合物和AEC分別保存在相應的緩沖液中，更有利于試劑的長期儲存。各緩沖液用于維持試劑的PH值，也可以使用其他的常用生物緩沖液來代替。底物A溶液中的少量二甲基甲酰胺是為了助溶，因為3-氨基-9-乙基卡巴唑較難溶于水，可以先在水中溶解二甲基甲酰胺后再加入3-氨基-9-乙基卡巴唑，有利于后者的溶解，此助溶劑不加也是可以的。此外，本試劑盒中還配備了特制玻片，這樣，在進行檢測染色時就可以在染色窗的固定區域(本例優選0.8mm，也可以是其他適宜值)中進行，既節省試劑又方便操作和觀察結果。并且一塊玻片上可設多個窗口(本例優選4個，也可以適當增加或減少)，適于批量檢測。
實施例三、另一種精液白細胞群染色定量檢測試劑，包括1、第一抗體凍干粉含鼠抗人CD45的IgG型單克隆抗體的凍干粉；2、第二抗體凍干粉含兔抗鼠IgG的IgG抗體的凍干粉；3、酶結合物含鼠IgG抗原與辣根過氧化物酶的復合物的Tris-HCl緩沖液；4、底物A含3-氨基-9-乙基卡巴唑4～6％、二甲基甲酰胺2～3％的醋酸鹽緩沖液；5、特制玻片(4孔/塊)涂有耐酸、疏水性涂料印有直徑為0.8mm的染色窗的玻片。
還包括6、固定液含丙酮40～60％、甲醇40～60％、40％甲醛3～8％的混合液；7、緩沖液含二水氯化鈣含量為0.015％、氯化鉀含量為0.02％、六水氯化鎂含量為0.015％、氯化鈉含量為0.8％的磷酸鹽緩沖液；8、濃縮組織洗滌液(20×)含氯化鈉含量為0.6％、氯化鉀含量為0.4％、硫柳汞含量為0.125％、吐溫含量為1.5％的磷酸鹽緩沖液；9、凍干粉溶解液含葡萄糖含量為1％、氯化鈉含量為30mM、酪蛋白含量為0.2％的去離子水溶液；10、底物B含30％過氧化氫含量為10％的水溶液；11、蘇木精染液含蘇木素含量為0.5％、硫酸鋁鉀含量為10％、氧化汞含量為0.25％、乙醇含量為5％的水溶液。
本實施例與實施例二相比，增加了6～11共六種試劑單元，這些試劑單元是在進行精液白細胞檢測中可能會使用到的各種常規試劑單元，為了本發明試劑在使用和檢測時更加方便，因此可以在試劑中一并包含。由于這些是常規試劑單元，它們的組分選取和含量都是本領域技術人員能夠根據實際情況進行適當調整和配置的，因此不改變其作用而進行的各種替換和調整均屬于本發明的保護范圍(各試劑單元的作用將在實施例五中進行詳細說明)。
此外(1)本發明試劑的最佳保存溫度為2～8℃，在室溫下則試劑有效期縮短。
(2)基于應用需要，本發明試劑可以制成試劑盒的形式，各部分的具體備量可以是緩沖液4～6ml、固定液0.5～1.5ml、濃縮組織洗滌液(20×)1～1.5ml、第一抗體(凍干前)6～14ul、第二抗體(凍干前)6～14ul、凍干粉溶解液12～24ul、酶結合物6～14ul、底物A 12～18ul、底物B 0.12～0.18ul、蘇木精染液50～150ul。
實施例四、一種制作實施例三中精液白細胞群染色定量檢測試劑的方法，包括以下步驟，1、第一抗體凍干粉的制備1)抗體凍干基礎液的制備準確稱取葡萄糖0.2克，氨基己酸0.15克，疊氮鈉0.125克置燒杯，攪拌溶于pH7.40.05M適量磷酸鹽緩沖液內，用磷酸鹽緩沖液定容至100毫升。用濾菌器濾過除菌，置4℃保存；該抗體凍干基礎液用于稀釋抗體，并使抗體在真空冷凍干燥過程中的效價不降低。
2)用抗體凍干基礎液將抗人CD45單克隆抗體及抗IgG抗體稀釋為各種濃度，與IgG-HRP復合物和AEC作交叉試驗，根據最后顯色及背景色的深淺確定出最佳稀釋度，用抗體凍干基礎液將抗人CD45單克隆抗體稀釋為最佳稀釋度，分裝凍干后保存。
2、第二抗體凍干粉的制備根據上述交叉試驗確定的最佳稀釋度，用抗體凍干基礎液將抗IgG抗體稀釋至最佳稀釋度，分裝凍干后保存；3、酶結合物的制備1)制備HRP結合物稀釋液①配制pH7.520mmol/L Tris-HCl。
②稱取0.5克酪蛋白，加至1000毫升Tris-HCl緩沖液中，在磁力攪拌器上加熱攪拌溶解。待其完全溶解后，加蒸餾水定容至1000毫升。
③稱取1克牛血清白蛋白(BSA)、0.015克莧菜紅(AMARANTH)溶于上述溶液中，濾過除菌，4℃保存；2)可按現有工藝方法制備IgG-HRP關聯物，包括如下步驟①取4.5mg HRP溶于1ml 0.3mol/L，pH8.0NaHCO3，加入1.5％DNFB無水乙醇溶0.1ml，室溫下輕微攪拌1小時。
②加1ml 0.06mol/L NaIO4，室溫下避光輕攪30分鐘。
③加1ml 0.15mol/L乙二醇，室溫下攪拌1小時，以終止氧化反應。
④裝入透析袋，對0.01mol/L pH9.5碳酸鹽緩沖液1000ml，4℃透析過液，換液三次。
⑤于3ml醛化HRP溶液中加入含4.5mg鼠IgG的碳酸鹽緩沖液1ml，室溫避光輕攪拌2～3小時。
⑥加入4.5mg NaHB4，放入4℃過夜。
⑦裝入透析袋，對0.01mol/L pH7.2PBS，4℃透析24小時。
⑧3000r/min離心30min，除去沉淀物。上清液通過Sephadex G-200凝膠柱層析，PBS洗脫。
⑨用HRP結合物稀釋液稀釋結合物，4℃保存；4、底物A的制備1)配制0.05M醋酸鹽緩沖液(pH5.0)200毫升。
2)稱取AEC 5毫克，溶入二甲基甲酰胺2500ul。用醋酸鹽緩沖液將上液定容至100毫升。待其完全溶解后過濾。4℃保存；5、特制玻片的制作玻片上用耐酸、疏水性涂料印上直徑為0.8mm的染色窗。
6、固定液的制備用量筒量取丙酮95ml、甲醇95ml、400g/l甲醛10ml，將上述液體倒在大燒杯內混勻。置室溫保存。
7、緩沖液的制備1)用分析天平準確稱量二水氯化鈣0.15克，氯化鉀0.20克，磷酸二氫鉀0.2克，六水氯化鎂0.15克，氯化鈉8克，十二水磷酸氫二鈉1.25克，依次攪拌溶解于800毫升蒸餾水內。
2)調pH至7.4，用蒸餾水定容至1000毫升。置4℃保存。
8、濃縮組織洗滌液(20×)的制備1)用分析天平稱量氯化鈉6克，磷酸氫二鉀4克，十二水磷酸氫二鈉58克，氯化鉀4克，硫柳汞1.25克，吐溫2010毫升，依次攪拌溶解于800毫升蒸餾水內。
2)調pH至7.4，用蒸餾水定容至1000毫升。置4℃保存。
9、凍干粉溶解液的制備1)稱取葡萄糖10克，氯化鈉30mM，酪蛋白2克，溶于800毫升蒸餾水中。
2)移入1000毫升裝容量瓶內，用蒸餾水定容至1000毫升。置4℃保存。
10、底物B的制備取30％過氧化氫10毫升，用蒸餾水定容至100毫升。4℃保存。
11、蘇木精染液的制備1)稱取蘇木素1.000克，溶于10毫升無水乙醇內；另稱取硫酸鋁鉀20.0克，溶于200毫升蒸餾水內。
2)將上述兩種液體混合后，加熱煮沸，徐徐加入0.500克紅色氧化汞，不斷攪拌，5分鐘后將溶液置冷水迅速冷卻，冷卻后過濾。置室溫保存。
實施例五、一種使用實施例三所述的精液白細胞群染色定量檢測試劑進行精液白細胞定量檢測的方法，包括以下步驟，1、試劑準備1)第一抗體凍干粉、第二抗體凍干粉分別以凍干粉溶解液溶解30min，恢復至凍干前體積，備用。溶解后抗體4℃保存可用1年。
2)濃縮組織洗滌液，以蒸餾水20倍稀釋(如取濃縮液5ml，加蒸餾水95ml)。
2、樣本準備新鮮液化精液或-20℃貯存精液標本。
3、檢測1)制作精液細胞涂片①將待檢標本進行精子計數。
②1份液化的精液(約0.4ml)與5體積的緩沖液混合，室溫500g離心5min，去上清液。按此步驟重復2次。所述緩沖液用于洗凈細胞表面的粘稠物質。
③用緩沖液將細胞團重新懸至精液樣品的原體積，然后以緩沖液將精子密度調整至40×106/ml左右。
④取此細胞懸液5ul，于干凈玻片上，空氣自然干燥。
⑤空氣干燥的細胞在固定液中浸泡固定5min，所述固定液用于沉淀蛋白、保持蛋白的空間構像，使得不容易被洗脫。以吸管吸取組織洗滌液，輕輕沖洗玻片5次，然后置洗滌液中浸泡3min，甩去玻片表面水份，以吸水紙擦干非細胞區域液體(注意勿觸及細胞區域)。
2)每份固定細胞上覆以10ul第一抗體，37℃濕盒內孵育30min，使得樣本中白細胞上的CD45抗原與第一抗體充分反應。同上洗滌(用于洗去未反應物質)、吸干水份。
3)用10ul第二抗體覆蓋細胞，37℃濕盒內孵育30min，使得已與CD45抗原結合的第一抗體與第二抗體充分反應。同上洗滌、吸干水份。
4)向每個樣本中加入10ul酶標物，37℃濕盒內孵育30min，使得已與第一抗體結合的第二抗體與酶結合物充分反應。同上洗滌、吸干水份。
5)臨用前配制顯色底物(按底物A∶底物B＝100∶1體積比配制，所述底物B用作氧化劑，除了可以是前述雙氧水以外也可以是過氧化脲等其他氧化劑)，每樣本加入顯色底物15ul，37℃濕盒內孵育20min，使得底物A充分反應、沉淀，以吸管吸取組織洗滌液，輕輕沖洗玻片5次，置組織洗滌液中浸泡5～10min，甩去玻片表面水份。
6)用蘇木精染液復染30秒鐘，組織洗滌液沖洗7次(每次1秒鐘)，將玻片豎起晾干或吹干。
7)每樣本滴加甘油封固液1滴，用于保護，覆以蓋玻片。于顯微鏡油鏡下觀察結果，如圖1所示(所述顯微鏡型號為DMLS2(生產廠家Leica)，圖片拍攝使用Leica DFC480專業數碼相機)。由圖1可以看出，白細胞與其他細胞(包括大小近似的其它類型圓細胞)能夠十分清晰的分辨，甚至白細胞碎片也能精確分辨出，檢測結果清晰并易于判讀。
四、結果計算光鏡下至少計數200個精子，記錄在計數精子過程中觀察到的白細胞數(白細胞呈棕紅色，其它類型圓細胞及精子染藍色)。計算每100個精子視野中白細胞數n，代入下列公式計算精液白細胞數精液白細胞數/ml＝n÷100×精子計數/ml五、正常參考值＜1×106/ml(WHO)六、臨床適用性用于男性白細胞精子癥的診斷。
權利要求
1.一種精液白細胞群染色定量檢測試劑，包括1)第一抗體A種動物抗人CD45的IgG型單克隆抗體；2)第二抗體B種動物抗A種動物IgG的IgG類抗體；3)酶結合物A種動物的IgG型抗體與辣根過氧化物酶復合物；4)底物A3-氨基-9-乙基卡巴唑。
2.根據權利要求1所述的精液白細胞群染色定量檢測試劑，包括1)第一抗體凍干粉含A種動物抗人CD45的IgG型單克隆抗體的凍干粉；2)第二抗體凍干粉含B種動物抗A種動物IgG的IgG抗體的凍干粉；3)酶結合物溶液含A種動物的IgG與辣根過氧化物酶復合物的緩沖液；4)底物A溶液含3-氨基-9-乙基卡巴唑的醋酸鹽緩沖液。
3.根據權利要求2所述的精液白細胞群染色定量檢測試劑，其特征在于所述底物A溶液中含3-氨基-9-乙基卡巴唑4～6％、二甲基甲酰胺2～3％。
4.根據權利要求1或2或3所述的一種精液白細胞群染色定量檢測試劑，其特征在于所述A種動物為鼠，B種動物為兔。
5.一種精液白細胞群染色定量檢測試劑盒，包括1)第一抗體A種動物抗人CD45的IgG型單克隆抗體；2)第二抗體B種動物抗A種動物IgG的IgG類抗體；3)酶結合物A種動物的IgG型抗體與辣根過氧化物酶復合物；4)底物A3-氨基-9-乙基卡巴唑。
6.根據權利要求5所述的精液白細胞群染色定量檢測試劑盒，其特征在于還包括5)特制玻片涂有耐酸、疏水性涂料印有染色窗的玻片。
7.一種使用權利要求1所述精液白細胞群染色定量檢測試劑進行精液白細胞定量檢測的方法，包括以下步驟1)制作精液樣本涂片，待其干燥后對細胞進行固定；2)在樣本上覆以反應量的第一抗體，適溫孵育使樣本中白細胞上的CD45抗原與第一抗體充分反應，洗去未反應物質；3)再覆以反應量的第二抗體，適溫孵育使已與CD45抗原結合的第一抗體與第二抗體充分反應，洗去未反應物質；4)再加入反應量的酶結合物，適溫孵育使已與第一抗體結合的第二抗體與酶結合物充分反應，洗去未反應物質；5)再加入反應量的顯色底物，所述顯色底物含底物A與氧化劑，適溫孵育使顯色底物充分反應、沉淀，洗去未反應物質；6)觀察記錄檢測結果。
8.一種使用權利要求2所述精液白細胞群染色定量檢測試劑進行精液白細胞定量檢測的方法，包括以下步驟1)制作精液樣本涂片，待其干燥后對細胞進行固定；2)以含單糖0.9～1.1％、氯化鈉25～35mM、酪蛋白0.15～0.25％的去離子水溶液復溶第一、第二抗體凍干粉；3)在樣本上覆以反應量的復溶后的第一抗體凍干粉，適溫孵育使樣本中白細胞上的CD45抗原與第一抗體充分反應，洗去未反應物質；4)再覆以反應量的復溶后的第二抗體凍干粉，適溫孵育使已與CD45抗原結合的第一抗體與第二抗體充分反應，洗去未反應物質；5)再加入含有反應量的酶結合物的酶結合物溶液，適溫孵育使已與第一抗體結合的第二抗體與酶結合物充分反應，洗去未反應物質；6)再加入反應量的顯色底物溶液，所述顯色底物溶液含底物A溶液與氧化劑，適溫孵育使顯色底物充分反應、沉淀，洗去未反應物質；7)觀察記錄檢測結果。
9.根據權利要求7或8所述的精液白細胞定量檢測方法，其特征在于所述精液樣本涂片以特制玻片制作，所述特制玻片為涂有耐酸、疏水性涂料印有染色窗的玻片。
10.根據權利要求7或8或9所述的精液白細胞定量檢測方法，其特征在于在所述觀察記錄檢測結果步驟之前，還用蘇木精染液對樣本中的精子細胞進行染色。
全文摘要
本發明公開了一種精液白細胞群染色定量檢測試劑、試劑盒及其檢測方法。所述精液白細胞群染色定量檢測試劑，包括第一抗體A種動物抗人CD45的IgG型單克隆抗體；第二抗體B種動物抗A種動物IgG的IgG類抗體；酶結合物A種動物的IgG型抗體與辣根過氧化物酶復合物；底物A3－氨基－9－乙基卡巴唑。上述試劑可制成試劑盒的形式并可進一步包括特制玻片涂有耐酸、疏水性涂料印有染色窗的玻片。本發明并提供使用上述精液白細胞群染色定量檢測試劑、試劑盒進行精液白細胞定量檢測的方法。本發明使用3－氨基－9－乙基卡巴唑進行顯色，與現有試劑相比大大提高了底物的穩定性，利于儲存，方便使用；使用特制涂有染色窗的玻片，節省試劑、便于操作，適于批量檢測。
文檔編號G01N33/535GK1755369SQ20041004081
公開日2006年4月5日 申請日期2004年10月1日 優先權日2004年10月1日
發明者傅劍華, 劉瑜, 胡家純, 何林, 何小紅 申請人:深圳華康生物醫學工程有限公司