人體心肌肌鈣蛋白Ⅰ的快速測定的方法

專利名稱：人體心肌肌鈣蛋白Ⅰ的快速測定的方法
技術領域：
本發明涉及一種親和層析法純化人體心肌肌鈣蛋白I的方法和制備該心肌肌鈣蛋白I的單克隆抗體的方法以及一步法測定其含量的方法。
背景技術：
心肌缺血性損傷，特別是急性心肌梗死(AMI)是威脅人類生命的主要疾病之一。臨床上一直在努力尋找特異性好、靈敏度高的血清指標，以對其進行診斷。目前，肌酸激酶同工酸(CK-MB)已用作診斷心肌梗死的重要指標，但CK-MB并非心臟特有，正常人的骨骼肌中也少量存在，橫紋肌源性疾病則更多，非心臟手術或骨骼肌損傷病人常有CK-MB增高，易造成AMI診斷假陽性。近年來的研究表明，心肌肌鈣蛋白I(cardiac troponin I，cTnI)具有高度的心肌特異性，當心肌細胞受損時，血液中cTnI出現時間早，持續時間長，與心肌損傷程度及預后密切相關。它可作為心肌損傷的一種特異性指標，對心臟病的診斷有十分重要的意義。
因此，對人體心肌肌鈣蛋白I進行純化并尋找其相應的抗體，用于對心臟病人的診斷以成為當今心臟病診斷研究的前沿學科。1999年歐洲和世界臨床化學協會(IFCC)已經提出將心肌肌鈣蛋白I(cTnI)作為診斷AMI的指標。
目前，對心肌肌鈣蛋白I的提取大多采用動物提取，尚沒見利用人體心肌提取的報道，如Bodor GS(Bodor GS，Porter S，Landt Y，et al.The development of monoclonal antibodies and an assay for cardiactroponin I with preliminary results in suspected myocardialinfarction.Chin Chem，1992；382203-2214)、Thulin E(Thulin E，VogelHJ.Purification of rabbit skeletal muscle troponin C.Clin Chem Acta，1988；211-215)、Syska H(Syska H，Perry SV，Trayer.A new method ofpreparation of troponin I using affinity chromatography.FEBS Letters，1974；40253-257)、Pharmacia LKB Biotechnology Ltd Co(Affinitychromatography principle and methods.1988，p15，Sweden)等的文獻對提取心肌肌鈣蛋白I都有報道。但其利用動物提取，主要缺點是同源性差，用于培育產生心肌肌鈣蛋白I的單克隆抗體，其特異性較差，敏感性較差。用于對心臟病的診斷準確率仍有待提高。
目前，用心肌肌鈣蛋白I制備其抗體，大多用動物心肌組織提取心肌肌鈣蛋白I制備其單抗或多抗抗體。Cummins等(Cummins P，Young A，Auckand ML，et al.Comparison of serum cardiac specifictoponin I with creatine kinase，creatine kinase MB isoenzyme，tropomyosin，myoglobin and C reactive protein release in marathonrunnerscardiac or skeletal muscle trauma？Eur J Clin Invest，1987；17317)于1987年首先用心肌肌鈣蛋白I給兔和羊注射后，培育和制備了心肌肌鈣蛋白I的多克隆抗體，并以核素碘標記。建立了放射免疫法對心肌肌鈣蛋白I的定量測量。采用動物制備單克隆抗體，用于檢測人體心肌肌鈣蛋白I的含量，主要存在抗體同源性差，特異性、敏感性較差的缺陷，還不能使心臟病診斷的準確率進一步提高。
目前，對于心臟疾病的患者的心肌肌鈣蛋白I的含量檢測，有定性、半定性和定量三種方法。由于單克隆抗體的來源不同，參照值不完全一致。測定原理主要以各種免疫酶檢測法與放射免疫檢測為主。國外主要通過免疫酶檢測法，利用自動化分析儀來完成(如Status、Access等自動化分析儀)，可在1小時內出結果，但需要購買涂有抗體的醋纖膜等配套試劑，且該類試劑價格昂貴。也有采用ELISA雙夾心定量法檢測的，但該法一般用手工系統操作，需較長時間，不利于對疾病患者爭取寶貴的診斷治療時間。

發明內容
本發明的目的是提供一種利用親和層析法純化人體心肌肌鈣蛋白I的方法，以及利用該心肌肌鈣蛋白I制備其單克隆抗體的方法。同時提供一種利用由該方法獲得的心肌肌鈣蛋白I及單克隆抗體建立一步法快速測定心臟病患者心肌肌鈣蛋白I含量的方法。
本發明的目的是通過如下技術解決方案實現的(一)依據本發明，人體心肌肌鈣蛋白I的純化方法如下(1)取人體新鮮或速凍冷藏的心肌組織，去脂肪及纖維，經勻漿、離心、沉淀、抽提、高鹽溶解等步驟處理后，在層析介質為CMSephadex-C50、Cellulose-DE52，緩沖體系為Tris-HCl，pH值為7.2～7.8，尿素含量為6～8mol/L條件下依次進行層析，分別收集含心肌肌鈣蛋白C(cTnC)和心肌肌鈣蛋白I(cTnI)的蛋白峰；
(2)取上述步驟(1)所得心肌肌鈣蛋白C，在耦聯溶液為0.1～0.3mol/L NaHCO3，pH值為7.8～8.5，3～6mmol/L CaCl2，平衡緩沖液為45～55mmol/L Tris-HCl，8～10mol/L尿素，0.8～1.2mmol/LCaCl2，12～18mmol/L β巰基乙醇，pH值為7.8～8.2的條件下與Sepharose 4B親和層析柱相耦聯，制備成Sepharose 4B親和層析柱；(3)取上述步驟(1)經CM Sephadex-C50層析后的粗提品的心肌肌鈣蛋白I峰收集液，再加入步驟(2)所得Sepharose 4B親和層析柱進行親和層析，即得純化的心肌肌鈣蛋白I。
(二)依據本發明，人體心肌肌鈣蛋白I的單克隆抗體制備方法如下(1)取前述(一)所制得心肌肌鈣蛋白I，多次注入BALB/c小鼠腹腔免疫小鼠，間隔時間為2～3周，至小鼠血清抗心肌肌鈣蛋白I抗體滴度大于1∶2000，取小鼠脾細胞和SP2/0骨髓瘤細胞；(2)上述步驟(1)的二種細胞混勻，加入DMEM無血清培養液處理，再加入含15～20％胎牛血清的HAT培養液，置培養箱培養，進行細胞融合；(3)取上述步驟(2)的培養液上清，用ELISA法檢測培養液中的雜交瘤細胞，即心肌肌鈣蛋白I的特異性抗體；(4)上述步驟(3)檢測出的雜交瘤細胞采用有限稀釋法培養，制得增殖的同源性細胞克隆，即單克隆細胞株；(5)將上述步驟(4)制得的單克隆細胞株，與標準單克隆抗體2B1.9、2F6.6進行對照，采用Western blot及ELISA法測定，檢測出抗心肌肌鈣蛋白I捕捉單克隆抗體IgG1(聯有辣根過氧化物酶的單克隆抗體)和抗心肌肌鈣蛋白I標記生物素抗體IgG2b(聯有生物素的單克隆抗體)，上述二單克隆抗體即為本方法所得的具有高特異性、高敏感性的心肌肌鈣蛋白I的單克隆抗體。
(三)依據本發明，人體心肌肌鈣蛋白I的一步法快速測定方法如下(1)用50～150mmol/L，pH值為9.4～9.6的碳酸氫鹽緩沖液、鏈親和素包被96孔聚苯乙烯酶聯板；(2)取待測樣品和標準品，分別與聯有生物素的抗心肌肌鈣蛋白I的單克隆抗體和聯有辣根過氧化物酶的抗心肌肌鈣蛋白I的單克隆抗體相接觸后，分別加入上述酶聯板包被孔中；(3)將步驟(2)之酶聯板進行孵育；(4)取孵育后的酶聯板，在其包被孔中分別加入底物過氧化氫與2，2’-連氧-雙-3-乙基苯噻唑林-6-磺酸鹽進行酶促顯色；(5)讀取上述步驟(4)酶促顯色后波長405nm時的吸光度，將待測樣品與標準品進行對照，計算出待測樣品中的心肌肌鈣蛋白I的含量。
本發明的優點是利用人體心肌組織來提純心肌肌鈣蛋白I，所得心肌肌鈣蛋白I用于培育制備其相應的單克隆抗體，具有所得抗體的同源性好，特異性和敏感性高的優點，用于檢測心臟病患者的心肌肌鈣蛋白I的含量準確性高，可使對心臟病的診斷準確率進一步提高。而且用本發明培育心肌肌鈣蛋白I的單克隆抗體可以大量制備，成功率高，適應工業化生產。采用本發明制備心肌肌鈣蛋白I的單克隆抗體可以取代進口，大大降低進口的昂貴費用，節約成本。此外采用本發明的測定心肌肌鈣蛋白I的方法，操作十分簡單，且測定時間快，一般為30分鐘出結果，便于推廣應用。一方面可為病人節約寶貴的診斷時間，另一方面，本發明的測定方法無需購買昂貴的自動化設備，不需采用價格昂貴的進口試劑，大大降低了檢測成本，減輕了病人的費用負擔。
具體實施例方式
下面結合實施例對本發明上述方法作進一步詳細說明(一)本發明對人體心肌肌鈣蛋白I的純化方法1.人體心肌肌鈣蛋白C(cTnC)的純化(1)取100g新鮮或液氮速凍后-75℃貯存的人心室肌組織，去除脂肪及纖維并剪碎，加入3～5倍體積的勻漿緩沖液(Tris-HCl50mmol/L，KCl 50mmol/L，EDTA 1mmol/L，pH7.5)充分勻漿，離心30分鐘，去上清，取沉淀，重復上述步驟10次；每次均需充分勻漿。取沉淀用乙醇和乙醚抽提2次以上，抽干成干粉狀。干粉用緩沖液1mol/L KCl溶解12～24小時，10000g離心30分鐘，去沉淀，取上清；(2)述上清用40～60％(NH4)2SO4沉淀。用50ml CMSephadex-C50層析柱平衡緩沖液溶解，并置此緩沖液中透析3次，10000g離心30分鐘，去沉淀，取上清；(3)用平衡好的CM Sephadex-C50裝柱(2.5×30cm)，平衡緩沖液平衡5個柱體積，將上述(2)之上清上樣(上樣蛋白量一般為200-400mg)，平衡緩沖液平衡5個柱體積后，用NaCl 0～0.5mol/L梯度洗脫，自動收集器收集，每管6mL，速度0.4mL/min；(4)收集CM Sephadex-C50層析柱NaCl梯度洗脫第一蛋白峰，平衡液透析后再經Cellulose-DE52層析柱NaCl 0～0.3mol/L梯度洗脫，后面一蛋白高峰即為cTnC；2.親和層析法純化人心肌肌鈣蛋白I(1)制備cTnC Sepharose 4B親和層析柱取50mg人cTnC(濃縮后終體積為20mL)，置偶聯溶液(0.1mol/L NaHCO3，pH8.3，5mmol/L CaCl2)中透析3次。取7.5g溴化氰活化的Sepharose 4B凝膠干粉，用1mol/L HCl 1500mL在15分鐘內洗滌并抽干，再用上述偶聯溶液洗滌并抽干后，與20mL cTnC混勻在4℃下緩慢搖動20小時。取出后反復用前述偶聯溶液洗滌至流出液A280值為零后抽干。懸浮于0.1mol/L，pH8.0的Tris-HCl緩沖液中，并在4℃下緩慢搖動12小時。取出抽干后，分別用5個柱體積的0.1mol/L乙酸鹽緩沖液(pH4.0，含0.5mol/L NaCl)和0.1mol/L Tris-HCl緩沖液(pH8.0，含0.5mol/L NaCl)洗3輪。再用平衡緩沖液(50mmol/L Tris-HCl，9mol/L尿素，1mmol/L CaCl2，15mmol/L β-巰基乙醇，pH8.0)洗滌，并裝柱(1.2×15cm)平衡備用；(2)親和層析法純化人cTnI取步驟1(1)之上清，置步驟2(1)所述偶聯溶液中透析3次，上cTnC Sepharose 4B層析柱。用50倍柱體積的平衡緩沖液洗去雜蛋白，再用洗脫緩沖液(50mmol/LTris-HCl，9mol/L尿素，10mmol/L EGTA，15mmol/L β-巰基乙醇，pH8.0)洗脫，自動收集器收集，每管2mL，速度0.1mL/min。收集所得即為純化的心肌肌鈣蛋白I；3.cTnI活性測定與蛋白定量用雙抗ELISA夾心法測定cTnI活性，考馬斯亮蘭法測定收集管蛋白含量，SDS-PAGE電泳測定cTnI分子量。
(二)心肌肌鈣蛋白I單克隆抗體的制備1.免疫動物取8～12周齡與骨髓瘤細胞同種系的BALB/c小鼠，以含蛋白質100μg/只的cTnI抗原與等量福氏完全佐劑充分混勻，注入小鼠腹腔內，每隔2周100μg/只的cTnI抗原與等量福氏不完全佐劑充分混勻，多次注入小鼠腹腔內加強免疫。經檢測小鼠血清(間接ELISA法)，滴度在1∶2000以上者可用于融合，融合前3天經小鼠腹腔內再次加強免疫，劑量為50μg/只；2.細胞融合(1)取40mL HAT培養液，15mL DMEM無血清培養液和1mL50％PEG(M12000)分別置于37℃水浴中預溫；(2)分別取上述免疫的BALB/c小鼠SP2/0骨髓瘤細胞(2-5×107)、脾細胞(108)懸液加入50mL離心管中混勻，并加DMEM無血清培養液至40mL。離心10分鐘，倒盡上清液，混勻成糊狀；(3)將離心管置于37℃預溫的盛水燒杯中，取0.7mL預溫的50％PEG溶液，1分鐘內加完，靜置90秒鐘。立即滴加37℃15mL預溫的無血清培養液，使PEG稀釋而停止作用。滴加方法是前30秒加1mL；后30秒加3mL；然后在1分鐘內加完；(4)補加DMEM無血清培養液至40mL，離心10分鐘，倒盡上清液。加40mL含15％～20％胎牛血清的HAT培養液。用吸管輕輕混勻，滴加到已含有飼養細胞的4塊96孔細胞培養板的小孔中，每孔2滴，置37℃、7％CO2的培養箱中培養；3.雜交瘤細胞的選擇培養免疫小鼠脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞，經PEG處理后，形成多種細胞成分的混合體，其中包括未融合的骨髓瘤細胞和免疫脾細胞；骨髓瘤細胞的共核體和免疫脾細胞的共核體，以及骨髓瘤細胞和免疫脾細胞的導核體。僅后者才能形成雜交瘤細胞。為此，在這多種細胞混合體中必須除去未融合的細胞和同種融合的共核體，并選擇出真正的雜交細胞。因此，在細胞融合后第1，3，5，7天用前述的HAT培養液換液培養；4.特異性抗體的檢測及雜交瘤細胞克隆化吸取每個培養孔的上清液，用間接ELISA法檢測出培養液中含cTnI的特異性抗體的培養孔。采用有限稀釋法使雜交瘤細胞克隆化。經過培養后單個細胞可增殖為同源性細胞克隆；5.雜交瘤細胞的凍存雜交瘤細胞一經建立應盡快凍存，保存雜交瘤細胞不致因傳代污染或因變異而丟失。必須在得到分泌特異性抗體的雜交瘤細胞后的早期即保存幾批細胞于液氮中。用于細胞融合的骨髓瘤細胞株也用同法保存，以取得穩定可靠的親本細胞來源。
取生長旺盛，形態良好的cTnI克隆化細胞制成細胞懸液，離心5分鐘，去上清液，加4℃凍存液(9份完全培養液加1份二甲基亞砜DMSO)，最終使細胞密度為3-5×106細胞/mL，以1mL細胞懸液分裝于2mL凍存管凍存或液氮內長期保存；6.單克隆抗體的大量制備在接種雜交瘤細胞前，先給BALB/c小鼠腹腔注射0.5mL降植烷(pristane)或液體石蠟，然后每只小鼠腹腔注射5×105-106個雜交瘤細胞。接種雜交瘤細胞至7-10日后，取其腹水，離心10分鐘，吸取上清液，加入0.02％疊氮鈉，分裝保存于-70℃；7.單克隆抗體的純化單克隆抗體在高pH環境下能和蛋白A結合，且在低pH環境下能從蛋白A上洗脫，操作步驟如下(1)取5mL Protein A-Sepharose(Repligen，Cat.No.IPA-300)加柱。50mL結合緩沖液流洗；(2)取10～15mL腹水與等量PBS緩沖液(磷酸鹽100mmol/L，pH7.4)混勻加柱。雜交瘤細胞上清液用NaOH調至pH9.0后加柱。50mL結合緩沖液流洗；(3)洗脫緩沖液洗脫，每管收集1mL與等量的0.1mol/L Tris，pH9.0混勻；(4)A280比色。收集高峰管合并，PBS溶液內透析，4℃貯藏；8.高特異性、高敏感性cTnI單克隆抗體的篩選經上述過程，最終共獲得16株單克隆抗體株。用ELISA雙抗夾心法替代檢測，選擇出兩株單克隆抗體株。命名為JS09(即聯有生物素的抗cTnI單克隆抗體)和JS05(即聯有辣根過氧化酶的抗cTnI單克隆抗體)，與國外兩株抗cTnI單克隆抗體2B1.9，2F6.6(此兩株抗體是目前唯一經美國FDA批準且應用最廣泛的一對單抗)對比。取少量新鮮勻漿后的人心肌、骨骼肌與平滑肌標本、純化的cTnI、cTnT(肌鈣蛋白T)與cTnC，通過Western Blot法與ELISA雙抗夾心法測定其與JS09、JS05單克隆抗體株的特異結合，發現JS09、JS05單克隆抗體僅與人心肌組織的cTnI結合，而與骨骼肌、平滑肌、cTnC及cTnT無交叉反應。JS09與JS05二株單克隆抗體的亞型經免疫競爭法檢測，分別為IgG1與IgG2b。
(三)人體心肌肌鈣蛋白I的一步法快速測定1.檢測試劑盒組成(1)鏈親和素預包被的96孔酶聯板，其準備過程為a.鏈親和素10μg/mL溶解于碳酸氫鹽緩沖液(100mmol/L，pH9.5)，每孔100μL，包被96孔聚苯乙酶聯板，4℃，18小時。
b.傾去包被液，以1％BSA封閉，37℃，30min，或4℃，12小時。
c.傾去封閉液，清洗液(含Tween 0.04％)清洗2次，保鮮膜密封于4℃待用或-20℃貯存備用。
(2)cTnI標準品5份，含量分別為1，2，4，8，16μg/L。
(3)陽性與陰性質控血清各1份。
(4)聯有生物素的心肌肌鈣蛋白I單克隆抗體(JS09-生物素)與聯有辣根過氧化酶的心肌肌鈣蛋白I單克隆抗體(JS05-PODs)各一份。
(5)抗體與樣品稀釋緩沖液PBS(磷酸鹽40mmol/L，pH7.2，NaCl 150mmol/L)1份。
(6)清洗緩沖液(Tween 0.04％，NaCl 150mmol/L)1份。
(7)底物過氧化氫(H2O2)與2，2’-連氧-雙-3-乙基苯噻唑林-6-磺酸鹽(ABTS)各1份。
(8)底物稀釋緩沖液檸檬酸磷酸鹽緩沖液(100mmol/L，pH4.2)1份。
2.檢測操作過程(1)取cTnI標準品(1，2，4，8，16μg/L)或待測樣品、質控血清50μL/mL，取聯有生物素的心肌肌鈣蛋白I單克隆抗體(JS09-生物素)及另一聯有辣根過氧化酶的心肌肌鈣蛋白I單克隆抗體(JS05-PODs)共50μL，混勻加入酶聯板孵育，37℃，30min，稀釋緩沖液為PBS。
(2)清洗液清洗3次，加入底物過氧化氫(H2O2)與2，2’-連氧-雙-3-乙基苯噻唑林-6-磺酸鹽(ABTS)100μL，稀釋緩沖液為檸檬酸磷酸鹽緩沖液，37℃，15min。
(3)通過讀取波長405nm時的吸光度，以標準品為對照計算待測樣品中所含心肌肌鈣蛋白I的量。
3.檢測中的相關參數(1)鏈親和素包被濃度6μg/mL時反應達平臺期，取鏈親和素10μg/mL為固定包被濃度，結果穩定。包被時間在4℃18小時達最大量。包被緩沖液pH9.5時最穩定。保鮮膜密封4℃貯存1月與-20℃貯存6月測定結果無統計差異。
(2)cTnI標準品含量分別為1，2，4，8，16μg/L時，直線相關系數γ＝0.994。
(3)JS09、JS05反應濃度分別為1μg/mL與2μg/mL時敏感性高且結果穩定。抗體與樣品稀釋緩沖液PBS pH7.2時反應最佳。
(4)底物過氧化氫(H2O2)濃度范圍為0.01-0.03％，2，2’-連氧-雙-3-乙基苯噻唑林-6-磺酸鹽(ABTS)濃度為1.9mmol/L時本底低，且敏感性高。底物稀釋緩沖液pH4.0-4.4為最佳。顯色時間37℃ 15min時本底低，反應接近平臺期。
(5)cTnI標準品或待測樣品、質控血清，與JS09、JS05混勻孵育37℃，30min時達平臺期。
(6)組間差異為8％，批間差異為6％。
(7)100例正常人血清cTnI參照值為1.5μg/L。
權利要求
1.人體心肌肌鈣蛋白I的快速測定的方法，其特征在于包含如下步驟(1)用50～150mmoL/L，pH值為9.4～9.6的碳酸氫鹽緩沖液、鏈親和素包被96孔聚苯乙烯酶聯板；(2)取待測樣品和標準品，分別與聯有生物素的抗心肌肌鈣蛋白I的單克隆抗體和聯有辣根過氧化物酶的抗心肌肌鈣蛋白I的單克隆抗體相接觸后，分別加入上述酶聯板包被孔中；(3)將步驟(2)之酶聯板進行孵育；(4)取孵育后的酶聯板，在其包被孔中分別加入底物過氧化氫與2，2’-連氧-雙-3-乙基苯噻唑林-6-磺酸鹽進行酶促顯色；(5)讀取上述步驟(4)酶促顯色后波長405nm時的吸光度，將待測樣品與標準品進行對照，計算出待測樣品中的心肌肌鈣蛋白I的含量。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于純化的心肌肌鈣蛋白C，I來源于新鮮或液氮速凍后-75℃貯存的人心肌組織。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于抗cTnI單克隆抗體來源于BALB/c小鼠與SP2/0小鼠骨髓瘤細胞的融合細胞。
4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所用的抗cTnI單克隆抗體是聯有生物素的抗cTnI單克隆抗體和聯有辣根過氧化物酶的抗cTnI單克隆抗體，該二抗cTnI單克隆抗體分別為IgG1與IgG2b亞型。
5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于聯有生物素的抗cTnI單克隆抗體和聯有辣根過氧化物酶的抗cTnI單克隆抗體是來源于小鼠。
6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于待測樣品與標準品在pH6.5-7.5，優選pH7.2的磷酸鹽緩沖液，與聯有生物素的抗cTnI單克隆抗體和聯有辣根過氧化物酶的抗cTnI單克隆抗體相接觸。
7.根據權利要求1所述的方法，其特征在于顯色之前所使用的洗滌液pH值介于6.8-8之間，溫度在2-37℃，優選低于10℃。
全文摘要
本發明公開了人體心肌肌鈣蛋白I的純化和其單克隆抗體的制備方法以及一步法測定其含量的方法。其特點是采用親和層析法純化人體心肌肌鈣蛋白I，利用該純化的心肌肌鈣蛋白I與BALB/c小鼠免疫制備該心肌肌鈣蛋白I的單克隆抗體，并建立了一步法測定心肌肌鈣蛋白I含量的方法。其優點是所得抗體的同源性好，特異性和敏感性高。其檢測方法操作簡單，成本低。可廣泛用于心臟病的檢查。
文檔編號G01N33/577GK1525172SQ20031011933
公開日2004年9月1日 申請日期2000年3月21日 優先權日2000年3月21日
發明者張寄南, 蘇恩本 申請人:上海潤東生物科技有限公司