專利名稱：檢測(cè)玉米赤霉醇的酶聯(lián)免疫試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及酶聯(lián)免疫和獸藥殘留檢測(cè)分析技術(shù)領(lǐng)域中的一種檢測(cè)玉米赤霉醇的酶聯(lián)免疫試劑盒。
背景技術(shù)：
玉米赤霉醇(zeranol，ZER)，屬于雷索酸內(nèi)酯類非甾體類同化激素。ZER作為牛羊促生長(zhǎng)劑，能促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成，能提高胴體瘦肉率及飼料轉(zhuǎn)化率，但它具有弱雌激素作用，在動(dòng)物組織中的殘留會(huì)引起人體性機(jī)能紊亂及影響第二性征的正常發(fā)育，在外部條件誘導(dǎo)下，還可能致癌。ZER排出動(dòng)物體外后，還可經(jīng)飲水和食物造成二次污染及環(huán)境污染。歐盟及我國(guó)農(nóng)業(yè)部明確禁止將玉米赤霉醇等激素類藥物應(yīng)用于畜禽養(yǎng)殖。2002年12月我國(guó)農(nóng)業(yè)部公告第235號(hào)文規(guī)定，在所有食品動(dòng)物的所有可食組織中不得檢出玉米赤霉醇?xì)埩?。但由于玉米赤霉醇作為牛羊增重劑效果好，?jīng)濟(jì)回報(bào)高，違法使用仍很普遍。因此加強(qiáng)對(duì)動(dòng)物性食品中玉米赤霉醇的殘留檢測(cè)是非常必要的。
目前，主要采用儀器分析法檢測(cè)玉米赤霉醇的殘留量，如薄層色譜法(TLC)、氣相色譜法(GC)、高壓液相色譜法(HPLC)、氣-質(zhì)聯(lián)機(jī)(GC/MS)、液-質(zhì)聯(lián)機(jī)(HPLC/MS)、毛細(xì)管電泳(CE)等，由于復(fù)雜的儀器設(shè)備和繁瑣的過(guò)程，不適合現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)控和大量樣本篩查。
發(fā)明創(chuàng)造內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種檢測(cè)玉米赤霉醇的酶聯(lián)免疫試劑盒。
本發(fā)明所提供的檢測(cè)玉米赤霉醇的酶聯(lián)免疫試劑盒，包括玉米赤霉醇特異性抗體、包被的玉米赤霉醇與載體蛋白的偶聯(lián)物和酶標(biāo)二抗。
其中，所述玉米赤霉醇特異性抗體可為玉米赤霉醇單克隆抗體或玉米赤霉醇多克隆抗體；所述玉米赤霉醇單克隆抗體或多克隆抗體可為鼠源、馬源、羊源、兔源和豚鼠源抗體，所述玉米赤霉醇單克隆抗體優(yōu)選為玉米赤霉醇鼠單克隆抗體，所述玉米赤霉醇多克隆抗體優(yōu)選為玉米赤霉醇兔多克隆抗體。以上抗體均可用玉米赤霉醇與載體蛋白的偶聯(lián)物作為免疫原按常規(guī)方法制備。所述載體蛋白可為牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)、卵清蛋白(OVA)或血蘭蛋白(KLH)等常用載體蛋白，所述玉米赤霉醇與載體蛋白的偶聯(lián)物可通過(guò)將玉米赤霉醇和載體蛋白用混合酸酐法進(jìn)行偶聯(lián)得到。所述標(biāo)記酶可為辣根過(guò)氧化物酶或堿性磷酸酯酶，優(yōu)選為辣根過(guò)氧化物酶，辣根過(guò)氧化物酶可通過(guò)戊二醛法或過(guò)碘酸鹽法交聯(lián)在二抗體上；所述二抗可為抗鼠或抗兔抗抗體。
可作為固定玉米赤霉醇與載體蛋白的偶聯(lián)物的載體的物質(zhì)很多，如聚苯乙烯、纖維素、聚丙烯酰胺、聚乙烯、聚丙烯、交聯(lián)葡聚糖、玻璃、硅橡膠、瓊脂糖凝膠等。該載體的形式可以是試管、微量反應(yīng)板凹孔、小珠、小圓片等。
為了更方便現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)控和大量樣本篩查，所述試劑盒還包括玉米赤霉醇標(biāo)準(zhǔn)溶液、顯色劑、終止液、濃縮洗滌液和復(fù)溶液。
所述濃縮洗滌液為含有0.8％-1.2％吐溫的磷酸鹽緩沖液；所述顯色劑由顯色液A液和顯色液B液組成，所述顯色液A液為過(guò)氧化氫或過(guò)氧化脲，所述顯色液B液為鄰苯二胺(OPD)或四甲基聯(lián)苯胺(TMB)；所述復(fù)溶液為含有2％甲醇的磷酸鹽緩沖液。
本發(fā)明的檢測(cè)原理為將玉米赤霉醇與載體蛋白的偶聯(lián)物作為包被原吸附于固相載體上，加入樣品和玉米赤霉醇特異性抗體，再加入酶標(biāo)二抗，待測(cè)樣品中殘留的玉米赤霉醇和固相載體上包被的玉米赤霉醇與載體蛋白的偶聯(lián)物競(jìng)爭(zhēng)特異性抗體，顯色后終止，測(cè)定樣品吸光值，該值與樣品中玉米赤霉醇?xì)埩粑锖砍守?fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出玉米赤霉醇的含量。同時(shí)根據(jù)酶標(biāo)板上的樣品顏色的深淺，與系列濃度的玉米赤霉醇標(biāo)準(zhǔn)溶液顏色的比較可判斷樣品的濃度范圍。
本發(fā)明的檢測(cè)玉米赤霉醇的酶聯(lián)免疫試劑盒主要采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法定性或定量檢測(cè)動(dòng)物組織、尿樣等樣品中玉米赤霉醇的殘留量；該試劑盒成本低，對(duì)樣品的前處理要求低，樣品前處理過(guò)程簡(jiǎn)單，能同時(shí)快速檢測(cè)大批樣品；該試劑盒采用高特異性的玉米赤霉醇單克隆抗體或多克隆抗體，主要試劑均以工作液形式提供，使用方便，具有高特異性、高靈敏度、高精確度、高準(zhǔn)確度等特點(diǎn)，可在動(dòng)物性食品玉米赤霉醇?xì)埩魴z測(cè)中發(fā)揮重要作用。
圖1為檢測(cè)玉米赤霉醇的酶聯(lián)免疫試劑盒的結(jié)構(gòu)示意圖具體實(shí)施方式
實(shí)施例1、抗原及抗體的制備(1)抗原的合成將玉米赤霉醇和牛血清白蛋白(BSA)采用混合酸酐法進(jìn)行偶聯(lián)得到免疫原。
將玉米赤霉醇和卵清蛋白(OVA)采用混合酸酐法進(jìn)行偶聯(lián)得到包被原。
(2)玉米赤霉醇鼠單克隆抗體制備動(dòng)物免疫程序采用BALB/c小鼠作為免疫動(dòng)物，以玉米赤霉醇與牛血清白蛋白偶聯(lián)物為免疫原，免疫劑量為80-100μg/只，首免時(shí)將抗原與等量的弗氏完全佐劑混合制成乳化劑，頸背部皮下多點(diǎn)注射，間隔2-3周取相同劑量免疫原加等量弗氏不完全佐劑混合乳化，加強(qiáng)免疫一次，四免后腹腔加強(qiáng)免疫一次，3天后取脾細(xì)胞。
細(xì)胞融合與克隆化取免疫BALB/c小鼠脾細(xì)胞，按5-10∶1比例與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA測(cè)定細(xì)胞上清液，篩選陽(yáng)性孔。利用有限稀釋法對(duì)陽(yáng)性孔進(jìn)行克隆化，直到得到穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。
細(xì)胞凍存和復(fù)蘇 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的雜交瘤細(xì)胞用凍存液制成1×106-5×106個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，分裝于凍存管，在液氮中長(zhǎng)期保存。復(fù)蘇時(shí)取出凍存管，立即放入37℃水浴中速融，離心去除凍存液后，移入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)。
單克隆抗體的制備與純化采用體內(nèi)誘生法，將BALB/c小鼠(8周齡)腹腔注入滅菌石蠟油0.5ml/只，7-14天后腹腔注射雜交瘤細(xì)胞5×105-106個(gè)/只，7-10天后采集腹水。經(jīng)辛酸-飽和硫酸銨法進(jìn)行腹水純化，小瓶分裝，-20℃保存。
(3)玉米赤霉醇兔多克隆抗體的制備采用新西蘭大白兔作為免疫動(dòng)物，以玉米赤霉醇與牛血清白蛋白偶聯(lián)物為免疫原，免疫劑量為1mg/kg·b.w.，首免時(shí)將免疫原與等量的弗氏完全佐劑混合制成乳化劑，頸背部皮下多點(diǎn)注射，間隔3-4周取相同劑量免疫原加等量弗氏不完全佐劑混合乳化，加強(qiáng)免疫一次，共免疫5次，最后一次不加佐劑。最后一次免疫7-10d后采血，測(cè)定血清抗體效價(jià)，頸動(dòng)脈放血，經(jīng)硫酸銨分級(jí)沉淀得到純化的多克隆抗體。
(4)二抗的制備以羊作為免疫動(dòng)物，以鼠或兔IgG為免疫原進(jìn)行免疫，得到羊抗鼠或羊抗兔抗抗體。
實(shí)施例2、檢測(cè)玉米赤霉醇的酶聯(lián)免疫試劑盒(1)檢測(cè)玉米赤霉醇的酶聯(lián)免疫試劑盒的結(jié)構(gòu)試劑盒的結(jié)構(gòu)如圖1所示，主要由盒體1、鋁膜真空包裝96孔/40孔酶標(biāo)板2、6瓶玉米赤霉醇系列濃度標(biāo)準(zhǔn)品3、酶標(biāo)記物工作液4、玉米赤霉醇抗體工作液5、底物顯色液A液6、底物顯色液B液7、終止液8、濃縮洗滌液9、復(fù)溶液10和泡沫托架11，泡沫托架11上制有凹孔，上述試劑瓶3-10安放在泡沫托架的凹孔內(nèi)，泡沫托架11及酶標(biāo)板2安放在盒體內(nèi)。其中酶標(biāo)板2由塑料支架和可拆分的塑料條組成。
(2)所用試劑的配制
a.玉米赤霉醇標(biāo)準(zhǔn)溶液玉米赤霉醇系列標(biāo)準(zhǔn)溶液6瓶，1-3ml/瓶。
b.包被緩沖液pH9.6，0.05mol/L的碳酸鹽緩沖液。
c.封閉液3-10％小牛血清。
d.濃縮洗滌液含0.8％-1.2％吐溫的磷酸鹽緩沖液(0.01M pH7.4)，為正常使用濃度的15-25倍，30-50ml/瓶，1瓶。
e.玉米赤霉醇抗體工作液將抗體稀釋成蛋白濃度為0.5-5.0μg/L使用，5-8ml/瓶，1瓶。
f.酶標(biāo)記物工作液酶標(biāo)抗鼠或抗兔的抗抗體稀釋液，5-8ml/瓶，1瓶。
g.底物顯色液A液過(guò)氧化氫或過(guò)氧化脲，5-8ml/瓶，1瓶。
h.底物顯色液B液鄰苯二胺(OPD)或四甲基聯(lián)苯胺(TMB)，5-8ml/瓶，1瓶。
i.終止液1-2mol/L硫酸或鹽酸，5-8ml/瓶，1瓶。
j.復(fù)溶液含有2％甲醇的磷酸鹽緩沖液，30-50ml/瓶，1瓶。
(2)酶標(biāo)板的制備用包被緩沖液將玉米赤霉醇與卵清蛋白偶聯(lián)物稀釋成0.1-1μg/ml，每孔加入100μl，37℃溫育2h，4℃過(guò)夜，傾去包被液，用洗滌液洗滌3次，每次30秒，拍干，然后在每孔中加入150-200μl封閉液，37℃溫育1-2h，傾去孔內(nèi)液體，干燥后用鋁膜真空密封保存。
實(shí)施例3、樣品的前處理(1)動(dòng)物組織稱取5g勻漿后的樣品，加入10ml醋酸鈉緩沖液和25μl β-葡萄糖醛酸酶，渦動(dòng)1min，然后37℃過(guò)夜。加入8ml乙醚，渦動(dòng)3min后，3000rpm離心10min。重復(fù)一次。將醚相合并，40℃氮?dú)獯蹈?。殘留物溶?ml氯仿中，用2.5ml 1M NaOH溶液萃取兩次，合并萃取液，渦動(dòng)1min后，3000rpm離心10min。保留水相，加入0.5ml 12M磷酸鹽緩沖液，然后用C18柱純化，得到待測(cè)樣品溶液。
(2)尿樣取0.5ml尿液，加入3ml 50mM醋酸鈉緩沖液，pH4.8，加入8μl β-葡萄糖醛酸酶，37℃孵育3h，然后用C18柱純化，得到待測(cè)樣品溶液。
實(shí)施例4、檢測(cè)牛尿樣品中殘留的玉米赤霉醇(1)取適量新鮮或解凍后的供試尿液，6000rpm離心10min，取上清液過(guò)0.45μm濾膜。取500μl尿液加入3ml 50mM pH4.8的醋酸鈉緩沖液。加入8μl β-葡萄糖苷酸酶/硫酸酯酶，渦動(dòng)30s，37℃恒溫箱中靜置3h。然后用C18柱純化。
(2)用3ml 100％甲醇活化C18柱，流速控制在1滴/秒。用2ml 50mM pH4.8的醋酸鈉緩沖液淋洗C18柱。加入500μl經(jīng)步驟(1)提取后的尿液樣品。用2ml 50mMpH4.8的醋酸鈉緩沖液洗滌C18柱。用3ml 40％的甲醇溶液洗滌C18柱，正壓吹干。用1ml 80％的甲醇溶液洗脫并收集滴出液，正壓吹干滴盡后的C18柱，以收集完全。60℃下氮?dú)獯蹈?，向吹干后的收集瓶中加?00μl復(fù)溶液，渦動(dòng)30s，作為試樣溶液，供ELISA方法測(cè)定。
(3)樣品檢測(cè)向用玉米赤霉醇與卵清蛋白偶聯(lián)物包被的96孔酶標(biāo)板微孔中加系列標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣品溶液(各2孔)5μl，然后加入玉米赤霉醇鼠單克隆抗體工作液50μl，用蓋板膜封板，37℃恒溫箱中反應(yīng)1h。倒出孔中液體，每孔加入250μl洗滌液，30秒后倒出孔中液體，用吸水紙拍干，如此重復(fù)操作共洗板5次。加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠抗抗體工作液100μl，用蓋板膜封板，37℃恒溫箱中反應(yīng)1h。取出酶標(biāo)板，如前述洗板5次。每孔加入底物顯色液A液50μl，再加B液50μl，輕輕振蕩混勻，37℃恒溫箱避光顯色15-30min。每孔加入終止液50μl，輕輕振蕩混勻，用酶標(biāo)儀測(cè)定每孔吸光度值(OD值)。
本實(shí)施例所用的試劑均按照實(shí)施例2中的試劑配制方法進(jìn)行配制。
所獲得的每個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣本吸光度值的平均值(B)除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)(0標(biāo)準(zhǔn))的吸光度值(B0)再乘以100，即百分吸光度值。
公式中B為標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值，B0為0μg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值。以玉米赤霉醇濃度(μg/L)的自然對(duì)數(shù)值為X軸，百分吸光度值為Y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，相對(duì)應(yīng)每一個(gè)樣品的濃度(μg/L)可以從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出。也可以用回歸方程法，計(jì)算出樣本溶液濃度。利用計(jì)算機(jī)專業(yè)軟件，更便于大量樣品的快速分析。整個(gè)檢測(cè)過(guò)程只需2.5小時(shí)就可以完成，最低檢測(cè)限為0.3μg/L。
實(shí)施例5、試劑盒精密度、準(zhǔn)確度和保存期試驗(yàn)(1)試劑盒精密度試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)可重復(fù)性從三批酶聯(lián)板中，每板各抽出20個(gè)微孔，測(cè)定同一濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度值(OD值)，重復(fù)測(cè)定10次，計(jì)算變異系數(shù)。結(jié)果表明變異系數(shù)范圍在8-15％。
樣品可重復(fù)性取不同濃度的玉米赤霉醇標(biāo)樣，添加到樣品中，分別取三個(gè)不同批次的試劑盒各三個(gè)，每個(gè)濃度重復(fù)5次。分別計(jì)算板內(nèi)，批內(nèi)，批間變異系數(shù)。結(jié)果表明牛肉的變異系數(shù)均低于18％，羊肉的變異系數(shù)均低于18％，牛尿樣和羊尿樣的變異系數(shù)均低于15％。
(2)試劑盒的準(zhǔn)確度取4個(gè)濃度的玉米赤霉醇標(biāo)樣，對(duì)樣品進(jìn)行添加回收試驗(yàn)，每個(gè)濃度設(shè)4個(gè)平行，分別計(jì)算回收率。結(jié)果表明牛肉為40-120％，羊肉為40-120％，牛尿樣為60-110％，羊尿樣為60-110％。
(3)試劑盒保存期試驗(yàn)試劑盒保存條件為2-8℃，經(jīng)過(guò)6個(gè)月的測(cè)定，試劑盒的最大吸光度值(零標(biāo)準(zhǔn))、50％抑制濃度、玉米赤霉醇添加實(shí)際測(cè)定值均在正常范圍之內(nèi)?？紤]在運(yùn)輸和使用過(guò)程中，會(huì)有非正常保存條件出現(xiàn)，將試劑盒在37℃保存的條件下放置6天，進(jìn)行加速老化實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明該試劑盒各項(xiàng)指標(biāo)完全符合要求。考慮到試劑盒冷凍情況發(fā)生，將試劑盒放入-20℃冰箱冷凍5天，測(cè)定結(jié)果也表明試劑盒各項(xiàng)指標(biāo)完全正常。從以上結(jié)果可得出試劑盒可以在2-8℃至少可以保存6個(gè)月以上。
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)玉米赤霉醇的酶聯(lián)免疫試劑盒，包括玉米赤霉醇特異性抗體及包被的玉米赤霉醇與載體蛋白的偶聯(lián)物和酶標(biāo)二抗。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述試劑盒還包括玉米赤霉醇標(biāo)準(zhǔn)溶液、顯色劑、濃縮洗滌液、終止液和復(fù)溶液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述玉米赤霉醇特異性抗體為玉米赤霉醇單克隆抗體或玉米赤霉醇多克隆抗體。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述載體蛋白為牛血清白蛋白、人血清白蛋白、卵清蛋白或血蘭蛋白。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述標(biāo)記酶為辣根過(guò)氧化物酶或堿性磷酸酯酶。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述二抗為抗鼠或抗兔抗抗體。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述濃縮洗滌液為含有0.8％-1.2％吐溫的磷酸鹽緩沖液。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述顯色劑由顯色液A液和顯色液B液組成，所述顯色液A液為過(guò)氧化氫或過(guò)氧化脲，所述顯色液B液為鄰苯二胺或四甲基聯(lián)苯胺。
9.根據(jù)權(quán)利要求2所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述復(fù)溶液為含有2％甲醇的磷酸鹽緩沖液。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種檢測(cè)玉米赤霉醇的酶聯(lián)免疫試劑盒。本發(fā)明所提供的檢測(cè)玉米赤霉醇的酶聯(lián)免疫試劑盒，包括玉米赤霉醇特異性抗體及包被的玉米赤霉醇與載體蛋白的偶聯(lián)物和酶標(biāo)二抗。本發(fā)明的檢測(cè)玉米赤霉醇的酶聯(lián)免疫試劑盒能同時(shí)快速檢測(cè)大批樣品；主要試劑均以工作液形式提供，使用方便，具有高特異性、高靈敏度、高精確度、高準(zhǔn)確度等特點(diǎn)，可在動(dòng)物性食品玉米赤霉醇?xì)埩魴z測(cè)中發(fā)揮重要作用。
文檔編號(hào)G01N33/547GK1563994SQ20041002980
公開(kāi)日2005年1月12日 申請(qǐng)日期2004年3月25日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月25日
發(fā)明者沈建忠, 史為民, 王鶴佳, 張素霞, 丁雙陽(yáng), 江海洋 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)