用于生物芯片的芯片讀出器及其相關方法

專利名稱：用于生物芯片的芯片讀出器及其相關方法
一般情況一般地，本發明涉及芯片的閱讀和解釋，更具體的是涉及由信號產生分子，例如熒光團，所標記的，并且形成于構建這些芯片的分子與來源于生物或化學樣本的分子或細胞之間的雜交的檢測。
根據第一方面，本發明涉及閱讀和分析芯片(或芯片讀出器)的裝置，其包括·用于接收打算鑒別至少一種樣本的芯片的工作臺，·在與其它分子反應之后激發芯片的分子或細胞的裝置，·閱讀和分析受到激發的分子的裝置。
更具體地，本發明還提供了一種控制芯片溫度的裝置，這樣就使其能夠發展出涉及芯片溫度變化的應用。
在具體應用中，芯片是DNA或寡核苷酸芯片，而溫度的控制使其能精確限定在所述芯片上寡核苷酸探針的雜交溫度。
本發明還涉及使用這樣的讀出器的方法，特別是用于檢測基因突變。
定義在介紹本發明的目的和特征之前，先定義一些將在本文中用到的術語。
術語“陣列，微陣列，芯片”，在本發明中是通用的，其指的是排列在固體支持物上特異位點中的細胞陣列或生物或化學分子的陣列(形成，例如，矩陣)。
分子或細胞通常結合至由聚合物所涂覆的固體支持物上的各個位點，并且排列從而使這些位點的每個都是與相應于其它位點的分子/細胞展示分子/細胞特異性相關的類型。
當陣列包含生物分子，例如核酸或肽時，其定義為生物芯片。
更精確地，當陣列包含脫氧核糖核苷酸時，其定義為DNA芯片或寡核苷酸芯片。
固體支持物選自由以下物質制成的固體支持物玻璃、塑料、Nylon、Kevlar、硅樹脂、硅，或其它多糖或雜多糖，例如纖維素。
優選的是玻璃。這種支持物可以是任何形式(扁平載波片、微珠，等等)，但是，根據優選實施例，支持物是平板，并且其包括扁平玻璃載波片。
當芯片在合適條件下與樣本接觸時，樣本的特定組分有選擇地與(并且特異地結合至)芯片的一個或更多分子/細胞反應。
此外，這些組分包含特定的標記(通稱為熒光染料或分子——一般稱為“熒光團”)而使其能夠在樣本與芯片接觸之后檢測組分的存在。這種檢測要求，在熒光團的情況下，用控制了波長的光激發芯片。
術語“分子”在這里包括化學分子和生物分子。
對于生物應用，“生物分子”優選的是核酸，更優選的是單鏈寡核苷酸。
對于化學應用，可以是針對生物分子的化學配體。
術語“核酸，核酸探針，核酸序列，多核苷酸，寡核苷酸，多核苷酸序列，核苷酸序列，寡核苷酸序列”，在本說明書中是通用的，指的是修飾或未修飾的核苷酸精義鏈，使其能限定核酸片段或區域，包含或不包含變性核苷酸，并且可以對應于雙鏈DNA，單鏈DNA，PNA(“肽核酸”)或LNA(對應于“鎖定的核酸”)以及所述DNA的轉錄產物，例如RNA。
術語“探針，寡核苷酸探針或寡核苷酸”在這里指的是功能性或非功能性寡核苷酸，其將被沉積(或“點樣”)并且通過共價鍵直接或間接經過位點水平上的間隔化合物結合到固體支持物。
這樣點樣的寡核苷酸能通過一個或更多化學鍵類型的方式結合到樣本中存在的互補序列的靶核酸(即，互補的寡核苷酸或多核苷酸)，通常是通過互補堿基配對形成氫鍵。
優選地，所述探針是單鏈DNA和RNA，優選為DNA，其大小為10至7000堿基(b)之間，優選為10至1000b之間，10至500b之間，10至250b之間，10至100b之間，10至50b之間或10至35b之間。
所點樣的寡核苷酸探針可以是化學合成的，從生物樣本純化的，或者，更常見的，通過重組DNA技術從天然和/或純化的多核苷酸中產生的。
例如，探針可以通過聚合酶鏈式反應(PCR)或RT-PCR(伴隨聚合酶鏈式反應的反轉錄)而產生。
術語“位點”對應于芯片上分子被結合的點。
相同分子的幾個復制本優選位于一個位點。
位點通過它們相對于芯片上的參考點的X-和Y-坐標來限定。
一個位點可以，例如，對應于具有一直徑的圓環，或對應于一個孔，或平行六面型凝膠墊(被稱為凝膠墊)，其中該圓環直徑取決于平板限定的區域內的所點樣溶液液滴的體積。
術語“樣本”對應于生物的溶液，生化或化學分子或對應于細胞組，其被預想為具有一定的特性。
在本發明的優選應用中，樣本是包含至少一種從生物來源獲得的寡核苷酸的溶液。
樣本可以來源于從各種組織或細胞的活的或死的來源。
生物樣本的例子包括體液，例如血液(特別是白血球)，尿液，唾液，精液，或者陰道分泌物，皮膚，以及細胞例如發根囊泡細胞，從正常或病理內部組織來的細胞，特別是來自腫瘤的，來自絨毛膜組織的細胞，羊膜細胞，胎盤細胞，胎兒細胞以及臍帶細胞。
術語“標記”或“信號產生標記”指的是能夠直接或間接與樣本中的生物，生化或化學分子相關聯的標記，為了隨后檢測的目的，它采用例如那些根據本發明的讀出器的閱讀方式。
信號產生標記優選地選自酶，染料，半抗原，例如生物素、抗生物素蛋白、鏈霉抗生物素蛋白或異羥洋地黃毒甙元(digoxygenin)的配體，或發光劑。
優選地，根據本發明的信號產生標記是一種熒光劑，根據激發能的來源其能分為放射發光，化學發光，生物發光以及光照發光(包括熒光和磷光)。
優選地，根據本發明的信號產生標記是一種熒光劑。
術語“熒光”一般是指一種例如熒光素的基質的特性，基質在受到光源以稱為激發波長的給定波長激發時會產生光，并且所發出的光具有更高的波長，被稱為發射波長，其能采用光子傳感器檢測，提供信號，當將信號結合起來時能夠構建芯片的雜交信號的圖像。
在本發明所采用的熒光團中包括但不盡于·異硫氰酸酯熒光素(FITC)[最大吸收波長494nm/最大發射波長517nm]；·得克薩斯紅(TR)[最大吸收波長593nm/最大發射波長613nm]；·花青素3(Cy3)[最大吸收波長554nm/最大發射波長568nm]；·花青素5(Cy5)[最大吸收波長652nm/最大發射波長670nm]；·花青素5.5(Cy5.5)[最大吸收波長675nm/最大發射波長694nm]；·花青素7(Cy7)[最大吸收波長743nm/最大發射波長767nm]；·Bopidy 630/650[最大吸收波長632nm/最大發射波長658nm]；·Alexa 488(495/519)；·Alexa 350(347/422)；·梅紅(rhodamine red)染料(570/590)。
術語“反應”指的是發生在與芯片上位點相關聯的分子和樣本的分子之間的化學或生物反應(例如，雜交)。
術語“雜交”指的是涉及沉積的(或點樣的)寡核苷酸和來源于生物樣本的靶序列之間通過互補堿基對結合的反應。
從雜交形成的雜交體或二倍體被稱為雜交復合物或雜交二倍體。
雜交復合物可以是互補復合物也可以是錯配復合物。
就是說，互補復合物是一種在點樣的寡核苷酸和樣本的靶序列之間沒有錯配的雜交復合物。
具有錯配的復合物是在點樣的寡核苷酸和樣本的靶序列之間至少存在一個錯配的雜交復合物。
術語“特異性雜交”指的是在嚴格條件下，并且當序列存在于復雜DNA或RNA環境時僅在特異核苷酸序列上結合到形成的二倍體或雜交的核酸分子。
一種“互補寡核苷酸”是一種探針，其序列與特異靶序列完全互補(在本文中，術語“匹配”將被用來指代這種類型的完美配對)。
展示“錯配”的探針指的是一種或多種其序列與特異靶序列不完全互補的探針。
雖然錯配可以出現在展示錯配探針的任何地方，但是末端錯配是更加不理想的，因為它們對靶序列上的雜交具有更低的影響。
就是說，探針通常具有的錯配位于探針中心或中心的邊緣，從而錯配具有在雜交條件下使與靶序列形成的二倍體不穩定的更大的變化。
術語“二倍體”或“雜交”對應于雙鏈DNA片段。要看到的是這樣的二倍體是通過寡核苷酸(排列在芯片上位點內的分子)與要鑒別的樣本的單鏈片段雜交獲得的。
術語“閱讀”通常指的是包括通過一種或更多合適的傳感器借助檢測標記而收集反應后分子的應答的過程。
這種閱讀具體可以是光閱讀，但是，作為替代，也可以是通過收集例如放射輻射的信號的閱讀。
要注意的是，在本文中，芯片“讀出器”的定義不僅指這種簡單閱讀過程，因為它還包括對“閱讀”信號的分析。

發明內容
“光源”方面上述芯片讀出器的類型是已知的。
這樣的讀出器使其能在芯片分子與樣本分子反應之后收集所述分子對給定激發的應答。
這種應答的收集使其能識別對所述激發反應特異的標記，其可以特別是集中在給定波長的照明(光激發)。
芯片，優選為平板的形式，位于工作臺上，可以沿著三個縱、橫和垂直軸x、y和z移動，因而連續地在芯片的各個位點上接受激發輻射，并且具有觀測這些位點的設備。
芯片可以直接放置在工作臺上或者放置在連接到工作臺的處理腔室中(例如，雜交小室)。
這些讀出器包括激發設備，其一般以光源形式存在(大約從幾百平方微米至幾平方毫米)，使其能夠以控制波長的光譜照明芯片的分子或細胞，因而使與分子結合的信號產生標記(優選為熒光標記)激發。
這些照明設備一般以燈(典型的是氙燈或汞燈)或一個或更多激光二極管的形式存在。
氙燈提供了一種連續和相等的光譜，覆蓋大多數常用標記的激發波長。
然而，這些燈的局限是與針對各種標記的激發線相關的能量水平可能太低以至于不能產生充足的理想激發線。
至于汞燈，它們提供一定波長的光譜展示線(最大能量)。
因此，這樣的燈能夠充分激發在對應于這些線的波長為可激發的熒光標記。
然而，汞燈的激發線不包括通常用于激發這些讀出器應用中所使用的激發熒光團(可以是Cy5或Cy7類型或者另一不能被廣譜燈有效激發的熒光團)的特定波長。這對汞燈構成了相當大的局限。
作為燈的替代，已知實現讀出器照明的設備是一種或多種給定波長的激光器。
“紅”激光器，非常普通并且不是很貴，這樣構成了實用和可獲得的解決方案用于激發標記，例如花青素5或花青素7。然而，當要激發的標記在位于藍光或接近藍光范圍的紫外光的波長具有反應活性(例如，激發FITC類型的標記)時，必需要利用不太常見類型的激光器，其導致成本上相當大的缺點。
這樣就顯現出用于為讀出器產生照明的設備的已知方案的局限性。
本發明的目的之一是使其能避免照明設備的相關局限。
“溫度控制”方面此外，對于許多應用，例如，芯片上的寡核苷酸雜交反應或酶反應，有利的是采用讀出器監控這些反應的參數，這些參數是芯片溫度函數。
提供溫度控制的讀出器工作臺的操作是已知的。這樣讀出器的例子見于文件US6329661。
因此結合溫度控制的工作臺與芯片讀出器的方式能夠通過輸送給定的信息部分而控制工作臺的溫度。
本發明的另一目的是改進這種裝置。
具體地，本發明的目的是能夠在用于觀測預想參數的最佳溫度條件下自動閱讀芯片。
為了實現上述目的，根據第一方面，本發明提供了一種用于閱讀和分析芯片的裝置，其包括·用于接收打算鑒別至少一種樣本的芯片的工作臺，·在其與其它分子反應之后激發芯片的分子或細胞的設備，·閱讀和分析受激發的分子的設備，其特征在于該裝置還包括·控制所述工作臺溫度的單元，所述控制單元被連接至由多個帕爾帖類型加熱/冷卻元件以相對于工作臺表面上各個位點排列所組成的模塊(111)，·并且至少一個工作臺傳感器(112)也被連接至所述控制單元。
優選，但不限于，該裝置的各部件如下·燈是汞燈，·激光器是輻射集中在大約635nm波長的激光器，·讀出器包括幾個激光器，·激光器集中在相同的波長，·激發設備包括至少一個激光器，與掃描其光束的模塊相關聯從而激發待分析的分子，·讀出器包括兩個激光器和模塊，模塊用于掃描兩個激光器并在兩個垂直方向上控制兩個獨立的分子掃描，·激發設備包括至少一個激光器組件，其包括輻射受光纖導向的激光器，·激發設備包括兩個同樣的激光器組件，·激發設備包括一個固定的激光器，其發射光束朝向兩個順序安裝的連續的，并且其移動受控沿著兩個不同的方向進行的鏡組件，·兩個鏡組件的移動是受控的，因而產生能跟隨芯片上的任何預定序列的光束，·激發設備包括燈和激光器，它們的輻射采用相同的光學通道，因為搖擺鏡能夠圍繞兩個位置之間的軸旋轉因而使這兩個輻射的其中之一直射入芯片，·光學系統被插入燈和待激發的分子之間，而激光器激發則發生對分子的直接照明，·所述光學系統包括窄帶激發光濾光器和窄帶發射光濾光器，以及光束分離器，·讀出器還包括激發控制單元，與每個激發設備相連從而控制其功能，·所述激發控制單元能夠選擇性地控制采用燈和至少一個激光器同時或連續照明分子，或者是采用燈和至少一個激光器對分子的獨立激發。
本發明還提供了用于閱讀和分析芯片的裝置，其包括·用于接收要鑒別至少一種樣本的芯片的工作臺，·在與其它分子或細胞反應之后，激發芯片的細胞或分子的設備，·閱讀受到激發的分子或細胞的設備，其特征在于該讀出器還包括溫度控制單元。
優選，但不限于，該裝置的各部件如下·工作臺包括與所述溫度控制單元相連接的溫度傳感器。
·讀出器包括與工作臺相關聯并且要控制工作臺溫度的加熱/冷卻模塊，所述加熱/冷卻模塊與溫度控制單元相連接。
·讀出器還包括包含微處理器并且與溫度控制單元和閱讀設備相連接的處理設備。
·讀出器包括存儲分子對于作為溫度的函數的激發設備的匹配和錯配應答的參考曲線的設備。
·存儲設備與根據所述參考曲線確定分子的匹配和錯配融合溫度的設備相連接。
·溫度控制單元能夠按照“靜態”模式控制讀出器的功能，即預先建立的作為溫度函數的分子匹配和錯配應答的參考曲線被所述溫度控制單元用來建立能被傳送的設定溫度，從而控制所述工作臺的溫度。
·溫度控制單元能夠按照“動態”模式控制讀出器的功能，即溫度控制單元控制工作臺上給定的溫度變化，并且，在溫度的這一變化期間
≯閱讀設備實時收集與芯片上各種位點相關聯的分子對激發設備的激發做出的應答，并將所述應答傳送給處理設備，≯存儲設備存儲，針對芯片上每個點的，作為溫度函數的分子應答的變化。
·讀出器包括處理設備，其能在所述應答變化的存儲末端建立針對每個分子的分子診斷狀態。
·所述診斷狀態是匹配/錯配診斷。
此外，本發明還涉及使用這樣的裝置閱讀芯片的方法。
這樣的方法可以具體為芯片的寡核苷酸雜交的方法，其可以采用根據上述一個方面的讀出器來實現，該方法包括以下步驟≯使對應于靶核酸的核酸探針與包含單鏈DNA片段的樣本接觸，從而通過形成二倍體實現特定探針與樣本的所述單鏈DNA片段的選擇性雜交。
≯閱讀這樣形成的二倍體，該方法的特征在于，該方法包括由自動確定下面溫度所組成的步驟≯針對每個處于“匹配”構象的靶核酸的融合溫度，以及≯針對每個處于“錯配”構象的靶核酸的融合溫度。
優選，但不限于，這樣方法的各步驟如下·所述確定在“靜態”模式中采用說明通過閱讀分別對應于匹配和錯配的二倍體所接收的信號中作為溫度函數的變化的參考曲線來實現，·該方法包括控制溫度從而在對應于匹配和錯配之間最大差別的溫度進行雜交，·該方法包括在先于閱讀步驟之前的步驟期間產生所述參考曲線，·該方法包括存儲所述參考曲線，·所述確定在“動態”模式中采用控制樣本溫度中給定的變化而實現，并且，在溫度的這個變化中，執行以下步驟≯實時收集與通過激發設備激發的芯片上各種位點相關聯的二倍體的應答，≯對于每個二倍體，存儲應答中作為溫度函數的變化，
·該方法包括，對于每個二倍體，在應答中每個變化的存儲末端建立二倍體的匹配/錯配的診斷。


本發明的其它優點和特點將通過以下結合實施例和附圖的說明書顯現出來，圖例的含義如下·圖1是根據本發明的讀出器的原理圖。
·圖2包括≯在其上半部分，根據本發明讀出器的工作臺的原理圖，詳細展示了溫度控制設備，≯在其下半部分，代表的是溫度可能的變化(以及具體顯示溫度的快速變化——大約為2.3℃/s——在根據本發明的裝置中是可能的)，·圖3a至3b是示例完成這樣的讀出器的全部或部分激發光設備的四種變體的圖，圖3a還包括通過激發設備光源掃描芯片的示例，·圖4a和4b是與本發明分子雜交應用相關的圖≯4a是由閱讀設備接收的針對相同DNA序列的匹配構象和錯配構象的作為溫度函數的芯片所有點信號變化的示例，≯圖4b是完成本發明的“動態”模式的示例，在其中那些圖4a類型的曲線是為幾種DNA序列構建的，·圖5是將探針固定在具有醛基官能團的載波片上的反應圖(來自TéléChem的超級醛基載波片)。醛基基團被共價結合到生物芯片的玻璃支持物上(長方形)。DNA分子的NH2官能團攻擊醛基基團從而形成共價鍵(中心圖)。該鍵通過脫水反應而穩定(在略微潮濕的空氣中干燥)，其結果導致形成希夫式(Schifff’s)堿基，·圖6示例了野生型寡核苷酸Q493X-Cy3和突變的寡核苷酸Q493X-Cy5混合物在包含各種以各種濃度(50，100和200μm)點樣的并且隨后以各種條件(低和高濕度)固定的相應探針的生物芯片上雜交的Cy3熒光。雜交在6×SSC，0.2％SDS，0.2mg/ml BSA中，在室溫中進行12小時。寡核苷酸的濃度是0.5μm。雜交后的生物芯片在6×SSC，0.2％SDS中室溫洗滌5分鐘，隨后是在2×SSC中室溫洗滌2分鐘，
·圖7顯示的是熒光信號的強度和信噪比，其對應于針對包含各種以各種濃度(50，100和200μm)點樣的并且隨后以各種條件(低和高濕度)固定的相應探針的芯片的寡核苷酸wtQ493X-Cy3和mutQ493X-Cy5的雜交溶液，·圖8代表了對應于Cy3標記的野生型寡核苷酸ΔF-508和Cy5標記的突變型寡核苷酸Q493X。
具體實施例方式
參考附圖1，根據本發明的讀出器10如圖所表示。
讀出器10包括·接收芯片12的工作臺11，·激發設備13，·閱讀設備14(即觀察芯片分子的設備，特別是對設備13發出的激發進行應答)，·命令和控制設備。
工作臺11工作臺11詳細見于圖2的上半部分。
這個工作臺通常包括用于容納芯片12的設備110。
這些設備可以包括腔室——例如，雜交小室。
工作臺11與能夠控制工作臺溫度的加熱/冷卻模塊111相關聯。
更加具體的，模塊111包括多個帕爾帖效應加熱/冷卻元件。這些帕爾帖元件與工作臺11的厚度融為一體。
這些帕爾帖元件的每一個相對位于工作臺11表面上的點中——并且因而位于工作臺所攜帶的芯片12上。
所述的點彼此相鄰，并且結合起來覆蓋了芯片的整個表面。
有利的是預先使這些點對應于芯片上將要接受探針的位點(見下文)。
而且，模塊111與溫度控制單元15相連，該單元產生設定溫度并將其傳送至模塊111，因而后者根據取決于觀察到的物理化學現象的溫度變化率而調節工作臺的溫度。
更為具體的，控制單元針對模塊111的每個帕爾帖元件產生單個設定溫度。
這些帕爾帖元件非常精確——它們通常為設定溫度提供大約為0.01℃的精確度。
由這些帕爾帖元件組合形成的模塊111與熱交換模塊相關聯，因而實現工作臺11的加熱/冷卻。
這個熱交換模塊可以是空氣或液體循環功能的。
這樣就能夠精細地控制工作臺上任何位點的溫度。
尤其是它能夠通過這種方式確保在工作臺11上的所有位點的溫度嚴格相同。
基于帕爾帖元件對于設定溫度的變化(升高或降低)非常敏感，這一點進一步得到提高。
這些元件因而能夠精確地提供快速溫度變化(典型地，精確度約為0.01℃，變化速率為每秒幾度)。
這樣就可以提供“快速”溫度變化——每秒大約幾度的變化，例如用于PCR類型的反應(聚合酶鏈式反應的縮合)。
它也可以提供“慢”變化(每分鐘大約幾度的變化——用于，例如，以解離為目的的DNA鏈融合類型的反應)。
為了能夠提供這些各種類型的變化，至少一個相應的工作表被存儲在單元15能夠存取的該裝置的存儲器中(例如，將要描述的計算機17的存儲器)。
要注意的是速率不僅取決于預定的反應類型，而且也取決于所采用的探針的類型，以及預定要鑒別的樣本的類型。
基于此，相應的工作表也要考慮這些參數。
此外，裝置的使用者能夠進入與單元15和/或計算機17相連的合適的接口(鍵盤或其類似物)，作為與相應工作表相關聯的程序的函數的參數(特別是，反應類型，探針，樣本)將自動地選擇要傳送給模塊111的設定溫度變化。
而且，溫度傳感器112整合入工作臺中，記錄其有效溫度并且將它傳送至也與該傳感器相連的溫度控制單元15。
以這樣的方式，芯片上位點的溫度由溫度控制單元15控制，并且芯片上位點的這一溫度也被溫度控制單元實時獲知。
而且，可以相對于位點的組或者甚至相對于芯片上各個位點的每一個預設幾個溫度傳感器112。
傳感器112整合入工作臺11中。
此外，如以后將要更詳細表述的(特別是關于動態模式)，這(這些)溫度傳感器使得它能記錄與裝置的功能相關聯的溫度參數，并且能調節這種功能。
激發設備13激發設備13包括兩種類型的光源·廣譜燈131——優選為汞燈，·至少一個激光器132。
這個激光器按照能激發常用標記的波長發射，并且其激發光譜與燈131的發射光譜不一致。
在優選實施例中，燈是汞燈——其不能激發Cy5標記——激光器是常用的紅激光器，其發出的射線集中在635nm，或者是其它能激發Cy5分子的激光器。
以這樣的方式，所有常用的發光標記都能通過激發設備13而激發。
而且，激光器的利用不會顯著增加讀出器的成本價格，因為這種類型的激光器非常普通而且便宜。
激發設備13還包括針對每個類型光源的獨立的電源1310，1320。
設備13還包括插入燈131和工作臺之間的光學系統1311(因而在芯片的分子和燈之間)。
如圖3a所示，這個光學系統包括激發濾光器13111，和光束分離器13112，使其能夠·使來自燈和來自濾光器13111的輻射直射向芯片，·使來自芯片的對應于來自燈的(或來自激發設備的激光器的)激發的信號直射向閱讀設備14。
特別的是，所述光學系統還可以包括窄帶激發光濾光器和窄帶發射光濾光器(至少2個直至8個)以及光束分離器。
直射向芯片以及來自該芯片的輻射還可以通過物鏡134。
激發設備13還可以包括干涉濾光器變化設備1312(見于圖1)，其與濾光器13111和濾光器控制設備16相連。
因而可以理解，芯片的分子被來自燈的經過了光學系統的輻射激發。
至于由來自激光器的輻射引起的芯片分子的激發，它是直接發生的，在激光器和芯片之間沒有插入任何元件。
在圖3a所示的更為特別的變體中，激發設備包括兩個激光器1321和1322。這兩個激光器是相同的。
每個激光器與用于掃描生物芯片的模塊(未示出)相關聯。
當讀出器僅僅包含一個激光器時，這個激光器本身還與在可參量排列的光束中實現這個功能的模塊相關聯。
為了有效覆蓋對應于要鑒別的芯片上位點的視野，并且通過激光器均勻照明該視野，兩個掃描模塊在兩個垂直方向上施加兩個獨立的分子掃描。
這種掃描類型在圖3a的下半部分示例。
兩個帶13210和13220代表了兩個激光器1321和1322的各自的光束。
這兩個光束具有延長的交叉部分，兩個光束的延長方向是垂直的。
這些方向中的每個可以在芯片上位點校準的兩個方向之一上被調準，這些位點一般形成矩形矩陣。
每個光束通過與其相關聯激光器的掃描模塊而在視野120中移動，其方向為垂直于光束延長的方向。
圖3b代表了完成激發設備13的激光器的第二種變體。這些激光器預定要用于激光器1321和1322的位置。
在這個變體中，激光器激發通過兩個產生兩個獨立光束13210’和13220’的相同組件1321’和1322’而直射向芯片12。
這些組件之一，1321’所指示的，如圖3b的上半部分所示例。
這種組件包括激光器13211’，其與輸出透鏡13212’相關聯，該透鏡使來自激光器的光流朝向光纖13213’。
這個光纖本身將輻射傳送至另一個透鏡，標號為13214’，其相對于芯片固定安裝并且使光束13210’朝向它。
圖3a的下半部分代表了兩個光束13210’和13220’在芯片上的影響以及在這樣被限定的照明范圍1320上的影響。
因此激光器可以是偏中心的。
圖3c代表了激光系統的第三種變體，在其中至少一個固定激光器132″使其光束朝向順序安裝的兩個連續鏡組件，標號為1321″和1322″。
這些鏡組件中的每個包括一個鏡，其方向是由獨立的壓電調節器13210″，13220″來控制的。
更具體的，這樣一來，每個鏡沿著各自的軸移動，這些軸對應于芯片12的橫向軸X，Y其中之一。
這樣，來自兩個鏡的光束1320″在芯片上采用的通路13201″可以沿著軸X、Y跟隨任意預定的序列。
此外，這種激光器系統可以替代圖3a中的激光器1321、1322。
最后，圖3d示例了完成另一種激發設備13的變體，其對應于圖3a所代表的設備的替代方式。
這個圖3d代表汞燈131和激光器132。
激光器和燈每個都與各自的輸出透鏡相關聯。
在這個變體中，來自激光器和來自燈的獨立輻射采用相同的光學通路，由于能圍繞位于兩個位置之間的軸1300旋轉的搖擺鏡130因而使這兩個輻射之一朝向系列透鏡1301以及回轉鏡1302以便使輻射朝向光學組件134和芯片12。
鏡130的搖擺控制設備可以控制任意序列，使其能夠用兩種類型輻射(激光器和燈)照明芯片，例如通過預定的頻率在它的兩個位置之間旋轉。
特別的是，在上述所有變體中，激發設備可以包括一個激光器，或幾個相同的激光器。
閱讀設備14閱讀設備14包括光學系統141，其用于獲取芯片12的圖像范圍120，而且，能夠用于該芯片通過工作臺11的受控制的移動而相對于讀出器的其余部分移動。
為了這種效果，閱讀設備還包括記錄設備，用于協調工作臺11的移動。
因此光學系統141包括第一探測光學組件1411，以及插入這第一光學組件和CCD攝像機142之間的濾光器1412。
光學系統141還包括濾光變化設備14120(見圖1)，其與濾光器1412和濾光器控制設備16相連。
控制和命令設備除了溫度控制單元15和濾光器控制設備16已經介紹過之外，用于控制和命令讀出器的設備包括，管理讀出器所有元件功能的計算機17。
計算機與如下元件以這樣一種方式相連以便將功能指令傳送給它們并且/或者接收來自它們的信息≯電源1310和1320——在這方面，計算機執行激發控制單元的功能。特別是計算機可以選擇控制采用燈和至少一個激光器同時照明芯片分子，或者采用燈和至少一個激光器分別激發分子≯溫度控制單元15，≯濾光器控制設備16，≯以及伴隨的其它控制和命令元件。
控制和命令讀出器的設備還可包含·用于控制工作臺11移動的單元18，其與該工作臺和計算機17相連，·控制攝像機142以及獲取由該攝像機獲得的圖像的單元19，其能按照各種模式，其中包括用于跟隨動態現象的實時模式，或者采用終止時間用于提高非常低強度的位點(雜交信號)的圖像信噪比。
讀出器的功能根據本發明的讀出器的結構在以上已經詳細描述了。特定的方面，尤其是芯片分子的激發也已經說明。現在，將從溫度控制的角度詳細說明該讀出器的功能。
更具體的，將在預定的本發明應用的基礎上描述該功能，即芯片的寡核苷酸與來自生物樣本的單鏈DNA片段的雜交。
然而，特異化的根據本發明的讀出器也能被用于其它應用——例如，用于實現酶反應(特別是連接酶，PCR，簡單寡核苷酸延伸，等類型)，用于篩選配體。
回到雜交應用，例如來自患者的生物樣本，被研究以便檢測其中特定的遺傳特征。所尋找的特征可以是，例如，特異核酸序列，例如，CFTR基因中，可能存在的突變。
該方法開始是常規的，通過將對應于靶核酸的核苷酸所構成的核酸探針構建在芯片的各個位點上而制備芯片。
這些探針預定要與包含單鏈DNA片段的樣本雜交。
而且，單鏈DNA片段是以已知方式獲得的，特別是通過PCR擴增。它們與標記相結合從而在這些片段與芯片探針雜交之后，使其能被讀出器的閱讀設備檢測。
所述探針隨后與樣本接觸因而實現特定探針與樣本單鏈DNA片段的選擇性雜交，從而構建二倍體。
特別的是，不是所有的探針都與樣本的DNA鏈雜交。
事實上，每個核酸探針將優先與其靶核酸雜交。
此外，一些探針對應于沒有突變的核酸，而另一些則對應于包含給定突變的核酸。
在這個雜交步驟期間，為有效雜交的探針形成二倍體。
探針正確雜交意味著包含單鏈DNA片段的樣本與所述探針的靶核酸相對應。
以這種方式雜交的探針因而在雜交步驟之后對應于“匹配”型二倍體。
而且，在雜交步驟之后，與樣本的單鏈DNA片段沒有雜交或雜交很差的探針對應于“錯配”型二倍體或者甚至是非雜交的單鏈。
溫度是這個雜交步驟的重要參數。
這是因為，對于每個靶核酸，存在著·針對處于“錯配”構象中的二倍體的融合溫度Tm1，以及·針對處于“匹配”構象中的二倍體的融合溫度Tm2。
融合溫度對應于二倍體的一半的兩條鏈彼此分離時的溫度。
Tm1小于Tm2，如圖4a所示。
此外，理想的是，對于給定的靶核酸，在對應于匹配和錯配之間差別最大的溫度進行雜交步驟。
這樣，“匹配”和“錯配”二倍體可采用芯片讀出器的閱讀設備有選擇的鑒別。
這個理想溫度介于Tm1和Tm2之間。
在已知雜交方法的情況中，通常需要重復幾次雜交從而獲得接近于這個理想溫度的溫度。
在本發明的情況中，溫度的控制是通過溫度控制單元15而進行的，從而避免了這一缺點。
更具體的，本發明的這一應用可按照兩種模式實現“靜態”模式和“動態”模式。
在這兩種模式中，以下溫度可以自動被確定·處于“匹配”構象中的每個靶核酸的融合溫度，以及·處于“錯配”構象中的每個靶核酸的融合溫度。
靜態模式這種模式非常適合于探針對應于同樣的靶核酸或靶核酸具有相似融合溫度的芯片的情況。
在這種模式中，所述融合溫度的確定是預先完成的，因此這些溫度在完成鑒別之前就已知了。
這些溫度可以讓操作者知曉，他實現這一鑒別并且因而將設定溫度輸入裝置(采用與計算機相連的接口，或者直接與單元15相連的接口)。
這些溫度還可以被存儲在讀出器的存儲器中，該存儲器與所述單元15相連。
這樣，芯片的溫度被控制，因而可在匹配與錯配之間差別最大的溫度進行雜交。
特別的是，融合溫度還可以通過讀出器(見隨后的動態模式)而確定，并且被存儲用于完成靜態模式。
在這樣的融合溫度的優先確定期間，參考曲線等價于圖4a產生的那些。
因而能在閱讀步驟之前形成參考曲線。
在這種情況下，讀出器被用來記錄在單元15控制的影響下溫度連續變化時，探針對已知類型的單鏈片段(對應于沒有突變，和有突變的靶核酸的片段)的應答。
此外，這些曲線可以被存儲在，例如計算機17中。
動態模式這種模式特別適合于這種情況的芯片，即其中的探針對應于具有非常不同融合溫度的“匹配”構象的靶核酸。
在這種模式中，芯片的溫度變化(例如，連續升高或連續降低)被控制，以通過各種探針的各種靶核酸的融合溫度。
這種變化通過從單元15輸送合適的信息至與工作臺相關聯的模塊111的帕爾帖元件而獲得。
在溫度的這種變化期間·閱讀設備14實時收集與芯片上各個位點相關聯的二倍體在激發設備13激發下的應答，并將所述應答傳送給計算機18。
·對于芯片上的每個位點，二倍體的應答作為溫度函數的發展情況被存儲在計算機18的存儲器中。
此外，至少一個溫度傳感器112存在于工作臺中使其能夠·記錄連續溫度值的變化(這發生在工作臺的各個位點——因此在芯片上——其中排列了各傳感器112)。這使其能鑒別二倍體應答中作為溫度函數的變化，·控制工作臺表面上的溫度。在這方面，傳感器112允許在簡單的滿足傳送設定溫度至加熱元件的“盲”控制之外，進行溫度的實際調節。
要強調的是，由于帕爾帖元件非常敏感并且可以進行快速溫度變化，所以PCR類型的應用也是可預見的。
此外，將離散的帕爾帖類型加熱/冷卻元件與至少一個溫度傳感器結合使其能夠·精細的控制溫度在工作臺所有位點的分布(以及在芯片上)，·確保在簡單控制之外進行真實調節。
這樣，對于芯片上的每個位點，計算機構建了探針的作為溫度函數的應答中變化的曲線，如圖4b所示，其示例了四位點芯片的非常簡單的情況(曲線1，2，3和4)。
探針成對分布，其中之一與沒有突變的靶核酸相對應，另一個則與具有突變的相同靶核酸相對應。
因此每一對的兩個探針的應答將對應于兩條與圖4a的參考曲線相似的曲線。
此外，通過分析每一對探針的曲線，它將能夠確定“匹配”探針和“錯配”探針。
對于這個效果，計算機包括了一個程序，一旦所述應答中的變化被存儲，該程序就能建立針對芯片上每個位點的與該位點相關聯的診斷狀態。
實現本發明的實施例根據本發明的芯片讀出器能夠閱讀DNA芯片。因而本發明的目的還包括提供一種DNA芯片，其包括許多對應于或包含野生型或突變基因片段的寡核苷酸(或探針)，特別是人的CFTR基因(囊性纖維化貫通膜傳導調節子)。這樣的芯片尤其適用于檢測人CFTR基因的突變并診斷囊性纖維化。
囊性纖維化是高加索人種中最常見的常染色體隱性疾病之一，在北美出生的每2000個人中就有一人受其影響(Boat等人，遺傳疾病的代謝基礎，6thEd.Pp 2649-1680，McGraw Hill，New York，1989)。
囊性纖維化與250kb長的并包含27個外顯子的CFTR基因的突變相關聯。由于該基因已經在1989年被鑒別，所以已經開展了很多基因分析以限定該基因的突變范圍。所述突變有很多變體，并且超過850種突變已被鑒別。然而，有一種突變被發現存在于50％的患者中；它是Delta F508突變。而大多數其它的突變在患者中發生率很低(1—5％)。
這一發現揭示了研發可能的診斷檢測的復雜性。因此一種診斷檢測允許檢測大約30種不同的突變，其采用試管配體反應(OLA，PerkinElmer)。
還有其它的涉及DNA芯片技術的方法被研發用于鑒別人CFTR基因的突變。這些記載見于美國專利US6027880；5837832；5972618；和5981178。然而，到目前為止，還沒有一種檢測能夠在一樣本中快速、有效而可靠地檢測CFTR基因中最常見的突變。這是本發明提出的所要解決的問題，其通過研發用于檢測人CFTR基因中突變的DNA芯片，該芯片可用于根據本發明的讀出器。
CFTR芯片的特性本發明提供了寡核苷酸或DNA芯片(CFTR芯片)的陣列用于檢測人CFTR基因的突變。該陣列包括固相支持物，有多個不同的寡核苷酸(探針)以所述寡核苷酸與互補寡核苷酸或多核苷酸有效雜交的方式(即，與存在于要檢測的生物樣本或取自其中的靶寡核苷酸或多核苷酸)結合在該支持物上，并且在這樣的方式中所述寡核苷酸在各個位點具有不同的核苷酸序列結合至所述固相支持物，以便寡核苷酸具有與在所述固體支持物的特異位點的互補靶寡核苷酸或多核苷酸有效雜交的特異核酸序列。
所述陣列的特征在于它包括至少一對，至少兩對，至少三對，至少四對，至少五對寡核苷酸，至少6對，至少7對，至少8對，至少9對，至少10對，至少15對寡核苷酸，每對寡核苷酸由對應于或包含野生型(wt)CFTR基因的寡核苷酸片段的寡核苷酸以及對應于或包含突變(mut)CFTR基因寡核苷酸片段的寡核苷酸以及與突變和野生型CFTR基因形成“錯配”二倍體的陰性對照寡核苷酸(cont)所組成。
產生了兩組大約為20nt(取決于堿基組成)和15nt長度的探針。
優選地，所述組(野生型/突變/對照)選自以下組中SET No.1(這組沒有對照探針)TAGGAAACACCAAAGATGATATTT(SEQ ID N°1)24merCATAGGAAACACCAATGATATTTT(SEQ ID N° 2)24merSET NO.2AGGAAAACTGAGAACAGAATG(SEQ ID N°3)21merAGGAAAACTAAGAACAGAATG(SEQ ID N°4)21merAGGAAAACTTAGAACAGAATG(SEQ ID N°5)21merSET No.3ACCTTCTCCAAGAACTATATTG(SEQ ID N°6)/22merACCTTCTCAAAGAACTATATTG(SEQ ID N°7)22merACCTTCTCTAAGAACTATATTG(SEQ ID N°8)22merSET No.4TTCTTGCTCGTTGACCT(SEQ ID N°9)/17merTTCTTGCTCATTGACCT(SEQ ID N°10)17merTTCTTGCTCCTTGACCT(SEQ ID N°11)17merSET No.5TCGTTGACCTCCACTCA(SEQ ID N°12)/17mer
TCGTTGATCTCCACTCA(SEQ ID N°13)17merTCGTTGAACTCCACTCA(SEQ ID N°14)17merSET No.6ACCTTCTCCAAGAAC(SEQ ID N°15)/15merACCTTCTCAAAGAAC(SEQ ID N°16)15merACCTTCTCTAAGAAC(SEQ ID N°17)15merSET No.7CTTGCTCGTTGACCT(SEQ ID N°18)/15merCTTGCTCATTGACCT(SEQ ID N°19)15merCTTGCTCCTTGACCT(SEQ ID N°20)15merSET No.8TCGTTGACCTCCACT(SEQ ID N°21)/15merTCGTTGATCTCCACT(SEQ ID N°22)15merTCGTTGAACTCCACT(SEQ ID N°23)15merNo.1的一對能檢測最普通的CFTR基因突變，即位于外顯子10中的delta F508突變。這個突變對應于檢測3堿基對(AGA編碼)，其結果導致CFTR蛋白缺失氨基酸508。
SET No.2能檢測CFTR基因外顯子10中的突變Q493X。這個突變對應于在位置493的G→A的替換，其結果導致出現無義突變。
SET No.3和6能檢測CFTR基因外顯子11中的突變G542X。這個突變對應于在位置542的C→A的替換，其結果導致出現無義突變。
SET No.4和7能檢測CFTR基因外顯子11中的突變R553X。這個突變對應于在位置553的G→A的替換，其結果導致出現無義突變。
SET No.5和8能檢測CFTR基因外顯子11中的突變G551D。這個突變對應于在位置551的C→T的替換，其結果導致在位置551以天冬氨酸替代甘氨酸。
優選地，本CFTR芯片至少包括上述五對寡核苷酸。根據本發明的CFTR芯片特征在于組成它的寡核苷酸在處于雙鏈形式時具有相似的融合溫度，并且優選介于大約55至85℃，大約65至75℃，優選大約70℃范圍(在1MNaCl中)。這樣，序列的寡核苷酸任選地，根據本發明的CFTR芯片還包含陰性對照寡核苷酸，即與所有要研究的靶形成錯配雜交的探針。
要在帶有錯配和沒有錯配的雜交之間獲得好的區別，固定在固體表面上的寡核苷酸序列的選擇非常重要。這樣，探針的設計非常重要，以便避免通過固定的探針形成第二分子內結構和形成分子間復合物的可能性，因為這些結構極大降低靶和探針雜交的效率，以及具有或沒有錯配雜交之間的區別。這樣，通過選擇寡核苷酸的核酸序列，尤其是其長度和堿基組成，和/或通過施加額外的核酸以便修飾Tm或形成分子內結構和分子間復合物的可能性，從而達到對寡核苷酸特性的要求。這些很難滿足的要求證明本發明步驟的優勢。
根據本發明的CFTR芯片，由寡核苷酸探針涂覆，其特征在于所述寡核苷酸探針被沉積形成位點，其平均直徑介于20μm至500nm之間，優選介于50μm至200μm之間。
每個寡核苷酸探針的位點中心之間的距離是可變的，并且取決于芯片，但是它們被限定以便不影響在兩個相鄰位點上的雜交反應。然而，這個距離優選介于50μm至80μm之間，1000μm至2500μm之間，或100μm至500μm之間。在每個位點，優選沉積相同寡核苷酸的多份拷貝。這樣，每個位點優選地包含至少1個，至少2個，或通常至少16個同樣的寡核苷酸。
根據本發明的芯片上的位點數量是可變的，并且取決于在固體表面上點樣的寡核苷酸對的數量。優選地，它是中間密度陣列，即具有限定數量的位點。這樣，所述位點的數量為至少2個/cm2，至少4個/cm2，至少6個/cm2，至少8個/cm2，至少10個/cm2，至少50個/cm2，至少100個/cm2，至少500個/cm2，至少1000個/cm2，至少10000個/cm2，至少50000個/cm2，或至少100000個/cm2。
根據本發明的CFTR芯片的固體支持物選自由玻璃，塑料，Nylon，Kevlar，硅樹脂，硅或多聚糖制成的固體支持物。優選地，固體支持物是玻璃載波片，更優選的是玻璃顯微載波片。
優選的是，載波片采用醛基功能化。對于商業可得到的例子是2D玻璃載波片。根據本發明的芯片優選來自2D-微陣列或3D-微陣列類型。根據第一實施例，它是2D-芯片，其中根據本領域人員已知的方法，探針優選地通過氨基和醛基化學功能團結合。這樣，未修飾的DNA和氨基修飾的DNA可以分別通過共價鍵在這些基質上雜交。
將介紹用于固定銨基修飾DNA的超醛基基質型載波片或用于固定未修飾DNA的超胺基基質類載波片(例如，注冊商標為TeleChemArray IT的載波片)。
氨基修飾DNA在商業化的醛基功能化載波片上的固定原理見于圖5。
圖6和7示例了對該方案修飾的影響以便實現在高濕度下DNA與超醛基表面的耦合(濕度為在具有大約700cm3封閉塑料盤中，水半滿)。
這種修飾提高了固定效率和信噪比。
根據第二實施例，芯片是水凝膠基的3D—芯片，例如3端連接的活性載波片(MotorolaTM)，其具有以下優點(i)更高的探針固定效率，以及更好的雜交信號強度；(ii)在帶有錯配和沒有錯配的雜交之間更好的差別(Livshits and Mirzabekov，1996，DNA與凝膠固定的寡核苷酸雜交的動力學理論分析.Biophys.J.Nov.；71(5)2795-2801)。
優選地，上述的CFTR芯片的寡核苷酸以單鏈DNA形式通過寡核苷酸的末端之一被點樣和結合至固體表面。優選地，它是3’-末端。
CFTR芯片的用途過程材料和方法雜交條件寡核苷酸和芯片的雜交樣本從包含以下的混合液中制備·采用Cy3熒光團標記的非突變(野生型或wt)寡核苷酸，以及·采用Cy5熒光團標記的突變(或mut)寡核苷酸其在芯片上被雜交AAATATCATCTTTGGTGTTTCCTA-Cy3(ΔF508-wt)AAAATATCATTGGTGTTTCCTATG-Cy5(ΔF508-mut)CATTCTGTTCTCAGTTTTCCT-Cy3(Q493X-wt)CATTCTGTTCTTAGTTTTCCT-Cy5(Q493X-mut)AATATACTTGGAGAAGGT-Cy3(G542X-wt)ACCTTCTCAAAGTATATT-Cy5(G542X-mut)
AGGTCAACGAGCAAGAA-Cy3(R552X-wt)AGGTCAATGAGCAAGAA-Cy5(R552X-mut)TGAGTGGAGGTCAACGA-Cy3(G551D-wt)TGAGTGGAGATCAACGA-Cy5(G551D-mut)圖8顯示了對應于芯片上寡核苷酸ΔF508-wt，ΔF508-mut，Q493-wt和Q493-mut雜交的雜交圖像。
觀察到了所有突變的匹配/錯配差別。
材料和方法雜交條件采用的是來自Metabion公司的3’末端標記的寡核苷酸。寡核苷酸的特質經過變性條件下20％聚丙烯酰胺凝膠被檢驗。
芯片上熒光團標記的寡核苷酸的雜交在2×SSC，0.2％SDS，0.2mg/ml BSA類型的溶液中，在室溫下進行12小時。雜交室的體積為180μl，每種寡核苷酸的濃度為0.1μm。
芯片的雜交后在2×SSC，0.2％SDS溶液中，室溫洗滌1分鐘。
隨后根據TeleChem方案通過在500×g離心1分鐘來干燥芯片，并且隨后被閱讀。
一般，本發明的這種應用包括利用根據本發明的CFTR芯片，用于檢測患者CFTR基因序列中可能存在的突變，優選采用根據本發明的讀出器。
本方法的必要步驟如下·靶多核苷酸或寡核苷酸的制備采用本領域技術人員常用的方法從生物樣本中提取基因DNA，或信使RNA，或其片段。利用重組DNA技術，RNA任選的轉換成cDNA(互補DNA)。這樣，所分離的DNA隨后被分成片段和/或通過PCR擴增，以便產生寡核苷酸片段。后者被標記，在采用根據常規方法的信號產生標記之前、期間或者之后。根據優選實施例，這樣被分離的DNA采用針對要檢測的CFTR基因范圍的特異性引物通過PCR被擴增，利用標記的或修飾的核苷酸。這樣標記的DNA，cDNA或RNA隨后被變性以便獲得單鏈分子。
·ssPCR產物的熒光標記外顯子10的ssPCR產物(長度大約400nt)采用Cy3或Cy5熒光標記被3’末端標記——將100pmol的ssPCR產物溶解在25μl溶液中(在水中1×TdT緩沖液，400pmol的Cy3—UTP(或Cy5-UTP))，——加入10單位的TdT。
反應在37C下進行1小時。未結合的標記采用QiagenDyeExTMSpin Kit柱根據Qiagen方案消除。
·靶DNA與芯片的寡核苷酸的雜交這樣標記和變性的DNA、cDNA或RNA隨后被點樣至芯片上，并且在限定的嚴格雜交條件下通過特異雜交與寡核苷酸探針適當結合。在清洗以去除過量標記的DNA、cDNA或RNA和/或那些非特異性雜交之后，所形成的二倍體采用根據本發明的讀出器檢測。
CFTR基因中突變的分析可以按照第一種方法實現，即比較CFTR生物芯片上野生型(wt)和/或突變靶寡核苷酸與采用熒光團標記的單一類型靶寡核苷酸的雜交信號的強度。第二種方法采用在CFTR芯片上至少兩種不同的，采用不同信號產生標記所標記的靶核苷酸的雜交，其中的寡核苷酸之一來自要檢測的樣本，另一個與參考寡核苷酸相對應(一般，寡核苷酸對應于野生型序列)。
雜交在室溫為大約20℃的情況下，在后文將限定的且不含甲酰胺的緩沖液中進行在所述靶核苷酸上的探針雜交。如果所用的雜交媒介中包含甲酰胺，本領域技術人員將不得不調整雜交條件。
優選地，用于根據本發明的所述CFTR芯片的雜交媒介包括至少6×SSC(1×SSC對應于0.15M NaCl+0.015M檸檬酸鈉)，0.2％的十二烷基硫酸鈉以及，任選地，0.2mg/ml的牛血清白蛋白。本領域的技術人員可以通過在雜交緩沖液中具有相似功能的化合物任意修訂這些條件。例如可以想得到，用動物膠替代牛血清白蛋白，或用SSPE緩沖液替代SSC緩沖液(5×SSPE由750M NaCl，50mM磷酸鈉，5mMEDTA組成，pH7.4)。
表述“允許靶核酸與所述寡核苷酸探針特異雜交的條件”優選指的是極為嚴格的條件，尤其是后文所定義的。“嚴格”條件是指在這些條件下探針將雜交在其靶序列上，但是不雜交在其它序列上。嚴格條件取決于序列，并且根據環境而不同。因子的變化可影響雜交的嚴格性。在這些之中，應該由基礎組分，互補鏈的大小，有機溶劑的存在和堿基錯配的長度來構成提及的表述。針對影響雜交的一般因素的討論可見于WO 93/02216或者Ausubel等人(分子生物學常規操作，GreenePublishing Associates，Inc.and John Wiley and Sons，Inc.)。一般，所選擇的嚴格條件為，例如，針對在限定的離子強度和pH的特異序列，溫度比融合溫度(Tm)低5℃。Tm是指50％的互補于靶序列的探針雜交至靶序列的平衡點的溫度(在限定的離子強度，pH值以及核酸濃度的條件下)。通常，嚴格條件包括至少大約0.01M至1M的鈉或其它的鹽濃度，pH值為7.0至8.3，以及針對小探針(10至50核苷酸)的至少為大約30℃的溫度。嚴格條件還可以通過加入不穩定試劑，例如甲酰胺或四烷基銨鹽而獲得。例如，5×SSPE(750M NaCl，50mM磷酸鈉，5mM EDTA，pH7.4)和25-30℃的溫度的嚴格條件是突變遺傳因子特異探針雜交常用的條件。
在極為嚴格條件下的雜交意味著選擇溫度和離子強度，以便維持兩個互補DNA/DNA或RNA/DNA片段的雜交。通過示例，以上所述用于雜交步驟的為了限定雜交條件的極為嚴格的條件具有以下優點DNA-DNA或DNA-RNA雜交分兩步進行(1)在包含5×SSC，50％甲酰胺，7％十二烷基硫酸鈉(SDS)，10×Denhardt’s，5％葡聚糖硫酸鹽和1％鮭精DNA的磷酸緩沖液(20mM，pH7.5)中42℃預雜交3小時；(2)每序列在取決于探針大小的溫度下(即，大于100核苷酸的探針，溫度為42℃)雜交20小時，隨后在2×SSC+2％SDS中20℃進行兩次20分鐘的洗滌，在0.1×SSC+0.1％SDS中20℃進行一次20分鐘的洗滌。對于大小大于100核苷酸的探針，最后在0.1×SSC+0.1％SDS中60℃進行30分鐘的洗滌。上述用于限定大小的多核苷酸的極為嚴格的雜交條件可以由本領域技術人員在用于更長或更短的寡核苷酸時進行調節，可參考Sambrook等人的描述(1989，分子克隆實驗室手冊。2ndEd.Cold Spring Harbor)。
最后，雜交可以在更潮濕或更不潮濕的空氣中進行。低濕度或高濕度的雜交條件使其能充分發揮雜交特異性。
嚴格性可以通過逐步提高嚴格條件而經驗的確定，例如通過提高鹽濃度，或者通過提高溫度直至獲得理想的特異性程度。本發明通過精確控制溫度的提高而能夠提高嚴格條件。
本發明還提供了用于診斷囊性纖維化的試劑盒，包含根據本發明的寡核苷酸陣列或CFTR芯片。用于檢測樣本中人CFTR基因中的突變或基因型的試劑盒或包的特征在于其包括根據本發明的CFTR芯片和，任選地，標記靶寡核苷酸或多核苷酸所需要的試劑。本發明的目的還包括利用根據本發明的寡核苷酸陣列或CFTR芯片診斷個體中的囊性纖維化。
本發明的目的還包括用于檢測樣本的CFTR基因中突變的方法，特征在于其包括如下步驟a)在允許這些靶核苷酸或把多核苷酸與所述寡核苷酸探針特異雜交的條件下，將取自懷疑存在突變的人CFTR基因中的包含靶核苷酸或多核苷酸的樣本點樣至采用根據本發明的寡核苷酸涂覆的芯片上；b)在合適條件下洗滌來自步驟a)的芯片，以便去除沒有被雜交捕獲的樣本核酸；并且c)任選地采用根據本發明的讀出器檢測芯片上被雜交捕獲的核酸。
本發明的目的之一還包括用于診斷個體中囊性纖維化的體外方法，其包括如下步驟(a)獲得至少一個取自個體的CFTR基因的DNA片段；(b)用信號產生標記來標記所述片段；任選地，使所述片段變性以便獲得單鏈片段；(c)使所述標記的片段與根據本發明的寡核苷酸陣列雜交；(d)檢測與所述陣列的一個或更多寡核苷酸特異雜交的DNA片段；(e)任選地，確定在所述個體中CFTR基因突變的存在。
根據本發明的優選實施例，所述片段在步驟(b)中直接或間接地用根據本發明的信號產生標記進行標記；優選地，其為選自以下組的熒光標記Cy3，Cy5，FITC，德克薩斯紅(梅紅)，Bodipy 630/650，Alexa 488，Alexa 350，等等。
根據第一實施例，由信號產生標記所標記的單一靶核苷酸在所述CFTR芯片上被雜交。
根據第二實施例，至少1個，至少2個，至少3個，至少4個，至少5個，至少6個，至少7個，至少8個，至少9個或至少10個由信號產生標記所標記的靶核酸在所述CFTR芯片上被雜交。
根據本發明的讀出器事實上能夠同時或在時間上分開的檢測帶有不同標記的雜交或二倍體。
權利要求
1.一種用于閱讀和分析芯片的裝置，包括·用于接收要鑒別至少一個樣本的芯片的工作臺，·在與其它分子反應之后激發芯片的分子或細胞的設備，·閱讀和分析受激發的分子的設備，特征在于該裝置還包括·用于控制所述工作臺溫度的控制單元，所述控制單元與由多個和工作臺表面上各種位點相對排列的帕爾帖加熱/冷卻元件所組成的模塊(111)相連，·并且至少一個工作臺溫度傳感器(112)也與所述控制單元相連。
2.如前述權利要求所述的裝置，其特征在于激發設備包括廣譜燈和至少一個激光器。
3.如前述權利要求之一所述的裝置，其特征在于激光器是輻射集中在635nm等級波長的激光。
4.如前述權利要求之一所述的裝置，其特征在于讀出器包括幾個激光器。
5.如前述權利要求所述的裝置，其特征在于激光器集中在相同的波長。
6.如前述權利要求之一所述的裝置，其特征在于激發設備包括至少一個與用于掃描其光束的模塊相關聯，以便激發待分析的分子。
7.如前述權利要求所述的裝置，其特征在于讀出器包括兩個激光器以及用于在兩個垂直方向中掃描兩個激光器和控制兩個獨立的分子掃描的模塊。
8.如權利要求1至5之一所述的裝置，其特征在于激發設備包括至少一個激光器組件，激光器組件包括輻射受光纖引導的激光器。
9.如前述權利要求所述的裝置，其特征在于激發設備包括兩個相同的激光器組件。
10.如權利要求1至5之一所述的裝置，其特征在于激發設備包括固定的激光器(132″)，其發射光束朝向兩個順序安裝的連續的鏡組件，鏡組件的移動被控制沿著兩個不同的方向進行。
11.如前述權利要求所述的裝置，其特征在于兩個鏡組件的移動是受控的，因而產生的光束能跟隨芯片上的任何預定序列。
12.如權利要求1至5所述的裝置，其特征在于激發設備包括燈和激光器，燈和激光器的輻射采用相同的光學通道，搖擺鏡(130)能夠圍繞兩個位置之間的軸(1300)旋轉因而使這兩個輻射的其中之一直射入芯片。
13.如前述權利要求之一所述的裝置，其特征在于一個光學系統被插入燈和待激發的分子之間，而激光器則發生對分子的直接照明。
14.如前述權利要求所述的裝置，其特征在于所述光學系統包括窄帶激發光濾光器和窄帶發射光濾光器，以及光束分離器。
15.如前述權利要求之一所述的裝置，其特征在于讀出器還包括激發控制單元，激發控制單元與每個激發設備相連從而控制其功能。
16.如前述權利要求所述的裝置，其特征在于所述激發控制單元能夠選擇性地控制采用燈和至少一個激光器同時或連續照明分子，或者是燈和至少一個激光器對分子的獨立激發。
17.一種用于閱讀和分析芯片的裝置，包括·用于接收要鑒別至少一種樣本的芯片的工作臺，·在與其它分子或細胞反應之后，激發芯片的細胞或分子的設備，·閱讀受到激發的分子或細胞的設備，其特征在于該讀出器還包括溫度控制單元。
18.如前述權利要求所述的裝置，其特征在于工作臺包括與所述溫度控制單元相連的溫度傳感器。
19.如前兩個權利要求之一所述的裝置，其特征在于讀出器包括與工作臺相關聯的并且要控制工作臺溫度的加熱/冷卻模塊，所述加熱/冷卻模塊與溫度控制單元相連接。
20.如前三個權利要求所述的裝置，其特征在于讀出器還包括包含微處理器并且與溫度控制單元和閱讀設備相連接的處理設備。
21.如前述權利要求所述的裝置，其特征在于讀出器包括存儲作為溫度的函數的分子對于激發設備的匹配和錯配應答的參考曲線的設備。
22.如前述權利要求所述的裝置，其特征在于存儲設備與用于根據所述參考曲線確定分子的匹配和錯配融合溫度的設備相連接。
23.如前六個權利要求之一所述的裝置，其特征在于溫度控制單元能夠按照“靜態”模式控制讀出器的功能，在“靜態”模式中預先建立的作為溫度函數的分子匹配和錯配應答的參考曲線被用來建立能通過所述溫度控制單元而被傳送的設定溫度，從而控制所述工作臺的溫度。
24.如前七個權利要求之一所述的裝置，其特征在于溫度控制單元能夠按照“動態”模式控制讀出器的功能，在“動態”模式中溫度控制單元控制工作臺上給定的溫度變化，并且，在溫度的這一變化期間·閱讀設備實時收集與芯片上各種位點相關聯的分子對激發設備的激發做出的應答，并將所述應答傳送給處理設備(18)，·針對芯片上每個點，存儲設備存儲作為溫度函數的分子應答的變化。
25.如前述權利要求所述的裝置，其特征在于讀出器包括處理設備，其能在所述應答變化的存儲末端建立針對每個分子的分子診斷狀態。
26.如前述權利要求的裝置，其特征在于所述診斷狀態是匹配/錯配診斷。
27.一種芯片的寡核苷酸雜交的方法，其可以采用根據上述各權利要求之一所要求的讀出器來實現，該方法包括以下步驟·使對應于靶核酸的核酸探針與包含單鏈DNA片段的生物樣本接觸，從而通過形成二倍體實現特定探針與樣本的所述單鏈DNA片段的選擇雜交。·閱讀這樣形成的二倍體，該方法的特征在于該方法包括由自動確定以下溫度構成的步驟·針對每個處于“匹配”構象的靶核酸的融合溫度，以及·針對每個處于“錯配”構象的靶核酸的融合溫度。
28.如前述權利要求所述的方法，其特征在于所述確定在“靜態”模式中采用說明通過閱讀分別對應于匹配和錯配的二倍體所接受的信號中作為溫度函數的變化的參考曲線來實現。
29.如前述權利要求所述的方法，其特征在于該方法包括控制溫度，從而實現在對應于匹配和錯配之間最大差別的溫度進行雜交。
30.如前述權利要求的方法，其特征在于該方法包括在先于閱讀步驟之前的步驟期間產生所述參考曲線。
31.如前述權利要求的方法，其特征在于該方法包括存儲所述參考曲線。
32.如前述五個權利要求之一所述的方法，其特征在于所述確定在“動態”模式中通過控制樣本溫度中給定的變化而實現，并且，在溫度的這個變化中，執行以下步驟·實時收集與通過激發設備激發的芯片上各種位點相關聯的二倍體的應答，·對于每個二倍體，存儲應答中作為溫度函數的變化。
33.如前述權利要求所述的方法，其特征在于該方法包括，對于每個二倍體，在應答中每個變化的存儲末端建立二倍體匹配/錯配的診斷。
全文摘要
本發明涉及用于閱讀和分析芯片的裝置。本發明的裝置包括工作臺(11)，其用于接收要鑒別至少一種樣本的芯片(12)；在芯片分子或細胞與其它分子反應之后激發它們的設備；以及閱讀和分析受激發的分子的設備(14)。本發明的特征在于該裝置還包括用于控制前述工作臺溫度的單元(15)，所述控制單元與由多個沉積在工作臺表面不同相對位點的多個帕爾帖類型加熱/冷卻元件組成的模塊(111)相連；并且至少一個工作臺溫度傳感器(112)也與所述控制單元相連。本發明還涉及相關的方法。
文檔編號G01N21/64GK1754095SQ200380109881
公開日2006年3月29日 申請日期2003年12月23日 優先權日2002年12月23日
發明者F·蘇薩麗娜, E·霍米亞科娃 申請人:愛慕斯塔爾圖像與模擬:戰略、分析與實現公司