專利名稱：急性心肌梗塞早期快速檢測試紙的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實用新型涉及用于基層醫(yī)院和各級醫(yī)院的急診室快速篩選診斷急性心肌梗塞AMI的檢測工具，具體地指一種急性心肌梗塞早期快速檢測試紙。
背景背景急性心肌梗塞AMI是內(nèi)科常見的急危重癥，其發(fā)病后1～6h是溶栓治療和介入手術(shù)治療的黃金時間，而快速診斷發(fā)病6h內(nèi)的早期AMI是決定治療的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。
目前，AMI診斷仍主要依靠持續(xù)心絞痛癥狀、心電圖心肌梗死演變經(jīng)過和血清心肌酶學(xué)動態(tài)改變。然而，在我國約25％的AMI病人無癥狀，約30％的病例無典型心絞痛表現(xiàn)。采用心電圖診斷AMI的準(zhǔn)確性平均約60％，診斷非Q波心肌梗死缺乏特異性，對不穩(wěn)定心絞痛和小范圍AMI難以鑒別，具有確診意義的病理性Q波常在發(fā)病6～8h以后才出現(xiàn)，因而AMI早期心電圖確診率很低。同時，常用的心梗標(biāo)志物CK-MB、肌鈣蛋白T和肌鈣蛋白I對發(fā)病6h以內(nèi)的AMI患者的診斷率也很低。因此，尋找新的AMI早期生化標(biāo)志物意義重大。在AMI檢測方法上，目前國內(nèi)常用的方法為化學(xué)發(fā)光法，該方法需要特定的儀器，成本高、操作復(fù)雜、檢測時間長，不適宜于AMI患者初次就診的基層醫(yī)院和急診室進行快速篩選診斷。因此，醫(yī)學(xué)科技工作者一直在試圖尋找一種簡便快速的檢測工具，以期提高AMI的早期診斷率。
心肌脂肪酸結(jié)合蛋白H-FABP是存在于心肌細胞胞漿內(nèi)的可溶性蛋白，它參與細胞內(nèi)脂肪酸的轉(zhuǎn)運。由于它是低分子細胞漿可溶性蛋白，當(dāng)心肌細胞受損時可快速釋放入血液中，因與其他組織產(chǎn)生的脂肪酸結(jié)合蛋白具有免疫學(xué)區(qū)別而成為AMI特異性標(biāo)志物。國外有學(xué)者用夾心ELISA法測定人血清心肌脂肪酸結(jié)合蛋白，發(fā)現(xiàn)其在AMI患者發(fā)病后3h內(nèi)可檢出，6h左右達高峰，12-24h回復(fù)基線水平，與肌紅蛋白和CK-MB比較，其檢出發(fā)病在3h之內(nèi)和3-6h的AMI的敏感性分別為72.3％和90.4％，均高于肌紅蛋白和CK-MB，可以作為急性心肌梗塞早期診斷的特異性指標(biāo)。目前國內(nèi)的診斷學(xué)教材在急性心梗的早期診斷生化學(xué)指標(biāo)中，已經(jīng)將H-FABP作為診斷指標(biāo)之一列出。
膠體金免疫層析技術(shù)是在酶聯(lián)免疫結(jié)合試驗的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種固相標(biāo)記免疫測定新技術(shù)。它可應(yīng)用于免疫學(xué)檢測的所有方面，主要用于檢測正常體液中不存在的抗原性物質(zhì)以及正常含量極低而在特殊情況下異常升高的物質(zhì)。目前在檢測AMI血清生化標(biāo)志物方面，該技術(shù)主要用于定性檢測cTnI，但其在6h內(nèi)的檢出率較低，并存在一定的假陽性。
發(fā)明內(nèi)容
針對目前基層醫(yī)院和各級醫(yī)院的急診室缺乏快速篩選診斷早期AMI有效手段的局面，本實用新型的目的旨在填補這一空白，其設(shè)計思路是將可用于急性心肌梗塞極早期檢測的生化標(biāo)志物心肌脂肪酸結(jié)合蛋白與成熟的膠體金免疫層析快速診斷技術(shù)結(jié)合起來，從而得到一種新的急性心肌梗塞早期快速檢測試紙，以適用于AMI的早期篩選診斷，從而順應(yīng)臨床早期診斷AMI的迫切要求。
為實現(xiàn)上述目的，本實用新型所提出急性心肌梗塞早期快速檢測試紙，具有一作為固相支架的基片，該基片的一面上依次首尾銜接地設(shè)置有加樣墊、反應(yīng)帶、檢測段和吸水墊。其中位于基片兩端的加樣墊和吸水墊由吸水紙構(gòu)成。緊鄰加樣墊的反應(yīng)帶由吸附有含顯色劑膠體金和心肌脂肪酸結(jié)合蛋白單克隆抗體橋聯(lián)物的玻璃纖維紙構(gòu)成，該橋聯(lián)物可與被測樣品中的心肌脂肪酸結(jié)合蛋白抗原特異性結(jié)合。在反應(yīng)帶和吸水墊之間的檢測段由包被有一條檢測線和一條對照線的硝酸纖維素膜構(gòu)成，檢測線由可結(jié)合反應(yīng)帶中橋聯(lián)物的物質(zhì)線狀點樣在硝酸纖維素膜上形成，對照線由兔抗鼠多克隆抗體線狀點樣在硝酸纖維素膜上形成。
本實用新型的急性心肌梗塞早期快速檢測試紙可采用如下制作方法獲得1)標(biāo)記抗體用膠體金顆粒標(biāo)記心肌脂肪酸結(jié)合蛋白單克隆抗體1形成反應(yīng)帶中的橋聯(lián)物。
2)固定受體將橋聯(lián)物固定到玻璃纖維紙上形成反應(yīng)帶；將可結(jié)合反應(yīng)帶橋聯(lián)物的物質(zhì)和兔抗鼠IgG分別線狀點樣到硝酸纖維素膜上形成包被有檢測線和對照線的檢測段。
3)制作試紙條在基片上依次首尾銜接地粘貼加樣墊(吸水紙)、反應(yīng)帶(玻璃纖維膜)、檢測段(硝酸纖維素膜)、吸水墊(吸水紙)，組裝成復(fù)合大卡，復(fù)合大卡切成4.2mm寬度的試紙條，再裝入試劑盒中即可。
檢測早期急性心肌梗塞時，在該試紙條的加樣墊處滴加液體樣品，液流即向吸水墊處移動。當(dāng)液體經(jīng)過反應(yīng)帶時，吸附在其上的橋聯(lián)物即被溶解，與樣品中的H-FABP抗原發(fā)生反應(yīng)而結(jié)合，并隨液流一起前移至檢測段處，被檢測線中的物質(zhì)捕獲，出現(xiàn)紅色的檢測線。當(dāng)液流前移至對照線時，對照線中的兔抗鼠IgG多克隆抗體可與復(fù)合物中的鼠單抗結(jié)合，從而出現(xiàn)紅色的對照線。未結(jié)合的金標(biāo)抗體繼續(xù)前移至吸水墊處而被吸收。其結(jié)果判定以檢測段出現(xiàn)2條肉眼可見的紅色線為陽性結(jié)果。若檢測線不顯色，而質(zhì)控線為紅色則為陰性。若兩條線均不顯色則為試紙條失效。
本實用新型的優(yōu)點在于使用該試紙檢測簡便、快速、單份測定，不需任何儀器設(shè)備，僅用肉眼即可觀察結(jié)果，檢測全過程僅需數(shù)分鐘，敏感度與需數(shù)小時完成的ELISA法相仿。其原因在于ELISA法樣品中的待檢抗原需緩慢地擴散才能與吸附于固相表面的抗體反應(yīng)，而在膠體金免疫層析試紙條中，待檢液體層層滲濾時抗原抗體緊密接觸形成免疫濃縮，從而提高了反應(yīng)效率。并且該試紙具有單一試劑、一步操作、全部試劑可在室溫長期保存的特點。為確診發(fā)病6h內(nèi)的早期心肌梗塞提供了快速、方便、價廉、實用的檢測工具，可望在將來廣泛應(yīng)用于臨床，尤其是基層醫(yī)院、急診室等，也可用于病人的自我監(jiān)測，提高早期AMI診斷準(zhǔn)確率，進而提高AMI的搶救成功率。
圖1為一種急性心肌梗塞早期快速檢測試紙的主視結(jié)構(gòu)示意圖；圖2為圖1的剖視結(jié)構(gòu)示意圖；圖3為該試紙實際檢測后，顯示陽性結(jié)果、陰性結(jié)果和試劑失效的示意圖。
具體實施方式
以下結(jié)合附圖和具體實施例對本實用新型作進一步的詳細描述圖中所示的急性心肌梗塞早期快速檢測試紙，具有一作為固相支架的塑料基片7，塑料基片7的一面上依次首尾銜接地粘接有加樣墊1、反應(yīng)帶2、檢測段3和吸水墊6。加樣墊1和吸水墊6由吸水紙構(gòu)成。反應(yīng)帶2由吸附有含顯色劑膠體金和心肌脂肪酸結(jié)合蛋白單克隆抗體橋聯(lián)物的玻璃纖維紙構(gòu)成。檢測段3由包被有一條檢測線4和一條對照線5的硝酸纖維素膜構(gòu)成，檢測線4由可結(jié)合反應(yīng)帶2中橋聯(lián)物的物質(zhì)線狀點樣在硝酸纖維素膜上形成，對照線5由兔抗鼠多克隆抗體線狀點樣在硝酸纖維素膜上形成。檢測線4的陽性閾值設(shè)定為被測樣品中的心肌脂肪酸結(jié)合蛋白抗原濃度大于或者等于16.8ng/ml，這是因為通過臨床試驗發(fā)現(xiàn)H-FABP用于急性心肌梗塞早期篩選診斷時，其檢測值以16.8ng/ml為最佳，當(dāng)血液中的HFABP抗原濃度大于或等于16.8ng/ml時，檢測結(jié)果為陽性，否則為陰性。
實施例1當(dāng)上述反應(yīng)帶2是依次吸附有膠體金標(biāo)記的心肌脂肪酸結(jié)合蛋白單克隆抗體1、生物素標(biāo)記的心肌脂肪酸結(jié)合蛋白單克隆抗體2的玻璃纖維紙時，對應(yīng)的檢測段3上的檢測線4則由鏈霉親合素線狀點樣在硝酸纖維素膜上形成。其具體的制作方式如下1)標(biāo)記抗體用膠體金顆粒標(biāo)記H-FABP單克隆抗體1；用生物素標(biāo)記H-FABP單克隆抗體2。
2)固定受體將膠體金標(biāo)記的H-FABP單克隆抗體1和生物素標(biāo)記的H-FABP單克隆抗體2分別固定到玻璃纖維紙上形成反應(yīng)帶2；將鏈霉親合素和兔抗鼠IgG分別線狀點樣到硝酸纖維素膜上形成檢測段3上的檢測線4和對照線5。
3)制作試紙條在塑料基片7上依次粘貼加樣墊1、反應(yīng)帶2、檢測段3、吸水墊6。以上各部分首尾銜接，組裝成復(fù)合大卡。復(fù)合大卡切成4.2mm寬度的試紙條，再組裝成試劑盒。
進行檢測時，在加樣墊1處滴加全血或血漿或血清標(biāo)本，液流即向吸水墊6處移動。當(dāng)液流經(jīng)過反應(yīng)帶2時，金標(biāo)H-FABP單克隆抗體1和生物素標(biāo)記H-FABP單克隆抗體2即被溶解，并與標(biāo)本中的H-FABP抗原形成金標(biāo)單克隆抗體1、HFABP抗原、生物素標(biāo)記單克隆抗體2復(fù)合物，并隨液流一起前移至檢測段3上的檢測線4處，帶有金標(biāo)記的復(fù)合物中的生物素被檢測線4上的鏈霉親合素捕獲，出現(xiàn)紅色的檢測線。當(dāng)液流繼續(xù)前移至對照線5時，對照線5中的兔抗鼠IgG多克隆抗體可與復(fù)合物中的鼠單抗結(jié)合從而出現(xiàn)紅色的對照線。未結(jié)合的金標(biāo)抗體繼續(xù)前移至吸水墊6處被吸收。
結(jié)果判定以檢測段3出現(xiàn)2條肉眼可見的紅色線為陽性結(jié)果；若檢測線不顯色，而對照線為紅色則為陰性；若兩條線均不顯色則為試紙條失效。
實施例2當(dāng)上述反應(yīng)帶2是吸附有膠體金標(biāo)記的心肌脂肪酸結(jié)合蛋白單克隆抗體1的玻璃纖維紙時，對應(yīng)的檢測段3上的檢測線4由心肌脂肪酸結(jié)合蛋白單克隆抗體2線狀點樣在硝酸纖維素膜上形成。其具體的制作方式如下1)標(biāo)記抗體用膠體金顆粒標(biāo)記H-FABP單克隆抗體1。
2)固定受體將金標(biāo)H-FABP單克隆抗體1固定到玻璃纖維紙上形成反應(yīng)帶2；將H-FABP單克隆抗體2和兔抗鼠IgG分別線狀點樣到硝酸纖維素膜上形成檢測段3上的檢測線4和對照線5。
3)制作試紙條在塑料基片7上依次粘貼加樣墊1、反應(yīng)帶2、檢測段3、吸水墊6。以上各部分首尾銜接，組裝成復(fù)合大卡。復(fù)合大卡切成4.2mm寬度的試紙條，再組裝成試劑盒。
進行檢測時，在加樣墊1處滴加全血或血漿或血清標(biāo)本，液流即向吸水墊6處移動。當(dāng)液流經(jīng)過反應(yīng)帶2時，金標(biāo)H-FABP單克隆抗體1即被溶解，并與標(biāo)本中的H-FABP抗原形成金標(biāo)單克隆抗體1、HFABP抗原復(fù)合物，并隨液流一起前移至檢測段3上的檢測線4處，帶有金標(biāo)記的復(fù)合物中的H-FABP抗原被檢測線4上的H-FABP單克隆抗體2捕獲，出現(xiàn)紅色的檢測線。當(dāng)液流繼續(xù)前移至對照線5時，對照線5中的兔抗鼠IgG多克隆抗體可與復(fù)合物中的鼠單抗結(jié)合從而出現(xiàn)紅色的對照線。未結(jié)合的金標(biāo)抗體繼續(xù)前移至吸水墊6處而被吸收。
結(jié)果判定以檢測段3出現(xiàn)2條肉眼可見的紅色線為陽性結(jié)果；若檢測線不顯色，而對照線為紅色則為陰性；若兩條線均不顯色則為試紙條失效。
當(dāng)檢測結(jié)果為陽性時，支持急性心肌梗塞的診斷，但確切診斷需結(jié)合臨床。其陽性結(jié)果可幫助醫(yī)生高度警惕急性心肌梗塞的發(fā)生和發(fā)展，通過嚴密檢測和及時處理來挽救病人生命。
從華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院對本急性心肌梗塞早期快速檢測試紙進行的初步實驗觀察顯示，該試紙對于早期AMI檢測的敏感性和特異性較高。其檢測結(jié)果如下早期急性心肌梗塞病人18例，陽性16例，其余2例陰性為極早期(2小時左右)；穩(wěn)定性心絞痛病人22例，弱陽性1例，余者均為陰性；不穩(wěn)定性心絞痛病人16例，弱陽性2例，余者均為陰性；非心源性胸痛病人15例，陽性2例(1例為皮肌炎病人，1例為外傷病人)。
權(quán)利要求1.一種急性心肌梗塞早期快速檢測試紙，包括作為固相支架的基片(7)，其特征在于基片(7)的一面上依次首尾銜接地設(shè)置有加樣墊(1)、反應(yīng)帶(2)、檢測段(3)和吸水墊(6)，其中位于基片兩端的加樣墊(1)和吸水墊(6)由吸水紙構(gòu)成；緊鄰加樣墊(1)的反應(yīng)帶(2)由吸附有含顯色劑膠體金和心肌脂肪酸結(jié)合蛋白單克隆抗體橋聯(lián)物的玻璃纖維紙構(gòu)成，該橋聯(lián)物可與被測樣品中的心肌脂肪酸結(jié)合蛋白抗原特異性結(jié)合；在反應(yīng)帶(2)和吸水墊(6)之間的檢測段(3)由包被有一條檢測線(4)和一條對照線(5)的硝酸纖維素膜構(gòu)成，檢測線(4)由可結(jié)合反應(yīng)帶(2)中橋聯(lián)物的物質(zhì)線狀點樣在硝酸纖維素膜上形成，對照線(5)由兔抗鼠多克隆抗體線狀點樣在硝酸纖維素膜上形成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的急性心肌梗塞早期快速檢測試紙，其特征在于所說的反應(yīng)帶(2)是依次吸附有膠體金標(biāo)記的心肌脂肪酸結(jié)合蛋白單克隆抗體1、生物素標(biāo)記的心肌脂肪酸結(jié)合蛋白單克隆抗體2的玻璃纖維紙，所說的檢測段(3)上的檢測線(4)是由鏈霉親合素線狀點樣在硝酸纖維素膜上形成的。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的急性心肌梗塞早期快速檢測試紙，其特征在于所說的反應(yīng)帶(2)是吸附有膠體金標(biāo)記的心肌脂肪酸結(jié)合蛋白單克隆抗體1的玻璃纖維紙，所說的檢測段(3)上的檢測線(4)是由心肌脂肪酸結(jié)合蛋白單克隆抗體2線狀點樣在硝酸纖維素膜上形成的。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的急性心肌梗塞早期快速檢測試紙，其特征在于所說的檢測段(3)上的檢測線(4)的陽性閾值設(shè)定為被測樣品中的心肌脂肪酸結(jié)合蛋白抗原濃度大于或者等于16.8ng/ml。
專利摘要一種急性心肌梗塞早期快速診斷試紙，具有一基片，基片上依次首尾銜接設(shè)置有加樣墊、反應(yīng)帶、檢測段和吸水墊。其加樣墊和吸水墊由吸水紙構(gòu)成。反應(yīng)帶由吸附有含顯色劑膠體金和心肌脂肪酸結(jié)合蛋白單克隆抗體橋聯(lián)物的玻璃纖維紙構(gòu)成，該橋聯(lián)物可與被測樣品中的心肌脂肪酸結(jié)合蛋白抗原特異性結(jié)合。檢測段由包被有檢測線和對照線的硝酸纖維素膜構(gòu)成，檢測線由可結(jié)合反應(yīng)帶中橋聯(lián)物的物質(zhì)線狀點樣在硝酸纖維素膜上形成，對照線由兔抗鼠多克隆抗體線狀點樣在硝酸纖維素膜上形成。該試紙通過定性快速檢測急性心肌梗塞早期患者血液中的HFABP抗原，對其進行篩選診斷，具有敏感性高、特異性強、操作簡便、反應(yīng)快速、經(jīng)濟適用等特點。特別適于基層醫(yī)院急診室。
文檔編號G01N33/558GK2676202SQ20032012545
公開日2005年2月2日 申請日期2003年12月18日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月18日
發(fā)明者陳莉莉, 郭小梅, 馬業(yè)新 申請人:華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院