快速檢測尿中的hiv抗體的裝置及檢測方法

專利名稱：快速檢測尿中的hiv抗體的裝置及檢測方法
技術領域：
本發明涉及免疫化學和生物化學分析方法，提供了一種用于快速檢測尿液內源性抗體(特別是針對HIV病毒包膜蛋白的特異性抗體)的裝置和方法。其它能引起尿液內源性抗體升高的病原體，包括目前已知的性傳播疾病的病原體，也可以使用通過本發明檢測。
背景技術：
目前已經有許多種側向流檢測方法應用于檢測像血液或尿液等體液中的各種物質。這些檢測方法包括抗原抗體反應，與酶、熒光物質或可視標記物交聯的合成物，特殊設計的反應室。在大多數這類檢測方法中，有一個特異針對特定抗原的受體(如抗體)，以及一套檢測抗原-抗體復合物出現和/或達到一定量的手段。這種檢測設計多為一種定量檢測，但是在很多情況下只需要得到陽性/陰性的結果。這種定性檢測的例子包括血液分型，早孕檢測和其它一些尿液檢測。在定性檢測中，優選出現可視的標記物，比如出現凝集或顏色改變。
陽性/陰性的檢測必須非常敏感，因為在待測液體中目的配體的濃度往往很低。錯誤的陽性將會產生麻煩，特別是凝集實驗和其它快速檢測手段，如沾棒(dipstick)和顏色改變實驗。針對這些問題，發展了夾心法和使用金屬溶膠或其它有色顆粒的敏感檢測手段，然而這些手段并沒有解決快速檢測方法中遇到的所有問題。現在仍需要既敏感又特異性的檢測體液中低濃度靶物質的方法，如檢測尿液中針對病原體的內源性抗體。

發明內容
本發明提供了一種用于快速檢測尿液內源性抗體，特別是針對HIV病毒包膜蛋白的特異性抗體的裝置和方法。發明者發現，在升高pH值的情況下，可以獲得比現有方法更高的敏感性和選擇性。相應的，在本發明的一個實施例中提供了一種側向流方法來檢測尿液中靶抗體的檢測裝置，該裝置包括能特異性結合靶抗體的抗原和在接觸尿液時能使溶液pH值至少達到8的包含緩沖液的樣品區。實施例中的緩沖液可以含有碳酸鹽，也可以含有碳酸鹽和重碳酸鹽。優選的裝置中的緩沖液中的碳酸氫鉀和碳酸鉀的摩爾比為2∶1。
上述實施例的抗原可以是人免疫缺陷病毒(HIV)的蛋白。HIV可以是HIV-1，也可以是HIV-2。在該實施例中，不只可以使用一種抗原，還可以是HIV-1和/或HIV-2的多抗原。在該實施例中，蛋白抗原還可以是重組的。優選的HIV蛋白是包膜蛋白，蛋白也可以是HIV-1的gp120或gp41或HIV-2的gp36的非天然肽，這些肽具有序列表SEQ ID No.1-5所述的氨基酸序列。優選的則包括含有序列表SEQ ID No.1-5所述的多肽中的一個和/多個的組合的多個HIV蛋白。在該實施例中，抗原可以被生物素標記物，并且通過抗生物素蛋白-或親和素-生物素鏈接物連接到裝置的基質上。
在上述實施例中，樣品區可以含有鳥類血清，優選雞血清。還可以包括有交聯區，它含有和標記物交聯的標記試劑。優選的標記試劑為蛋白G，更優選的為蛋白A。優選的標記物為膠體金。在上述實施例中還可以包括含有捕獲試劑的對比區。優選的捕獲試劑包括抗人IgG的抗體，更優選的抗人IgG抗體為羊抗人IgG抗體。
本發明的另外一個實施例為使用側向流方法檢測尿液中抗體的裝置，該裝置含有(a)交聯區含有蛋白A/膠體金交聯物；(b)對照區含有捕獲試劑，其中捕獲試劑與人尿液中抗體、蛋白A/膠體金交聯物結合的能力大于蛋白A與人尿液中抗體、蛋白A/膠體金交聯物的結合能力。如前述實施例一樣，捕獲試劑是抗人IgG的抗體，優選為羊抗人IgG抗體。本實施例還可以增加由pH至少為8的緩沖液和與目標抗體特異性結合的抗原組成的樣品區。本實施例優選的緩沖液包括碳酸鹽和/或重碳酸鹽，優選它們的鉀鹽或銨鹽。本實施例的緩沖液中可以包括摩爾比為2∶1的重碳酸鉀和碳酸鉀。
上述實施例的抗原可以是人免疫缺陷病毒蛋白。HIV可以是HIV-1，也可以是HIV-2，這取決于選擇哪一個具體應用。也可以使用HIV-1和/或HIV-2的多抗原。在一些實施例中，抗原是包膜蛋白，另一些實施例中抗原是從SEQ ID NO1-5中挑選的。如前實施例所述，這些抗原可以是從自然中分離的或重組表達獲得。上述實施例也可以包含鳥類血清的樣品區，優選雞血清。
該發明的上述兩個實施例，以及這些實施例的所有可行方式，都以試劑盒的形式提供，并在包裝中附帶一項或多項補充條款，象這里描述的一樣。
本發明的再一個實施例是從病人尿中檢測抗體的方法，該方法包括將樣品加到側向流裝置的樣品區，其中樣品區的緩沖液pH值至少為8。該方法還可以使用和前兩個實施例相同的緩沖液和抗原。
本發明還有一個實施例也是從病人尿中檢測抗體的方法，該方法包括將樣品加到側向流裝置的樣品區，該裝置由結合區和對照區組成，結合區含有蛋白A/膠體金交聯物；對照區包括捕獲試劑，其中捕獲試劑與人尿液中抗體、蛋白A/膠體金交聯物結合的能力大于蛋白A與人尿液中抗體、蛋白A/膠體金交聯物的結合能力。在抗體、抗原和緩沖液方面，該實施例與前面的實施例基本一致。
具體實施例方式
本發明提供的裝置和方法適合于快速檢測尿液內源性抗體，特別是直接針對HIV病毒包膜蛋白的抗體。其它引起尿液內源性抗體升高的病原體，如性傳播疾病和感染性疾病的病源，也可以使用本發明進行檢測，例如衣原體、皰疹病毒、淋病、梅毒、幽門桿菌、甲肝、乙肝、丙肝、EB病毒、巨細胞病毒、單純皰疹病毒、瘧疾、流感、西尼羅河病毒、風疹、登革熱、萊姆病、查格斯病，結核病、弓漿蟲病、埃博拉病毒等。使用合適的緩沖液使尿樣pH保持在8或更高，因為在低pH值時無法正常檢測。尿樣pH保持在8或更高時，本發明的靈敏度和特異性顯著提高，所標記的可視信號比低pH時顯著增強。本發明提供了一個比目前檢測方法更準確的技術。
本發明提供的裝置和方法是經濟的，因為在免疫測定中盡量使用低成本的試劑，比如非特異性抗體結合蛋白如蛋白A、蛋白G或血凝素。在工作中發現一項令人驚奇的情況可以檢測到在本發明的免疫復合物中存在一分子這類抗體結合蛋白。
本發明的化驗裝置包括一系列不同的區帶，這些區帶所包含的試劑不同，操作時分別在不同的區帶進行反應。這些區帶可以是一個連續基質的不同部分，或分別附著在分離的墊上，通過墊的吸附使液體流動。
為了更加容易理解本發明中的術語，以下提供了一些術語的定義I定義“分析區”是指液體流經區域，包括特異結合被檢尿液中內源性目標抗體的固定抗原。抗原特異性結合目標抗體使目標抗體和與之相連的任何分子滯留在分析區。
“抗原”指進入哺乳動物或鳥類時刺激其產生抗體的物質。因此，抗體識別和特異性結合激發其產生的抗原。本發明的優選抗原包括人免疫缺陷病毒(HIV)蛋白，特別是病毒包膜蛋白HIV-1的gp120和gp41，HIV-2的gp36。本發明中的抗體是在與病人不同的物種中使用目標抗體刺激產生的，因此病人尿液中的內源性目標抗體也是本發明中抗體所識別的抗原。比如，人尿液中的目標抗體是由非人物種產生的抗人抗體特異識別的抗原。
“抗體”指由免疫球蛋白基因或片斷編碼的、特異性結合和識別抗原的多肽。目前已知的免疫球蛋白基因包括κ，λ，α，γ，δ，ε和μ恒定區基因和無數的可變區基因。輕鏈又分為κ或λ，重鏈分為γ，μ，α，δ或ε，它們決定免疫球蛋白的種類分別為IgG，IgM，IgA，IgD和IgE。本發明的抗體可以是多克隆或單克隆。
抗體以兩種形式存在完整的免疫球蛋白或經多種肽酶消化產生一定結構的片斷。例如，胃蛋白酶消化抗體后，在二硫鍵下方絞鏈區切斷抗體產生F(ab)’2(Fab的二聚體)，Fab由輕鏈通過二硫鍵與VH-CH1連接。在溫和的條件下可以打斷絞鏈區的二硫鍵降解F(ab)’2二聚體使之變為Fab’單體。Fab’單體主要由Fab和部分絞鏈區組成(見Fundamental Immunology，Paul ed.，3rded.，1993))。通過消化完整抗體區別不同的抗體片斷或抗原結合片斷，本領域的技術人員可以使用化學方法或者DNA重組技術合成來重新合成這些片斷。因此，抗體的定義，應包括對整個抗體修飾后產生的抗體片斷，或者使用DNA重組技術重新合成的片斷(如單鏈Fv)或由噬菌體展示文庫產生的抗體(見McCafferty et al.，Nature，348552-554(1990)和Zapata et al.，Protein Eng.8(10)1057-1062 )。本發明中的抗體可以是多克隆或單克隆的。制備這些抗體的技術是本領域公知常識(參見Kohler and Milsten，Nature，256495-497(1975)；Kozbor et al.，ImmunologyToday，472(1983)；Cole et al.，pp.77-96 Monoclonal Antibodies and CancerTherapy，Alan R.Liss，Inc(1985)；美國專利，4,946,778)。
“目標抗體”指被測尿液中的內源性抗體，通過本發明提供的裝置可以檢測到。目標抗體可能是如上所述的抗體片斷，但更多是含有功能可變區和恒定區的整個免疫球蛋白。目標抗體的功能可變區特異性的結合相應的抗原，而功能恒定區則與抗目標抗體的抗體(如二抗)特異結合，或與蛋白A或G或其它與目標抗體特異結合族發生特異結合。
“吸水的”指在液體通過吸附物質時，吸附物質支持不同溶質遷移的能力。因此吸水的吸附物質能夠根據溶質的物理/化學性質進行層析分離。
“捕獲試劑”指能與目標抗體特異結合的任何分子。本發明的捕獲試劑優選的以確定模式固定到介質上，通常與流經途徑垂直。優選的捕獲試劑是抗目標抗體的抗體、蛋白A和蛋白G。
“膠體金”指細小的金顆粒溶膠，以不確定的水懸液形式存在。
“蛋白A”指由金黃色葡萄球菌產生的高度穩定的表面受體，它能與大量物種的免疫球蛋白(特別是IgG)的Fc段結合(Boyle，M.D.P.and K.J.Reis.Bacterial Fc Receptors.Biotechnology 5697-703(1987))。一個蛋白A分子能同時結合至少兩個IgG分子(Sjquist，J.，Meloun，B.and Hjelm，H.Protein A is isolated from Staphylococcus aureus after digestion withlysostaphin.Eur J Biochem 29572-578(1972))。
“蛋白G”指鏈球菌的菌體表面相關蛋白，與IgG的親和力高，有三個高度同源的IgG結合域(參見Lian，et.al.1992.Journal of Mol.Biol.2281219-1234 and Derrick and Wigley.1994.Journal of Mol.Biol.243906-918)。
“標記物”指可以檢測到的原子或分子族，它與分析物通過直接或間接方式特異結合。本發明的標記物可以通過物理或化學方法檢測。優選的標記物應該為指示陽性結果時應肉眼可見。
“基質”指能夠支持流動相的不溶性物質。基質材料可以是自然或人工合成的，能吸水或不能吸水，纖維狀或顆粒狀。本發明的基質可以是由相同材料組成的連續條帶，或由沿條帶分布一致的不同材料的混合物組成，或不一致分布的材料組成，如組成區的材料與條帶上其它區有不同的物理、化學性質。同樣，一系列離散的墊也是由相同或不同基質材料組成的，每個墊上加有檢測試劑。然后將墊放在液體流動部位形成連續的流動途徑。考慮到進行檢測時本發明的材料保持不溶，有可能與試劑發生或不發生反應。
“下游”指液體加入后，從加樣處通過基質直接流經途徑。
“上游”指液體通過基質流向加樣處的流經途徑。
“流經途徑”指尿液通過基質時的途徑。流經途徑優選的是單一途徑，但也可以包括幾條途徑，其中的每條途徑相對于其它途徑而言都可以同時的、順序的、或獨立的支持液體流動。
II簡介正如以上所總結的，本發明的裝置是用來檢測病人尿樣中的內源性目標抗體。本發明裝置首先識別的目標抗體是與HIV蛋白，優選HIV-1的gp120或gp41和HIV-2的gp36結合的抗體。
本發明的裝置包含一系列的區帶，每個區帶由于使用不同的化學試劑而不同，反應和/或交互作用分別發生不同區內。每個裝置至少包括三個區樣品區，結合區和分析區。本發明的裝置還可以包括對照區，用來指示操作是否正確和提供有效的實驗結果。還可以選擇在裝置流經途徑的最后區帶部位保留廢液區，過量的樣品可以存留在那里。廢液區的存在使在必要時加入過量體積樣品成為可能。典型的廢液區含有吸收材料，可以與組成任一區帶或所有區帶的基質材料相同。
下文對本發明裝置的不同區帶提供了詳細的描述以及這些區帶是如何沿流經途徑排列得到有效的診斷結果。通過這些描述有助于理解該裝置的操作方法。
III裝置結構總的來說，本發明是尿樣沿著每個區帶組成的流經途徑順序流過的一種裝置。因此尿樣加到樣品區后，將依次遇到每個區帶內的試劑，因此每個區帶內的樣品會和試劑發生預先確定的反應。液體流經裝置是通過具有多種功能的基質材料控制的，如下文描述。基質材料也可以選擇性的置于殼中，這在下文進行討論。討論完基質材料和殼后，將按加入尿樣后流經途徑順序對裝置上的每個區帶進行描述。
A.基質本發明使用的適合基質是能支持液體流動的不溶性材料。基質材料可以是自然或人工合成的纖維或顆粒，具備多孔、吸水或不吸水的特點。它也可以由相同的材料、或沿一條帶連續分布的不同材料的混合物、或在不同條帶區域形成不同物理或化學性質的不連續分布的混合物組成連續條帶。同樣，基質也是由兩種或多種基質材料墊組成，這些墊在裝置中導流液體，使之沿一定方向流動。當裝置中需要很多區域(每個區域都含有不同的試劑)或準備使用統一方法時，由一系列墊組成的液體流經途徑十分有用。考慮到組成基質的材料在檢測時保持不溶狀態，就可能與一種或多種試劑發生或不發生反應。
適合的基質材料一般為親水性的；或能夠補償具有親水性，包括無機粉末，如硅酸鹽和氧化鋁；玻璃纖維濾紙；天然多聚物，優選以纖維素為基礎的如濾紙、層析紙等的類似物；合成或修飾過的天然聚合體，如硝酸纖維素、醋酸纖維素、聚氯乙烯、聚丙烯酰胺、交聯右旋糖苷、瓊脂糖等；這些材料可以單獨或混合使用。基質材料還可以包含功能基團或具有與發明中的抗原或試劑共價交聯的功能。
在檢測中基質材料引導尿液沿一定的途徑流動，因此檢測中使用的試劑主要以顆粒或溶液的形式直接吸附在基質材料上，如下所述。
1.緩沖液本發明的一個特點是緩沖液系統，它在操作過程中使尿液pH至少保持在8，優選在8-11之間，更優選的是8.2-11，再優選是8.2-10，再優選是8.5-9.5，最優選是9-9.5。能使尿液保持在適宜pH范圍的緩沖液的生產技術眾所周知，如2002年Sigma目錄中描述的“生物緩沖液”。優選的緩沖液包括碳酸鹽、重碳酸鹽、硼酸鹽，尤其是其鉀鹽和銨鹽。本發明的其它有用的緩沖液包括醋酸鹽，EPPS，Tricine，Gly-Gly，Bicine，HEPBS，TAPS，AMPD，TABS，MOPS，CHES，CAPSO，AMP，CAPS，CABS和其它一些。
本發明中使用的緩沖液優選在進行操作前應用于裝置的基質。可以以任何方式加入緩沖液，只要能夠在尿液與基質接觸時使之形成具有理想pH的溶液。例如，可以以干粉的形式將緩沖液加入到基質上，或者優選的以溶液的形式，然后在基質上凍干。
2.封閉試劑盡管在本發明中可以使用吸水材料做基質，最好還是使用天然不吸水的材料。
使用封閉試劑后吸水材料可能變的不再吸水。這些試劑可以是去污劑，糖或蛋白，它們能降低產生吸水特征的相互作用力。典型的蛋白封閉試劑包括天然狀態或甲基化狀態或琥珀酰狀態的牛血清白蛋白，動物全血如馬血清或胎牛血清或其它血蛋白。優選的封閉試劑是鳥類血清，比如鵝或火雞血清，最優選的是雞血清。其他的蛋白封閉試劑包括酪蛋白和脫脂奶粉。根據所封閉基質的特點從不解離、酸性、堿性和兩性等不同形式選擇含有去污劑的封閉劑。吐溫20在封閉膜時非常有用。典型的用作封閉劑的糖包括蔗糖和果糖。
封閉吸水性基質時，使用有效濃度的封閉液處理基質材料以除去基質表面的不想發生的反應。總之，該方法是使用封閉液進行封閉，如1-20mg/ml的蛋白溶液，室溫下在幾分鐘到幾小時內完成。通過空氣干燥、凍干或其它干燥方法將包被物質持久吸附到基質上。
使用本身具有吸水性，但后來轉變為不吸水的基質，在固定抗原和捕獲試劑時非常有效。例如，封閉前將捕獲試劑加到基質上，可以進行原位固定。可以在捕獲試劑固定到基質后再進行封閉。
B.殼本發明的基質可以放在功能性和保護性的殼中。在一個優選的實施例中，殼的典型形式為至少具有一個端口，以便容納尿樣并引導液流同樣品區接觸。殼也可以設計為具有窗口的形式，允許選擇不同端口從而可以選擇液體流經途徑，流經分析區和/或對照區。具有這種殼的實施例被稱為“盒式裝置”。
相應的，基質可以無支持物，或有耐久材料作為支持物，該耐久材料最好為防滲漏并能保持基質的物理完整性。具有此類結構特征的實施例被稱為“沾棒(dipstick)”。
本裝置的第三個實施例包括一個與盒式裝置相似的保護性殼，但是樣品區延伸并超越殼，形成一個燈芯結構，該結構可以浸入尿樣中。該方面的其它變化形式都是以基本結構為模板，從而可以很容易的被本領域的人員所識別。
殼可以使用本領域公知的任何合適材料構建。液體中的殼部件與流經途徑相接觸，但不會阻止液體沿途徑流動，所以其材料親水性不能太強。相反，如果與液體流經途徑接觸的殼材料親水性太強，則樣品可能被殼吸收一部分或透過殼壁滲漏。
C.裝置區本發明的裝置至少有三個區，每個區內包含能與加到裝置上的尿樣中的內源性抗體作用的反應物。樣品區容納尿樣，尿樣加樣于樣品區可以通過流體裝置，或先收集尿樣再通過滴加、加樣器或傾倒方式加樣到樣品區。尿樣優選不稀釋，并在收集后立即使用。如果必要，使用本發明裝置檢測的尿樣自收集后可以在室溫存放有限的時間(如多達一個星期)，如果冷凍，可以存放更長的時間。樣品區優選有足夠的緩沖液，使尿樣在裝置檢測期間pH值升高和/或保持在8左右。如上所述，緩沖液應該可以被尿樣增溶，并且有足夠的緩沖能力，使pH值在裝置檢測期間保持在8左右。
加樣于樣品區的尿樣首先遷移進入交聯區，在該區段尿樣中的內源性抗體與下面描述的連接于標記物上的標記試劑作用，形成標記抗體交聯物。
標記抗體交聯物遷移進入分析區，在分析區，抗原與靶抗體特異性結合并固定于基質上。如果標記抗體交聯物中的抗體為靶抗體，固定的抗原與靶抗體特異性結合，并固定標記抗體交聯物于基質上。通過這種方式，標記物在分析區聚集，從而可以被檢測到，并說明尿樣中靶抗體的存在。如果標記抗體交聯物沒有包含靶抗體，則它們沿流道繼續遷移，不在分析區聚集。
本發明的裝置可以選擇性的包括對照區，對照區內是固定于基質上的捕獲試劑。捕獲試劑在對照區內形成對照線，并且非特異性的與標記抗體交聯物中的抗體結合。通過這種方式，使標記抗體交聯物在對照區聚集，說明裝置工作正常。當包括對照區時，對照區位于交聯區和分析區的下游。
在上述區段的下游，裝置還可選擇性包括廢棄區。廢棄區可以是基質的簡單延伸，但最好是由吸水性物質構成，從而可以使得加樣于裝置上的樣品量達到最大。
為了更好的描述本發明，本部分上面提到的每個區段將在下面詳細描述。
樣品區樣品區用于操作者加入尿樣。樣品區一般由靶抗體低滯留性的材料構成。相應的，用于樣品區封閉的封閉試劑需能夠阻止靶抗體在操作期間與基質材料相互作用。用于樣品區封閉的試劑優選鳥類血清，更優選雞血清。在優選的實施例中，樣品區由玻璃纖維墊制成，先將其用溶液(含聚乙烯吡咯烷酮、牛血清白蛋白、鳥類血清、硼酸鹽和/或碳酸鹽緩沖液(～0.5M)、Triton X-100或Tween-20去污劑)浸透。然后將墊壓干去除多余的緩沖液，在30℃干燥過夜。該方法的先進性在于增加了樣品區的吸水性和燈芯抽吸作用。在實施例中，樣品區也可以起過濾器的作用，除去那些不需要的顆粒。
交聯區交聯區位于樣品區的下游，并包含有與標記物直接或間接連接的標記試劑構成的標記部分。這里提到的連接標記物和標記試劑的方法是本領域的公知技術。
標記部分位于基質上的交聯區，使其在液體樣品(如尿樣)向上流動時與液體樣品接觸。要完成該過程，交聯區的基質需由聚酯纖維紡織物組成，并將其浸泡在含聚乙烯吡咯烷酮、牛血清白蛋白、鳥類血清、硼酸鹽和/或碳酸鹽緩沖液(～0.5M)、Triton X-100或Tween-20去污劑的緩沖液中封閉。最后在50℃通風環境中干燥。標記部分被剪成條狀，通過黏性末端或氣溶膠末端固定于墊上。在處理為條狀之前，標記部分最好先進行穩定化處理，如標記部分可以置于單一的或復合的糖溶液中(如20％(w/v)的蔗糖和5％(w/v)的海藻糖，或10％(w/v)的糊精)。
當尿樣流經交聯區時，標記部分溶解并同液流一起流經裝置。合適的標記試劑和標記物將在下面進一步討論。
a)標記試劑本發明的標記試劑優選能特異性結合尿樣中的內源性抗體。合適的能與尿樣中的所有內源性抗體結合的標記試劑包括細菌蛋白(如蛋白G和蛋白A)和能夠識別特定抗體類型的抗體，例如羊抗人IgG可以用來結合來自病人尿樣中的任何IgG抗體。
不管使用何種標記試劑，即使尿樣中沒有靶抗體，標記抗體交聯物總是在交聯區生成。如果沒有靶抗體，那么形成的標記抗體交聯物將包括尿樣中的普通內源性抗體。尿樣中含有足夠的內源性抗體來形成可被檢測到的標記抗體交聯物。
b)標記物本發明中適用的標記物可以是可見的也可以是不可見的，但是如果它們在檢測區域聚集，則必須是能夠被檢測到的。本發明中適用的標記物包括但不限于顆粒族和酶。可見的標記物可以是染料或足量情況下可見的著色多聚物，優選的標記物為顆粒物質，如著色乳膠珠、脂質體、金屬、有機物、無機物、染料溶液、熒光顆粒、著色的或有色的細胞或組織、血紅細胞等。金屬溶膠顆粒、著色的或熒光標記的微粒可以用肉眼看到或使用合適的儀器讀取(分光光度計、熒光讀數儀等)。相應的，也可以使用放射性同位素。
本發明的優選標記物為直徑大于20nm的膠體金顆粒，更優選的為20-100nm，最優選為20-40nm。本發明中使用的膠體金可以使用現在眾所周知的技術制造，如G.Frens，Natrure，241，20-22(1973)。除了膠體金，顆粒也可以是由鉑、金、銀、硒、銅或其它呈現特征性顏色的合金或金屬復合物制成。本發明中的合金、金屬復合物和金屬或金屬復合物包裹的多聚核技術在美國專利4,313,734中有相關描述。現有技術中還有其他將分析物吸附于金顆粒上的方法。這些方法包括通過共價鍵和疏水鍵進行吸附，但并不局限于此。
分析區分析區位于流動途徑中交聯區的下游。分析區含有固定于基質上的特異性針對靶抗體的抗原，通過與靶抗體結合將標記抗體交聯物固定于基質上。固定抗原可以是能特異結合靶抗體的任何抗原，但優選HIV蛋白，更優選的是HIV包膜蛋白，再優選的是來自HIV-1gp120或gp41，或者來自HIV-2 gp36的一個或多個肽段，最優選的是從SEQ ID NO1-5中選出的至少一個抗原。
本發明適合使用的抗原可以是現有方法的任意來源，包括天然的、化學合成的或重組的產物。例如，優選的SEQ ID1-5肽段可以使用固相肽合成技術來化學合成，或者可以連接編碼合適肽段的核苷酸并將其導入表達載體，然后將重組載體導入合適的宿主，重組生產。將肽段分離純化后，就可以使用已知的技術用生物素標記。
合適的抗原可以使用目前已知的技術固定于基質上，但是不能破壞抗原與靶抗體特異性結合的位點。優選的固定方法為使用生物素/鏈球菌抗生物素蛋白連接子，更優選的是抗原與生物素偶聯，然后與事先偶聯于基質上的鏈球菌抗生物素蛋白結合。在對吸水性基質進行封閉之前，先進行鏈球菌抗生物素蛋白與基質的偶聯，該技術現在已經公知。較好的偶聯效果可以通過調節溶液中鏈球菌抗生物素蛋白生物素結合位點和生物素比例至少為2∶1獲得，其它的比例如0.5∶1、1∶1、3∶1、4∶1和5∶1，以及其它的一些比例，都在本發明的范圍內。對于吸水性基質，最終的復合物可以簡單的加于基質材料上，干燥后使用合適的封閉液封閉。本發明中可用來仿效的抗原性肽段的氨基酸順序在下面的SEQ ID1-5中有描述。SEQ ID1、3、4和5中的鏈間連接半胱氨酸殘基表明，這些殘基的側鏈容易發生氧化反應形成半胱氨酸。
基質上固定的抗原可以濃集特異性結合它們的標記抗體交聯物。通過濃集標記抗體交聯物，加強了標記物生成的信號、提高了敏感性，同時也最大可能的降低了產生錯誤結果的機率。
典型的標記物信號可以在尿樣加于樣品區后15-60分鐘內觀察到，優選的是在15-45分鐘，最優選的是在15-30分鐘。如上所述，有色標記物產生的信號，可以不經進一步處理直接在裝置上檢測到。熒光標記物則需要熒光光度計進行檢測。金屬溶膠標記物產生的信號可以通過本領域公知的方法使用銀鹽溶液加強。同樣的，如果使用酶作為標記物，則需要與相應底物作用來產生可以被檢測到的產物。這些加強手段都是從常規的使用有色粒子和溶膠標記物一步式檢測方法發展來的，在這些加強方法中，基質需同顯像液(如銀鹽溶液或底物液)作用，從而產生可以檢測的信號。
對照區本發明的裝置中可以選擇性的包括對照區。當其存在時，對照區位于流經途徑交聯區的下游，優選分析區的下游。
對照區含有能與尿樣中內源性抗體特異性結合的捕獲試劑，捕獲試劑優選的固定于對照區內形成對照線，它們能結合并濃集尿樣中的所有標記抗體交聯物。捕獲試劑可以是與某一類型抗體有親和力的蛋白，如蛋白G或蛋白A，但是在本發明中，只有當這類抗體結合分子沒有被用作標記試劑時，它們才能被用作捕獲試劑。優選的捕獲試劑在本發明操作期間，應該擁有比蛋白A更大的與內源性尿抗體的親和力，如上所述它們包括來自不同尿樣來源物種的抗IgG抗體。
本發明中適用的捕獲試劑可以通過已知的技術固定于基質上，其中包括上述用于固定抗原的技術。優選的固定方法為使用生物素/鏈球菌抗生物素蛋白連接子，更優選的是如上面所說的捕獲試劑與生物素偶聯，然后與事先偶聯于基質上的鏈球菌抗生物素蛋白結合。對于吸水性基質，基質材料在固定捕獲試劑后需要封閉，如使用含有0.01M磷酸鉀、0.25％BSA和0.025％Tween-20的溶液進行封閉，然后膜在50℃過夜干燥。
在正確使用的條件下，捕獲試劑將連續結合所有的標記抗體交聯物，直至不再有未結合的標記抗體交聯物或捕獲試劑已經飽和。因為一般來說來自健康哺乳動物的尿樣中都含有內源性IgG，并且與標記物結合的標記試劑在分子數量上超過固定的抗原，所以總是有標記抗體交聯物與捕獲試劑結合，并在對照區顯示信號。所以，如果不能在對照區檢測到信號，則說明裝置操作存在錯誤或不當。
IV.試劑盒本發明提供了包括一個或多個上述裝置的試劑盒。每個試劑盒可以選擇性的包括說明包裝裝置如何使用的說明，裝有用于檢測裝置是否有效的陽性和陰性對照溶液的瓶子，用于決定本發明的檢測何時結束的定時器，尿液收集容器(如一個小試管)，一個或多個移液管和/或一次性生物危險品容器。
說明書中引用的出版物和專利申請都在這里用作參考文獻，每件個人出版物和專利申請分別被特別引用作參考文獻。
前述發明通過解釋和舉例進行了詳細說明，以使其更加清楚和易于理解，本領域的技術人員沒有背離本發明的權利要求的精神和范圍的某些改變和修改仍然在本發明的教導范圍內。
正如以上進行的充分描述，本發明在應用中具有很大的變化范圍。相應的，出于更好的說明本發明的目的，提供了下面的例子，但是并不是將本發明局限于此。那些應用于本發明的技術有許多非關鍵性的參數，要獲得相似的結果，可以對這些參數進行修改或變化。
實施例1評價免疫分析裝置對冷凍和新鮮樣品的選擇性和靈敏性本實施例表明根據本發明制造的免疫分析裝置對不同來源的AIDS樣品有非常高的靈敏性和特異性。
本發明的免疫分析裝置包含以下組份使用含有聚乙烯吡咯烷酮、牛血清白蛋白、鳥類血清、碳酸鹽緩沖液(0.5M)和Triton-X 100的溶液封閉和裝載的玻璃纖維樣品區墊。擠壓樣品墊除去過量液體，30℃過夜干燥。
分析區的墊包括采用鏈球菌抗生物素蛋白/生物素交聯劑交聯到聚酯無紡膜上的HIV抗原。簡言之，準備100mg/ml的抗生物素蛋白溶液，濃度為10mg/ml的HIV-1多肽、HIV-2多肽溶液。抗生物素蛋白溶液和HIV溶液按照2.1個抗生物素蛋白結合位點對應于1個生物素分子的比例混勻。室溫(25℃)反應5分鐘，用去離子水/5％異丙醇溶液將其稀釋到終體積。使用線性加液器將稀釋好的溶液加到膜上，50℃干燥4個小時后，50℃在封閉液(含0.25％BSA和0.025％吐溫20的0.01M磷酸鉀溶液)中封閉過夜。
交聯區的墊是使用氣霧劑吸頭將標記物加到聚酯無紡膜上制成。加入前將墊的標記物結合部分在20％(w/v)的蔗糖溶液和5％(w/v)的糊精溶液穩定。然后將墊浸入含有聚乙烯吡咯烷酮、牛血清白蛋白、鳥類血清和碳酸鹽的緩沖液，通風條件下50℃干燥50分鐘。
對照區的對照線是通過稀釋溶液中羊抗體的F(ab)片段制備的，該片段特異針對人抗體Fc段。使用氣霧吸頭將稀釋溶液噴灑在聚酯無紡膜上，50℃干燥4小時。50℃在封閉液(含0.25％BSA和0.025％吐溫20的0.01M磷酸鉀溶液)中封閉過夜。
經過上述處理的膜在液體流經途徑中順序排列，樣品區位于交聯區上游，交聯區位于分析區上游，分析區位于對照區上游。
在樣品區加入4滴(50-100μl)尿液，室溫放置20分鐘后，從裝置讀取結果。如果在對照區出現陽性信號(如出現有顏色的條帶)，說明檢測操作正確。如果對照區位置未出現陽性信號，說明該裝置出現錯誤，應棄去，并使用新的裝置進行免疫檢測。
假設裝置操作正確，分析區對應抗原的位置出現陽性信號，說明尿液中存在直接針對抗原的抗體。在目前的分析中，這一結果表明尿液捐獻者感染了HIV。如果在分析區未出現陽性信號，說明尿液中沒有直接針對抗原的抗體，即尿液捐獻者沒有感染HIV。
表1所示為10個不同來源的尿液使用上述方法分析的結果。


實施例2快速免疫色譜(RIC)一步法檢測結果本實施例說明盒式檢測方法適合檢測尿液中的HIV抗體。盡管尿液中的抗體水平低于血液或血清，本方法對經EIA和Western Blot確證的尿液進行了成功檢測。快速免疫色譜法(RIC)用來檢測血液/血清中的HIV抗體，對降低HIV傳播率起到重要的作用。以下描述的研究使用HIV-1 RIC分析法檢測尿液中HIV-1抗體的潛在能力。
方法對快速檢測的評估通過檢測11份冷凍保存的存檔尿樣進行，通過使用Calypte HIV-1尿液EIA方法檢測，使用Cambridge BiotechHIV-1尿液Westem Blot方法確認，11份尿樣中有6份為抗HIV-1抗體陽性，4份為抗HIV-1抗體陰性。尿樣在加樣于RIC檢測裝置之前先在室溫下簡單混勻。150ml尿樣加樣于裝置用于分析，并隨后確定在裝置的樣品線和對照線出現的信號的強度。計算樣品與對照的比率作為相對強度的指標。如果比率大于1.0，則判讀為HIV陽性。快速檢測裝置上出現的對照線也證實了其性能，同時表明樣品是有效的。分別在10、20和30分鐘時使用上述的盒式分析裝置讀取結果。
結果RIC檢測結果顯示已知的6份HIV-1陽性樣品都給出了HIV-1抗體反應性結果，4份陰性樣品全部無反應性結果，與EIA方法和WesternBlot結果比較得到100％的敏感性和特異性。總的來說，本檢測的準確率為100％。
表2尿液HIV-1快速檢測結果—冷凍樣品

結論在一步法RIC檢測方式對冷凍樣品的盲試檢測中，所有樣品的檢測結果與預計結果一致，說明該檢測方法適用于檢測尿液中抗HIV-1抗體。
這種檢測方式的優勢在于易于使用，需要極少的特殊培訓、設備和采樣裝置，即是非冷凍保存也有較好的穩定性，這使得其易于在AIDS流行的邊遠地區使用。尿液樣品中沒有感染性HIV使得暴露于HIV之下的危險顯著降低。另外，尿液樣品也易于大量提供來進行HIV感染檢測和其它疾病和狀態的的檢測。
序列表<110>北京克利普特生物醫藥科技有限公司<120>快速檢測尿中的HIV抗體的裝置及檢測方法<130>MP040001<160>5<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>39<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述生物素標記單賴氨酸連接子HIV-1(gp41肽段)<220>
<221>MOD_RES<222>(1)<223>Xaa＝生物素標記Lys<220>
<221>DISULFID<222>(20)...(26)<400>1Xaa Ile Leu Ala Val Glu Arg Tyr Leu Lys Asp Gln Gln Leu Leu Gly1 5 10 15Ile Trp Gly Cys Ser Gly Lys Leu Ile Cys Thr Thr Ala Val Pro Trp20 25 30Asn Ala Ser Gly Lys Leu Ile35<210>2<211>22<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述生物素標記HIV-1 gp120肽段<220>
<221>MOD_RES<222>(1)<223>Xaa＝生物素標記Lys
<400>2Xaa Thr Glu Pro Leu Gly Val Ala Pro Thr Lys Ala Lys Arg Arg Val1 5 10 15Val Gln Arg Glu Lys Arg20<210>3<211>35<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述生物素標記單賴氨酸連接子HIV-2(gp36肽段)<220>
<221>MOD_RES<222>(1)<223>Xaa＝生物素標記Lys<220>
<221>MOD_RES<222>(35)<223>Xaa＝serinamide<220>
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<223>人工序列描述生物素標記雙賴氨酸連接子HIV-1(gp41肽段)<220>
<221>MOD_RES
<222>(1)<223>Xaa＝生物素標記Lys<220>
<221>DISULFID<222>(21)...(27)<400>4Xaa Lys Ile Leu Ala Val Glu Arg Tyr Leu Lys Asp Gln Gln Leu Leu1 5 10 15Gly Ile Trp Gly Cys Ser Gly Lys Leu Ile Cys Thr Thr Ala Val Pro20 25 30Trp Asn Ala Ser Gly Lys Leu Ile35 40<210>5<211>37<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述生物素標記雙賴氨酸連接子HIV-2(gp36肽段)<220>
<221>MOD_RES<222>(1)<223>Xaa＝生物素標記Lys<220>
<221>MOD_RES<222>(37)<223>Xaa＝serinamide<220>
<221>DISULFID<222>(21)...(27)<400>5Xaa Lys Val Thr Ala Ile Glu Lys Tyr Leu Gln Asp Gln Ala Arg Leu1 5 10 15Asn Ser Trp Gly Cys Ala Phe Arg Gln Val Cys His Thr Thr Val Pro20 25 30Trp Val Asn Asp Xaa3權利要求
1.一種用于檢測尿液中的靶抗體的側向流裝置，該裝置含有能特異性結合靶抗體的抗原和預置有與尿液接觸時使溶液pH值至少為8的緩沖液的樣品區。
2.如權利要求1所述的側向流裝置，其中所述的緩沖液含有碳酸鹽。
3.如權利要求2所述的側向流裝置，其中所述的緩沖液還含有重碳酸鹽。
4.如權利要求3所述的側向流裝置，其中所述的緩沖液中含有的碳酸氫鉀與碳酸鉀的摩爾比為2∶1。
5.如權利要求1所述的側向流裝置，其中所述的抗原為HIV蛋白。
6.如權利要求5所述的側向流裝置，其中所述的HIV為HIV-1。
7.如權利要求5所述的側向流裝置，其中所述的HIV為HIV-2。
8.如權利要求5所述的側向流裝置，其中所述的蛋白為重組蛋白。
9.如權利要求5所述的側向流裝置，其中所述的HIV蛋白為包膜蛋白。
10.如權利要求9所述的側向流裝置，其中所述的蛋白為從SEQ IDNO1-5的蛋白中選擇的。
11.如權利要求1所述的側向流裝置，其中所述的樣品區還含有鳥類血清。
12.如權利要求11所述的側向流裝置，其中所述的鳥類血清為雞血清。
13.如權利要求1所述的側向流裝置，它還含有與標記物交聯的標記試劑構成的交聯區。
14.如權利要求13所述的側向流裝置，其中所述的標記試劑為蛋白A。
15.如權利要求13所述的側向流裝置，其中所述的標記物為膠體金。
16.如權利要求1所述的側向流裝置，它還具有含有捕獲試劑的對照區。
17.如權利要求16所述的側向流裝置，其中所述的捕獲試劑為抗人IgG抗體。
18.如權利要求17所述的側向流裝置，其中所述的抗人IgG抗體為羊抗人IgG 2抗體。
19.一種檢測尿液中抗體的側向流裝置，該裝置含有a.含有蛋白A/膠體金的交聯區；b.含有捕獲試劑的對照線，其中所述的捕獲試劑與蛋白A/膠體金交聯物結合的尿源性抗體具有親和力，并且該親和力大于蛋白A/膠體金交聯物中蛋白A與尿源性抗體的親和力。
20.如權利要求19所述的側向流裝置，其中所述的捕獲試劑為抗人IgG抗體。
21.如權利要求20所述的側向流裝置，其中所述的抗人IgG抗體為羊抗人IgG 2抗體。
22.如權利要求19所述的側向流裝置，它還包括一個含有pH值至少為8的緩沖液的樣品區和能特異性結合靶抗體的抗原。
23.如權利要求22所述的側向流裝置，其中所述的緩沖液含有碳酸鹽。
24.如權利要求23所述的側向流裝置，其中所述的緩沖液還含有重碳酸鹽。
25.如權利要求24所述的側向流裝置，其中所述的緩沖液含有的碳酸氫鉀與碳酸鉀的摩爾比為2∶1。
26.如權利要求22所述的側向流裝置，其中所述的抗原為HIV蛋白。
27.如權利要求26所述的側向流裝置，其中所述的HIV為HIV-1。
28.如權利要求26所述的側向流裝置，其中所述的HIV為HIV-2。
29.如權利要求26所述的側向流裝置，其中所述的蛋白為重組蛋白。
30.如權利要求26所述的側向流裝置，其中所述的HIV蛋白為包膜蛋白。
31.如權利要求30所述的側向流裝置，其中所述的蛋白是從SEQ IDNO1-5的蛋白中選擇的。
32.如權利要求22所述的側向流裝置，其中所述的樣品區還含有鳥類血清。
33.如權利要求32所述的側向流裝置，其中所述的鳥類血清為雞血清。
34.一種含有權利要求1或權利要求19所述的側向流裝置的試劑盒。
35.一種檢測病人尿樣中抗體的方法，該方法含有用側向流裝置的樣品區與尿樣接觸的步驟，其中所述的樣品區含有pH值至少為8的緩沖液。
36.如權利要求35所述的方法，其中所述的緩沖液含有碳酸鹽。
37.如權利要求36所述的方法，其中所述的緩沖液還含有重碳酸鹽。
38.如權利要求37所述的方法，其中所述的緩沖液中含有的碳酸氫鉀與碳酸鉀的摩爾比為2∶1。
39.一種檢測病人尿樣中抗體的方法，該方法含有用側向流裝置的樣品區與尿樣接觸的步驟，該裝置中含有蛋白A/膠體金交聯物的交聯區和含有捕獲試劑的對照區，其中所述的捕獲試劑與蛋白A/膠體金交聯物結合的尿源性抗體具有親和力，并且該親和力大于蛋白A/膠體金交聯物中蛋白A與尿源性抗體的親和力。
40.如權利要求39所述的方法，其中所述的捕獲試劑為抗人IgG抗體。
41.如權利要求40所述的方法，其中所述的抗人IgG抗體為羊抗人IgG抗體。
42.如權利要求39所述的方法，其中所述的樣品區含有pH至少為8的緩沖液。
43.如權利要求42所述的方法，其中所述的緩沖液含有碳酸鹽。
44.如權利要求43所述的方法，其中所述的緩沖液還含有重碳酸鹽。
45.如權利要求44所述的方法，其中所述的緩沖液中含有的碳酸氫鉀與碳酸鉀的摩爾比為2∶1。
46.如權利要求39或權利要求35所述的方法，其中所述的病人為可疑HIV感染者，并且所述的側向流裝置含有HIV抗原。
47.如權利要求46所述的方法，其中所述的HIV為HIV-1。
48.如權利要求46所述的方法，其中所述的HIV為HIV-2。
49.如權利要求46所述的方法，其中所述的蛋白為重組蛋白。
50.如權利要求46所述的方法，其中所述的HIV蛋白為包膜蛋白。
51.如權利要求50所述的方法，其中所述的蛋白為從SEQ ID NO1-5的蛋白中選擇的。
全文摘要
本發明提供了快速檢測尿液中的內源性抗體，特別是針對HIV包膜蛋白的抗體的裝置和方法。其它的能引起尿液中內源性抗體升高、因而也可以使用本發明進行檢測的病原體包括已知的性傳播疾病的病原體。
文檔編號G01N33/53GK1558237SQ20041000424
公開日2004年12月29日 申請日期2004年2月12日 優先權日2004年2月12日
發明者羅那多·明克, 托比·告特弗瑞德, 約翰·安尼斯, 保羅·斯告特, 告特弗瑞德, 安尼斯, 斯告特, 羅那多 明克 申請人:北京克利普特生物醫藥科技有限公司