專利名稱：Sars冠狀病毒3cl蛋白酶活性測定和抑制劑篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子和細(xì)胞生物學(xué)研究領(lǐng)域，具體涉及SARS冠狀病毒3CL蛋白酶熒光底物的合成；利用熒光共振能量轉(zhuǎn)移(Fluorescence Resonance Energy Transfer，F(xiàn)RET)方法，測定SARS冠狀病毒3CL蛋白酶的活性以及進(jìn)行其抑制劑的篩選。
背景技術(shù)：
2003年春季我國爆發(fā)了SARS(嚴(yán)重急性呼吸綜合癥，Severe Acute RespiratorySyndrome，SARS)疫情，并迅速蔓延至世界30多個國家和地區(qū)。4月16日，經(jīng)過科學(xué)家們的共同努力，世界衛(wèi)生組織(WHO)在各國研究成果的基礎(chǔ)上，正式宣布SARS冠狀病毒(SARS Coronavirus，SARS_CoV)為導(dǎo)致嚴(yán)重急性呼吸綜合癥(SARS)的病原體。SARS在我國內(nèi)地的北京、山西、內(nèi)蒙等25個省市自治區(qū)“肆意橫行”，對我國人民群眾的生命財(cái)產(chǎn)曾構(gòu)成嚴(yán)重威脅。SARS是一種傳染性強(qiáng)、生存強(qiáng)、致死率高的新型病毒，截止到2003年5月19日，全球累計(jì)報(bào)告病例已達(dá)7864人，死亡病例643人。SARS已被世界公認(rèn)為人類的共同敵人。
根據(jù)SARS冠狀病毒(SARS_CoV)的基因組分析發(fā)現(xiàn)，在編碼SARS冠狀病毒RNA聚合酶的多聚蛋白質(zhì)開放閱讀框(OPF)中，除了RNA聚合酶編碼序列，還存在一類主要蛋白酶(M proteinase)的編碼序列，因?yàn)檫@一類蛋白酶的底物剪切特異性類似小RNA病毒(Picomavirus)的3C蛋白酶，所以又被稱為3CL蛋白酶(3 chymotrypsin-likeproteinase，3CLpro)。3CL蛋白酶是SARS冠狀病毒復(fù)制過程中的關(guān)鍵蛋白，其主要功能是水解冠狀病毒所表達(dá)的兩個多聚蛋白質(zhì)ppla(replicase la，約450kD)和pplab(replicase lab，約750kD).這兩個多聚蛋白質(zhì)編碼了冠狀病毒復(fù)制和轉(zhuǎn)錄所需的所有蛋白，其中pplab的表達(dá)是在ppla開放閱讀框的基礎(chǔ)上，通過-1核糖體移碼閱讀(-1 ribosomal frameshifting)完成的。3CL蛋白酶能夠在不同的位點(diǎn)切割ppla和pplab，釋放出各種成熟形式的非結(jié)構(gòu)性蛋白，完成病毒的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。
序列分析表明不同的冠狀病毒3CL蛋白酶具有很高的同源性，其中SARS CoV 3CL蛋白酶與人冠狀病毒(Human coronavirus，HCoV 229E)，豬傳染性胃腸炎病毒(Porcinetransmissible gastroenteritis virus，TGEV)的3CL蛋白酶的序列同一性分別達(dá)到了40％和44％，與鼠肝炎病毒(Mouse hepatitis virus，MHV)和牛冠狀病毒(Bovine coronavirus，BCoV)的3CL蛋白酶的序列同一性達(dá)到了50％和49％，與鳥感染性支氣管炎病毒(Avian infectiousbronchitis virus，IBV)的3CL蛋白酶的序列同一性也達(dá)到了39％。由于冠狀病毒3CL蛋白酶的序列具有高度的保守性，科學(xué)家通過同源建模的方法，分別以HCoV 229E 3CL蛋白酶的結(jié)構(gòu)和TGEV 3CL蛋白酶與CMK(hexapeptidyl chloromethal ketone)抑制劑的復(fù)合物結(jié)構(gòu)為模板，得到了SARS CoV 3CL蛋白酶的三級結(jié)構(gòu)。3CL蛋白酶的單體結(jié)構(gòu)由三個結(jié)構(gòu)域(domain)構(gòu)成，結(jié)構(gòu)域1(residue 8-99)和結(jié)構(gòu)域2(residue 100-183)由6個反向平行的β折疊構(gòu)成，緊密堆積成類似小病毒3C蛋白酶的糜胰蛋白酶樣結(jié)構(gòu)，底物結(jié)合位點(diǎn)位于結(jié)構(gòu)域1和2之間的裂縫中。結(jié)構(gòu)域3(residue 200-300)是一個由5個α螺旋構(gòu)成的相對獨(dú)立的球狀區(qū)域，通過一個長的環(huán)狀區(qū)(loop，residue 184-189)與結(jié)構(gòu)域2相連，結(jié)構(gòu)域3對于3CL蛋白酶的水解活性是必需的。在晶體結(jié)構(gòu)中3CL蛋白酶以二聚體的形式存在，其中一個蛋白酶分子的結(jié)構(gòu)域2與另一個蛋白酶分子的N末端殘基通過疏水相互作用，以相互垂直的方式相結(jié)合，其埋藏面積約為1300A2。在二聚體結(jié)構(gòu)中，一個單體分子的N末端位于自身的結(jié)構(gòu)域2，3與另外一個單體分子的結(jié)構(gòu)域2所形成的復(fù)合結(jié)構(gòu)中，N末端的這種定位有利于3CL蛋白酶對多聚蛋白質(zhì)的切割。
SARS-CoV 3CL蛋白酶模型的底物結(jié)合位點(diǎn)與TGEV和HCoV 229E 3CL蛋白酶晶體結(jié)構(gòu)的底物結(jié)合位點(diǎn)匹配得相當(dāng)好。因此可以推測，與TGEV 3CL蛋白酶結(jié)合的抑制劑應(yīng)當(dāng)可以與HCoV 229E、SARS-CoV 3CL蛋白酶以類似的方式結(jié)合。這一點(diǎn)已經(jīng)通過底物切割實(shí)驗(yàn)得到證實(shí)。序列為H2N-VSVNSTLQ↓SGLRKMA-COOH的十五肽(代表TGEV 3CLpro的氨基末端自切割位點(diǎn))可以有效地被SARS-CoV 3CLpro水解，說明TGEV 3CLpro與SARS-CoV3CLpro的作用方式是十分類似的。
由于3CL蛋白酶在SARS冠狀病毒的復(fù)制過程中具有關(guān)鍵性作用，同時它在不同的冠狀病毒中具有高度的保守性，所以SARS冠狀病毒3CL蛋白酶已成為研究抗SARS藥物的一個重要靶標(biāo)。如果可以有效抑制該蛋白酶的活性，就可以控制住SARS冠狀病毒在體內(nèi)的傳播，從而發(fā)現(xiàn)治療SARS的有效藥物。
因此，在體外有效的測定SARS冠狀病毒3CL蛋白酶的活性，建立SARS冠狀病毒3CL蛋白酶抑制劑的分子篩選模型將具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。本發(fā)明者經(jīng)過反復(fù)實(shí)驗(yàn)并利用實(shí)驗(yàn)過程中所積累的獨(dú)特相關(guān)技術(shù)經(jīng)驗(yàn)，首次利用熒光共振能量轉(zhuǎn)移(Fluorescence Resonanceenergy Transfer.FRET).合成了SARS冠狀病毒3CL蛋白酶的熒光底物，成功地在體外測定了SARS冠狀病毒3CL蛋白酶的活性，并對可能的抑制劑進(jìn)行了篩選，從而完成了本發(fā)明。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供能夠在體外對SARS冠狀病毒3CL蛋白酶進(jìn)行活性測定和抑制劑篩選的熒光底物。
本發(fā)明的另一個目的是提供SARS冠狀病毒3CL蛋白酶的體外測活方法和抑制劑分子高通量篩選模型。
1)SARS冠狀病毒3CL蛋白酶熒光底物的合成根據(jù)SARS冠狀病毒3CL蛋白酶的底物切割特異性，即底物氨基酸序列(Leu，Ile)-Gln↓-(Ser，Ala，Gly)的保守性，參照文獻(xiàn)[1]，通過固相合成技術(shù)合成SARS冠狀病毒3CL蛋白酶的類似底物十二肽，其氨基酸序列為Val-Asn-Ser-Thr-Leu-Gln-↓-Ser-Gly-Leu-Arg-Lys-Met，并利用熒光共振能量轉(zhuǎn)移(Fluorescence Resonance Energy Transfer，F(xiàn)RET)，在兩端的纈氨酸(Val)和賴氨酸(Lys)殘基上分別連接熒光基團(tuán)5′-(2′-氨乙基氨基萘-1-磺酸)(EDANS)和淬滅基團(tuán)4′-(4′-二甲基氨基疊氮苯)苯甲酸(Dabcyl)，最終得到3CL蛋白酶的熒光底物。([1]CarlosGarcia-Echeverria，Daniel H.Rich New intramolecularly quenched fluorogenic peptidesubstrates for the study of the kinetic specificity of papain FEBS Lett，Vol297，100-102)；2)SARS冠狀病毒3CL蛋白酶的體外活性測定將熒光底物與反應(yīng)緩沖液(20mM Sodium Phosphate，pH7.5，100mM Nacl)混合，25℃下平衡30分鐘，再加入SARS冠狀病毒3CL蛋白酶，利用熒光分光光度計(jì)以340nm波長的光激發(fā)，檢測490nm發(fā)射波長下的熒光值變化，完成對SARS冠狀病毒3CL蛋白酶的體外活性測定。
3)SARS冠狀病毒3CL蛋白酶抑制劑的篩選將SARS冠狀病毒3CL蛋白酶與待篩選的小分子化合物25℃下孵育30分鐘，再加入上述合成的熒光底物，充分混勻，利用熒光分光光度計(jì)以340nm波長的光激發(fā)，檢測490nm發(fā)射波長下的熒光值，測定加入小分子化合物后3CL蛋白酶的活性，與不加入化合物的3CL蛋白酶進(jìn)行活性比較，計(jì)算小分子化合物對3CL蛋白酶活性的抑制率，完成對SARS冠狀病毒3CL蛋白酶抑制劑的體外篩選。
優(yōu)選實(shí)施方案實(shí)驗(yàn)材料熒光底物(十二肽)根據(jù)Carlos Garcia-Echeverria，Daniel H Rich所報(bào)道的方案[1]，通過固相合成技術(shù)獲得。SARS冠狀病毒3CL蛋白酶為本實(shí)驗(yàn)室借助細(xì)胞分子生物學(xué)方法，選用pQE30載體構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒(pQE30-3CL)，在大腸桿菌中表達(dá)，通過NTA-Ni柱層析的方法純化所獲得，具體方法參照文獻(xiàn)[2]。用于篩選的小分子化合物為本實(shí)驗(yàn)室所合成([2]Haifang Sun，Haibin Luo，Changying Yu，Tao Sun etc，Molecular cloning，expression，purification，and mass spectrometric characterization of 3C-like protease of SARScoronavirus Protein Expression and Purification，Vol32,302-308)。
實(shí)驗(yàn)原理基本原理是熒光共振能量轉(zhuǎn)移(Fluorescence Resonance Energy Transfer，F(xiàn)RET)。如圖1，多肽底物上合成有兩個熒光基團(tuán)一個熒光供體(Donor)及該供體的淬滅受體(Acceptor)。由于熒光供體(D)的發(fā)射波長和淬滅受體(A)的激發(fā)波長有重疊，兩個基團(tuán)之間的距離很短(10-100埃米)，使得在光激發(fā)狀態(tài)下，熒光供體(D)的能量被受體(A)特異性的淬滅，該量子現(xiàn)象稱為共振能量轉(zhuǎn)移。經(jīng)過蛋白酶特異性切割后，多肽底物斷裂，熒光供體與淬滅受體分離，恢復(fù)其本身的全部熒光，所以一個低熒光的多肽底物經(jīng)過酶切割反應(yīng)以后成為高熒光的物質(zhì)，而且熒光強(qiáng)度的增加與多肽水解的程度呈線性相關(guān)。
本發(fā)明提供的SARS冠狀病毒3CL蛋白酶的熒光底物是根據(jù)3CL蛋白酶的底物切割特異性，根據(jù)Carlos Garcia-Echeverria，Daniel H.Rich所報(bào)道的方案[1]，通過固相合成技術(shù)合成的十二肽，其氨基酸序列為Val-Asn-Ser-Thr-Leu-Gln-Ser-Gly-Leu-Arg-Lys-Met。在十二肽的兩端分別連接熒光基團(tuán)5′-(2′-氨乙基氨基萘-1-磺酸)(EDANS)和淬滅基團(tuán)4′-(4′-二甲基氨基疊氮苯)苯甲酸(Dabcyl)。EDANS和Dabcyl為常用的熒光-猝滅分子對，結(jié)構(gòu)如下圖所示，EDANS是一種常用的藍(lán)綠色熒光分子，最適激發(fā)波長為340nm，最適發(fā)射波長為490nm，Dabcyl是一種常用的熒光淬滅分子，其吸收光譜與EDANS的熒光發(fā)射光譜重疊(圖2)。Dabcyl對EDANS的淬滅效率大于95％，檢測的熒光背景很低。
5′-(2′-氨乙基氨基萘-1-磺酸(EDANS)結(jié)構(gòu) 4′-(4′-二甲基氨基疊氮苯)苯甲酸(Dabcyl)結(jié)構(gòu)將本發(fā)明提供的熒光底物與SARS冠狀病毒3CL蛋白酶孵育，由于3CL蛋白酶能特異性地識別并切割該熒光底物的核心序列(Leu-Gln↓-Ser)，使得底物兩端的EDANS和Dabcyl分離。通過熒光分光光度計(jì)以340nm波長的光激發(fā)，檢測490nm波長下發(fā)射光的熒光強(qiáng)度，就能在體外準(zhǔn)確測定SARS冠狀病毒3CL蛋白酶的活性，如圖3所示。
實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1.SARS冠狀病毒3CL蛋白酶的表達(dá)和純化利用本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的3CL-pQE30表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌M15，選用合適的條件(IPTG濃度、溫度、表達(dá)時間)，通過NTA-Ni柱層析的方法純化SARS冠狀病毒3CL蛋白酶，具體方案參照(Haifang Sun，Haibin Luo，Changying Yu，Tao Sun etc，Molecular cloning，expression，purification，and mass spectrometric characterization of 3C-like protease ofSARS coronavirus Protein Expression and Purification，Vol32,302-308)。
2.SARS冠狀病毒3CL蛋白酶的體外活性測定將熒光底物與反應(yīng)緩沖液(20mM Sodium Phosphate，pH7.5，100mM Nacl)混合，25℃下平衡30分鐘，再加入SARS冠狀病毒3CL蛋白酶，利用熒光分光光度計(jì)以340nm波長的光激發(fā)，檢測490nm發(fā)射波長下的熒光值變化，完成對SARS冠狀病毒3CL蛋白酶的體外活性測定。
圖1是FRET基本原理示意圖。
圖2A是3CL蛋白酶的熒光底物質(zhì)譜分析圖。
圖2B是3CL蛋白酶的熒光底物反相HPLC分析圖。
圖3是EDANS和Dabeyl的熒光光譜圖。
圖4是SARS冠狀病毒3CL蛋白酶活性測定原理。
圖5是熒光底物420nm-600nm熒光發(fā)射光譜。
圖6A是熒光底物490nm波長下的熒光強(qiáng)度-反應(yīng)時間作圖。
圖6B是被切割的底物濃度-反應(yīng)時間作圖。
圖7是3CL蛋白酶切割熒光底物的反應(yīng)初速度。
圖8A是熒光底物(不加入3CL蛋白酶)420nm-600nm的熒光發(fā)射光譜。
圖8B是熒光底物(不加入3CL蛋白酶)490nm波長下的熒光強(qiáng)度-反應(yīng)時間作圖。
圖9是3CL蛋白酶(不加入熒光底物)420nm-600nm的熒光發(fā)射光譜。
圖10是雙倒數(shù)作圖法(Lineweaver-Burk double-reciprocal plot)。
圖11是熒光底物(加入待篩選的化合物)490nm波長下的熒光強(qiáng)度-反應(yīng)時間作圖。
圖12是篩選結(jié)果圖。
具體實(shí)施例方式
1、SARS冠狀病毒3CL蛋白酶的體外活性測定；1)SARS冠狀病毒3CL蛋白酶熒光底物的合成；2)熒光底物和3CL蛋白酶的準(zhǔn)備熒光底物母液的制備將棕紅色粉末狀熒光底物溶解于10％二甲基亞砜dimethylsulfoxide，DMSO)溶液至終濃度100μM，-20□保存。
3CL蛋白酶濃度測定通過U-2010紫外分光光度計(jì)(HITACHI公司)測定蛋白濃度，100μl(1∶10)體系，10μl待測3CL蛋白酶加入90μl緩沖液(20mM Sodium PhosphatepH7.5，100mM Nacl)，用該緩沖液作空白對照，測定280nm的吸光值，蛋白濃度計(jì)算公式如下C=A×Mag×Mϵ×L]]>C待測蛋白濃度(g/L) A280nm吸光值(unity)Mag稀釋倍數(shù) M待測蛋白分子量(Da)ε待測蛋白的摩爾消光系數(shù)(L/Mol/cm) L比色杯內(nèi)徑(cm)3CL蛋白酶分子量35833.153 Da 3CL蛋白酶摩爾消光系數(shù)34390 L/Mol/cm3)3CL蛋白酶體外活性的測定反應(yīng)條件3CL蛋白酶濃度1μM(0.36mg/ml)熒光底物濃度10μM溫度25℃反應(yīng)緩沖液20mM Sodium Phosphate，pH7.5100mM Nacl實(shí)驗(yàn)儀器F-2500熒光分光光度計(jì)(HITACHI公司)激發(fā)光波長340nm，發(fā)射光光譜420nm-600nm，狹縫寬度10nm熒光石英比色杯(HITACHI公司)內(nèi)徑(path length)1cmSDC-6數(shù)控超級低溫恒溫槽(上海新芝生物技術(shù)研究所)總反應(yīng)體系1000μl取100μl熒光底物母液(100μM)與比色杯中的反應(yīng)緩沖液(20mM Sodium Phosphate，pH7.5，100mM Nacl)混合至終濃度10μM，25℃平衡30分鐘，再加入一定體積的3CL蛋白酶母液至終濃度1μM，以340nm波長的光激發(fā)，記錄420nm-600nm波長范圍的發(fā)射光譜，總反應(yīng)時間4小時，每10分鐘檢測一次。如圖4所示，隨著反應(yīng)時間的延長，490nm波長下的熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)。
將490nm波長下的熒光強(qiáng)度對應(yīng)反應(yīng)時間作圖，并扣除反應(yīng)時間為0時的本底熒光值，如圖5A所示。將縱坐標(biāo)熒光強(qiáng)度轉(zhuǎn)換為被切割的底物濃度(產(chǎn)物濃度)，對應(yīng)反應(yīng)時間作圖(圖5B)，符合標(biāo)準(zhǔn)的酶促反應(yīng)動力學(xué)，反應(yīng)初期，產(chǎn)物形成速度恒定，符合一級反應(yīng)(afirst-order reaction)動力學(xué)，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，產(chǎn)物形成速度逐漸下降，到反應(yīng)末期，產(chǎn)物形成速度趨近于0，符合零級反應(yīng)(a zero-order reaction)動力學(xué)。
由于反應(yīng)初期(2％-10％的熒光底物被3CL蛋白酶切割)產(chǎn)物形成的速度恒定，符合一級反應(yīng)(a first-order reaction)動力學(xué)，所以可將反應(yīng)初期被切割的底物濃度對應(yīng)反應(yīng)時間作圖，其線性回歸的斜率就是3CL蛋白酶切割該熒光底物的反應(yīng)初速度(initialvelocity，V0)，如圖6所示，該酶促反應(yīng)的初速度為0.028μM/min。
對照實(shí)驗(yàn)總反應(yīng)體系1000μl，溫度為25℃，取100μl熒光底物母液(100μM)與比色杯中的反應(yīng)緩沖液混合，終濃度為10μM，不加入3CL蛋白酶，以340nm波長的光激發(fā)，記錄420nm-600nm波長范圍的發(fā)射光譜，總反應(yīng)時間3小時，前1小時每10分鐘檢測一次，后2小時每20分鐘檢測一次，如圖7A所示。再將490nm波長下的熒光強(qiáng)度對應(yīng)反應(yīng)時間作圖，并扣除反應(yīng)緩沖液的本底熒光值，如圖7B所示，隨著時間的延長，490nm波長下的熒光強(qiáng)度幾乎沒有變化，說明熒光底物本身淬滅效率很高，檢測的熒光背景很低，且在反應(yīng)緩沖液中十分穩(wěn)定。
對照實(shí)驗(yàn)總反應(yīng)體系1000μl，溫度為25℃，取一定體積的3CL蛋白酶母液與比色杯中的反應(yīng)緩沖液混合至終濃度1μM，不加入熒光底物，以340nm波長的光激發(fā)，檢測420nm-600nm波長范圍的發(fā)射光譜，如圖8所示，3CL蛋白酶本身在該波長范圍熒光背景很低，對測活反應(yīng)幾乎沒有影響。
4)動力學(xué)常數(shù)KM，kcat以及kcat/KM的測定雙倒數(shù)作圖法(Lineweaver-Burk double-reciprocal plot)1V=(KMVmax1[S])+1Vmax,Vmax=kcat[E0]]]>固定3CL蛋白酶的濃度(1μM)，溫度為25℃，改變熒光底物的濃度，測定不同底物濃度下3CL蛋白酶切割底物的反應(yīng)初速度，以反應(yīng)初速度的倒數(shù)對應(yīng)底物濃度的倒數(shù)作圖，通過線性回歸求得斜率和縱截距，就能測定米氏常數(shù)KM和轉(zhuǎn)換數(shù)kcat，(圖9)，具體數(shù)值見表1。
表13CL蛋白酶促反應(yīng)的動力學(xué)常數(shù)2、SARS冠狀病毒3CL蛋白酶抑制劑的篩選將SARS冠狀病毒3CL蛋白酶與待篩選的小分子化合物孵育，再加入熒光底物，利用熒光分光光度計(jì)以340nm波長的光激發(fā)，檢測490nm發(fā)射波長下的熒光值變化，測定加入小分子化合物后3CL蛋白酶的活性，與不加入化合物的3CL蛋白酶進(jìn)行活性比較，完成對SARS冠狀病毒抑制劑的體外篩選。
1)待篩選抑制劑的制備待篩選的小分子化合物DC060037，DC060117，DCO060185均為本實(shí)驗(yàn)室通過計(jì)算機(jī)藥物輔助設(shè)計(jì)，在原有化合物結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上改造所得。
小分子化合物母液的制備將粉末狀小分子化合物溶解于100％二甲基亞砜(dimethylsulfoxide，DMSO)溶液至終濃度10mM，4℃保存。
2)抑制劑體外篩選反應(yīng)條件3CL蛋白酶濃度1μM熒光底物濃度10μM小分子化合物濃度10μM(DMSO終濃度0.1％)溫度25℃反應(yīng)緩沖液20mM Sodium Phosphate，pH7.5100mM Nacl總反應(yīng)體系1000μl取100μl熒光底物母液(100μM)與比色杯中的反應(yīng)緩沖液混合至終濃度10μM，25℃平衡30分鐘。
取10-50μl的3CL蛋白酶母液和待篩選的小分子化合物母液，25℃孵育30分鐘，然后加入比色杯中，使3CL蛋白酶終濃度為1μM，小分子化合物終濃度為10μM(DMSO終濃度0.1％)。
通過F-2500熒光分光光度計(jì)以340nm波長的光激發(fā)，記錄420nm-600nm波長范圍的發(fā)射光譜，總反應(yīng)時間2小時，每10分鐘檢測一次，測定3CL蛋白酶的活性。
對照實(shí)驗(yàn)不加小分子化合物，加入相應(yīng)體積的100％DMSO溶液，終濃度為0.1％，其它反應(yīng)條件同上，測定3CL蛋白酶的活性。
篩選結(jié)果將490nm波長下的熒光強(qiáng)度對應(yīng)反應(yīng)時間作圖，并扣除反應(yīng)時間為0時的本底熒光值，如圖10所示，不同的小分子化合物對SARS冠狀病毒3CL蛋白酶的活性具有不同程度的抑制作用。
將不加入小分子化合物所測得的3CL蛋白酶的活性設(shè)為100％，則加入小分子化合物后的3CL蛋白酶相對活性為 如圖11所示，0.1％DMSO對3CL蛋白酶的活性幾乎沒有影響，化合物DC060117對3CL蛋白酶沒有明顯的抑制作用，DC060037表現(xiàn)出一定的抑制作用，DC060185則表現(xiàn)出較好的抑制作用。抑制作用強(qiáng)的化合物可通過濃度梯度進(jìn)一步測定其IC50值，并檢驗(yàn)其在細(xì)胞或動物水平上的藥效，抑制活性不強(qiáng)的則可通過計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾提高其活性，進(jìn)行進(jìn)一步的高通量大規(guī)模篩選。
上述抑制劑篩選結(jié)果證明，利用本發(fā)明提供的熒光底物所建立的SARS冠狀病毒3CL蛋白酶抑制劑分子篩選模型是有效和可靠的，為抗SARS新藥的發(fā)現(xiàn)提供了一個很好的篩選平臺。
本發(fā)明的有益效果是(1)利用本發(fā)明，首次人工合成了SARS冠狀病毒3CL蛋白酶的熒光底物。
(2)使用本發(fā)明提供的熒光底物，利用熒光共振能量轉(zhuǎn)移(Fluorescence Resonance EnergyTransfer，F(xiàn)RET)檢測490nm波長處熒光強(qiáng)度的變化，測定SARS冠狀病毒3CL蛋白酶的體外活性，是一種非常靈敏和有效的方法。
(3)利用本發(fā)明可實(shí)現(xiàn)SARS冠狀病毒3CL蛋白酶抑制劑的高通量篩選，為抗SARS藥物的結(jié)構(gòu)修飾和先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
本發(fā)明可用于SARS冠狀病毒3CL蛋白酶體外活性的測定以及抑制劑的高通量篩選1)由于不同種類3CL蛋白酶的底物識別位點(diǎn)具有高度保守性，因此本發(fā)明不僅可應(yīng)用于SARS冠狀病毒3CL蛋白酶體外活性的測定，還可用于3CL蛋白酶家族其它成員(如TGEV和HCoV 229E 3CL蛋白酶等)的體外活性測定。
2)本發(fā)明不僅可應(yīng)用于SARS冠狀病毒3CL蛋白酶抑制劑的高通量篩選，還可用于3CL蛋白酶家族其它成員(如TGEV和HCoV 229E 3CL蛋白酶等)抑制劑的高通量篩選。
權(quán)利要求
1.一種對SARS冠狀病毒3CL蛋白酶進(jìn)行體外活性測定或抑制劑篩選方法，體外活性測定步驟如下a.合成SARS冠狀病毒3CL蛋白酶的熒光底物；b.將SARS冠狀病毒3CL蛋白酶與熒光底物孵育，用340nm波長光激發(fā)，檢測490nm發(fā)射波長下的熒光值變化，熒光值強(qiáng)弱代表體外活性強(qiáng)弱。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的SARS冠狀病毒3CL蛋白酶進(jìn)行體外活性測定方法，其特征在于合成SARS冠狀病毒3CL蛋白酶的熒光底物十二肽、氨基酸序列如下Val-Asn-Ser-Thr-Leu-Gln↓-Ser-Gly-Leu-Arg-Lys-Met利用熒光共振能量轉(zhuǎn)移，在兩端的纈氨酸(Val)和賴氨酸(Lys)殘基上分別連接熒光基團(tuán)5’-(2’-氨乙基氨基萘)-1-磺酸(EDANS)和淬滅基團(tuán)4’-(4’-二甲基氨基疊氮等)苯甲酸(Dabcyl)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的SARS冠狀病毒3CL蛋白酶進(jìn)行體外活性測定方法，其特征在于將熒光底物與反應(yīng)緩沖液(20mM Sodium Phosphate，pH7.5，100mM Nacl)混合至終濃度10μM，25℃下平衡30分鐘，再加入SARS冠狀病毒3CL蛋白酶，終濃度為1μM。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的SARS冠狀病毒3CL蛋白酶進(jìn)行體外活性測定或抑制劑篩選方法，其特征在于SARS冠狀病毒3CL蛋白酶抑制劑篩選步驟如下a.將SARS冠狀病毒3CL蛋白酶與待篩選的小分子化合物孵育；b加入合成的熒光底物，用340nm波長光激發(fā)，檢測490nm波長下的熒光值變化；c.測定加入小分子化合物后3CL蛋白酶的活性。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述抑制劑篩選方法，其特征在于將SARS冠狀病毒3CL蛋白酶與待篩選小分子化合物在25℃下孵育30分鐘。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述抑制劑篩選方法，其特征在于將熒光底物與孵育后的SARS冠狀病毒3CL蛋白酶和待篩選小分子化合物溶液混合，利用熒光分光光度計(jì)以340nm波長光激發(fā)，檢測490nm發(fā)射波長下熒光值變化，測定出加入小分子化合物后3CL蛋白酶的活性，再與不加入化合物的3CL蛋白酶進(jìn)行活性比較，計(jì)算小分子化合物對3CL蛋白酶活性的抑制率，進(jìn)行抑制劑篩選。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種SARS冠狀病毒3CL蛋白酶活性測定和抑制劑篩選方法，該方法采用合成SARS冠狀病毒3CL蛋白酶熒光底物將熒光底物與反應(yīng)緩沖液混合再加入3CL蛋白酶在一定條件下激發(fā)，檢測發(fā)射波長的熒光值變化，完成對SARS冠狀病毒3CL蛋白酶的體外活性測定。3CL蛋白酶與待篩選小分子化合物在一定條件下孵育，再加上熒光底物混勻，用光激發(fā)檢測發(fā)射波長下的熒光值，測定加入小分子化合物后的3CL蛋白酶的活性，與不加入化合物的3CL蛋白酶進(jìn)行活性比較，計(jì)算出小分子化合物對3CL蛋白酶的活性抑制率。
文檔編號G01N21/64GK1690691SQ200410017899
公開日2005年11月2日 申請日期2004年4月23日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月23日
發(fā)明者沈旭, 蔣華良, 沈建華, 陳帥, 陳莉莉, 羅小民, 柳紅, 陳凱先 申請人:中國科學(xué)院上海藥物研究所