肝癌組織特異性粘附肽、體內外結合篩選方法及其用途的制作方法

專利名稱：肝癌組織特異性粘附肽、體內外結合篩選方法及其用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種腫瘤導向治療中的導向肽、該導向肽的篩選方法，以及該導向肽的應用，尤其是涉及一種能特異性結合肝癌組織/細胞的粘附肽、該粘附肽的篩選方法以及該粘附肽的應用，屬于分子藥理學技術領域。
背景技術：
肝癌作為一種最常見的惡性腫瘤對人類健康造成了極大的威脅，據估計，全世界每年死于肝癌的患者達125萬。目前用于肝癌治療的方法主要有手術療法、放射療法和化學療法等，但這些方法對人體的健康組織和器官都存在不同程度副作用。
導向治療技術為腫瘤的治療開辟了廣闊的前景。腫瘤導向治療是指應用針對腫瘤特異性或相關抗原的單克隆抗體與殺傷腫瘤細胞的活性物質如化療藥物、毒素、放射性核素等相偶聯，將活性物質選擇性地運送到腫瘤部位，定向殺傷腫瘤細胞的方法。腫瘤導向治療作為近年來興起的第四種腫瘤療法即生物治療法中的重要組成部分而受到了人們很大的重視。
關于利用噬菌體肽庫技術對腫瘤組織特異性粘附肽的篩選，1996年Pasqualinii和Ruoslahti首先在Nature上報道了該方法，并且利用該方法篩選出了特異結合腦和腎的噬菌體結合肽。1997年他們成功篩選到一條對惡性黑素瘤和乳腺癌組織上的αv整合素特異性親和的包含RGD的短肽，其與腫瘤細胞結合的特異性較與腦和腎正常組織結合高20倍以上；到目前為止，人們已發現多條特異性親和人腫瘤血管的短肽，如RGD_4C，CNGRC，GSL，SMSIARL，CPGPEGAGC等，前述的兩條短肽已在動物身上進行了抗腫瘤活性測定，抗癌效果良好。
在導向治療中非常關鍵的在于如何篩選得到具有很強特異性的導向肽，目前噬菌體肽庫技術是一種比較有效的篩選方法。噬菌體肽庫技術自20世紀90年代誕生以來給探索生物大分子間相互作用的結合位點、尋找高親和力生物活性的配體分子以及給藥物篩選、新型診斷試劑和疫苗等領域的研究帶來了革命，其最大優點就是無需知道蛋白質的任何性質，就可篩選到特異性的結合肽，因而方法方便快速有效。目前用噬菌體肽庫技術篩選導向肽分為體內篩選和體外篩選兩種。體內篩選法尤其在篩選組織或腫瘤組織特異性結合肽時有其明顯的優越性其一，噬菌體肽庫進入機體的血液系統，在血液循環過程中可以去除大量與靶組織無關的噬菌體肽，經過多次重復操作后可以得到所需的組織或腫瘤特異性結合肽，其原理是不同的組織都有其特異細胞膜標志，如淋巴細胞的歸巢、腫瘤細胞定向轉移等；其二，在體內篩選到的是自然狀態下的組織或腫瘤特異性結合肽，這在診斷和導向治療中更有使用價值；其三，用體內篩選法經常能篩選到與腫瘤新生血管特異性結合的多肽，而腫瘤新生血管壁上存在著正常血管所沒有或很少有的粘附分子，這些分子與腫瘤抗原相比其異質性和調變要少得多，也無需克服腫瘤的生物屏障，因此作為導向治療的“彈頭”有更多的優越性。但體內篩選法明顯的缺陷在于在篩選和鑒定方面都比體外篩選法來得麻煩和困難，因此大多數報道還是采用細胞的體外篩選法。但是體外篩選雖然篩選和鑒定都較體內篩選簡單，其缺點也是很明顯的，因為體外培養的細胞所處的環境與體內差異較大，因此無法準確判斷篩選出的導向肽的特異性。

發明內容
本發明的目的在于提供一種能特異性結合肝癌組織/細胞粘附肽；本發明的另一目的在于提供該肝癌組織/細胞粘附肽的體內外結合篩選方法；本發明的目的還在于提供該肝癌組織/細胞粘附肽的用途。
本發明提供的肝癌組織/細胞粘附肽，其多肽序列為序列一NH2-P-F-A-R-A-P-V-E-H-H-D-V-V-G-L-COOH序列二NH2-R-N-L-L-P-S-C-S-P-Q-L-S-R-C-Y-COOH為得到上述肝癌組織/細胞粘附肽，本發明采取體內外結合的篩選方法，具體包括以下步驟第一步將正常肝細胞株加入噬菌體肽庫中，回收不與正常肝細胞結合的噬菌體肽，進行擴增；第二步將回收的不與正常肝細胞結合的噬菌體肽注射到荷瘤鼠體內，這些噬菌體經過血液循環后含有肝癌組織特異性肽的噬菌體會吸附到癌細胞或被癌細胞內吞，從肝癌組織回收噬菌體肽，感染大腸桿菌K91Kan感受態細胞，然后將該噬菌體擴增后純化；第三步將第二步經過擴增和純化的噬菌體注射到新的荷瘤鼠體內，重復第二步，從肝癌組織回收得到更多與肝癌組織結合特異性強、親和力高的噬菌體多肽。
第四步篩選得到的噬菌體單克隆化，用細胞ELISA方法對單克隆的噬菌體進行鑒定，以正常肝細胞作為陰性對照，選擇結合系數大的克隆為與腫瘤細胞結合特異性好的陽性克隆。
在第四步中克隆的特異性結合系數是指噬菌體肽與腫瘤細胞結合得OD490值除以同樣條件下與正常細胞結合的OD490的百分比。
本發明還可以在第三步結束后，再進行一到兩次和第三步一樣的體內篩選過程，以回收得到更多與肝癌組織結合特異性強、親和力高的噬菌體多肽。
篩選結束后為進一步證明篩選得到的粘附肽的導向效果，可以用免疫熒光等方法來驗證，證明篩選得到的陽性克隆的多肽能有效地導向肝癌組織。同時再將得到的陽性克隆的噬菌體純化后回輸到荷瘤裸鼠體內，用免疫組化的方法來測定其組織分布特異性，驗證其導向效果。并對陽性克隆進行了序列分析，從而可以得到該多肽的序列。
本發明還提供序列一NH2-P-F-A-R-A-P-V-E-H-H-D-V-V-G-L-COOH和序列二NH2-R-N-L-L-P-S-C-S-P-Q-L-S-R-C-Y-COOH的肝癌組織/細胞特異性粘附肽在制備肝癌的導向藥物中的應用。
本發明提供的肝癌組織/細胞粘附肽導向效果好，組織分布特異性強，是一個很好的肝癌導向治療中的粘附肽，具有較廣闊的應用前景。
本發明提供的體內外結合的肝癌組織特異性粘附肽的篩選方法比體內篩選方法和體外篩選方法都具有明顯的優勢因為其中經過體內篩選的步驟，所以篩選出的粘附肽與體內環境更相吻合，從而克服了單純體外篩選的缺點；另外由于在篩選的后期采用的是體外篩選的方法，所以克服了體內篩選時鑒定困難的缺點，鑒定起來比較簡單。最后通過回輸荷瘤鼠體內進一步鑒定粘附肽的結合特異性，彌補了體外篩選的缺陷，所以可以明顯看出本發明克服了單純體內和單純體外篩選方法的缺陷，而同時兼有了兩者的優點。
具體實施例方式
在說明具體實施方式
前，先對本發明要用到的材料和試劑以及試劑的配置進行簡單的說明試驗材料與試劑(一)試劑1.噬菌體隨機15-肽文庫(多樣性為108)、K91Kan由美國密蘇里大學G.P.Smith教授惠贈，因為G.P.Smith教授長期以來一直無償提供這兩種試劑，這在業內是眾所諸知的，所以任何人都可以在需要的時候得到這兩種試劑。
2.人肝臟細胞株L-02、人肝癌細胞株BEL-7402購自中國科學院上海生物化學與細胞生物學研究所細胞庫3.兔抗噬菌體M13抗血清、辣根過氧化物酶標記的抗M13單克隆抗體購自瑞典Pharmacia公司。
4.辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG(HRP-羊抗兔IgG)、異硫氰酸熒光黃(FITC)標記的山羊抗兔IgG、碘化丙錠(PI)、鄰苯二胺(OPD)、二氨基聯苯胺(DAB)等購自美國SIGMA公司5.硝酸纖維薄膜(NC膜)(美國進口分裝)
6.酵母提取物Yeast Extract、蛋白胨Bacto-Tyrptone購自英國OXOID公司7.RPMI-1640干粉劑、新生小牛血清購自美國GIBCO公司8.二甲基亞砜購自德國SERVA公司9.胰蛋白酶由Difco進口分裝(二)試劑的配制培養基1、噬菌體擴增培養基(1)大腸桿菌K91Kan液體培養基(LB培養基)蛋白胨(Bacto-Tyrptone)10g/L、酵母粉(Yeast Extract) 5g/LNaCl 10g/L、加入適量的dH2O充分溶解后，用1N的NaOH將pH值調到7.0-7.5之間，最后用dH2O定容至1L，分裝后高壓滅菌。
(2)LB固體培養基上述分裝好的液體培養基加入1.5％的瓊脂糖后再進行高壓滅菌即可(3)高營養液體培養基(terrific broth，TB)a、K-PBS(0.17M KH2PO4-0.72M K2HPO4)KH2PO4(anhydrous) 2.31g；K2HPO4(anhydrous)12.54g；dH2O加至100ml，高壓滅菌。
b、TB培養基蛋白胨(Bacto-Tryptone)12g；酵母粉(Yeast Extract)24g；甘油(Glycerol)4ml；dH2O加至900ml，高壓滅菌。
使用前a∶b以1∶9混勻(4)選擇培養基將高壓滅菌后的LB固體培養基加熱完全溶解，待到冷卻至50℃左右時加入所需的抗生素，小心搖動三角燒瓶充分混勻，注意掌握時間在培養基凝固之前澆制平板。保存條件含有抗生素的LB固體培養基應保存在4℃，卡那霉素的有效期為7天，四環素的為5天2、細胞培養基1640培養基(1)RPMI1640培養基a、基本培養基800ml的三蒸水中加入RPMI-1640干粉劑溶解，加入2gNaHCO3，溶解后定容至1000ml。5％NaHCO3調節pH至7.0，0.22um過濾除菌，-20℃保存。
b、培養基基本培養基90％；56℃滅活30min的新生小牛血清10％；雙抗100IU/ml，用時配制，4℃備用。
(2)D-hank’s母液(10×)NaCl 10g、KCl 0.4g、KH2PO40.06g、Na2HPO40.12g、ddH2O 100ml，配好后，用5％NaHCO3調pH至7.0左右，高壓滅菌，4℃保存。(3)胰蛋白酶消化液稱250mg胰蛋白酶(1∶250，Difco進口分裝)粉末于燒杯中，先用加入D-Hanks液至100ml，攪拌均勻，置室溫4hr或4℃過夜，經常振搖使其完全溶解；用0.22um的微孔濾膜過濾除菌，分裝每只1ml，-20℃保存，臨用前解凍。
(4)雙抗高溫高壓滅菌D-Hanks液，用5ml無菌D-Hanks溶解80萬單位的青霉素鈉，吸取5ml；另用5ml無菌D-Hanks溶解100萬單位的硫酸鏈霉素，吸取4ml，補充無菌D-Hanks至80ml，-20℃保存。
(5)細胞凍存液基本培養基70％、小牛血清20％、二甲基亞砜(DMSO)10％；抗生素的配制1、卡那霉素儲備液的配制卡那霉素(kanamycin)1000×用ddH2O溶解100mg/ml，-20℃保存2、四環素儲備液的配制四環素(tetracycline)1000×用50％甘油溶解40mg/ml，-20℃避光保存PEG-NaClPEG8000，100g；NaCl，116.9g；dH2O，475ml；于1L的燒杯中攪拌溶解(可以加熱至65℃)，高壓滅菌，終體積應為600ml，4℃避光保存洗板液1、pH7.4磷酸鹽緩沖液(PBS)10×NaCl 80g、KH2PO42g、Na2HPO4·12H2O29g、KCL 2g，dH2O定容至1000ml2、洗板液apH7.4 PBS 0.05％，Tween 20(PBST05)；Tween 20 0.5ml1×PBS加至 1000ml3、洗板液bpH7.4 PBS 0.5％，Tween 20(PBST05)Tween 20 5ml1×PBS加至 1000ml封阻液PBST05-3％BSA，同時也是酶標抗體的稀釋液TBS1M Tris-HCl pH7.5，5ml；NaCl，0.9g；dH2O加至100ml，高壓滅菌OPD(鄰苯二胺)底物顯色液1、OPD底物緩沖液(PCS)檸檬酸4.66g、Na2HPO4·12H2O，18.4g；dH2O加至1000ml，于4℃保存2、OPD底物顯色液PCS9ml、30％過氧化氫10ul、OPD4mg酶終止液2M H2SO4DAB底物顯色液10mM Tris-HCl pH7.5，9ml；30％過氧化氫10ul；DAB6mg；30％NiCl，100ul篩選前期的準備工作1.肝癌細胞及正常肝細胞的體外培養肝癌細胞BEL-7402；正常肝細胞L-02均購于中國科學院上海生物化學與細胞生物學研究所的細胞庫。細胞在含1％雙抗、10％小牛血清的RPMI-1640完全培養基中，以37℃，5％CO2傳代培養。傳代時采用0.25％胰蛋白酶消化，于-70℃冰箱中冷凍保存。
2.荷瘤裸鼠動物模型的建立及飼養與中科院實驗動物中心合作完成肝癌細胞株BEL-7402荷瘤裸鼠動物模型的建立。方法是采用2周齡裸鼠，腋下注射200μl約106個腫瘤細胞BEL-7402。4-6周后選用腫瘤直徑達到1cm左右的荷瘤裸鼠進行體內篩選或體內鑒定。
本發明的噬菌體的擴增及效價測定采用如下方法在含有卡那霉素(100μg/ml)的LB中過夜培養(37℃ 270rpm)大腸桿菌K91Kan，次日110轉入10ml TB培養基中繼續震蕩培養2小時45分鐘37℃震蕩(100rpm)培養10--15分鐘，即為感受態細胞。
將待擴增噬菌體加入到感受態細胞中，37℃震蕩(100rpm)培養15分鐘，將培養物轉入100ml LB-0.02Tet(0.02％四環素)中37℃震蕩(270rpm)培養30分鐘，加入100ul四環素(20mg/ml)繼續培養24小時。
培養物于4℃8000rpm離心15分鐘，取上清夜加入15％PEG-NaCl充分混合并置于4℃下沉淀過夜；沉淀過夜后溶液于4℃ 10000rpm離心20min，棄上清，加入TBS 1ml充分溶解，4℃ 10000rpm離心10min除去剩余的菌體，將上清夜轉入到另一干凈的小離心管中，加入200μl PEG-NaCl后充分混合，4℃沉淀1小時，4℃ 10000rpm離心后200μl TBS溶液溶解，60℃水浴中恒溫20min。加入0.7％二甲基亞砜與0.02％疊氮化鈉-70℃保存。
噬菌體效價測定取大腸桿菌K91Kan感受態細胞10ul于15-ml指管中并與10ul一定稀釋度(10-x)的噬菌體溶液混合，室溫保持10分鐘；加入1ml LB-0.02Tet液體培養基，37℃震蕩(270rpm)培養30分鐘；取100ul培養液涂平板(Kan100-Tet40 LB固體培養基平板)，37℃培養過夜；對培養皿中的菌落進行記數(y)，效價＝y×10x×103TU/ml，(其中10x代表稀釋度。y代表平板上藍斑數目)下面結合實施例詳細說明具體的篩選步驟1、噬菌體體外反向吸收正常肝細胞與噬菌體15肽庫共同37℃孵育1小時，離心，取上清，擴增、純化噬菌體，用于下一步荷瘤裸鼠體內篩選。
2、噬菌體隨機肽庫的活體篩選挑選腫瘤直徑1cm見方的荷瘤裸鼠用乙醚麻醉后，將1010的噬菌體肽庫靜脈注射入荷瘤裸鼠體內，這些噬菌體經過血液循環后，含肝癌細胞特異性肽的噬菌體將會吸附與肝癌細胞上或被癌細胞內吞，5分鐘后先用10ml的DMEM、后用100ml生理鹽水對小鼠進行心臟灌流，盡量洗去血液，以便以后組織切片的觀察，減少背景。取出小鼠的主要器官和一部分腫瘤組織，浸入3％的甲醛中，以備組織切片用。剩下的腫瘤組織用PBS洗三次，研磨后，感染大腸桿菌，37℃230rpm振蕩1小時，取100ul測效價。其余的繼續搖24小時。
3、擴增純化后噬菌體進入第二輪篩選，重復步驟2。
4、噬菌體的單克隆化將第三次篩選得到的噬菌體感染大腸桿菌K91Kan所形成的單菌落投入已放有1ml LB-Kan100-Tet40液體培養基的15ml-指管中，37℃震蕩(×270rpm)培養24小時；離心除去菌體，取上清液，測效價后保存并測序。
5、用細胞ELISA方法對得到的單克隆化的噬菌體進行鑒定篩選把體外培養的BEL-7402人肝癌細胞和L-02人正常肝細胞分別消化下來，記數后制成相同濃度的細胞懸液。分別加入96孔細胞培養板，使培養板上下各兩個孔分別對應相同濃度的肝癌細胞和正常肝細胞。
(1)細胞板每孔加100ul細胞懸濁液，37℃細胞培養箱中過夜，使細胞貼壁。
(2)固定每孔加入100ul 3％多聚甲醛固定，1hr后用PBST-05、PBST-5分別洗板3次，(3)封阻每孔加封阻液(PBST05-3％BSA)100ul，37℃封阻1hr，同上洗板(4)每孔加噬菌體單克隆100ul，并留一孔不加噬菌體作空白對照。在37℃溫育1hr，同上洗板(5)每孔加噬菌體M13抗血清100ul，37℃度溫育2hr，洗板(6)每孔加辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG100ul，37℃溫育1hr。洗板(7)每孔加OPD底物顯色液，振蕩顯色(8)每孔加酶終止液(2M H2SO4)，(9)終止顯色(10)細胞板離心，將每孔中的上清顯色液以在細胞板上同樣位置轉移到酶標板中，酶標儀490nm波長讀數。
按下列公式計算每個克隆的特異結合系數 每個孔的OD值讀數均為為某噬菌體單克隆在肝癌細胞孔中或在正常肝細胞孔中的讀數的均值6、免疫組織化學鑒定(1)取出浸在3％多聚甲醛中的樣品，自然干燥后，切片，然后將切片貼到玻片上，晾干，丙酮固定5min，PBST洗3次，每次3min。
(2)1％過氧化氫甲醇混合液室溫浸泡30min，PBST洗3次，每次5min。
(3)5％脫脂奶粉室溫封阻20min，加入按1∶1000稀釋的噬菌體M13抗血清，37℃濕盒中溫育1hr，PBST洗3次，每次5min。
(4)加入1∶300稀釋的HRP標記的羊抗兔IgG，37℃濕盒中溫育1hr，PBST洗3次，每次5min，(5)DAB進行顯色反應(約12min)，用流水終止反應(6)蘇木青復染核約3min，自來水沖洗，加飽和碳酸鋰分色，用酒精逐級脫水，二甲苯3min透明，最后用中性樹脂封片觀察。
7、熒光免疫細胞鑒定(1)把體外培養的BEL-7402人肝癌細胞和L-02人正常肝細胞分別用胰酶消化，把兩種細胞制成相同濃度的懸液，分裝于小離心管(2)每管加1ml 3％多聚甲醛固定30min，用PBST洗3次(3)每管加1ml PBST05-3％BSA，37℃封阻1hr，加入PBST洗3次(4)加入噬菌體，37℃溫育1hr。用PBST洗3次(5)加噬菌體M13抗血清37℃溫育2hr。用PBST洗3次(6)每孔加FITC標記的羊抗兔IgG和PI，振蕩，冰育15min。
(7)取一滴緩沖甘油溶液滴片，熒光顯微鏡鏡檢，拍照。
8、體內鑒定取噬菌體肽擴增測得效價為1.26×1011。通過荷瘤裸鼠的尾靜脈注射回輸到裸鼠體內，經5分鐘的體內循環后，對裸鼠進行心臟灌流，隨后取其心、腦、肝及肝癌組織進行組織冰凍切片，行免疫組織化學觀察。
通過兩輪的體內篩選得到目標噬菌體。將目標噬菌體單克隆化后隨機挑取144個單克隆進行擴增、純化，并調整每個噬菌體克隆為相同的濃度(1010左右)。對每個單克隆化的噬菌體肽分別進行細胞ELISA的免疫熒光鑒定、體內鑒定，挑選結合特異性好的噬菌體進行測序，測序前將噬菌體單克隆化擴增，離心取上清液500μl，加入200μl PEG/NaCL，反復顛倒至混勻，室溫靜置10分鐘，10000rpm離心去上清，然后低速離心，去除剩余上清。加100μl Iodide緩沖液將沉淀溶解，再加250μl無水乙醇室溫孵育10分鐘，這樣可以使單鏈的噬菌體DNA沉淀而溶解噬菌體蛋白，10000rpm離心去上清，用70％乙醇清洗沉淀，真空干燥，加30μl TE緩沖液溶解沉淀。樣品送華大基因上海鼎安生物科技有限公司測序，結果經GENG RUNNER、CLONE MANNAGER等軟件翻譯、分析。對它們DNA測序發現兩種多肽序列序列一NH2-P-F-A-R-A-P-V-E-H-H-D-V-V-G-L-COOH序列二NH2-R-N-L-L-P-S-C-S-P-Q-L-S-R-C-Y-COOH
權利要求
1.一種肝癌組織特異性粘附肽，其特征在于多肽序列為序列一NH2-P-F-A-R-A-P-V-E-H-H-D-V-V-G-L-COOH序列二NH2-R-N-L-L-P-S-C-S-P-Q-L-S-R-C-Y-COOH
2.一種肝癌組織特異性粘附肽的篩選方法，其特征在于包括以下步驟第一步將正常肝細胞株加入噬菌體肽庫中，回收不與正常肝細胞結合的噬菌體肽，進行擴增；第二步將回收的不與正常肝細胞結合的噬菌體肽注射到荷瘤鼠體內，從肝癌組織回收噬菌體肽，感染大腸桿菌K91Kan感受態細胞，然后將該噬菌體擴增后純化；第三步將第二步經過擴增和純化的噬菌體注射到新的荷瘤鼠體內，重復第二步，從肝癌組織回收得到更多與肝癌組織結合特異性強、親和力高的噬菌體多肽；第四步將篩選得到的噬菌體單克隆化，用細胞ELISA方法對單克隆的噬菌體進行鑒定，以正常肝細胞作為陰性對照，選擇結合系數大的克隆為與腫瘤細胞結合特異性好的陽性克隆。
3.如權利要求2所述的肝癌組織特異性粘附肽的篩選方法，其特征在于在第三步結束后，再進行一到兩次和第三步一樣的體內篩選過程，以回收得到更多與肝癌組織結合特異性強、親和力高的噬菌體多肽。
4.如權利要求2或者3所述的肝癌組織特異性粘附肽的篩選方法，其特征在于在第四步中克隆的特異性結合系數是指噬菌體肽與腫瘤細胞結合得OD490值除以同樣條件下與正常細胞結合的OD490的百分比。
5.如權利要求2或者3所述的肝癌組織特異性粘附肽的篩選方法，其特征在于將得到的陽性克隆的噬菌體純化后回輸到荷瘤裸鼠體內，用免疫組化的方法來測定其組織分布特異性，驗證其導向效果。
6.序列一NH2-P-F-A-R-A-P-V-E-H-H-D-V-V-G-L-COOH和序列二NH2-R-N-L-L-P-S-C-S-P-Q-L-S-R-C-Y-COOH的肝癌組織特異性粘附肽在制備肝癌的導向藥物中的應用。
全文摘要
一種能特異性結合肝癌組織/細胞的粘附肽、該粘附肽的篩選方法以及該粘附肽的應用，屬于分子藥理學技術領域。本發明提供的體內外結合的篩選方法，兼備了體內和體外篩選的優點，克服了其缺點，篩選出兩種肝癌組織/細胞粘附肽，并測定了其多肽序列。該肝癌組織/細胞特異性粘附肽導向效果好，組織分布特異性強，在制備肝癌的導向藥物中具有廣闊的應用前景。
文檔編號G01N33/68GK1563078SQ200410017049
公開日2005年1月12日 申請日期2004年3月19日 優先權日2004年3月19日
發明者錢旻, 周忠良, 章平, 杜冰, 于靜, 金怡, 郁萌 申請人:華東師范大學