專利名稱：多通道trail受體檢測系統及其檢測方法
背景技術：
細胞凋亡是生物體最重要的生理和病理現象之一。TRAIL(TNF-relatedapoptosisindecingligand)是新的腫瘤壞死因子TNF(Tumomecrosisfactor)家族成員，其最大的生物學特點是選擇性細胞毒作用，即僅誘導腫瘤細胞、轉化細胞或病毒感染細胞的凋亡，而不引起正常的細胞凋亡。這一特點在腫瘤治療中具有潛在而廣泛的應用前景。
現階段檢測TRAIL四種受體的方法有兩種。一是用流式細胞儀的方法在實驗室進行檢測。每個病人的樣品需要進行四種抗體的單獨標記、單獨操作，操作過程復雜，容易造成試劑及消耗品的浪費。流式細胞儀的方法僅適用于實驗室少量標本的研究而不利于臨床大量標本的批量檢測。二是酶聯免疫吸附試驗(ELISA)方法。這種方法雖然簡單易行，但僅適于液體介質中可溶性成分的檢測，不適合檢測用于細胞表面的跨膜蛋白，TRAIL屬于II型跨導蛋白的一種，即ELISA方法不適于TRAIL四種受體的檢測。
迄今為止，對TRAIL的研究主要集中在其生物學特性方面的研究，尚未建立TRAIL高通量的快速檢測系統。生物與電子技術結合產生的生物傳感器，可以對蛋白質等大分子進行檢測，為解決現有檢測手段的困難提供了可能。
發明內容
本發明的主要目的在于提供一種多通道TRAIL受體檢測系統及其檢測方法，利用抗原抗體反應原理研制出免疫場效應型TRAIL生物傳感器，可實現對腫瘤細胞凋亡因子TRAIL四種受體的檢測。
本發明的目的還在于提供一種TRAIL抗體生物敏感膜，以及制造方法。
本發明的目的還在于提供一種免疫場效應型TRAIL生物傳感器，以及檢測腫瘤細胞凋亡因子TRAIL四種受體的方法。
為實現上述目的，本發明提供的一種TRAIL抗體生物敏感膜制備的制造方法，其特征在于，其步驟如下A、采用P型硅材料，用半導體制備工藝制成MOS型場效應晶體管，該場效應晶體管包括源極、漏極、非金屬的絕緣材料氮化硅柵極；B、氮化硅作為敏感柵，將其做硅烷化處理；C、用吸附方法將蛋白A固定在氮化硅表面，室溫干燥，牛血清蛋白(BSA)做封閉處理，磷酸緩沖溶液(PBS)清洗待干燥，由此形成氮化硅—蛋白A的復合敏感膜；D、將TRAIL受體的抗體用吸附方法固定在蛋白A上，待室溫干燥，磷酸緩沖溶液(PBS)清洗置干備用；至此制備成氮化硅—蛋白A-TRAIL受體的抗體這樣有疊型結構的生物敏感膜。
本發明還提供一種TRAIL抗體生物敏感膜，其特征在于，包括一固定在氮化硅上的蛋白A，兩者共同組成氮化硅—蛋白A的復合敏感膜；還包括一層吸附在其上的TRAIL受體的抗體。
本發明還提供一種免疫場效應型TRAIL生物傳感器，其特征在于，包括以下結構一采用P型硅材料用半導體制備工藝制成MOS型場效應晶體管；還包括一在該場效應晶體管上制得的如上所述的TRAIL抗體生物敏感膜；該傳感器分別提供單參數TRAIL和多參數TRAIL腫瘤細胞的檢測。即單參數檢測TRAIL采用離子敏場效應管、多參數檢測TRAIL采用光尋址電位傳感器LAPS。
本發明還提供一種檢測TRAIL受體的方法，其特征在于，步驟如下
a、將定量TRAIL抗體固定在離子敏場效應管(ISFET)敏感柵氮化硅表面構成如前所述的生物功能性TRAIL抗體生物敏感膜；b、抗體識別待測液中不同細胞上表達的TRAIL受體抗原量，形成穩定的復合體，抗原抗體的結合產生的荷電狀態，引起離子敏場效應管膜電位變化；c、測量膜電位的電壓變化值得到待檢TRAIL受體抗原量的數量，完成對腫瘤細胞凋亡因子TRAIL的檢測。
其中步驟a，細分為如下步驟a1、將敏感柵上的氮化硅做硅烷化處理；a2、用吸附方法將蛋白A固定在氮化硅表面，室溫干燥，牛血清蛋白(BSA)做封閉處理，磷酸緩沖溶液(PBS)清洗待干燥，由此形成氮化硅—蛋白A的復合敏感膜；a3、將TRAIL受體的抗體用吸附方法固定在蛋白A上，待室溫干燥，磷酸緩沖溶液(PBS)清洗置干備用；本發明還提供一種多通道TRAIL受體檢測系統，其特征在于，包括若干個如前所述的免疫場效應型TRAIL生物傳感器，用于將待檢TRAIL受體抗原量轉換為膜電位的電壓值；多路開關，用于依次選通各傳感器通道，把參比電極上的控制電位VG輸入到模數轉換器；反饋前級電路，用于保持漏源電流Ids恒定，使得參比電極上的控制電位VG與待測物質活度ai的對數呈線性關系；數模轉換器，用于將參比電極上的控制電位VG由模擬量轉換為數字量；單片機，用于控制采樣，換算，顯示，存儲，通訊和按鍵操作；存儲器，用于存儲采樣結果；顯示器，用于顯示參比電極上的控制電位VG；所述的單片機，控制多路開關，依次選通各通道，模數轉換器，將參比電極上的控制電位，由模擬量轉換為數字量，間隔定期進行數據采樣，并且將采樣結果存入存儲器，優選為電可擦寫存儲器，采樣的結果由顯示器，優選為液晶顯示器。
上述多通道TRAIL受體檢測系統，還包括PC機，與單片機連接，用于處理采樣數據。
由上可見，本發明采用微電子技術可以實現傳感器芯片的陣列化，使腫瘤細胞凋亡因子TRAIL的大批量臨床檢測成為可能。傳感器方法檢測腫瘤細胞凋亡因子TRAIL四種受體，其特點是簡單、快速、成本低、價格低廉、特異性好、無需標記、所需樣本量少，微升量級、可同時對多人多批次進行檢測。利用多通道TRAIL受體快速檢測系統對腫瘤病人進行檢測，可以為醫生提供半定量的數據信息。避免盲目用藥給病人造成的經濟負擔。
免疫場效應型TRAIL生物傳感器及其多通道快速檢測系統可以完成對腫瘤細胞凋亡因子TRAIL四種受體的定量或半定量檢測。比如用固定量的抗體檢測等量的不同腫瘤細胞上表達的TRAIL受體抗原的量，通過電壓數據變化表明之間有差別。
TRAIL多通道快速檢測系統可與普通PC機相兼容，通過與PC機的通訊實現復雜的數據分析與管理。這一點與現有的用流式細胞儀檢測腫瘤細胞凋亡因子TRAIL四種受體的方法完全不同。流式細胞儀是檢測用熒光素標記后細胞的專用儀器，能分別對標記的四種熒光素細胞進行計數，主要的檢測與分析軟件名為″Cellquest″，能用各種圖形進行分析，并讀取數值，但其主機只能與蘋果機兼容，只能用蘋果機讀取和分析數據。
圖1是有疊型結構生物敏感膜場效應型傳感器示意圖；圖2是場效應型生物傳感器用于檢測TRAIL受體的示意圖；圖3是本發明實施例TRAIL多通道快速檢測系統結構示意圖。
具體實施例方式
如圖1所示為有疊型結構生物敏感膜場效應型傳感器示意圖。采用P型硅材料3，用半導體制備工藝制成MOS型場效應晶體管。該場效應晶體管包括源極1、漏極2、非金屬的絕緣材料氮化硅4柵極。將敏感柵氮化硅4做硅烷化處理，用吸附方法將蛋白A5固定在氮化硅4表面，室溫干燥，牛血清蛋白(BSA)做封閉處理，磷酸緩沖溶液(PBS)清洗待干燥，由此形成氮化硅—蛋白A的復合敏感膜。再將TRAIL受體的抗體6用吸附方法固定在蛋白A5上，待室溫干燥，磷酸緩沖溶液(PBS)清洗置干備用。至此制備成氮化硅—蛋白A-TRAIL受體的抗體這樣有疊型結構的生物敏感膜。
場效應型生物傳感器用于檢測TRAIL受體的實施方式如圖2所示。
免疫場效應型TRAIL生物傳感器是利用抗原和抗體免疫反應的特異性結合構成的，具有高度專一性。定量TRAIL抗體2被固定在離子敏場效應管(ISFET)敏感柵氮化硅表面構成生物功能性敏感膜1，抗體識別待測液中不同腫瘤細胞4上表達的TRAIL受體3抗原量，形成穩定的復合體。抗原抗體的結合產生的荷電狀態，會引起離子敏場效應管膜電位變化，其膜電位改變和待測溶液中的離子活度遵循Nernst原理。將傳感器與多通道快速檢測系統連接，測量膜電位的電壓變化值即能得到待檢TRAIL受體3抗原量的多少。利用這種現象可以實現生物信號與電子信號的轉換，即用微結構場效應型生物傳感器的方法完成對細胞凋亡因子TRAIL四種受體的檢測。
便攜式多通道快速檢測系統的實施方式如圖3框圖所示。
多通道快速檢測系統是基于MOS器件基本原理設計完成的，可以用來檢測因待測物質濃度變化而引起的膜電位變化。多通道快速檢測系統采用ATMEL公司的89c52單片機，通過它來控制采樣，換算，顯示，存儲，通訊和按鍵操作。通過應用89c52單片機，有效的減少了外圍電路，增加了儀器的靈活性和可靠性。可以根據用戶的要求，通過改變儀器或者上位機的軟件，為該檢測系統擴展一系列新功能。
圖3中，根據離子敏場效應管ISFET原理，采用運算放大器Lm258構成反饋補償前級電路33，保持漏源電流Ids恒定，則參比電極上的控制電位VG與待測物質活度ai的對數呈線性關系。單片機35，型號為AT89c52；控制多路開關32，型號為AD7501；依次選通各通道，模數轉換器34，型號為Max187；將參比電極上的控制電位VG由模擬量轉換為數字量，以4秒(S)的間隔通過傳感器采樣31，數量為1～n，進行數據采樣，并且將采樣結果存入電可擦寫存儲器36，型號為x25043。采樣的結果由液晶驅動電路Icm7211驅動4位液晶顯示器顯示38。采樣數據量較大時，可通過連接電纜連接到計算機37，使用配套的軟件進行數據分析與管理。
多通道快速檢測系統特點可以與PC機進行數據通訊，實現復雜的數據分析與管理。
軟件界面友好，操作簡單，無需專業人員。
用途廣泛，可以測量多種參數，易于實現功能擴展。
檢測速度快，響應時間小于4S。
檢測量大，有多個通道，可同時檢測多個樣品。
儀器使用9V直流電源，可在室內、野外使用。
LED數字顯示。
體積小、重量輕、便于攜帶、穩定可靠。
多通道快速檢測儀表技術參數最大樣品數量n(1～35)個檢測范圍0～1000mV標準溫度 25℃標準反應時間 4S工作電源 9V直流電源使用環境 室內/室外使用環境溫度 0～40℃使用濕度 ＜90％(40℃時)密封性不易滲水、腐蝕顯示電壓精度 1mV儀器尺寸 134×70×20mm儀器重量約 100g
權利要求
1.一種TRAIL抗體生物敏感膜制備的制造方法，其特征在于，其步驟如下A、采用P型硅材料，用半導體制備工藝制成MOS型場效應晶體管，該場效應晶體管包括源極、漏極、非金屬的絕緣材料氮化硅柵極；B、氮化硅作為敏感柵，將其做硅烷化處理；C、用吸附方法將蛋白A固定在氮化硅表面，室溫干燥，牛血清蛋白做封閉處理，磷酸緩沖溶液清洗待干燥，由此形成氮化硅—蛋白A的復合敏感膜；D、將TRAIL受體的抗體用吸附方法固定在蛋白A上，待室溫干燥，磷酸緩沖溶液清洗置干備用；至此制備成氮化硅—蛋白A-TRAIL受體的抗體這樣有疊型結構的生物敏感膜。
2.一種TRAIL抗體生物敏感膜，其特征在于，包括一固定在氮化硅上的蛋白A，兩者共同組成氮化硅—蛋白A的復合敏感膜；還包括一層吸附在其上的TAIL受體的抗體。
3.一種免疫場效應型TRAIL生物傳感器，其特征在于，包括以下結構一采用P型硅材料用半導體制備工藝制成MOS型場效應晶體管；還包括一在該場效應晶體管上制得的如權利要求2所述的TRAIL抗體生物敏感膜；該傳感器分別提供單參數TRAIL和多參數TRAIL腫瘤細胞的檢測，該單參數檢測TRAIL采用離子敏場效應管、多參數檢測TRAIL采用光尋址電位傳感器LAPS。
4.一種檢測腫瘤細胞凋亡因子TRAIL四種受體的方法，其特征在于，步驟如下a、將定量TRAIL抗體被固定在離子敏場效應管敏感柵氮化硅表面構成如權利要求2所述的生物功能性TRAIL抗體敏感膜；b、抗體識別待測液中不同細胞上表達的TRAIL受體抗原量，形成穩定的復合體，抗原抗體的結合產生的荷電狀態，引起離子敏場效應管膜電位變化；c、測量膜電位的電壓變化值得到待檢TRAIL受體抗原量的數量，完成對腫瘤細胞凋亡因子TRAIL的檢測。
5.根據權利要求4所述的檢測腫瘤細胞凋亡因子TRAIL四種受體的方法，其特征在于，其中步驟a，細分為如下步驟a1、將敏感柵上的氮化硅做硅烷化處理；a2、用吸附方法將蛋白A固定在氮化硅表面，室溫干燥，牛血清蛋白做封閉處理，磷酸緩沖溶液清洗待干燥，由此形成氮化硅—蛋白A的復合敏感膜；a3、將TRAIL受體的抗體用吸附方法固定在蛋白A上，待室溫干燥，磷酸緩沖溶液清洗置干備用；
6.一種多通道TRAIL受體檢測系統，其特征在于，包括若干個如權利要求3所述的免疫場效應型TRAIL生物傳感器，用于將待檢TRAIL受體抗原量轉換為膜電位的電壓值；多路開關，用于依次選通各傳感器通道，把參比電極上的控制電位VG輸入到模數轉換器；反饋前級電路，用于保持漏源電流Ids恒定，使得參比電極上的控制電位VG與待測物質活度ai的對數呈線性關系；數模轉換器，用于將參比電極上的控制電位VG由模擬量轉換為數字量；單片機，用于控制采樣，換算，顯示，存儲，通訊和按鍵操作；存儲器，用于存儲采樣結果；顯示器，用于顯示參比電極上的控制電位VG；所述的單片機，控制多路開關，依次選通各通道，模數轉換器，將參比電極上的控制電位，由模擬量轉換為數字量，間隔定期進行數據采樣，并且將采樣結果存入存儲器，采樣的結果由顯示器顯示。
7.根據權利要求6所述的多通道TRAIL受體檢測系統，其特征在于，還包括PC機，與單片機連接，用于處理采樣數據。
全文摘要
本發明公開一種TRAIL抗體生物敏感膜制備的制造方法，其步驟如下A.采用P型硅材料，用半導體制備工藝制成MOS型場效應晶體管，該場效應晶體管包括源極、漏極、非金屬的絕緣材料氮化硅柵極；B.氮化硅作為敏感柵，將其做硅烷化處理；C.用吸附方法將蛋白A固定在氮化硅表面，室溫干燥，牛血清蛋白做封閉處理，磷酸緩沖溶液清洗待干燥，由此形成氮化硅－蛋白A的復合敏感膜；D.將TRAIL受體的抗體用吸附方法固定在蛋白A上，待室溫干燥，磷酸緩沖溶液清洗置干備用；至此制備成氮化硅－蛋白A－TRAIL受體的抗體這樣有疊型結構的生物敏感膜。本發明還涉及應用上述TRAIL抗體生物敏感膜的多通道TRAIL受體檢測系統及檢測腫瘤細胞凋亡因子TRAIL四種受體方法。
文檔編號G01N27/30GK1782709SQ20041000993
公開日2006年6月7日 申請日期2004年12月2日 優先權日2004年12月2日
發明者張虹, 鞏祥鵬, 韓涇鴻, 黃俊琪 申請人:中國科學院電子學研究所, 中山大學