專利名稱：用于構筑生物分子微觀排列的與基質結合的連接分子的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物分子排列，更具體地說，本發明涉及可用于利用有效的、高產率的技術制造生物分子排列的一系列可光活化的表面結合的連接分子。
背景技術：
公開在例如E.S.Lander，Nature Genetic Supplement 1999，21，3中的核苷酸微觀排列(所謂的“DNA芯片”)，和公開在例如G.Macbeth，et al.，Science 2001，289，1760中的與基質結合的蛋白質排列的制造和使用，在人類基因組第一次草圖在最近公布(參見，例如Science 2001，291，1145-1134)后就成為人們非常感興趣的領域。低聚核苷酸和cDNA的微觀排列可以利用多種技術來制造，包括機器人定位(robot spotting)和噴墨印刷，對于低聚核苷酸，可以原位平版印刷合成。這些現有技術中的有些方法還可以用于制造芯片。
上述所有現有技術方法都依賴于通過物理沉積或光描繪方法，以一定圖案的方式在某些類固體載體上共價結合核酸或多肽。盡管這些不同的“第一代”方法被用于制造用于科研目的的少量微觀排列，但是這些診斷設備的大規模實施將需要大量、有效的制造方法，所述制造方法優選既能夠制造DNA排列又能制造蛋白質排列。
G.Wallraff，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.1996，93，13555中描述了一種基于用在化學增強的抗蝕劑(chemically amplified resists)中的光致酸(photoacid)化學過程的、平版印刷制造低聚核苷酸排列的技術。這種稱作“光致酸成圖排列(PPA)”的現有方法比可光脫除的保護基方法具有多個潛在的優點，后一種方法公開在例如S.P.A.Fodor，etal.，Science 1991，251，767中，目前被Affymetrix用于制造GeneChipTM。PPA方法是基于標準的核酸合成化學過程(參見
圖1)，其中酸催化劑是在涂覆在結合有核酸前體的基質上的帶圖案的聚合物膜中產生的(參見圖2)。通過PPA技術產生的光致酸隨后除去了對酸不穩定的二甲氧基三苯甲基保護基團(DMT)，并活化表面結合的連接分子來偶聯第一核酸堿。圖2中描述的現有方法可以被重復多次來構筑所需長度的低聚核苷酸排列。
盡管生物分子排列制造領域中取得了上述進展，但是仍然需要提供一種制造生物分子排列的新型改進技術。此外，需要提供一種現有技術沒法制造的蛋白質排列的制造技術。
發明概述本發明提供一系列能夠用于制造生物分子排列的可光活化的表面結合的連接分子。具體地說，在一個實施方案中，本發明提供了一種組合物，它包括固體基質，一個末端連接到所述固體基質上并且至少一個其它末端含有醇官能團或羰基官能團的有機連接基團，和連接到醇官能團或羰基官能團上的選自縮醛和縮酮的對酸不穩定的保護基團。本發明還設計了一種組合物，它包括大量這種帶有醇官能團或羰基官能團的表面結合的連接基團，所述醇官能團或羰基官能團用縮醛或縮酮基團保護。
本發明還提供了一種組合物，它包括固體基質，一個末端結合到所述固體基質上并且至少一個其它末端含有醛基團的有機連接基團。本發明還設計了帶有大量這種結合到固體基質表面上的有機連接基團的組合物。
本發明還提供了一種組合物，它包括固體基質，和至少一種結合到固體基質上的光致酸生成劑或光敏劑。所述結合到組合物上的至少一種光致酸生成劑或光敏劑還可以包括結合到光致酸生成劑或光敏劑上的對酸不穩定的選自縮醛和縮酮的保護基團。這種光致酸生成劑或光敏劑還可以包括其中一個末端結合到固體基質上并且至少一個其它末端結合到光致酸生成劑或光敏劑上的有機連接基團。
附圖的簡要說明圖1是表示現有核酸合成技術的簡圖。
圖2是表示稱作光致酸成圖排列(PPA)的低聚核苷酸現有合成技術的簡圖。
發明詳述下面將更詳細地描述本發明，它提供了用于構筑生物分子排列和蛋白質排列的與基質結合的連接分子。
本發明的一方面涉及一種組合物，它包括固體基質，一個末端連接到所述固體基質上并且至少一個其它末端含有醇官能團或羰基官能團的至少一個有機連接基團，和結合到醇官能團或羰基官能團上的選自縮醛和縮酮的對酸不穩定的保護基團。
本發明的這一方面利用常規有機連接基團，提供了用于低聚核苷酸合成的改進了的對酸不穩定的保護基團。與現有技術的二甲氧基三苯甲基(DMT)保護的醇相比，由于低溫下更高的合成產率和更高的反應性，因此本發明這一實施方案中的本發明組合物去保護反應中看到的高反應性(低活化能)和高效的酸催化作用在排列構筑中是有利的。在核苷酸砌塊中引入縮醛/縮酮保護的醇也是可能的。
本發明組合物中的一種組分是固體基質。本發明所用的固體基質的實例包括但不限于玻璃，攙雜玻璃，諸如氧化硅、氧化銦錫(ITO)和氧化鈦之類的氧化物，半導體基質，如Au的金屬等。本發明所用的優選固體基質是玻璃基質。
一般在使用前，將固體基質用本領域技術人員公知的常規清潔技術進行清潔。例如，當固體基質是玻璃時，在連接分子結合之前，利用多種處理方法例如硫酸、去離子(DI)水、異丙醇(IPA)、熱、NaOH、氧氣等離子體和鹽酸清潔該玻璃基質。本發明還想到了上述清潔處理的組合。
任選在使用前被清潔的固體基質，一般在與連接分子結合之前用合適的溶劑濕潤。可以用于濕潤固體基質表面的合適溶劑包括但不限于醇，例如甲醇、乙醇、丁醇、戊醇、己醇、庚醇、辛醇和壬醇；烴，例如戊烷、己烷和庚烷；二元醇醚乙酸酯；二元醇醚；芳香烴，例如甲苯和二甲苯；氯代烴，例如氯仿和二氯甲烷；和其它類似溶劑。在這些溶劑中，本發明特別優選醇如乙醇來濕潤固體基質表面。
固體基質表面的濕潤一般在室溫下進行，但是也可以采用最高達并包括溶劑沸點的升高的溫度。濕潤步驟的時間可以變化，但是濕潤一般進行約1-約30分鐘，更優選約2-約10分鐘。
然后，將含有基本上溶解在一種上述溶劑中的“連接化合物”的溶液涂覆在固體基質表面上。“連接化合物”在固體基質上的涂覆是用本領域技術人員公知的常規方法進行的。例如，可以將固體基質浸入含有“連接化合物”的溶液中，或者可以將含有“連接化合物”的溶液利用刷涂、浸涂、噴涂或其它類似涂覆方法進行涂覆。
含有“連接化合物”的溶液在固體基質上的涂覆可以在室溫下進行，也可以采用最高達并包括溶劑沸點的升高的溫度。“連接化合物”涂覆步驟的時間可以根據固體基質表面積改變，但是“連接化合物”在固體基質上的涂覆一般進行約5分鐘至約24小時，更優選涂覆時間為約10-約30分鐘。
整個申請中所用的術語“連接化合物”表示有機連接基團和能夠結合到固體基質上的化合物之間形成的反應產物。本發明這一點中所用的溶液一般含有約1-約20wt％，更優選約2-約15wt％，甚至更優選約3-約10wt％的溶解在100％溶劑中的連接化合物。
能夠結合到固體基質上的化合物可以是鍵，碳原子，取代的碳原子，羧酸酰胺，Si原子，取代的Si原子例如三烷氧基甲硅烷基，離子鍵，羧酸，胺，硫醇，氯二烷氧基甲硅烷基，烷基二烷氧基甲硅烷基，或者二烷基烷氧基甲硅烷基。本發明中，當固體基質是由玻璃組成的時，優選結合到固體基質上的連接化合物的末端包括Si片段。本發明中可以采用的優選連接基團的一個實例是氨基丙基三乙氧基硅烷。
本發明中所用的術語“有機連接基團”表示一種有機化合物，它包括能夠結合到有機化合物(該化合物能夠結合到固體基質上)上的一個末端，一個橋連部分，和至少一個含有醇官能團或羰基官能團的其它末端。該有機連接基團可以是線性的、聚合的或樹枝狀的。
將各末端連接在一起的橋連部分是線性或支化的、取代或未取代的烷烴，鏈烯基，烷基羧酸酰胺，芳基，如乙氧化物和丙氧化物的烷氧化物，芳氧化物或它們的任意組合。有機連接基團的橋連部分可以含有約3-約600個碳原子，優選約10-約200個碳原子，更優選約12-約100個碳原子。連接基團中可以存在的取代基包括但不限于，烷基，鏈烯基，鹵原子，醚或酰胺。
在本發明的一個優選實施方案中，連接基團的橋連部分是樹枝狀化合物，其中n為約3-約30的式-(CH2)-n的烷烴鏈，其中x為約1-約50的式-(CH2CH2O)-x的乙氧化物，和其中x為約1-約50的式-(C6H4O)x-的芳氧化物。本發明中所用的術語“樹枝狀的”表示高度支化的有機化合物。
本發明中所用的縮醛或縮酮包括公知的低活化能的脂族或環狀縮醛或縮酮。能夠用于本發明的縮醛或縮酮的一些實例包括但不限于，二甲基縮醛或縮酮，二氧戊環，四氫呋喃基，四氫吡喃基，甲氧基環己基，甲氧基環戊基，環己氧基乙基，乙氧基環戊基，乙氧基環己基，甲氧基環庚基，和乙氧基環庚基。優選的對酸不穩定的縮醛或縮酮包括四氫吡喃基縮醛，二甲基縮醛或縮酮，或二氧戊環。
在固體基質上涂覆連接化合物之后，將含有結合的連接分子的固體基質用一種上述溶劑漂洗，然后將該組合物(即含有結合的連接化合物的基質)在室溫下或者在最高達并包括110℃的升高的溫度下，在空氣中或在真空下干燥。干燥步驟進行約5-約60分鐘，更優選約10-約20分鐘。
干燥后，將包括結合的連接化合物的組合物在爐子中或熱板上烘烤。烘烤步驟的溫度和時間可以根據使用爐子或熱板而改變。當采用熱板時，烘烤步驟在約80-約150℃的溫度下進行約5-約60分鐘。更優選的是，熱板烘烤步驟在約100-約110℃的溫度下進行約10-約20分鐘。當烘烤步驟中使用爐子時，烘烤步驟在約80-約150℃的溫度下進行約5-約60分鐘。更優選的是，爐子烘烤步驟在約100-約110℃的溫度下進行約10-約20分鐘。
烘烤步驟之后，就可以以一定圖案的方式對結合的連接分子進行去保護，得到用于生物分子排列的活性基質。去保護可以利用本領域技術人員公知的方法，通過加熱或者暴露于輻射下來進行。
本發明該實施方案的一些優選組合物的說明性實例包括 其中，R和R’各自獨立地是烷基，例如乙基、甲基等，或者R和R’連接在一起形成環烷烴，R”是H、烷基，或者R”與R或R’連接在一起形成環烷烴，R1是支化點如二取代乙酰胺，或三取代芳醚如三氧基取代苯甲酰胺，R2是烷基、烷氧基、烷氧化物、芳基或芳氧化物，n為0-20。
上述帶有保護的對酸不穩定的官能團的與基質結合的連接分子，可以用于利用標準核酸合成方法的低聚核苷酸的合成，或者用于制備生物分子排列。帶有保護的對酸不穩定的官能團的與基質結合的連接分子還可以用于蛋白質排列的制備。將蛋白質結合到基質上的優選方法是通過與表面結合的醛形成Schiff堿。這可以用上述結合了對酸不穩定的縮醛或縮酮的連接分子，通過用醛位點簡單代替醇連接位點來實現。該方法另外的優點在于，結合之前官能化的醛和醇易于互相轉換，因此一種硅烷前體可被用于DNA和蛋白質芯片二者。
下圖顯示了用于蛋白質連接的帶有對酸不穩定的醛保護的與基質結合的連接分子 本發明還提供了一種組合物，它包括固體基質，和結合到固體基質上的至少一種光致酸生成劑或光敏劑。所述至少一種結合到組合物上的光致酸生成劑或光敏劑還可以包括結合到其上的對酸不穩定的選自縮醛和縮酮的保護基團。這種光致酸生成劑或光敏劑還可以包括其中一個末端結合到固體基質上并且至少一個其它末端結合到光致酸生成劑或光敏劑上的有機連接基團。
在本發明的該實施方案中，聚合物抗蝕劑組分，即光致酸生成劑或光敏劑以上述有機連接化合物的一部分或者以單獨組分的形式結合到基質表面上。
該實施方案中，含有連接基團和光致酸生成劑的化合物可以按照下述方法制成通過使3-溴丙基三甲氧基硅烷或α-溴代-ω-三烷氧基甲硅烷基烷烴與二芳基硫(二苯硫)反應，然后用所需的陰離子(即三氟甲磺酸根(triflate))交換溴陰離子，能夠合成連接分子锍鹽PAG。或者，基質結合的光致酸生成劑可以這樣制成通過PAG上的芳羥基將PAG連接到α-溴代-ω-乙烯基烷烴上，隨后用三烷氧基硅烷進行處理。
本發明中可以使用的合適的光致酸生成劑(PAG)包括三氟甲磺酸鹽(例如三苯基锍三氟甲磺酸鹽或雙-(叔丁基苯基)碘鎓三氟甲磺酸鹽)，連苯三酚(例如1，3，5-苯三酸鹽或連苯三酚)，鎓鹽例如三芳基锍和二芳基碘鎓六氟銻酸鹽、六氟砷酸鹽、三氟甲磺酸鹽和其它，碘鎓磺酸鹽和羥基胺的三氟甲磺酸酯，α-雙-磺酰基重氮甲烷，硝基取代的苯甲醇和萘醌-4-二疊氮化物的磺酸酯和烷基二磺酸鹽。本發明所用的其它合適的光致酸生成劑公開在例如Allen等人的美國專利5,045,431和5,071,730中，以及Reichmanis等人的綜述文章(Chemistryof Materials，第3卷，第395頁(1991))，它們的內容通過引用而結合在本文中。
帶有光敏劑的連接分子可以這樣制備α-溴代-ω-乙烯基烷烴與羥基取代的光敏劑如9-蒽甲醇反應，隨后用三烷氧基硅烷處理。
本發明可以使用的光敏劑的實例包括類、芘類、熒蒽類、蒽酮類、二苯酮類、噻噸酮類和蒽類如9-蒽甲醇(9-AM)。其它蒽衍生物光敏劑公開在美國專利4,371,605中。光敏劑可以包括氧或硫。
下面描述了本發明的一些組合物，它們包括帶有或不帶有對酸不穩定的縮醛或縮酮保護基團的光敏劑，和帶有或不帶有對酸不穩定的縮醛或縮酮保護基團的光致酸生成劑。
利用與基質結合的光致酸生成劑和光敏劑的優點如下(1) 用于“完全干燥”模式的可能性由于光致酸生成劑(和光敏劑)結合到基質上，因此如果連接化合物的單分子層為在曝光和去保護過程中發生的光化學反應和熱反應提供了合適的溶劑化作用的話，原則上就不需要聚合物抗蝕劑或其它溶劑的面漆層。預期聚醚樹枝狀體在這方面特別有用。去保護反應的催化性質和能夠產生的高濃度酸有利于使用較少量的與基質結合的PAG。光生成的酸的擴散仍是一個問題，可能必須要控制。隨后，低聚核苷酸和蛋白質偶合反應可以用常規方式進行。聚合物涂覆步驟的缺省大大簡化了排列的制備。
(2) 當“完全干燥”方法不可行時，基質結合的PAG和光敏劑還可以用在溶劑基方法中。在此酸擴散問題將被最小化(要求較低的酸濃度并且它們在表面生成)。即使一種組分是在溶液中也是這樣的。溶劑基方法可以被用于高分辨率低聚核苷酸排列，或者優選被用于采用直接書寫路線的低密度排列。
(3) 使用基質結合的PAG的多次曝光和順序反應將依賴于所采用的任何去保護反應的催化性質。因此，正確控制與基質結合的PAG將確保在任何步驟中僅使用了部分PAG，并且允許順序曝光來催化其它去保護化學反應。
下面實施例用于舉例說明本發明的方法，它被用于制備光化學活性的表面結合的連接分子，所述連接分子能夠用于制備生物分子排列。
實施例1用于制備蛋白質排列的帶有縮醛保護的醛基的連接分子的合成該實施例中，二氧化硅活性基團和生物活性基團之間的間隔基是烷烴鏈(CH2)12。
將12-羥基十二酸(2.15g，9.93mmol)在160ml甲醇中用1.34ml1N鹽酸室溫下處理過夜，將其轉變為甲酯。用稀氫氧化鈉中和后，通過旋轉蒸發去除溶劑，并將產物再次溶解在醋酸乙酯中，用去離子(DI)水和5％的碳酸氫鈉洗滌，用硫酸鈉干燥，并旋轉蒸發至干，得到2.00g8.68mmol的12-羥基十二酸甲酯(粗產率87.4％)。
醛是按照J.E.Baldwin，R.M.Adlington和S.H.Ramcharitar，Tetrahedron 1992，48，2963中描述的方法制備的。將草酰氯(1.27g，9.98mmol)和20ml二氯甲烷放入安裝有三個加料漏斗的3頸圓底燒瓶中，其中第一個漏斗中裝有在4ml二氯甲烷中的1.5mlDMSO，第二個漏斗中裝有在5ml二氯甲烷中的2.00g 12-羥基十二酸甲酯，第三個漏斗中裝有6ml三乙胺。將燒瓶冷卻到-50℃后，將DMSO溶液快速滴加。10分鐘后，將醇用10分鐘滴加進去。45分鐘后，滴加三乙胺。再攪拌10分鐘后，燒瓶自然升溫到室溫并攪拌過夜。加入50ml二氯甲烷，并將溶液用水(3×50ml)洗滌，用硫酸鎂干燥，過濾并旋轉蒸發至干，得到2.03g 8.85mmol的12-氧代十二酸甲酯。
按照V.Pozsgay，J.Org.Chem 1998，63，5998中描述的方法保護醛基。將12-氧代十二酸甲酯(2.02g，8.85mmol)溶解在15ml 2，2-二甲氧基丙烷中，并加入對甲苯磺酸一水合物(0.17g，0.885mmol)。攪拌30分鐘后，將體積通過旋轉蒸發減少大約1/2，用過量三乙胺處理，用二氯甲烷稀釋，用水洗滌，用硫酸鈉干燥，并旋轉蒸發至干，得到2.11g 7.69mmol 12，12-二甲氧基十二酸甲酯。將其重新溶解在15ml甲醇中，并加入11.4ml1N的NaOH。45分鐘后，將甲醇通過旋轉蒸發除去。將溶液用乙醚洗滌三次。向水溶液中加入固體檸檬酸，直到pH值達到3.5。將產物萃取到二氯甲烷中(萃取三次)，將合并的有機相用水洗滌，用硫酸鎂干燥，通過旋轉蒸發濃縮，真空箱中干燥，得到1.95g淡黃色油狀物，為7.49mmol 12，12-二甲氧基十二酸。
在100ml 1∶1的醋酸乙酯/二氯甲烷混合溶劑中，混合3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)(1.66g，7.49mmol)、12，12-二甲氧基十二酸(1.95g，7.49mmol)和DCC(1.85g，8.99mmol)，并攪拌過夜。過濾出固體，并將濾液旋轉蒸發，得到4.33g 12，12-二甲氧基-N-(3’-三乙氧基甲硅烷基丙基)十二酰胺，即一種用于蛋白質排列制造的帶有縮醛保護的醛基的連接分子。
實施例2用于蛋白質排列制備的帶有縮醛保護的醛基的連接分子的合成該實施例中，二氧化硅活性基團和生物活性基團之間的間隔基是聚乙二醇(PEG)，它能夠為生物分子提供惰性表面。PEG具有兩個對稱的末端基團(羥基)。該聚乙二醇必須通過部分官能化并分離不對稱取代的聚合物，進行不對稱官能化，在一端上接上被保護的生物活性基團并在另一端上接上二氧化硅活性基團。
如A.Dal Pozzo，A.Vigo，和G.Donzelli在Makromol.Chem.1989，190，2457-2461中所述，將分子量為600的PEG(21.70g，36.17mmol)用在90ml二氯甲烷中的三苯甲基氯(10.08g，36.17mmol)和5ml三乙胺(36.17mmol)處理，并在室溫下攪拌2小時。將淤漿用DI水洗滌(1×180ml，5×90ml)以去掉未反應的PEG，旋轉蒸發至干。將油狀物再溶解在甲苯(100ml)中，并用鹽水洗滌(1×50ml，5×25ml)，用硫酸鈉干燥，過濾，旋轉蒸發，并在真空箱中干燥，得到22.98g油狀物，它是雙-三苯甲基化PEG和單-三苯甲基化PEG的混合物。
如T.Bigo，N.D.Sachinvala和O.A.Hamed在Polymer Prepr.2000，41(1)，144中所述，將NaH(5.73g，143.16mmol)用己烷洗滌，分散在100mlTHF中形成淤漿并加熱至回流。將溶解在60mlTHF中的三苯甲基化PEG的混合物在半小時內滴加進去，并在回流下攪拌4.5小時。將溶解在60mlTHF中的氯乙酸(2.25g，23.86mmol)在半小時內滴加進去。將淤漿在回流下攪拌過夜，冷卻到室溫并加入60ml水。將pH值用稀鹽酸調整到約為5，并通過旋轉蒸發去掉揮發物。將淤漿在乙醚中(3×60ml)搗碎以除去雙-三苯甲基化PEG和氯乙酸。將淤漿再次溶解在二氯甲烷中，用硫酸鎂干燥，過濾，旋轉蒸發，并在真空箱中干燥，得到11.62g(12.91mmol)α-三苯甲基-ω-羧基-PEG。
將α-三苯甲基-ω-羧基-PEG在260ml甲醇中用2ml 12N的鹽酸室溫下處理過夜。用固體碳酸鈉中和后，將溶液過濾并旋轉蒸發，再次溶解在鹽水中并用乙醚洗滌(5×100ml)。將水溶液用鹽酸中和，并將產物萃取到二氯甲烷中(4×200ml)，用硫酸鎂干燥并旋轉蒸發，得到α-羥基-ω-羧基-PEG的油狀物(7.04g，10.49mmol)。
按照實施例1中的方法，將α-羥基-ω-甲基羧基-PEG轉變為醛、保護并進一步與APTES反應，以制備α，α-二甲氧基-ω-[N-(3’-三乙氧基甲硅烷基丙基)碳酰胺-PEG，即一種用于蛋白質排列制造的帶有縮醛保護的醛基的連接分子。
或者，通過在回流THF中，用氫化鈉(2.00g，49.38mmol)和溴乙醛二甲基縮醛(2.78g，16.47mmol)處理α-羥基-ω-甲基羧基-PEG(8.23mmol)過夜，能夠一步法加上保護的醛官能團。加入水之后，將溶劑通過旋轉蒸發除去。用乙醚研磨除去過量的溴乙醛。通過加入固體檸檬酸將淤漿變為酸性，并將產物萃取到二氯甲烷中，用水洗滌，用硫酸鎂干燥，過量并旋轉蒸發，得到α，α-二甲氧基-ω-羧基-PEG，它能夠按照上述方法與APTES反應制成所需的連接分子。
實施例3帶有環狀縮醛保護的醇的連接分子的合成使α-羥基-ω-甲基羧基-PEG(來自實施例2)(3mmol)與氫化鈉(1.44g，36mmol)和2-(2-氯乙氧基)四氫-2H-吡喃(0.99g，6.01mmol)在回流的THF中反應過夜。加入水之后，將溶劑通過旋轉蒸發除去。用乙醚研磨除去過量的2-(2-氯乙氧基)四氫-2H-吡喃。通過加入固體檸檬酸將淤漿變為酸性，并將產物萃取到二氯甲烷中，用水洗滌，用硫酸鎂干燥，過濾，并旋轉蒸發，得到α，α-二甲氧基-ω-甲基羧基-PEG，它能夠按照上述方法與APTES反應以制備所需要的連接分子。
實施例4
帶有DMT保護醇的連接分子的合成通過用酸處理水解α-羥基-ω-甲基羧基-PEG(來自實施例2)，并將所得到的α-羥基-ω-羧基-PEG(3.04g，4.62mmol)用二甲氧基三苯甲基氯(DMTCI)(3.13g，9.24mmol)在100ml 1∶1的吡啶/二氯甲烷混合溶劑中室溫下處理過夜。通過旋轉蒸發除去溶劑，并將產物再次溶解在乙醚中，過濾除去鹽，并旋轉蒸發至干。然后將α-DMT氧-ω-羧基-PEG按照實施例1中的方法與APTES反應，得到α-DMT氧-ω-[N-(3，-三乙氧基甲硅烷基丙基)碳酰胺-PEG，即一種用于生物分子排列制造的帶有DMT保護醇的連接分子。
實施例5用于生物分子連接的2-支化連接分子的合成按照實施例2所述方法，用二氯乙酸代替氯乙酸與單-三苯甲基化的PEG反應，生成支化的連接分子，然后分離和純化該連接分子。
然后該支化的連接分子可以根據需要被改性和保護(P)，然后與APTES反應生成官能化的支化的連接分子。
實施例6用于生物分子連接的3-支化連接分子的合成如S.J.Meunier，Q.Wu，S.-N.Wang和R.Roy，Can J.Chem.1997，75，1472-1482中所述，將對甲苯磺酰氯(6.88g，36mmol)在氮氣氣氛下緩慢加入到來自實施例2的單-三苯甲基化PEG(33.3mmol)和50ml三乙胺在乙醚(300ml)中的0℃溶液中。將淤漿自然升溫到室溫并攪拌過夜。將溶劑旋轉蒸發掉，并將殘留物溶解在二氯甲烷中，用飽和碳酸氫鈉溶液(50ml)和水(2×50ml)洗滌。將有機層用硫酸鎂干燥并旋轉蒸發干燥，得到α-三苯基甲氧基-ω-對甲苯磺酰氧基-PEG。
將它連同沒食子酸乙酯(1.65g，8.325mmol)和碳酸鉀(11.65g，83.25mmol)溶解在DMF(250ml)中，并在80℃下攪拌2天。冷卻到室溫后，過濾出固體，并將溶劑真空下除去，然后用叔丁醇共蒸發來輔助除去DMF。加入水并將產物萃取到二氯甲烷中。將有機層用水和鹽水洗滌，用硫酸鎂干燥，過濾，旋轉蒸發得到棕色油狀物。
室溫下，將3，4，5-三-(ω-三苯基甲氧基-PEG)苯甲酸乙酯在甲醇(200ml)中與1.5N氫氧化鈉(200ml)攪拌過夜。通過旋轉蒸發除去溶劑，并將殘留物用乙醚(3×100ml)研磨，以除去雙-三苯甲基化PEG。然后將殘留物溶解在二氯甲烷中，用硫酸鎂干燥并旋轉蒸發，得到22.35g 3，4，5-三-(ω-三苯基甲氧基-PEG)苯甲酸。在250ml甲醇中與12N鹽酸(4ml)一起攪拌過夜后，用固體碳酸鈉中和，乙醚洗滌以除去三苯甲醇，并萃取到二氯甲烷中，制成了三官能化連接分子，其端羥基可以反應/被保護，然后與APTES反應，制成生物官能化/二氧化硅活性連接分子。
實施例7連接分子與二氧化硅基質的結合在即將進行連接分子結合之前清潔基質，以確保表面上活性羥基的存在。這種清潔包括用硫酸、DI水、IPA、加熱、NaOH和鹽酸處理。然后將基質浸泡在乙醇中5分鐘，隨后用溶解在乙醇中的5％連接分子溶液浸泡15分鐘，隨后在乙醇中再浸泡一分鐘。空氣流中干燥后，將基質在110℃下烘烤15分鐘，得到結合有所需的連接分子的基質，此時這種基質可以以一定圖案的方式進行去保護反應，得到用于生物分子排列的活性基質。
實施例8如流程圖1中所述，利用正交保護基團，能夠制成多種支化的多羥基酸和酯。在此例中，由羧酸制成苯甲酸酯，并將羥基以叔丁基二甲基甲硅烷基醚的形式保護。該酯可以通過催化氫解被選擇性地切斷，并可以用三氟化硼乙醚去掉甲硅烷基。這些方法中的每一個都可以選擇性地進行。用于合成的起始物是雙-(羥甲基)丙酸(DMPA)。利用流程圖1中描述的化學過程和簡單的砌塊，能夠制備多種含有2、4、8、16和更多側羥基官能團的多羥基酸和酯衍生物。利用選擇性保護/去保護流程，這些物質可以結合到諸如APTES的連接分子和所述的其它分子上。另外，利用羥基官能團來引發包括己內酯在內的多種內酯的開環聚合反應，可以加上脂族酯間隔基。采用多種金屬和有機催化劑，這些聚合是活性聚合，并得到帶有端羥基的多種結構的支化聚酯。間隔基的引入在末端官能團之間提供了額外的分隔。(M.Trollsas，J.L.Hedrick J.Am.Chem.Soc.1998，120，4644；M.Trollsas，H.Claesson，B.Atthoff，J.L.Hedrick Angew.Chem.Int.Ed.1998，37(22)，3132；M.Trollsas，J.L.Hedrick，D.Mecerreyes，Ph.Dubois，R.Jerome，H.Ihre，A.Hult Macromolecules，1998，31，2756)。
2，2-雙(叔丁基二甲基甲硅烷氧基甲基)丙酸芐酯G1(CO2Bz，TBDMS)將2，2-雙(羥甲基)丙酸芐酯(49.8g，222mmol)、叔丁基二甲基氯硅烷(TBDMSCl)(80.5g，535mmol)和咪唑(37.8g，533mmol)溶解在150ml二氯甲烷中。將該混合物室溫下攪拌12小時，并蒸發掉溶劑。將粗殘留物溶解在己烷中并用水萃取。蒸發有機相得到95.2g(94％)的無色液體。1H-NMR(CDCl3)δ0.00(s，12H)，0.83(s，18H)，1.12(s，3H)，3.64-3.77(q，4H)，5.10(s，2H)，7.32(s，5H)。
脫甲硅烷基的通用程序向氮氣氣氛下的燒瓶中加入0.52mmolTBDMS保護的物質，30ml干燥的二氯甲烷和BF3-Et2O(92.6mmol)。將混合物40℃下攪拌12小時，并倒入冷甲醇中。將產物通過潷析或過濾分離，并且無需進一步純化即可使用。
2，2-雙(叔丁基二甲基甲硅烷氧基甲基)丙酸G1(CO2H，TBDMS)和除去芐酯基團的通用程序將G1(CO2Bz，TBDMS)(210mmol，95.2g)溶解在EtOAc(100ml)中，并加入Pd/C(10wt％)(1.5g)。在氫化瓶中充入氫氣(50psi)并在室溫下搖晃6小時。停止反應并過濾催化劑。蒸發溶劑得到94.2g(99％)的無色液體。1H-NMR(CDCl3)δ0.00(s，12H)，0.82(s，18H)，1.07(s，3H)，3.6-3.69(q，4H)。
G2(CO2Bz，TBDMS)和用DCC酯化的通用程序將2，2-雙(羥甲基)丙酸芐酯(23.3g，104mmol)、G1(CO2H，TBDMS)(79g，218mmol)和4-(二甲基氨基)吡啶鎓-對甲苯磺酸鹽(DPTS)溶解在150ml二氯甲烷中。然后加入二環己基碳二亞胺(DCC)(55.7g，270mmol)，并在室溫下攪拌反應混合物12小時。將混合物過濾，并用柱層析純化濾液(硅膠，己烷，EtOAc95∶5洗脫劑)。得到30g(32％)的無色粘稠油狀物1H-NMR(CDCl3)δ0.00(s，24H)，0.84(s，36H)，1.09(s，6H)，1.23(s，3H)，3.56-3.70(q，8H)，4.15-4.30(q，4H)，5.13(s，2H)，7.33(s，5H)。
G2(CO2H，TBDMS)將G2(CO2Bz，TBDMS)(30.0g，32.9mmol)和Pd/C(1.5g)溶解在100mlEtOAc中，并按照上述方法用氫氣處理4小時。得到26.2g(97％)的無色粘稠液體。1H-NMR(CDCl3)δ0.00(s，24H)，0.84(s，36H)，1.06(s，6H)，1.25(s，3H)，3.57-3.72(q，8H)，4.06-4.29(m，4H)，5.28(s，2H)。
盡管參考其優選實施方式對本發明進行了具體描述，但是本領域技術人員應當理解，在不偏離本發明精神和范圍的前提下可以對其形式和細節作出多種變化。因此本發明決不限于所描述的準確形式和細節上，而是要落在所附權利要求書的范圍內。
反應路線1
權利要求
1.一種組合物，它包括固體基質，一個末端部分連接到所述固體基質上并且至少一個其它末端部分含有醇官能團或羰基官能團的有機連接基團，和連接到醇官能團或羰基官能團上的選自縮醛和縮酮的對酸不穩定的保護基團。
2.根據權利要求1的組合物，其中所述固體基質選自玻璃、攙雜玻璃、氧化物、半導體和金屬。
3.根據權利要求1的組合物，其中所述固體基質是玻璃。
4.根據權利要求1的組合物，還包括用所述縮醛或縮酮保護的大量有機連接基團。
5.根據權利要求1的組合物，其中所述有機連接基團選自線性連接基團、聚合物連接基團和樹枝狀連接基團。
6.根據權利要求1的組合物，其中所述有機連接基團包括在所述末端部分之間的橋連基團。
7.根據權利要求6的組合物，其中所述橋連基團是具有式-(CH2)-n的烷烴鏈，其中n為約3-約30。
8.根據權利要求6的組合物，其中所述橋連基團是具有式-(CH2CH2O)-x的乙氧化物，其中x為約1-約50。
9.根據權利要求1的組合物，其中結合到所述固體基質上的所述末端部分包含取代的Si原子。
10.根據權利要求1的組合物，其中所述縮醛或縮酮是脂肪族或環狀化合物。
11.根據權利要求1的組合物，其中所述縮醛或縮酮選自二甲基縮醛或縮酮，二氧戊環，四氫呋喃基，四氫吡喃基，甲氧基環己基，甲氧基環戊基，環己基氧乙基，乙氧基環戊基，乙氧基環己基，甲氧基環庚基，和乙氧基環庚基。
12.根據權利要求1的組合物，其中所述縮醛或縮酮選自四氫吡喃基縮醛，二甲基縮醛或縮酮，或二氧戊環。
13.根據權利要求1的組合物，其中所述縮醛或縮酮是通過加熱或暴露于輻射下而去保護的。
14.一種組合物，它包括固體基質，一個末端部分結合到固體基質上并且至少一個其它末端部分含有醛基團的有機連接基團。
15.一種組合物，它包括固體基質，和至少一種結合到固體基質上的光致酸生成劑或光敏劑。
16.根據權利要求15的組合物，還包括結合到光致酸生成劑或光敏劑上的選自縮醛和縮酮的對酸不穩定的保護基團。
17.根據權利要求15的組合物，還包括其中一個末端部分結合到固體基質上并且至少一個其它末端部分結合到光致酸生成劑或光敏劑上的有機連接基團。
18.根據權利要求15的組合物，其中所述固體基質選自玻璃、攙雜玻璃、氧化物、半導體和金屬。
19.根據權利要求15的組合物，其中所述固體基質是玻璃。
20.根據權利要求17的組合物，其中所述有機連接基團選自線性連接基團、聚合物連接基團和樹枝狀連接基團。
21.根據權利要求17的組合物，其中所述有機連接基團包括在所述末端部分之間的橋連基團。
22.根據權利要求21的組合物，其中所述橋連基團是具有式-(CH2)-n的烷烴鏈，其中n為約3-約30。
23.根據權利要求21的組合物，其中所述橋連基團是具有式-(CH2CH2O)-x的乙氧化物，其中x為約1-約50。
24.根據權利要求16的組合物，其中所述縮醛或縮酮是脂肪族或環狀化合物。
25.根據權利要求16的組合物，其中所述縮醛或縮酮選自二甲基縮醛或縮酮，二氧戊環，四氫呋喃基，四氫吡喃基，甲氧基環己基，甲氧基環戊基，環己基氧乙基，乙氧基環戊基，乙氧基環己基，甲氧基環庚基，和乙氧基環庚基。
26.根據權利要求16的組合物，其中所述縮醛或縮酮選自四氫吡喃基縮醛，二甲基縮醛或縮酮，或二氧戊環。
27.根據權利要求16的組合物，其中所述縮醛或縮酮是通過加熱或暴露于射線下而去保護的。
28.根據權利要求15的組合物，其中所述光致酸生成劑選自三氟甲磺酸鹽，連苯三酚，鎓鹽，碘鎓磺酸鹽，羥基胺的三氟甲磺酸酯，α-雙-磺酰基重氮甲烷，硝基取代的苯甲醇和萘醌-4-二疊氮化物的磺酸酯和烷基二磺酸鹽。
29.根據權利要求15的組合物，其中所述光致酸生成劑選自三氟甲磺酸鹽和鎓鹽。
30.根據權利要求15的組合物，其中所述光敏劑選自蔗類、芘類、熒蒽類、蒽酮類、二苯酮類、噻噸酮類和蒽類。
31.一種制備可光活化的表面結合的連接分子的方法，包括將含有連接化合物的溶液涂覆在固體基質的濕潤表面上，所述連接化合物包含結合到所述固體基質上的組分；干燥含有結合的連接化合物的固體基質；和烘烤干燥的固體基質。
32.根據權利要求31的方法，還包括在所述涂覆之前清潔所述固體基質。
33.根據權利要求32的方法，其中所述清潔處理選自硫酸處理、去離子水處理、異丙醇處理、熱處理、NaOH處理、氧等離子體處理和鹽酸處理。
34.根據權利要求31的方法，其中所述濕潤的固體基質是通過將溶劑涂覆在所述固體基質上形成的，所述溶劑選自醇、烴、二元醇醚乙酸酯、二元醇醚、芳烴和氯代烴。
35.根據權利要求34的方法，其中所述濕潤是在室溫至最高達溶劑沸點的溫度下進行的。
36.根據權利要求31的方法，其中含有所述連接化合物的所述溶液含有約1-約20wt％的溶解在溶劑中的連接化合物。
37.根據權利要求31的方法，其中所述連接化合物是有機連接基團和能夠結合到所述固體基質上的化合物之間的反應產物。
38.根據權利要求31的方法，還包括將所述連接化合物去保護。
39.根據權利要求38的方法，其中所述去保護是通過加熱或暴露于輻射下進行的。
全文摘要
本發明描述了一系列能夠用于制造生物分子排列的可光活化的表面結合的連接分子。具體地說，公開了一種組合物，它包括固體基質，一個末端連接到所述固體基質上并且至少一個其它末端含有醇官能團或羰基官能團的有機連接基團，和連接到醇官能團或羰基官能團上的選自縮醛和縮酮的對酸不穩定的保護基團。本發明還描述了一種組合物，它包括固體基質，一個末端結合到固體基質上并且至少一個其它末端含有醛基團的有機連接基團。本發明還提供了一種組合物，它包括固體基質，和至少一種結合到固體基質上的光致酸生成劑或光敏劑。
文檔編號G01N33/543GK1510420SQ20031011801
公開日2004年7月7日 申請日期2003年11月20日 優先權日2002年12月20日
發明者P·J·布羅克, R·A·迪派特羅, N·S·芬德, R·D·米勒, S·A·斯旺森, G·M·沃爾拉夫, P J 布羅克, 斯旺森, 沃爾拉夫, 米勒, 芬德, 迪派特羅 申請人:國際商業機器公司