專利名稱：生物傳感器的制備方法
技術領域：
本發明屬于一種生物傳感器的制備方法，具體的講，本發明屬于硅溶膠-凝膠膜固載血紅蛋白第三代生物傳感器的制備方法。
背景技術：
生物電傳感器在工農業生產、醫療衛生、環境保護等領域具有廣泛的應用。生物傳感器是利用生物物質作為識別元件，將被測物質的濃度與可測量的電信號關聯起來。生物傳感器中研究最多的是酶傳感器。根據酶與電極間電子轉移的機理大致可將酶生物傳感器分為三代在葡萄糖傳感器中，采用酶的天然介體一氧的催化原理設計制作的酶傳感器稱為第一代生物傳感器；第二代生物傳感器將人工合成的媒介體摻入酶層中，減少了空間氧的干擾；第三代生物傳感器是指在無媒介體存在下，利用酶與電極間的直接電子傳遞制作的酶傳感器。近年來，第三代生物傳感器的研究十分活躍，但大多數都集中在以天然酶(如辣根過氧化物酶HRP)作為識別元件。然而，天然酶基的第三代生物傳感器最大的缺點是使用壽命短、價格昂貴。
由于血紅蛋白具有和HRP相同的鐵卟啉輔基而可望代替HRP作為生物傳感器的識別元件，這方面的研究吸引了大量化學工作者的興趣。然而，由于血紅蛋白分子龐大，活性中心深埋于折疊的肽鏈之中。所以，要使血紅蛋白成為第三代生物傳感器的識別元件，需要克服的困難就是實現其直接的電子轉移。也就是既要有效的固載血紅蛋白于電極表面，又要防止由于固載而使其變性失活，還要實現血紅蛋白與電極之間的直接電子轉移。硅溶膠-凝膠過程條件溫和，化學惰性，包埋于溶膠-凝膠中的生物活性物質可以保持其結構、活性和功能，而且小分子可通過溶膠-凝膠的孔道與生物活性物質接觸。基于此，硅溶膠-凝膠已經廣泛的用于電極表面固載生物酶而研制葡萄糖、H2O2傳感器等。
發明內容
本發明的目的是提供一種硅溶膠-凝膠膜固載血紅蛋白第三代生物傳感器的制備方法。
我們的發明思想是用硅溶膠-凝膠儲備液涂于已修飾了血紅蛋白的碳糊電極表面，使其在室溫下現場堿催化聚合成膜而使血紅蛋白固載，從而制成硅溶膠-凝膠膜固載血紅蛋白第三代生物傳感器。制成的傳感器具有較強的過氧化物酶的催化特性，能夠對H2O2、O2、亞硝酸鹽、三氯乙酸等選擇性的電催化還原。該傳感器達到平衡的時間短、響應快、制作簡單、價格低廉、使用壽命長。
一種生物傳感器的制備方法，其特征在于該方法將含有15-20mg/mL血紅蛋白的磷酸鹽溶液涂于碳糊電極表面，室溫干燥生成血紅蛋白膜；再在血紅蛋白膜表面均勻涂布由硅烷、醇、氫氧化鈉溶液組成的硅溶膠-凝膠液，經過室溫堿催化聚合生成硅溶膠-凝膠膜固載血紅蛋白生物傳感器。
本發明所用的硅烷選自四乙氧基硅烷或四甲氧基硅烷。
本發明所用的醇選自乙醇或甲醇。
由于本發明固載血紅蛋白使用硅溶膠-凝膠膜，并且采用了現場堿催化成膜，從而避免了強酸作催化劑而導致的血紅蛋白的變性。實驗證明固載于碳糊電極表面的血紅蛋白保持了其原始的結構狀態，因而顯示了較強的過氧化物酶的催化活性。另外，硅的溶膠-凝膠膜存在有大量的羥基基團可以和蛋白質形成氫鍵，可以防止血紅蛋白從電極表面脫落；加上血紅蛋白本身比HRP穩定，從而使得本發明制得的第三代生物傳感器具有比生物酶有較強的操作穩定性和較長的使用壽命。
由于本發明采用的基底電極是碳糊電極、識別元件是血紅蛋白、固載血紅蛋白使用硅溶膠-凝膠膜。材料得來容易，制作簡單，價格低廉。
本發明制備的生物傳感器具有較好的酸堿適應性，能夠在pH4-9的范圍內均顯示出較好的催化活性和穩定性。
具體實施例方式
實施例1將5g石墨粉與3mL液體石蠟混合均勻后，取適量填入玻璃管[4.5mm(i.d.)；5.5mm(o.d.)]的一端約5mm的高度，另一端插進一根銅線構成碳糊電極。電極的表面在稱量紙上磨光滑。
將600μL乙醇、50μL四乙氧基硅烷(TEOS)、10μL 5mmol/L的NaOH溶液以及60μLH2O于一支小試管中快速混合后得到硅溶膠-凝膠液，置于4℃冰箱中保存備用。
將5μL 15mg/mL血紅蛋白的磷酸鹽緩沖溶液(pH7.0)滴到碳糊電極的表面，用一端封口的毛細管涂布均勻；室溫涼干1h。然后，將10μL硅溶膠-凝膠儲備液滴到已被Hb修飾的電極表面并涂布均勻，使其在室溫下聚合1小時。最后，將制備好的電極(即硅溶膠-凝膠膜固載血紅蛋白第三代生物傳感器)浸于pH7.0的磷酸鹽緩沖溶液中置于4℃冰箱保存。該傳感器具有良好的響應性能達到平衡時間短，不大于10分鐘；響應快，約0.5-1分鐘；使用壽命長，10周以上。
實施例2硅溶膠-凝膠液的組成為600μL甲醇、50μL四甲氧基硅烷(TMOS)、10μL 5mmol/L的NaOH溶液以及60μLH2O。其它操作步驟同實施例1。
實施例1和實施例2制備的傳感器的性能傳感器用于水溶液中過氧化氫的測定過氧化氫響應靈敏度為64.8μA/mmol/L。
檢出限為8.6×10-7mol/L測量線性范圍為1×10-6-2.8×10-4mol/L。
傳感器用于水溶液中亞硝酸鹽的測定檢出限為3×10-7mol/L。
測量線性范圍為0-8.6×10-4mol/L。
傳感器用于水溶液中三氯乙酸的測定檢出限為3×10-6mol/L。
測量線性范圍為2.3×10-5-8.6×10-3mol/L。
傳感器在22℃的室溫條件下用于水溶液中溶解氧的測定檢出限為5.2×10-6mol/L測量線性范圍為7.8×10-6-1×10-3mol/L。
權利要求
1.一種生物傳感器的制備方法，其特征在于該方法將含有15-20mg/mL血紅蛋白的磷酸鹽溶液涂于碳糊電極表面，室溫干燥生成血紅蛋白膜；再在血紅蛋白膜表面均勻涂布由硅烷、醇、氫氧化鈉溶液組成的硅溶膠-凝膠液，經過室溫堿催化聚合生成硅溶膠-凝膠膜固載血紅蛋白生物傳感器。
2.如權利要求1所說的方法，其特征在于硅烷選自四乙氧基硅烷或四甲氧基硅烷。
3.如權利要求1所說的方法，其特征在于醇選自乙醇或甲醇。
全文摘要
本發明屬于硅溶膠－凝膠膜固載血紅蛋白傳感器的制備方法。本發明采用硅烷在堿性條件下現場水解聚合形成薄膜，用該薄膜固載血紅蛋白于碳糊電極表面而制成生物傳感器。該傳感器對于過氧化氫、氧氣、亞硝酸鹽、三氯乙酸等具有催化電流響應，其優點在于平衡時間短、響應快、靈敏度高、使用壽命長、制作簡單、價格低廉。
文檔編號G01N27/327GK1635370SQ200310117748
公開日2005年7月6日 申請日期2003年12月30日 優先權日2003年12月30日
發明者呂功煊, 王全林 申請人:中國科學院蘭州化學物理研究所