一種功能性納米鋱熒光探針及其應用的制作方法

專利名稱：一種功能性納米鋱熒光探針及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及納米鋱熒光探針，具體地說是一種以納米硅膠為基質，以鋱熒光配合物為發光內核并且在納米硅膠微粒表面帶有生物標記活性官能團的具有強熒光性的功能性納米鋱熒光微粒及其在生物檢測技術中的應用。
背景技術：
生物技術與生命科學的飛速發展對生物分析化學提出了大量新的課題，核酸、多肽、蛋白質等生物大分子、生物藥物、微生物、超微量生物活性物質等的分析測定對醫學及生命科學的發展正起著越來越重要的作用。因此生物分析化學已成為當今國際生物技術，生命科學及分析科學領域最重要的前沿研究領域之一。納米尺度上的生物分析化學是納米生物技術的最主要發展方向之一，功能性納米熒光材料是近年來納米材料研究中的一個新生長點，已有的研究結果表明其在生物大分子的單分子原位檢測、熒光顯微鏡檢測、免疫組織化學染色、細胞生物學，分子生物學，生物傳感器等生物技術和生命科學領域有重要的應用價值和應用前景。
納米熒光探針是指可標記到生物分子上作為熒光檢測探針使用的納米發光粒子，目前已經報道的納米熒光探針主要有(1)半導體納米晶體(又稱量子點)(文獻1W.C.W.Chan，S.Nie，Science，1998，281，2016-2018；文獻2Y.W.Cao，Angew.Chem.Int.Ed.，1999，38，3692-3694)。(2)內含熒光分子的納米熒光探針(文獻3H.Hrm，T.Soukka，T.Lvgren，Clin.Chem.，2001，47，561-568；文獻4趙藝強，高海峰，楊武利，府壽寬，熒光標記的高分子微粒及其制備方法，中國專利，
公開日2001年1月3日，公開號CN1278534A)。(3)內包三(聯二吡啶)釕熒光配合物的納米硅膠微粒熒光探針(文獻5S.Santra，P.Zhang，K.Wang，R.Tapec，W.Tan，Anal.Chem.，2001，73，4988-4993；文獻6S.Santra，K.Wang，R.Tapec，W.Tan，Journal ofBiomedical Optics，2001，6，160-166；文獻7譚蔚泓，王柯敏，肖丹，核殼型納米顆粒，中國專利，
公開日2002年4月3日，公開號CN1342515A)。
量子點納米熒光探針是II-VI族和III-V族元素化合物的納米級微晶體，如CdSe，InP和InAs等。量子點熒光探針雖然激發光范圍寬，發光峰尖銳，Stokes位移大，通過改變其粒徑可以獲得從藍色到紅色幾乎所有波長的發光探針等優點，但其缺點是水溶性差，表面修飾及生物標記困難，發光不穩定，易閃爍，且不具備足夠好的單分散性。另外由于量子點熒光探針的發光是常規熒光，在熒光測定時存在各種散亂光和背景熒光干擾測定的問題。
內含熒光分子的納米熒光探針是用聚苯乙烯內包β-二酮-銪熒光配合物的納米塑料熒光微粒，該類高分子塑料微粒由于是疏水性的，在水中易凝集，而在有機溶劑中高分子又易溶脹而導致微粒內熒光分子泄漏，另外該類納米微粒通常粒子直徑在100納米以上，限制了其作為熒光探針的使用范圍(如細胞標記染色等)。
內包三(聯二吡啶)釕熒光配合物的納米硅膠微粒熒光探針是以三(聯二吡啶)釕熒光配合物為核，以硅膠為外殼的納米熒光微粒。由于此類納米熒光微粒的發光內核-三(聯二吡啶)釕熒光配合物所發出的仍然是常規熒光，無法解決各種散亂光和短壽命本底熒光對熒光測定干擾的問題。
稀土熒光化合物的熒光具有非常特殊的性質，其最大的特征是熒光壽命非常長。基于這一特征，以稀土熒光化合物作為標記物的時間分辨熒光免疫測定法等生物檢測技術近20年來已經取得了重大的進展，在醫學與生命科學的實踐與研究中發揮著越來越重要的作用。時間分辨熒光生物檢測技術的最大優點就是可完全消除各種散亂光和短壽命熒光對測定的影響，從而極大地提高測定靈敏度。稀土熒光化合物直接作為標記物使用的不利之處是這類化合物一般熒光量子產率都較小，熒光較弱，雖然采用時間分辨熒光測定法已極大地提高了這類化合物的熒光測定靈敏度，但僅從改進稀土熒光標記物的熒光量子產率進而大幅度提高時間分辨熒光生物檢測技術的靈敏度已經不太可能。袁景利等最近開發的功能性納米稀土熒光探針(文獻8袁景利，譚明乾，葉志強，王桂蘭，一種功能性納米稀土熒光微粒及其制備和應用，中國發明專利，申請號02144517.6，申請日2002.11.01；文獻9袁景利，譚明乾，海曉丹，王桂蘭，β-二酮-三價銪配合物納米熒光探針及其制備和應用，中國發明專利，申請號03133857.7，申請日2003.07.04)技術由于可將高濃度的稀土熒光化合物包裹在納米級的硅膠微粒中，一方面有效的解決了直接使用稀土熒光化合物作為標記物使用時存在的熒光較弱的問題，另外該類熒光探針可使用時間分辨熒光測定技術進行測定，從而解決了測定中各種散亂光和短壽命本底熒光對熒光測定干擾的問題。但前述發明中制備的硅膠基質的納米鋱熒光微粒由于需要經過表面活化過程才可用于生物標記(文獻10，Zhiqiang Ye，Mingqian Tan，GuilanWang，Jingli Yuan，Anal.Chem.，2004，76，513-518)，其生物標記過程比較繁雜費時。為解決這種問題，研制一種熒光發光強，化學性質穩定，且可直接用于生物標記的納米鋱熒光探針十分必要。

發明內容
針對以上的問題，本發明的目的是提供一種可直接用于生物標記的鋱納米熒光探針及其在生物檢測技術中的應用方法。
為了實現上述目的，本發明的技術方案如下利用鋱熒光配合物與硅酸酯及氨基烴基單取代的硅酸酯共聚成粒技術首先制備內部包裹了鋱熒光配合物、表面帶有活性氨基，顆粒形狀規則、大小均勻的功能性納米硅膠熒光微粒。在對其進行各種物理化學性質表征的基礎上，將其與抗體等生物分子共價鍵合制備納米熒光微粒標記的生物分子。這種標記了納米熒光微粒的生物分子即可用于細胞及組織染色，以及時間分辨熒光免疫測定等生物檢測技術。
其采用如下過程制備獲得，將三價鋱熒光配合物(采用三價鋱離子與下述配位體所形成的熒光配合物)作為發光內核，采用鋱熒光配合物與硅酸酯和氨基烴基單取代的硅酸酯在含有表面活性劑、助表面活性劑，有機溶劑以及水制成的油包水型(W/O)微乳液中，用氨水引發聚合制備的內部包裹了鋱熒光配合物的顆粒形狀規則、大小均勻的納米硅膠熒光微粒，由于氨基烴基單取代的硅酸酯在共聚合后可在硅膠微粒表面導入氨基，因此制備出的納米熒光微粒表面帶有可直接用于生物標記的氨基活性官能團，省卻了常規納米硅膠微粒用于生物標記時必需進行的表面修飾過程。
所述油包水型微乳液中水∶TEOS∶Triton X-100∶正辛醇∶環己烷的質量比例為1～1.5∶0.1～0.3∶2～3.5∶1.5～3∶5～10；三價鋱熒光配合物是指三價鋱離子(Tb3+)與具有N，N，N1，N1-[2，6-二(3-氨甲基-1-吡唑基)-吡啶]四乙酸骨架結構的配位體所形成的強熒光性配合物，有機配位體的結構式可表示如下 結構式中R＝H，C6H5，CnH2n+1，n＝1，2，3，4，5等脂肪烴類及芳香烴類取代基。
有機溶溶劑為苯、正己烷、環己烷、石油醚中的一種；助表面活性劑為乙醇、丙醇、異丙醇、正己醇、乙二醇、正辛醇或正癸醇中的任何一種；表面活性劑為Triton X-100，Tween 20，Tween 40，Tween 80中的一種，優選為Triton X-100；硅酸酯的分子式為[Si(OR)4]，其中的R是-CnH2n+1，n＝1～5。優選為正硅酸四乙酯[Si(OC2H5)4]；氨基烴基單取代的硅酸酯為氨丙基三乙氧基硅烷或[2-(2-氨基乙基氨基)乙基氨基]丙基三甲氧基硅烷中的一種。
本發明功能性納米鋱熒光探針的生物標記方法首先使用橋聯試劑將納米熒光微粒與一種架橋蛋白質分子共價鍵合，然后再將表面健合了架橋蛋白質分子的納米微粒用橋聯試劑與生物活性分子共價鍵合；橋聯試劑為二醛類化合物(如戊二醛)或三氯三氮銼等，架橋蛋白質分子為各種血清白蛋白及卵白蛋白，生物活性分子為各種抗體，抗原，親合素，鏈親合素或核酸等。具體為一定量的納米熒光微粒和戊二醛(或三氯三氮唑)溶液加入到含有血清白蛋白的緩沖溶液中，4℃至室溫下攪拌反應。離心收集沉淀，沉淀用水和緩沖溶液洗后加入到含有生物活性分子(抗體等)的緩沖溶液中，再加入戊二醛溶液。4℃至室溫下攪拌反應后，加入NaBH4室溫反應，離心收集沉淀，洗滌數次后懸浮于含有BSA，NaN3，NaCl的緩沖溶液中備用。
本發明的另一目的是提供一種具有強熒光性的、制備方法簡單的納米鋱熒光探針在生命科學、醫學檢測等領域的應用技術。由于本發明的納米鋱熒光探針在制備時就已引入可與生物分子結合的官能團，可直接用于各種生物分子的標記。標記后的生物分子可用于各種時間分辨熒光生物檢測技術(在時間分辨熒光測定法中的應用)，如時間分辨熒光免疫測定、時間分辨熒光DNA雜交測定、細胞識別(時間分辨熒光組織染色測定法)、顯微鏡成像測定(時間分辨熒光顯微鏡成象測定法)、單細胞原位測定(時間分辨熒光細胞測定法)、生物芯片(時間分辨熒光生物芯片測定法)等技術。


圖1是內包了鋱熒光配合物BPTA-Tb3+的功能性納米硅膠熒光微粒的透射電子顯微鏡照片(十萬倍，插入的為二十萬倍)。
圖2是BPTA-Tb3+配合物(1.1M，虛線)和功能性鋱納米熒光微粒(20mg/L，實線)水溶液的時間分辨熒光光譜。
圖3是BPTA-Tb3+配合物(a，30μM)、功能性鋱納米熒光微粒(b，40mg/L)和空白硅膠納米顆粒(c，70mg/L)的紫外吸收光譜。
圖4是功能性鋱納米熒光微粒標記抗人甲胎蛋白(AFP)抗體的步驟及反應原理。
圖5是使用功能性鋱納米熒光微粒標記抗體夾心法測定人血清中甲胎蛋白(AFP)的反應原理。
圖6是使用功能性鋱納米熒光微粒標記抗體的時間分辨熒光免疫分析法測定人血清中AFP的工作曲線。
具體實施例方式
下面通過實施例對本發明作進一步說明。本實施例僅用于對本發明的具體說明，其它基于相同原理及使用類似試劑的方法也屬于本發明的范疇。
實施例1內包三價鋱離子與N，N，N1，N1-[2，6-二(3-氨甲基-1’-吡唑基)-苯基吡啶]四乙酸的熒光配合物(簡稱BPTA-Tb3+)及N，N，N1，N1-[2，6-二(3’-氨甲基-1’-吡唑基)-甲基吡啶]四乙酸的熒光配合物(簡稱BMTA-Tb3+)的功能性納米硅膠熒光微粒的的制備及表征(1)功能性納米熒光微粒的制備BPTA-Tb3+配合物的制備將192mg的BPTA溶于4ml水中，用NaHCO3將pH調到6.5。然后將120mg的TbCl3溶于2ml水的溶液加入到BPTA水溶液中，用NaHCO3將pH調到6.5，室溫下攪拌2小時，過濾除去沉淀，濾液中加入300ml丙酮，室溫下攪拌1小時，過濾收集沉淀，真空干燥，再用干燥甲醇洗滌干燥固體，濾液減壓蒸干，真空干燥即可制得198mg的BPTA-Tb3+配合物(收率為72.9％)。
BMTA-Tb3+配合物的制備采用相同方法制備，收率為75.0％。
將含有160mg的BPTA-Tb3+(或BMTA-Tb3+)水溶液加入含有的正硅酸四乙酯(簡稱TEOS)，Triton X-100、正辛醇以及環己烷制成的W/O型微乳液中，其中水∶TEOS∶Triton X-100∶正辛醇∶環己烷的重量百分比比例控制在1～1.5∶0.1～0.3∶2～3.5∶1.5～3∶5～10，在劇烈攪拌下向其中加入含有TritonX-100、正辛醇、環己烷以及濃氨水的另一種微乳液，其中Triton X-100∶正辛醇∶環己烷∶濃氨水(重量百分比為28％)的比例控制在2～3.5∶1.5～3∶5～10∶0.1～0.3。室溫攪拌反應5小時后，加入6～10μl的[2-(2-氨基乙基氨基)乙基氨基]丙基三甲氧基硅烷(簡稱AEPS)，繼續反應至總反應時間達24小時后，加入約50ml丙酮結束反應。將反應液離心后除去上清液，沉淀部分則分別用乙醇和二次蒸餾水分別洗三次，真空干燥后得到白色的功能性硅膠包裹鋱配合物納米熒光微粒。
(2)功能性納米熒光微粒的性質表征(a)納米熒光微粒的形態及大小尺寸圖1是內包了鋱熒光配合物BPTA-Tb3+的功能性納米硅膠熒光微粒的透射電子顯微鏡照片。通常情況下，共聚合反應是將兩種硅烷化試劑同時加入到反應體系中進行水合化和聚合化反應。但實驗中發現用此方法制備的納米微粒大小不均勻，直徑分布非常寬。這可能是因為AEPS所帶甲氧基的水解速度要快于TEOS的乙氧基的水解速度。雖然AEPS的量比較小，但是只要聚合在硅膠納米顆粒的表面，它所帶的氨基基團就會阻止Si-O-Si骨架的形成，納米熒光顆粒的直徑也就不再增長。本實驗通過延遲AEPS的加入時間解決了這一問題，在一系列的條件試驗后，確定采用TEOS開始水解5小時后再加入AEPS的方法所制備的納米微粒不但大小均勻，粒徑分布范圍窄(45±3nm)，而且氨基基團也成功地被引入到熒光納米顆粒的表面。粒徑的大小可以通過調整水與表面活性劑的比例、助表面活性劑的種類、氨水的濃度、TEOS的量以及反應時間等來進行調控。
(b)納米熒光微粒的熒光光譜特性圖2是BPTA-Tb3+配合物(1.1M，虛線)和功能性納米鋱熒光微粒(20mg/L，實線)水溶液的時間分辨熒光光譜。從時間分辨熒光光譜圖中可以看出，BPTA-Tb3+配合物和鋱納米熒光微粒的最大激發波長和最大發射波長基本上沒有差別，都為324nm和543nm。發射光譜的四個峰是鋱離子的四種躍遷形式，分別為5D4→7F6(489nm)，5D4→7F5(543nm)，5D4→7F4(582nm)和5D4→7F3(620nm)。納米熒光微粒的熒光壽命為2.0ms，這雖然比BPTA-Tb3+配合物的熒光壽命(2.68ms)稍短，但已經足夠用于時間分辨熒光免疫分析。
(c)納米熒光微粒的熒光量子產率納米熒光微粒在pH值9.1的0.05mol/L硼酸緩沖溶液中的熒光量子產率通過比較法來測定(文獻12，L.Qu，X.Peng，J.Am.Chem.Soc.，2002，124，2049-2055)，用公式1＝I1A2/I2A1計算求得。公式中I1和I2分別為納米微粒和標準比較物最大發射波長的熒光強度；A1和A2分別為納米微粒和標準比較物的吸光度值；2為標準比較物的熒光量子產率。標準比較物使用N，N，N1，N1-[4’-苯基-2，2’6’，2”-聯三吡啶-6，6”-二取代]二(亞甲基氨基)四乙酸與鋱的配合物，其熒光量子產率為10.0％(文獻13，M.Latva，H.Takalo，V.-M.Mukkala，C.Matachescu，J.C.Rodríguez-Ubis，J.Luminescence，1997，75，149-169)。測定結果顯示，功能性鋱納米熒光微粒的熒光量子產率為10％，這低于游離BPTA-Tb3+配合物在同樣條件下的熒光量子產率(～100％)，其原因可以通過測定鋱納米熒光微粒、BPTA-Tb3+配合物和空白硅膠納米微粒的紫外吸收光譜來解釋。
圖3是BPTA-Tb3+配合物(a，30μM)、功能性鋱納米熒光微粒(b，40mg/L)和空白硅膠納米顆粒(c，70mg/L)的紫外吸收光譜。從圖中可以看出，空白的硅膠微粒在紫外光區有持續的吸收，而這部分被吸收的能量是不能用于發射熒光的。也就是說納米熒光微粒所吸收的光并沒有全部用于激發稀土配合物發射熒光，其中一部分硅膠基質的吸收對熒光發光沒有作用，從公式1＝I1A22/I2A1可以看出，硅膠基質的吸收必然導致納米微粒熒光量子產率的下降。此外，硅膠基質和鋱配合物之間的相互作用也是納米微粒熒光量子收率下降的重要原因之一。
雖然功能性鋱納米熒光微粒的熒光量子產率要低于游離的BPTA-Tb3+配合物，由于每個納米微粒中包裹有大量的BPTA-Tb3+配合物分子(從熒光光譜強度比較可得出每個納米微粒中包裹有3000個以上的BPTA-Tb3+配合物分子)，所以在作為標記物使用時每個功能性鋱納米熒光微粒的熒光強度要遠大于每個游離的BPTA-Tb3+配合物。另外由于游離的BPTA-Tb3+配合物沒有合適的用于生物標記的活性官能團，制備成功能性鋱納米熒光微粒后引入的活性氨基官能團解決了該配合物不能直接用于生物標記的難題。
實施例2功能性納米鋱熒光微粒作為標記物的時間分辨熒光免疫測定法測定人血清樣品中的甲胎蛋白(簡稱AFP)(1)利用功能性納米鋱熒光微粒標記山羊抗人AFP多克隆抗體2.0mg的納米熒光微粒和100μl的1％戊二醛溶液加入到含有20mgBSA(牛血清白蛋白)的1.0m1的0.1mol/L磷酸緩沖溶液(pH＝7.0)中，4℃下攪拌反應24小時。離心收集沉淀，沉淀用水和磷酸緩沖溶液各洗兩次后加入到含有0.25mg山羊抗人AFP多抗的1.0ml、pH值7.0的0.1mol/L磷酸緩沖溶液中，再加入100μl的1％戊二醛溶液。4℃下攪拌反應24小時后，加入2mg的NaBH4，室溫反應2小時，離心收集沉淀，洗滌數次后懸浮于含有0.2％BSA，0.1％NaN3，0.9％NaCl的pH值7.8的0.05mol/LTris-HCl緩沖溶液中備用。圖4給出了該標記方法的的步驟及反應原理，由于功能性納米鋱熒光微粒表面帶有活性氨基基團，使得使用納米微粒標記抗體分子變得簡單方便。在修飾方法中，通過二次使用戊二醛作為橋聯試劑將納米微粒-BSA和BSA-抗AFP抗體相連，每一步反應都是共價結合，所以納米微粒和抗體的結合是十分穩定的。
(2)人血清樣品中AFP的測定(a)96微孔板的包被將含抗人AFP單克隆抗體(10μg/ml)的pH值為9.6的0.1mol/L的NaHCO3緩沖溶液50μl分注于96微孔板的各孔中，4℃，24小時包被后，用含有0.05％Tween 20的0.05mol/L，pH值7.8的Tris-HCl緩沖溶液(緩沖溶液1)洗兩次，再用0.05mol/L，pH值7.8的Tris-HCl緩沖溶液(緩沖溶液2)洗1次備用。
(b)AFP的時間分辨熒光免疫測定將稀釋到一定濃度(稀釋溶液為5％BSA-0.9％NaCl-0.1％NaN3的pH值7.8的0.05mol/L Tris-HCl緩沖溶液)的AFP標準溶液或血清樣品45μl注入上述包被后的微孔板的各孔中，37℃，1小時反應后，用上述緩沖溶液1洗兩次，緩沖溶液2洗一次，然后加入45μl納米熒光微粒標記的抗AFP多抗溶液，37℃，1小時反應后，用緩沖溶液1洗4次，然后進行固相時間分辨熒光測定。測定用儀器為PerkinElmer Victor 1420型時間分辨熒光測定儀，測定條件為激發波長＝320nm，發射波長＝545nm，延遲時間＝0.2ms，測定時間＝0.4ms。
圖5給出了上述測定的的反應原理，該方法采用的是熒光微粒標記抗體夾心型時間分辨熒光免疫測定法。
(3)人血清中AFP測定的工作曲線使用功能性納米熒光微粒標記抗AFP多抗的時間分辨熒光免疫分析法測定人血清中AFP的工作曲線如圖6所示。從圖中可以看出，在AFP濃度范圍為0.1-10ng/ml之間，工作曲線顯示了很好的線性響應，線性方程式為log(signal)＝0.893log[AFP]+3.649，r＝0.999。方法的最低檢測限為0.1ng/ml(計算方法dl＝(3SD×C)/(I-I0)，SD是本底信號的標準偏差，C是最低測定液濃度，I是其對應的熒光強度，I0是本底信號的熒光強度)，曲線的最高檢測上限約為100ng/ml。
(4)方法的精密度和準確度為了考察AFP測定方法的精密度和準確度，選取三種不同濃度的AFP添加到三個不同的血清樣品中(皆為健康人血清，用前在-20℃保存)，每個樣品平行測定6次，測定結果如下表所示。由表中結果可以看出該法的相對標準偏差(CV％)小于9.0％，回收率在84.0-98.0％范圍內，說明該法具有較高的精密度和準確度，可以滿足樣品測定中微量分析的要求。

權利要求
1.一種功能性納米鋱熒光探針，其特征在于其采用如下過程制備獲得，將三價鋱熒光配合物作為發光內核，采用鋱熒光配合物與硅酸酯和氨基烴基單取代的硅酸酯在含有表面活性劑、助表面活性劑，有機溶劑以及水制成的油包水型微乳液中，用氨水引發聚合制備的內部包裹了鋱熒光配合物的顆粒形狀規則、大小均勻的納米硅膠熒光微粒，其表面帶有的氨基可直接用于生物分子的標記。
2.根據權利要求1所述的功能性納米鋱熒光探針，其特征在于所述油包水型微乳液中水∶TEOS∶Triton X-100∶正辛醇∶環己烷的質量比例為1～1.5∶0.1～0.3∶2～3.5∶1.5～3∶5～10。
3.根據權利要求1所述的功能性納米鋱熒光探針，其特征在于所述的三價鋱熒光配合物是指三價鋱離子(Tb3+)與具有N，N，N1，N1-[2，6-二(3’-氨甲基-1’-吡唑基)-吡啶]四乙酸骨架結構的配位體所形成的強熒光性配合物，有機配位體的結構式可表示如下 結構式中R＝H，C6H5，CnH2n+1，n＝1，2，3，4，5。
4.根據權利要求1所述的功能性納米鋱熒光探針，其特征在于所述的有機溶溶劑為苯、正己烷、環己烷、石油醚中的一種。
5.根據權利要求1所述的功能性納米鋱熒光探針，其特征在于其中所述的助表面活性劑為乙醇、丙醇、異丙醇、正己醇、乙二醇、正辛醇或正癸醇中的任何一種；表面活性劑為Triton X-100，Tween 20，Tween 40，Tween80中的一種。
6.根據權利要求1所述的功能性納米鋱熒光探針，其特征在于其中所述的硅酸酯的分子式為[Si(OR)4]，其中的R是-CnH2n+1，n＝1～5。
7.根據權利要求1所述的功能性納米鋱熒光探針，其特征在于其中所述的氨基烴基單取代的硅酸酯為氨丙基三乙氧基硅烷或[2-(2-氨基乙基氨基)乙基氨基]丙基三甲氧基硅烷中的一種。
8.一種權利要求1所述的功能性納米鋱熒光微粒的生物標記方法，其特征在于首先使用橋聯試劑將納米熒光微粒與一種架橋蛋白質分子共價鍵合，然后再將表面健合了架橋蛋白質分子的納米微粒用橋聯試劑與生物活性分子共價鍵合；橋聯試劑為二醛類化合物或三氯三氮唑，架橋蛋白質分子為各種血清白蛋白或卵白蛋白，生物活性分子為各種抗體，抗原，親合素，鏈親合素或核酸。
9.一種權利要求1所述的功能性納米鋱熒光探針在時間分辨熒光測定法中的應用。
10.根據權利要求9所述的功能性納米鋱熒光探針在時間分辨熒光測定法中的應用，其特征在于其中的時間分辨熒光測定法為時間分辨熒光免疫測定法，時間分辨熒光DNA雜交測定法，時間分辨熒光組織染色測定法，時間分辨熒光顯微鏡成象測定法，時間分辨熒光細胞測定法及時間分辨熒光生物芯片測定法。
全文摘要
本發明公開了一種以納米硅膠為基質，內包鋱熒光配合物并且在納米硅膠表面帶有活性氨基的具有強熒光性的功能性納米鋱熒光探針的制備方法及其在生物檢測技術中的應用方法。它以三價鋱的強熒光性配合物為發光中心，采用與硅酸酯與氨基烴基單取代的硅酸酯共聚成粒技術制備而成。所得納米微粒除具有強的鋱化合物特征性熒光外，其表面還帶有可直接用于生物標記的活性氨基官能團，作為熒光探針用于時間分辨熒光測定時不受各種散亂光和短壽命熒光的干擾，在臨床檢測、醫學、生命科學以及分析化學等領域有重要的應用價值。
文檔編號G01N21/76GK1707246SQ20041002070
公開日2005年12月14日 申請日期2004年6月9日 優先權日2004年6月9日
發明者袁景利, 葉志強, 譚明乾, 王桂蘭 申請人:中國科學院大連化學物理研究所