治療性人抗－il－1r1單克隆抗體的制作方法

專利名稱：治療性人抗－il－1r1 單克隆抗體的制作方法
技術領域：
本發明涉及結合白介素-1受體型1(IL-1R1)蛋白的抗體。還提供了用于治療IL-1介導的疾病，如類風濕性關節炎、骨關節炎和其他炎性病癥的組合物，特別是藥物組合物和方法。
背景技術：
抗體開發炎癥是身體對機械損傷、感染或抗原刺激導致的損傷的應答。炎癥反應通常出現病理性地表達。當炎癥以夸張方式表達，被不適當地刺激或者有害劑被除去后仍然持續時，出現這些病癥。
炎癥應答由細胞因子介導。目前發現的最有效的炎癥細胞因子之一是白介素-1(IL-1)。IL-1信號增加導致與一些疾病有關的持續炎癥，并且認為IL-1是許多疾病和醫學病癥的關鍵介導劑。該細胞因子主要(盡管不是專門地)由巨噬細胞/單核細胞譜系的細胞產生并且可以以兩種形式產生IL-1 alpha(IL-1α)和IL-1 beta(IL-1β)。
IL-1通過與異二聚體受體復合體相互作用刺激細胞應答，該異二聚體受體復合體由兩種跨膜蛋白IL-1受體型1(IL-1R1)和IL-1受體輔助蛋白(IL-1RAcP)組成。IL-1首先結合IL-1R1；然后IL-1RAcP被募集到該復合體(Greenfeder等人，1995，J.Biol.Chem.27013757-13765；Yoon和Dinarello，1998，J.Immunology1603170-3179；Cullinan等人，1998，J Immunology1615614-5620)，接著是信號轉導，從而誘導細胞應答。
基于細胞的結合研究表明IL-1RAcP通過延緩配體離開速度來穩定IL-1R信號復合體(Wesche等人，1998，FEBS Letters429303-306)。盡管已經完全表征了IL-1和IL-1R的相互作用，但是IL-1RAcP與配體-結合的受體之間的相互作用仍然沒有被較好地限定。因為IL-1RAcP與單獨的IL-1或者IL-1R1都沒有顯著親和性，但是與其復合體卻有高親和性，因此推斷通過IL-1/IL-1R結合事件產生了IL-1RAcP的新的結合位點，該結合事件甚至包括IL-1殘基的貢獻(Ettorre等人，1997，Eur.Cytokine Netw.8161-171)。另一種分子——IL-1受體拮抗劑(IL-1ra)與IL-1α和IL-1β競爭受體結合但是不能募集IL-1RAcP，導致一種被占據但是無信號的受體。IL-1活性還可以被II型IL-1R均衡，II型IL-1R是一種引誘受體，其結合配體但是由于截斷的細胞內結構域而不參與信號化。IL-1ra和II型IL-1R降低IL-1介導的炎癥事件的嚴重性和持續時間(Wesche等人，1998，FEBSLetters429303-306；Dripps等人，1991，J.Biol.Chem.26610331-10336；Dripps等人，1991，J.Biol.Chem.26620331-20335)。
可以從能夠特異防止IL-1的細胞受體活化的任一種蛋白質產生白介素-1抑制劑，該活化的防止可以來自許多機理。這些機理包括下調IL-1產生、結合游離的IL-1、干擾IL-1結合IL-1R、干擾IL-1R-IL-1RAcP復合體的形成或者干擾IL-1與其受體結合后IL-1信號化的調節。IL-1抑制劑的類別包括●白介素-1受體拮抗劑如IL-1ra，如下面描述的；●抗-IL-1R單克隆抗體(例如，如在公布的歐洲專利申請號EP623674中公開的，其公開在此處被并入作為參考)；●IL-1結合蛋白，如可溶性IL-1受體(例如，如在美國專利號5,492,888；5,488,032、5,464,937、5,319,071和5,180,812中公開的，它們的公開在此處被并入作為參考)；●抗-IL-1單克隆抗體(例如，如在國際專利申請公布號WO9501997、WO9402627、WO9006371、美國專利號4,935,343、EP364778、EP267611和EP220063中公開的，它們的公開在此處被并入作為參考)；●IL-1受體輔助蛋白和其抗體(例如，如在國際專利申請公布號WO96/23067和WO99/37773中公開的，它們的公開在此處被并入作為參考)；和●白介素-1β轉換酶抑制劑(ICE)或半胱天冬酶I(例如，如在國際專利申請公布號WO99/46248、WO99/47545和WO99/47154中公開的，它們的公開在此處被并入作為參考)；它們可用于抑制IL-1β產生和分泌；
●白介素-1β蛋白酶抑制劑；和●其他化合物和蛋白質，它們阻斷IL-1的體內合成或胞外釋放。
示例性IL-1抑制劑在下面的參考文獻中公開美國專利號5,747,444、5,359,032、5,608,035、5,843,905、5,359,032、5,866,576、5,869,660、5,869,315、5,872,095、5,955,480、和5,965,564、國際專利申請公布號WO98/21957、WO96/09323、WO91/17184、WO96/40907、WO98/32733、WO98/42325、WO98/44940、WO98/47892、WO98/56377、WO99/03837、WO99/06426、WO99/06042、WO91/17249、WO98/32733、WO98/17661、WO97/08174、WO95/34326、WO99/36426、和WO99/36415、歐洲專利申請公布號EP534978和EP89479、和法國專利申請號FR2762514。所有上述參考文獻的公開在此處被并入作為參考。
白介素-1受體拮抗劑(IL-1ra)是作為白介素-1的天然抑制劑的一種人體蛋白并且是IL-1家族的一員，IL-1家族包括IL-1α和IL-1β。優選的受體拮抗劑(包括IL-1ra和其變體與衍生物)，以及其產生和使用方法在美國專利號5,075,222、國際專利申請公布號WO91/08285、WO91/17184、WO92/16221、WO93/21946、WO94/06457、WO94/21275、WO94/21235、DE4219626，WO94/20517、WO96/22793、WO97/28828、和WO99/36541、澳大利亞專利申請號AU9173636，和法國專利申請號FR2706772中公開，它們的公開在此處被并入作為參考。蛋白質包括IL-1受體拮抗劑的糖基化和非糖基化形式。
特別地，在美國專利號5,075,222(’222專利)中公開和描述了IL-1ra的3個有用的形式及其變體。IL-1raα通過SDS-PAGE被表征為一種22-23kD的分子，等電點約為4.8，在Tris緩沖液(pH 7.6)中約52mM NaCl處從Mono Q FPLC中洗脫出來。IL-1raβ被表征為22-23kD蛋白，在48mM NaCl處從Mono Q柱洗脫出來。IL-1raα和IL-1raβ都被糖基化。IL-1rax被表征為20kD蛋白，在48mM NaCl處從Mono Q柱被洗脫出來，并且未被糖基化。’222專利還公開了分離負責編碼該抑制劑的基因、在適宜的載體和細胞類型中克隆該基因，并表達該基因以產生抑制劑的方法。盡管該方法有效，但是IL-1ra的半衰期相對較短。在當前使用中，IL-1ra被每天施用一次。具有相當長的半壽期的IL-1受體拮抗劑對于本領域是有益的。
通過抑制IL-1結合IL-1受體而防止IL-1信號化對于治療IL-1介導的疾病是一種有吸引力的治療方法。本領域中需要IL-1信號途徑的臨床上有效的抑制劑，該抑制劑可以改善IL-1介導的疾病的作用并且適于被遞送到人類患者中。阻礙IL-1信號化的人抗體對實現該需求尤其有利并且將提供比當前可利用的治療更長的半壽期。
發明概述本發明提供了結合白介素-1受體型1(IL-1R1)的單克隆抗體。優選地，該抗體通過與IL-1β和IL-1α競爭結合IL-1R1而抑制IL-1信號化。本發明還提供了雜交瘤細胞系，其產生，并且最優選地，向細胞培養基分泌本發明的單克隆抗體。本發明的抗體成功地阻斷人細胞中的IL-1信號化并從而可用于治療患有IL-1介導的疾病的患者。本發明還提供了融合蛋白，其含有抗體Fc區的序列和選自SEQ ID NO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14、SEQ ID NO16、SEQ ID NO18、SEQ ID NO20、SEQ ID NO22、SEQ ID NO24、SEQ ID NO26、SEQ ID NO28、SEQ ID NO30、SEQ ID NO32、SEQ ID NO34、SEQ ID NO36、SEQ ID NO38、和SEQ ID NO40的一種或多種序列。可以使用如，例如，WO 00/24782中描述的方法制備這些分子，WO 00/24782在此處被并入作為參考。這些分子可以例如，在哺乳動物細胞(例如，中國倉鼠卵巢細胞)或者細菌細胞(例如，大腸桿菌細胞)中表達。
在某些方面，本發明提供了抗體，優選單克隆抗體，最優選人抗體，它們含有重鏈和輕鏈，其中重鏈含有如在SEQ ID NO2、SEQ IDNO6或SEQ ID NO8任一個中提出的氨基酸序列，或者其抗原結合片段或其具有免疫學功能的免疫球蛋白片段。
本發明還提供了抗體，優選單克隆抗體，最優選人抗體，其含有重鏈和輕鏈，其中輕鏈含有如在SEQ ID NO4中提出的氨基酸序列，或者其抗原結合片段或其具有免疫學功能的免疫球蛋白片段。
在某些方面，本發明的抗體含有重鏈和輕鏈，其中重鏈的可變區含有如在SEQ ID NO10、SEQ ID NO14、或SEQ ID NO16任一個中提出的氨基酸序列，或者其抗原結合片段或其具有免疫學功能的免疫球蛋白片段。在其他方面，輕鏈可變區含有如在SEQ ID NO12或SEQ ID NO18任一個中提出的氨基酸序列，或者其抗原結合片段或其具有免疫學功能的免疫球蛋白片段。在另外的方面，重鏈含有如在SEQ ID NO20、SEQ ID NO22、SEQ ID NO24、SEQ ID NO26、SEQ ID NO28、SEQ ID NO30、SEQ ID NO32、SEQ ID NO34、或SEQ ID NO36任一個中提出的氨基酸序列，或者其抗原結合片段或其具有免疫學功能的免疫球蛋白片段。在其他方面，輕鏈含有如在SEQ ID NO38或SEQ ID NO40任一個中提出的氨基酸序列，或者其抗原結合片段或其具有免疫學功能的免疫球蛋白片段。這些抗體鏈可用于制備特異結合IL-1R1的抗體，還可以用于制備雙特異抗體，其中所得分子結合IL-1R1和/或另一種靶分子(例如，TNF或TNF受體)。
本發明還提供了特異結合IL-1R1的抗體，其中重鏈包含含有SEQID NO10中提出的氨基酸序列的重鏈可變區，或者其抗原結合片段或其具有免疫學功能的免疫球蛋白片段，輕鏈包含含有SEQ ID NO12中提出的氨基酸序列的輕鏈可變區，或者其抗原結合片段或其具有免疫學功能的免疫球蛋白片段。
在某些方面，本發明還提供了含有重鏈和輕鏈的抗體，其中重鏈含有第一可變區，并且其中第一可變區含有與SEQ ID NO10中提出的氨基酸序列具有至少90％，更優選至少95％，最優選約99％的同一性的序列，其中輕鏈含有第二可變區，其中第二可變區含有與SEQ ID NO12中提出的氨基酸序列具有至少90％，更優選至少95％，最優選約99％的同一性的序列，其中該抗體與IL-1R1相互作用。
本發明還提供了特異結合IL-1R1的抗體，其中重鏈包含含有如SEQ ID NO14中提出的氨基酸序列的重鏈可變區，或者其抗原結合片段或其具有免疫學功能的免疫球蛋白片段，輕鏈包含含有如SEQ IDNO12中提出的氨基酸序列的輕鏈可變區，或者其抗原結合片段或其具有免疫學功能的免疫球蛋白片段。
在某些方面，本發明提供了含有重鏈和輕鏈的抗體，其中重鏈含有第一可變區，并且其中第一可變區含有與SEQ ID NO14中提出的氨基酸序列具有至少90％，更優選至少95％，最優選約99％的同一性的序列，并且其中輕鏈含有第二可變區，其中第二可變區含有與SEQ IDNO12中提出的氨基酸序列具有至少90％，更優選至少95％，最優選約99％的同一性的序列，其中該抗體與IL-1R1相互作用。
本發明還提供了特異結合IL-1R1的抗體，其中重鏈包含含有如SEQ ID NO16中提出的氨基酸序列的重鏈可變區，或者其抗原結合片段或其具有免疫學功能的免疫球蛋白片段，并且輕鏈包含含有如SEQID NO18中提出的氨基酸序列的輕鏈可變區，或者其抗原結合片段或其具有免疫學功能的免疫球蛋白片段。
在某些方面，本發明提供了含有重鏈和輕鏈的抗體，其中重鏈含有第一可變區，并且其中第一可變區含有與SEQ ID NO16中提出的氨基酸序列具有至少90％，更優選至少95％，最優選約99％的同一性的序列，并且其中輕鏈含有第二可變區，其中第二可變區含有與SEQ IDNO18中提出的氨基酸序列具有至少90％，更優選至少95％，最優選約99％的同一性的序列，其中該抗體與IL-1R1相互作用。
本發明還提供了特異結合IL-1R1的抗體，其中重鏈含有如SEQ IDNO20、SEQ ID NO22、SEQ ID NO24、SEQ ID NO26、SEQ IDNO28、或SEQ ID NO30中提出的氨基酸序列，或者其抗原結合片段或其具有免疫學功能的免疫球蛋白片段，并且輕鏈含有如SEQ IDNO38中提出的氨基酸序列，或者其抗原結合片段或其具有免疫學功能的免疫球蛋白片段。
本發明還提供了特異結合IL-1R1的抗體，其中重鏈含有如SEQ IDNO32、SEQ ID NO34、或SEQ ID NO36中提出的氨基酸序列，或者其抗原結合片段或其具有免疫學功能的免疫球蛋白片段，并且輕鏈含有如SEQ ID NO40中提出的氨基酸序列，或者其抗原結合片段或其具有免疫學功能的免疫球蛋白片段。
本發明還提供了所有前述的實施方案，它們是單鏈抗體、單鏈Fv抗體、Fab抗體、Fab’抗體和(Fab’)2抗體。
在具體方面，本發明提供了含有如SEQ ID NO38或SEQ ID NO40任一個中提出的氨基酸序列的輕鏈，或者其抗原結合片段或其具有免疫學功能的免疫球蛋白片段。
此外，本發明提供了含有如SEQ ID NO20、SEQ ID NO22、SEQID NO24、SEQ ID NO26、SEQ ID NO28、SEQ ID NO30、SEQ IDNO32、SEQ ID NO34或SEQ ID NO36任一個中提出的氨基酸序列的重鏈，或者其抗原結合片段或其具有免疫學功能的免疫球蛋白片段。
本發明還涉及分離的人抗體，其特異結合IL-1R1，其中該抗體含有(a)人重鏈框架區、人重鏈CDR1區、人重鏈CDR2區，和人重鏈CDR3區；和(b)人輕鏈框架區、人輕鏈CDR1區、人輕鏈CDR2區，和人輕鏈CDR3區。在某些方面，人重鏈CDR1區可以是如

圖10中所示的26F5、27F2或15C4的重鏈CDR1區，人輕鏈CDR1區可以是如圖11中所示的26F5、27F2或15C4的輕鏈CDR1區。在其他方面，人重鏈CDR2區可以是如圖10中所示的26F5、27F2或15C4的重鏈CDR2區，人輕鏈CDR2區可以是如圖11中所示的26F5、27F2或15C4的輕鏈CDR2區。在其他方面，人重鏈CDR3區可以是如圖10中所示的26F5、27F2或15C4的重鏈CDR3區，人輕鏈CDR3區可以是如圖11中所示的26F5、27F2或15C4的輕鏈CDR3區。
此外，本發明提供了分離的人抗體，其特異結合白介素-1受體1型(IL-1R1)，該抗體含有人重鏈CDR1區，其中重鏈CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO61、SEQ ID NO62或SEQ ID NO63；人重鏈CDR2區，其中重鏈CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO64、SEQ ID NO65或SEQ ID NO66；和/或人重鏈CDR3區，其中重鏈CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO67、SEQ ID NO68或SEQ ID NO69。
本發明還提供了分離的人抗體，其特異結合白介素-1受體型1(IL-1R1)，該抗體含有人輕鏈CDR1區，其中輕鏈CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO70或SEQ ID NO71；人重鏈CDR2區，其中重鏈CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO72或SEQ ID NO73；和/或人重鏈CDR3區，其中重鏈CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO74或SEQ IDNO75。
在一些實施方案中，本發明的抗體結合IL-1R1的第三個結構域，該結構域在圖17中顯示。優選地，本發明抗體的表位由氨基酸序列YSV組成，其在此處被稱為表位4并且在圖24中顯示。本發明還涉及融合蛋白和能夠結合表位4的其他分子(與上述抗體在此處統稱為“特異結合配偶體”)，如使用如，例如，WO00/24782中描述的方法可以制備的分子，該文獻在此處并入作為參考。可以在例如，哺乳動物細胞(例如，中國倉鼠卵巢細胞)或細菌細胞(例如，大腸桿菌細胞)中表達這些分子。
此外，本發明提供了所選抗原的表位作圖方法。一方面，本發明包括步驟(a)產生一組融合蛋白，其中每種融合蛋白含有(i)抗生物素蛋白和(ii)抗原的片段；(b)篩選與所述抗原的一種或多種特異結合配偶體結合的融合蛋白組；(c)在含有生物素的介質上分離融合蛋白，其中抗生物素蛋白結合生物素；和(d)分析被特異結合配偶體結合的融合蛋白以確定該特異結合配偶體在該抗原上的結合位點。在具體方面，特異結合配偶體是抗體。
在另外實施方案中，本發明提供了治療IL-1介導的疾病、病癥或失調的方法，該方法包括對需要該治療的個體施用藥學有效量的一種或多種本發明的單克隆抗體或者其抗原結合或具有免疫學功能的免疫球蛋白片段。
本發明還提供了檢測生物樣品中IL-1R1的水平的方法，該方法包括將樣品與本發明的單克隆抗體或者其抗原結合片段接觸。本發明的抗-IL-1R抗體可用于任一公知的測定方法，如競爭結合測定法、直接和間接三明治測定法、免疫沉淀測定法和酶聯免疫吸附測定法(ELISA)(見，Sola，1987，Monoclonal AntibodiesA Manual ofTechniques，147-158頁，CRC Press，Inc.)中，以檢測和定量IL-1R。抗體可結合IL-1R，其親和力適于所用的測定方法。
從下面的一些優選的實施方案的更詳細描述和權利要求，本發明的特別優選的實施方案將變得顯而易見。
附圖簡述圖1A-1B描繪編碼人抗-IL-1R1抗體重鏈IgG1恒定區的cDNA序列(SEQ ID NO1)(圖1A)和人抗-IL-1R1抗體重鏈IgG1恒定區的氨基酸序列(SEQ ID NO2)(圖1B)。
圖2A-2B描繪編碼人抗-IL-1R1抗體κ鏈恒定區的cDNA序列(SEQID NO3)(圖2A)和人抗-IL-1R1抗體κ鏈恒定區的氨基酸序列(SEQID NO4)(圖2B)。
圖3A-3B描繪編碼人抗-IL-1R1抗體重鏈IgG2恒定區的cDNA序列(SEQ ID NO5)(圖3A)和人抗-IL-1R1抗體重鏈IgG2恒定區的氨基酸序列(SEQ ID NO6)(圖3B)。
圖4A-4B描繪編碼人抗-IL-1R1抗體重鏈IgG4恒定區的cDNA序列(SEQ ID NO7)(圖4A)和人抗-IL-1R1抗體重鏈IgG4恒定區的氨基酸序列(SEQ ID NO8)(圖4B)。
圖5A-5B描繪編碼26F5抗-IL-1R1抗體重鏈可變區的cDNA序列(SEQ ID NO9)(圖5A)和26F5抗-IL-1R1抗體重鏈可變區的氨基酸序列(SEQ ID NO10)(圖5B)。
圖6A-6B描繪編碼26F5抗-IL-1R1抗體κ鏈可變區的cDNA序列(SEQ ID NO11)(圖6A)和26F5抗-IL-1R1抗體1鏈可變區的氨基酸序列(SEQ ID NO12)(圖6B)。
圖7A-7B描繪編碼27F2抗-IL-1R1抗體重鏈可變區的cDNA序列(SEQ ID NO13)(圖7A)和27F2抗-IL-1R1抗體重鏈可變區的氨基酸序列(SEQ ID NO14)(圖7B)。
圖8A-8B描繪編碼15C4抗-IL-1R1抗體重鏈可變區的cDNA序列(SEQ ID NO15)(圖8A)和15C4抗-IL-1R1抗體重鏈可變區的氨基酸序列(SEQ ID NO16)(圖8B)。
圖9A-9B描繪編碼15C4抗-IL-1R1抗體κ鏈可變區的cDNA序列(SEQ ID NO17)(圖9A)和15C4抗-IL-1R1抗體κ鏈可變區的氨基酸序列(SEQ ID NO18)(圖9B)。
圖10顯示了命名為15C4、27F2和26F5的抗-IL-1R1抗體的重鏈的氨基酸序列比對。互補決定區(CDRs)被下劃線標出。26F5的CDR1被指定為SEQ ID NO61；27F2的CDR1被指定為SEQ ID NO62；15C4的CDR1被指定為SEQ ID NO63。26F5的CDR2被指定為SEQ IDNO64；27F2的CDR2被指定為SEQ ID NO65；15C4的CDR2被指定為SEQ ID NO66。26F5的CDR3被指定為SEQ ID NO67；27F2的CDR3被指定為SEQ ID NO68；15C4的CDR3被指定為SEQ ID NO69。
圖11顯示了命名為15C4、27F2和26F5的抗-IL-R1-γ抗體的輕鏈的氨基酸序列比對。26F5/27F2的CDR1被指定為SEQ ID NO70；15C4的CDR1被指定為SEQ ID NO71。26F5/27F2的CDR2被指定為SEQ ID NO72；15C4的CDR2被指定為SEQ ID NO73。26F5/27F2的CDR3被指定為SEQ ID NO74；15C4的CDR3被指定為SEQ ID NO75。
圖12圖解了抗-IL-1R1抗體對IL-1R/IL-1β/IL-1RAcP復合體形成的抑制作用。
圖13圖解了如此處描述并且被命名為15C4的抗-IL-1R1單克隆抗體對IL-1R/IL-1α/IL-1RacP復合體形成的抑制作用。
圖14表示抗-IL-1R1抗體與IgG對照相比，阻斷IL-1β結合而不顯著干擾IL-1ra結合。
圖15A顯示與IL-1ra相比在此處鑒定被命名為15C4、26F5和27F2的抗-IL-1R1抗體抑制原代人軟骨細胞中IL-6的產生。
圖15B顯示與10H7和24E12代表的單克隆抗體類相比，IL-1ra和單克隆抗體15C4和27F2抑制原代人軟骨細胞中IL-6的產生。
圖16顯示與IL-1ra相比被命名為15C4、26F5和27F2的抗-IL-1R1單克隆抗體抑制人全血中IL-6的產生。
圖17描繪了人氨基酸(SEQ ID NO76)和核苷酸(SEQ ID NO77)和大鼠核苷酸(SEQ ID NO78)和氨基酸(SEQ ID NO79)第三個結構域IL-1R1序列。人序列上編號的橫條指出15個不同的突變位點，它們用于構建15種不同的突變蛋白。通過突變導入的大鼠殘基在大鼠核酸序列下列出。
圖18顯示了蛋白質印跡分析，證明IL-1R1突變體的抗-IL-1R1單克隆抗體識別。
圖19表示(I)IL-1信號途徑的活化，其以IL-1β與IL-1R1的結合和IL-1RacP的募集開始，和三類抗-IL-1R1抗體(II)第三結構域表位IL-1阻斷劑，(III)第三結構域表位RAcP阻斷劑，和(IV)第一/第二個結構域表位IL-1阻斷劑。
圖20描繪了具有如此處描述的突變10的15C4和27F2的晶體結構。灰色殘基表示15C4和27F2表位。
圖21描繪了胞外IL-1R1的第三個結構域中的15C4表位。
圖22描繪了胞外IL-1R1的第三個結構域中的24E12表位。
圖23描繪了本發明的抗生物素蛋白-人IL-1R1-FLAG嵌合蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO59)。
圖24描繪了抗生物素蛋白-獼猴IL-1R1-FLAG嵌合蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO60)。重組雞抗生物素蛋白(斜體)通過6個氨基酸組成的連接體連接到獼猴IL-1R1的成熟胞外結構域(下劃線標出，C-末端FLAG標記為粗體)。單獨或者組合導入獼猴序列的人IL-1R1的四個氨基酸在獼猴序列下用粗體表示。表位4用粗體、斜體和下劃線表示。
圖25A顯示了結合IL-1R1的抗-人IL1-R1抗體(抗-huIL1-R1)的蛋白質印跡分析。*指示以5μg/mL使用的抗體，而剩余的抗體以1μg/mL使用。
圖25B顯示了一式兩份的蛋白質印跡實驗的光密度分析概況。
圖26表示復合的基于珠子的結合測定法中抗huIL1R1抗體與抗生物素蛋白IL-1R1-FLAG蛋白的結合。
一些優選實施方案的詳細描述此處所用的章節標題僅用于組織的目的，不應被理解為限制所描述的主題。該申請中引用的所有參考文獻在此次為了任何目的被特別地并入作為參考。
定義如果天然發生的或者實驗誘導的疾病或者醫學病癥與體液或者組織中IL-1的水平升高有關或者如果從身體得到的細胞或者組織在培養中產生水平升高的IL-1，那么疾病或者醫學病癥被認為是“白介素-1(IL-1)介導的疾病”。IL-1的升高的水平可以包括，例如，超過在具體細胞或組織中正常發現的水平的水平，或者可以是在通常不表達IL-1的細胞或組織中可檢測的IL-1水平。在許多情況中，IL-1介導的疾病也被下面的額外的兩個條件識別通過使用IL-1或者IL-1的表達的上調可以在動物中通過實驗模擬的與疾病或醫學病癥相關的病理發現；和(2)用抑制IL-1作用的試劑處理可以抑制或者消除在該疾病或者醫學病癥的實驗動物模型中誘導的病理。在多數IL-1介導的疾病中，三個條件中的至少兩個被滿足，在許多IL-1介導的疾病中，所有三個條件都被滿足。
急性和慢性IL-1-介導的疾病的非排他性列表包括但不限于下面的急性胰腺炎、amyelolateroschlerosis(ALS)、阿爾茨海默氏病、惡病質/厭食，包括AIDS-誘導的惡病質；哮喘和其他肺病、動脈粥樣硬化、自身免疫血管炎、慢性疲勞綜合癥、梭狀芽孢桿菌相關的疾病，包括梭狀芽孢桿菌相關的腹瀉；冠狀病癥和適應癥，包括充血性心力衰竭、冠狀再狹窄、心肌梗塞、心肌功能異常(例如，與膿毒相關)，和冠狀動脈旁路移植；癌，如多發性骨髓瘤和骨髓性(例如，AML或CML)和其他白血病，以及腫瘤轉移、糖尿病(例如，依賴胰島素的糖尿病)、子宮內膜異位癥、發熱、fibromyalgia、腎小球性腎炎、移植物抗宿主病/移植排斥、出血性休克、感覺過敏、炎性腸病、關節的炎性病癥，包括骨關節炎、牛皮癬關節炎和類風濕性關節炎；炎性眼病，如可能與例如角膜移植有關的炎性眼病；局部缺血，包括腦局部缺血(例如，由于創傷導致的腦損傷、癲癇、出血或中風，它們的每一種都可以導致神經退化)；川畸病；學習損傷；肺病(例如，ARDS)；多發性硬化；肌病(例如，肌蛋白代謝，特別是膿毒癥中)；神經毒性(例如，HIV誘導的)；骨質疏松；疼痛，包括癌相關的疼痛；帕金森病、牙周病、pre-term labor、牛皮癬、再灌注損傷、膿毒性休克、放射治療的副作用、顳顎關節病、睡眠障礙、葡萄膜炎；或者損傷、扭傷、軟骨損傷、外傷、矯形手術、感染或其他疾病過程導致的炎癥。下面描述了治療這些急性和慢性IL-1介導的疾病以及其他IL-1-介導的病癥和疾病的本發明方法。
可以用常規技術制備重組DNA、進行寡核苷酸合成，和實施組織培養和轉化(例如，電穿孔、轉染或脂轉染)。可以根據生產商的說明書或者如本領域中通常完成的或者如本文中描述的實施酶反應和純化技術。可以根據本領域中熟知的常規方法或者如本說明書中引用和討論的各種一般性和更具體的參考文獻中描述的實施前面的技術和方法。見，例如，Sambrook等人，2001，Molecular CloningA LaboratoryManual，第三版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，N.Y.，其在此處為了任一目的被并入作為參考。除非提供具體定義，此處描述的與分析化學、合成有機化學，和醫學和藥物化學有關的術語和實驗方法是本領域中熟知的并且通常用于本領域。標準技術可用于化學合成、化學分析、藥物制備、制劑和遞送，和患者的治療。
如按照本公開所用的，下面的術語，除非特別說明，將被理解為具有下面的意思術語“分離的多核苷酸”指主題多核苷酸，(1)不與其他多核苷酸的所有或一部分結合(共價或非共價)，該主題多核苷酸在天然中與這些其他多核苷酸結合，(2)與一種分子結合，該主題多核苷酸在天然中不與該分子結合，或者(3)天然不與任何其他多核苷酸結合。這種分離的多核苷酸可以是基因組DNA、cDNA、mRNA或合成的其他RNA，或者它們的組合。
術語“分離的蛋白”在此處指主題蛋白(1)沒有至少一些其他蛋白，這些蛋白通常被發現與主題蛋白在一起，(2)基本上無來自相同來源，例如，來自相同物種的其他蛋白，(3)被不同物種的細胞表達，(4)已經與至少50％的多核苷酸、脂質、糖類或自然界中與主題物質在一起的其他物質分開，(5)不與天然狀態下通常與“分離的蛋白”結合的蛋白質的部分結合(共價或非共價相互作用)，(6)可操作地與一種多肽結合(通過共價或非共價相互作用)，自然中主題蛋白通常不與該多肽結合，或者(7)不在自然中發生。基因組DNA、cDNA、mRNA或者合成來源的其他RNA，或者它們的任一組合可以編碼這種分離的蛋白。優選地，該分離的蛋白基本上不含有在其天然環境中發現的蛋白質或多肽或者其他污染物，這些蛋白質或多肽或者其他污染物將干擾該分離的蛋白質的治療、診斷、預防、研究或其他的用途。
術語“多肽”或者“蛋白質”指一條或多條氨基酸鏈，其中每條鏈含有通過肽鍵共價連接的氨基酸，并且其中所述多肽或蛋白質可以包含非共價地和/或通過肽鍵共價連接的多條鏈，這些鏈具有天然蛋白的序列，即，通過天然發生的和特異非重組細胞，或者基因工程化的或者重組細胞產生蛋白質，并且包括具有天然蛋白質的氨基酸序列的分子，或者通過天然序列的一個或多個氨基酸的缺失、加入和/或置換得到的分子。術語“多肽”和“蛋白質”特別包括抗-IL1-R1抗體，或者抗-ILR-1R1抗體的一個或多個氨基酸的缺失、加入和/或置換得到的序列。從而，“多肽”或“蛋白質”可以包括一條(稱為“單體”)或多條(稱為“多體”)氨基酸鏈。
術語“多肽片段”指多肽，其可以是單體或多體的，該多肽具有天然發生的或重組產生的多肽的氨基末端缺失、羧基末端缺失，和/或內部缺失或置換。在一些實施方案中，多肽片段可含有至少5到約500個氨基酸長的氨基酸鏈。將明白在一些實施方案中，片段長為至少5、6、8、10、14、20、50、70、100、110、150、200、250、300、350、400、或450個氨基酸。特別有用的多肽片段包括功能結構域，包括結合結構域。對于抗-IL1-R1抗體，有用的片段包括，但不限于CDR區，特別是重或輕鏈的CDR3區；重或輕鏈的可變結構域；抗體鏈的一部分或者其僅僅包括兩個CDR的可變區；等等。
如此處所用的術語“具有免疫學功能的免疫球蛋白片段”指至少含有免疫球蛋白重鏈和輕鏈的可變結構域的多肽片段。本發明的有免疫學功能的免疫球蛋白片段能夠結合配體，防止配體與其受體的結合，中斷配體結合其受體導致的生物學應答，或者它們的任一組合。優選地，本發明的具有免疫學功能的免疫球蛋白片段特異結合IL-1R1。
術語“天然發生的”和“天然的”指用此術語的生物學材料(分子、序列、蛋白質復合體、細胞，等)可以在自然界中發現并且沒有受到人的操作。例如，存在于可從天然來源分離并且沒有被人有意地修飾的生物(包括病毒)中的多肽或者多核苷酸序列是天然發生的。同樣，術語“非天然發生的”或者“非-天然的”指未在自然界中發現或者被人進行結構修飾或者合成的材料。
術語“可操作地連接”指該術語所指的組分處于一種關系中，該關系允許這些組分在適宜的條件下發揮它們的內在功能。例如，指控制序列“可操作地連接”到蛋白質編碼序列，指控制序列連接到該蛋白質編碼序列，從而在與控制序列的轉錄活性相容的條件下實現蛋白質編碼序列的表達。
術語“控制序列“指主題多核苷酸序列可以影響其所連接的編碼序列的表達和加工。這些控制序列的性質可取決于宿主生物。在具體實施方案中，原核生物的控制序列可以包括啟動子、核糖體結合位點，和轉錄終止序列。在其他具體實施方案中，真核生物的控制序列可包括啟動子，其含有轉錄因子的一個或多個識別位點、轉錄增強子序列，和轉錄終止序列。在特定實施方案中，“控制序列”可包括引導序列和/或融合配偶體序列。
術語“多核苷酸”指長至少10個堿基的單鏈或雙鏈核酸聚合物。在一些實施方案中，含有核苷酸的多核苷酸可以是核糖核苷酸或者脫氧核糖核苷酸或者任一類型的核苷酸的修飾形式。所述修飾包括堿基修飾如溴尿苷和次黃苷衍生物，核糖衍生物如2’，3’-二脫氧核糖，和核苷酸間鍵修飾如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、phosphoroanilothioate、phoshoraniladate和phosphoroamidate。該術語DNA的單鏈和雙鏈形式。
術語“寡核苷酸”指含有長200個或更少堿基的多核苷酸。在優選的實施方案中，寡核苷酸長為10到60個堿基。在更優選的實施方案中，寡核苷酸長為12、13、14、15、16、17、18、19、或20到40個堿基。寡核苷酸可以是單鏈或雙鏈的，例如，用于構建突變基因。本發明的寡核苷酸可以是有義或反義寡核苷酸。
術語“天然發生的寡核苷酸”包括脫氧核糖核苷酸和核糖核苷酸。術語“修飾的核苷酸”包括具有修飾的或取代的糖基或者修飾的或取代的堿基的核苷酸。術語“寡核苷酸鍵”包括如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、phosphoroanilothioate、phoshoraniladate和phosphoroamidate等的鍵。見，例如，LaPlanche等人(1986)，Nucl.Acids Res 149081；Stec等人(1984)，J.Am.Chem.Soc.1066077；Stein等人(1988)，Nucl.Acids Res.163209；Zon等人(1991)，Anti-Cancer Drug Design 6539；Zon等人(1991)，Oligonucleotides and AnaloguesA PracticalApproach，87-108頁(F.Eckstein，編者)，Oxford UniversityPress，Oxford England；Stec等人，美國專利號5,151,510；Uhlmann和Peyman(1990)，Chemical Reviews 90543，這些文獻的公開在此為了任何目的被并入作為參考。本發明的寡核苷酸可以含有標記，包括放射標記、熒光標記、半抗原或抗原性標記，以用于檢測測定法。
術語“載體”指用于將編碼信息轉移到宿主細胞的任一種分子(例如，核酸、質粒、或病毒)。
術語“表達載體”或“表達構建體”指適于轉化宿主細胞的載體并且該載體含有核酸序列，該核酸序列指導和/或控制(與宿主細胞聯合)可操作地連接到該核酸序列的一個或多個異源編碼區的表達。表達載體可包括，但不限于，一些序列，該序列影響或控制與其可操作地連接的編碼區的轉錄、翻譯和RNA剪接(如果存在內含子)。
術語“宿主細胞”指已經或者能夠用核酸序列轉化并從而表達所選的目標基因的細胞。該術語包括親本細胞的后代，無論該后代與原來的親本細胞在形態或基因組成上是否相同，只要后代存在所選基因即可。
術語“轉導”指通常通過噬菌體將基因從一個細菌轉移到另一細菌。
“轉導”還指通過逆轉錄病毒的真核細胞序列的獲得和轉移。
術語“轉染”指外來或外源DNA被細胞攝入，當該外源DNA已經被導入細胞膜內時，該細胞已經被“轉染”。許多轉染技術是本領域熟知的并且在本文中公開。見例如，Graham等人，1973，Virology52456；Sambrook等人，2001，Molecular CloningALaboratoryManual，Id.；Davis等人，1986，Basic Methods inMolecular Biology，Elsevier；和Chu等人，1981，Gene13197。這些技術可用于將一種或多種外源DNA部分導入適宜的宿主細胞。
術語“轉化”指細胞遺傳特征的變化，當其被修飾而含有新DNA時，該細胞已經被轉化。例如，當通過轉染、轉導或其他技術使細胞從其天然狀態被遺傳修飾時，該細胞被轉化。轉染或轉導后，轉化DNA可以通過物理整合到細胞的染色體與細胞的DNA重組，或者可以作為附加體元件暫時保留而不被復制，或者可以作為質粒獨立地復制。當轉化DNA隨著細胞的分離而復制時，認為細胞已經被“穩定轉化”。
術語“抗原”指能夠被選擇性結合劑，如抗體結合，并且還能夠用于動物中以產生能夠結合該抗原的一個表位的抗體的分子或者分子的一部分。一個抗原可以具有一個或多個表位。
術語“表位”包括任一決定簇，優選多肽決定簇，其能夠特異結合免疫球蛋白或T-細胞受體。在一些實施方案中，表位決定簇包括分子的化學活性表面基團，如氨基酸、糖側鏈、膦酰基或磺酰基，并且，在一些實施方案中，可以具有特定三維結構特征，和/或特定電荷特征。表位是被抗體結合的抗原的一個區域。在一些實施方案中，當抗體優先識別蛋白質和/或大分子的復雜混合物中其靶標抗原時，可以說該抗體特異結合抗原。在優選的實施方案中，當解離常數小于或等于約10nM，更優選地，當解離常數小于或等于約100pM時，最優選地，當解離常數小于或等于約10pM時，可以說該抗體特異結合抗原。
術語“同一性”指兩個或多個多肽分子或者兩個或多個核酸分子序列之間的關系，該關系通過比較它們的序列確定。在本領域中，“同一性”還指核酸分子或者多肽序列相關性的程度，這可以通過兩個或多個核苷酸或兩個或多個氨基酸的序列之間的匹配來確定。“同一性”測量兩個或多個序列的較小者之間相同匹配的百分數，用特定數學模型或計算機程序(即，“算法”)處理缺口比對(如果存在)。
術語“相似性”關于相關的概念用于本領域中；然而，與“同一性”相比，“相似性”指對相關性的一種量度，其包括相同匹配和保守置換匹配。如果兩個多肽序列有，例如，10/20個相同氨基酸，并且剩余的都是非-保守置換，那么同一性和相似性百分數將都是50％。如果在相同實例中，還有5個位置有保守置換，那么同源性百分數仍然為50％，但是相似性百分數將是75％(15/20)。因此，對于有保守置換的情況，兩個多肽之間的相似性百分數將高于那兩個多肽之間的同一性百分數。
可以通過公知的方法容易地計算有關核酸和多肽的同一性和相似性。這些方法包括，但不限于，《計算分子生物學》(Lesk，A.M.，編者)，1988，Oxford University Press，NewYork；《生物計算信息學和基因組計劃》(Smith，D.W.，ed.)，1993，Academic Press，New York；《序列數據的計算機分析》，第一部，(Griffin，A.M.，和Griffin，H.G.，編者)，1994，Humana Press，New Jersey；vonHeinje，G.，《分子生物學中的序列分析》，1987，Academic Press；《序列分析引物》(Gribskov，M.and Devereux，J.，編者)，1991，M.Stockton Press，New York；Carillo等人，1988，SIAM J.AppliedMath.481073；和Durbin等人，1998，生物序列分析，CambridgeUniversity Press。
確定同一性的優選方法被設計用以得到所檢查的序列之間的最大匹配。確定同一性的方法在公開的可得到的計算機程序中描述。確定兩個序列之間同一性的優選計算機程序方法包括，但不限于，GCG程序包，包括GAP(Devereux等人，1984，Nucl.Acid.Res.12387；Genetics Computer Group，University of Wisconsin，Madison，WI)、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul等人，1990，J.Mol.Biol.215403-410)。BLASTX程序可以公開地從國際生物技術信息中心(NCBI)和其他來源(BLAST手冊，Altschul等，NCB/NLM/NIHBethesda，MD 20894；Altschul等人，1990，如前)得到。熟知的SmithWaterman算法也可用于確定同一性。
用于比對兩個氨基酸序列的一些比對方案可導致這兩個序列的僅僅短的區域匹配，并且該小的比對區域可能具有非常高的序列同一性，即使這兩個全長序列之間沒有明顯的關系。因此，在一些實施方案中，所選擇的比對方法(GAP程序)將導致一種比對，其橫跨靶標多肽的至少50個相鄰氨基酸。
例如，使用計算機算法GAP(Genetics Computer Group，University of Wisconsin，Madison，WI)，比對兩個多肽以得到它們的各自氨基酸的最佳匹配(“匹配的跨度”，如該算法所確定的)，從而確定這兩個多肽的序列同一性百分比。在一些實施方案中，缺口開口罰分(其被計算為三倍平均對角線，其中“平均對角線”是所用的比較矩陣的對角線平均值；“對角線”是具體比較矩陣分配給每個完全氨基酸匹配的得分或數字)和缺口延伸罰分(其通常是缺口開口罰分的十分之一)，以及比較矩陣如PAM250或BLOSUM 62與算法結合使用。在一些實施方案中，算法也使用標準比較矩陣(對于PAM250比較矩陣，見Dayhoff等人，1978，Atlas of Protein Sequence andStructure5345-352；對于BLOSUM 62比較矩陣，見Henikoff等人，1992，Proc.Natl.Acad.Sci USA8910915-10919)。
在一些實施方案中，多肽序列比較的參數包括下面的算法Needleman等人(1970)，J.Mol.Biol.48443-453；比較矩陣Henikoff等人(1992)(如前)的BLOSUM 62；缺口罰分12缺口長度罰分4相似性閾值0GAP程序可以使用上面的參數。在一些實施方案中，上述參數是使用GAP算法比較多肽的默認參數(對于末端缺口無罰分)。
術語“天然發生的”用于氨基酸，指20種常見氨基酸。見Immunology--A Synthesis，第二版，(E.S.Golub和D.R.Gren，編者)，Sinauer AssociatesSunderland，MA(1991)，其在此處為了任何目的被并入作為參考。
多肽類似物通常用于制藥工業作為非肽藥物，其具有類似于模板肽的性質。這些非-肽化合物類型被稱為“肽模擬物”。見Fauchere(1986)，Adv.Drug Res.1529；Veber & Freidinger，1985，TINS392頁；和Evans等人(1987)，J.Med.Chez.301229，這些文獻在此處為了任何目的被并入作為參考。通常通過計算機分子建模來開發這些化合物。結構類似于用于治療的肽的肽模擬物可用于產生類似的治療或預防效果。通常，肽模擬物結構上類似于范例肽或者多肽(即，具有生化性質或藥理學活性的肽或多肽)，如人抗體，但是具有一個或多個肽連接，其任選通過本領域中熟知的方法用選自-CH2-NH-、-CH2-S-、-CH2-CH2-、-CH＝CH-(順式和反式)、-COCH2-、-CH(OH)CH2-、和-CH2SO-的連接代替。在一些實施方案中，可以將共有序列的一個或多個氨基酸用相同類型的D-氨基酸(例如，D-賴氨酸置換L-賴氨酸)進行系統的置換以產生更穩定的肽。此外，通過本領域中公知的方法(Rizo & Gierasch，1992，Ann.Rev.Biochem.61387，此處為了任何目的并入作為參考)；例如，通過加入能夠形成分子內二硫鍵以環化該肽的內部半胱氨酸殘基，可以產生含有共有序列或者基本上相同的共有序列變異的約束肽。
“抗體”或“抗體肽”指完整抗體，或者其結合片段，該結合片段與完整抗體競爭特異結合，抗體或抗體肽包括嵌合抗體、人源化抗體、完全人的抗體和雙特異抗體。在一些實施方案中，通過重組DNA技術產生結合片段。在額外的實施方案中，通過完整抗體的酶或化學切割產生結合片段。結合片段包括，但不限于，Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv、和單鏈抗體。
術語“重鏈”包括全長重鏈和其片段，該片段具有足夠的可變區序列而賦予對IL-1R1的特異性。全長重鏈包括可變區結構域、VH和三個恒定區結構域CH1、CH2和CH3。VH結構域在多肽的氨基末端，CH3結構域在羧基末端。
術語“輕鏈”包括全長輕鏈和其片段，該片段具有足夠的可變區序列而賦予對IL-1R1的特異性。全長輕鏈包括可變區結構域、VL和恒定區結構域CL類似重鏈，輕鏈的可變區結構域在多肽的氨基末端。
“Fab片段”由一條輕鏈和一條重鏈的CH1和可變區組成。Fab分子的重鏈不能與另一重鏈分子形成二硫鍵。
“Fab’片段”含有一條輕鏈和一條重鏈，該重鏈還含有CH1和CH2結構域之間的恒定區，從而兩條重鏈之間可以形成鏈間二硫鍵而形成F(ab’)2分子。
“F(ab’)2片段”含有兩條輕鏈和兩條重鏈，重鏈含有CH1和CH2結構域之間的恒定區的一部分，從而兩條重鏈之間形成鏈間二硫鍵。
“Fv區”含有來自重鏈和輕鏈的可變區，但是缺少恒定區。
“單鏈抗體”是Fv分子，其中重鏈和輕鏈可變區通過柔性連接體連接形成一條多肽鏈，該多肽鏈形成抗原-結合區。在國際專利申請WO88/01649和美國專利號4,946,778和5,260,203中詳細討論了單鏈抗體，這些文獻在此為了任何目的被并入作為參考。
在一些實施方案中，“二價抗體”而不是“多特異的”或“多功能的”抗體被理解為含有具有相同抗原特異性的結合位點。
“雙特異的”或“雙功能的”抗體是具有兩個不同重/輕鏈對和兩個不同結合位點的雜交體抗體。可通過各種方法產生雙特異抗體，這些方法包括，但不限于，雜交瘤的融合或Fab’片段的連接。見，例如，Songsivilai & Lachmann(1990)，Clin.Exp.Immunol.79315-321；Kostelny等人(1992)，J.Immunol.1481547-1553。
在評估根據本發明的抗體結合和特異性時，當抗體過量使受體結合到反受體的數量減少至少約20％、40％、60％、80％、85％，或更多(如在體外競爭結合測定法中測量)時，抗體“基本上”抑制配體對受體的結合。
術語“試劑”指化學化合物、化學化合物的混合物、生物大分子，或者生物材料的提取物。
術語“標記”或“標記的”指可檢測標記物的摻入，例如，通過摻入放射標記的氨基酸或者將生物素部分附著到多肽，該生物素部分可以通過標記的抗生物素蛋白檢測(例如，鏈霉抗生物素蛋白，其優選含有可檢測標記如熒光標記物、化學發光標記物或可以被光學或者比色方法檢測的酶活性)。在一些實施方案中，標記也可以是治療性的。標記多肽和糖蛋白的各種方法是本領域中熟知的并且可有利地用于此處公開的方法中。多肽標記的實例包括，但不限于下面的放射性同位素或放射性核素(例如，3H、14C、15N、35S、90Y、99mTc、111In、125I、131I)、熒光標記(例如，異硫氰酸熒光素(FITC)、羅丹明或鑭系磷光素)、酶標記(例如，辣根過氧化物酶、β-半乳糖苷酶、螢光素酶、堿性磷酸酶)、化學發光標記、半抗原標記如生物素基，和被第二報道分子識別的預定的多肽表位(例如，亮氨酸拉鏈對序列、第二抗體的結合位點、金屬結合結構域、表位標記)。在一些實施方案中，標記通過各種長度的間隔臂(如(CH2)n，其中n＜約20)附著以降低潛在的立體位阻。
術語“生物樣品”包括，但不限于，來自活物或者以前的活物得到的物質的任一數量。這些活物包括，但不限于，人、小鼠、猴、大鼠、兔，和其他動物。這些物質包括，但不限于，血液、血清、尿、細胞、器官、組織、骨、骨髓、淋巴、淋巴結、滑液組織、軟骨細胞、滑液巨噬細胞、內皮細胞、血管組織(特別是發炎的血管組織)，和皮膚。術語“藥學試劑”和“藥物”指當正確施用于患者時能夠誘導所希望的治療效果的化學化合物或組合物。
術語“患者”包括人和動物受試者。
除非上下文特別需要，單數術語將包括復數，復數術語將包括單數。
氨基酸20種天然發生的氨基酸和它們的縮寫按照常規用法。見Immunology--A Synthesis，第二版，(E.S.Golub和D.R.Gren，編者)，Sinauer AssociatesSunderland，MA(1991)，其為了任何目的在此處被并入作為參考。這20種常規氨基酸的立體異構體(例如，D-氨基酸)、非天然氨基酸如α-、α-二取代的氨基酸、N-烷基氨基酸，和其他非常規氨基酸也可以是本發明多肽的適宜組分。非常規氨基酸的實例包括4-羥脯氨酸、Y-羧基谷氨酸、ε-N，N，N-三甲基賴氨酸、ε-N-乙酰基賴氨酸、O-磷絲氨酸、N-乙酰基絲氨酸、N-甲酰甲硫氨酸、3-甲基組氨酸、5-羥基賴氨酸、6-N-甲基精氨酸，和其他類似氨基酸和亞氨基酸(例如，4-羥基脯氨酸)。按照標準用法和常規，在此處所用的多肽符號中，左手方向是氨基末端方向，右手方向是羧基末端。
類似地，除非特別指出，單鏈多核苷酸序列的左手末端是5’末端；雙鏈多核苷酸序列的左手方向被稱為5’方向。新RNA轉錄物的5’到3’方向加入被稱為轉錄方向；DNA鏈上具有和RNA轉錄物相同的序列并且在該RNA轉錄物的5’末端的5’的序列區被稱為“上游序列”；DNA鏈上具有和RNA轉錄物相同的序列并且在該RNA轉錄物的3’末端的3’的序列區被稱為“下游序列”。
天然發生的氨基酸殘基可以基于通常的側鏈性質分成下面的類別1)疏水的正亮氨酸(Nor或Nle)、Met、Ala、Val、Leu、Ile；2)中性親水的Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；3)酸性Asp、Glu；4)堿性His、Lys、Arg；5)影響鏈取向的殘基Gly、Pro；和
6)芳香族的Trp、Tyr、Phe。
保守氨基酸置換可包括這些類別的之一的一個成員與相同類別的另一成員置換。保守氨基酸置換可包括非天然發生的氨基酸殘基，其通常被化學肽合成而不是生物體系中的合成摻入。這些包括肽模擬物和氨基酸部分的其他顛倒或倒轉的形式。
非保守氨基酸置換可包括這些類別之一的一個成員與另一類別的一個成員置換。這些置換的殘基可被，例如，導入到與非人抗體同源的人抗體的區域，或者導入該分子的非同源區。
根據一些實施方案，在進行這些改變時，可以考慮氨基酸的親水指數。基于每個氨基酸的疏水性和電荷特征對其分配親水指數。它們是異亮氨酸(+4.5)、纈氨酸(+4.2)、亮氨酸(+3.8)、苯丙氨酸(+2.8)、半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)、甲硫氨酸(+1.9)、丙氨酸(+1.8)、甘氨酸(-0.4)、蘇氨酸(-0.7)、絲氨酸(-0.8)、色氨酸(-0.9)、酪氨酸(-1.3)、脯氨酸(-1.6)、組氨酸(-3.2)、谷氨酸(-3.5)、谷氨酰胺(-3.5)、天冬氨酸(-3.5)、天冬酰胺(-3.5)、賴氨酸(-3.9)、和精氨酸(-4.5)。
親水氨基酸指數在賦予蛋白質的相互作用生物功能中的重要性是本領域中理解的(見，例如，Kyte等人，1982，J.Mol.Biol.157105-131)。公知一些氨基酸可被具有類似親水指數或得分的其他氨基酸置換并且仍然保持類似的生物學活性。在基于親水指數進行改變時，在一些實施方案中，包括氨基酸的親水指數為±2以內的氨基酸置換。在一些實施方案中，包括氨基酸的親水指數為±1以內的氨基酸置換，在一些實施方案中，包括氨基酸的親水指數為±0.5以內的氨基酸置換。
在本領域中還理解可以基于親水性有效進行像氨基酸的置換，特別當如此產生的生物學功能蛋白質或肽旨在用于如此處所公開的免疫學實施方案中時。在一些實施方案中，蛋白質的最大局部平均親水性(受到其鄰近氨基酸的親水性的控制)與其免疫原性和抗原性，即，與該蛋白質的生物學性質相關。
下面的親水性值被分配給這些氨基酸殘基精氨酸(+3.0)、賴氨酸(+3.0)、天冬氨酸(+3.0±1)、谷氨酸(+3.0±1)、絲氨酸(+0.3)、天冬氨酸(+0.2)、谷氨酰胺(+0.2)、甘氨酸(0)、蘇氨酸(-0.4)、脯氨酸(-0.5±1)、丙氨酸(-0.5)、組氨酸(-0.5)、半胱氨酸(-1.0)、甲硫氨酸(-1.3)、纈氨酸(-1.5)、亮氨酸(-1.8)、異亮氨酸(-1.8)、酪氨酸(-2.3)、苯丙氨酸(-2.5)和色氨酸(-3.4)。在基于相似的親水性值進行改變時，在一些實施方案中，包括氨基酸的親水性值為±2以內的氨基酸置換。在一些實施方案中，包括氨基酸的親水性值為±1以內的氨基酸置換，在一些實施方案中，包括氨基酸的親水性值為±0.5以內的氨基酸置換。可以基于親水性從原來的最初的氨基酸序列鑒定表位。這些區域也稱為“表位核心區”。
示例性氨基酸置換在表1中給出。
表1氨基酸置換
技術人員使用熟知的技術將能夠確定如此處提出的多肽的適宜的變體。在一些實施方案中，本領域技術人員可以鑒定分子的適宜區域，可以改變認為對活性不重要的靶標區域而不破壞分子的活性。在其他實施方案中，技術人員可以鑒定分子的一些殘基和部分，這些殘基和部分在相似的多肽中是保守的。在其他實施方案中，甚至對于生物學活性或對于結構重要的區域也可以進行保守氨基酸置換而不破壞生物學活性或者對多肽結構造成不利影響。
此外，技術人員可以回顧結構-功能研究，這些研究鑒定相似的多肽中對于活性或結構重要的殘基。鑒于這種比較，技術人員可以預測一種蛋白中相應于另一相似蛋白中對活性或結構重要的氨基酸殘基的氨基酸殘基的重要性。技術人員可以選擇對這種被預測重要的氨基酸殘基進行化學上相似的氨基酸置換。
技術人員還可關于類似多肽中的結構分析三維結構和氨基酸序列。考慮到該信息，技術人員可以關于三維結構預測抗體的氨基酸殘基的排列。在一些實施方案中，技術人員可以選擇不對預測位于蛋白質表面上的氨基酸殘基進行根本的改變，因為這些殘基可能參與與其他分子的重要的相互作用。此外，技術人員可以產生試驗變體，其含有每個所希望的氨基酸殘基處的一個氨基酸置換。然后可以使用本領域中技術人員公知的活性測定法篩選這些變體。這些變體可用于收集關于適宜變體的信息。例如，如果發現特定氨基酸殘基的改變導致被破壞的、不希望地降低的，或者不適宜的活性，那么可以避免具有這種改變的變體。換句話說，基于從這些常規實驗收集的信息，本領域技術人員可以容易地確定一些氨基酸，其中進一步置換應該被單獨地或者與其他突變一起被避免。
許多科學出版物已經致力于二級結構的預測。見Moult，1996，Curr.Op.Biotech.7422-427；Chou等人，1974，Biochemistry13222-245；Chou等人，1974，Biochemistry 113211-222；Chou等人，1978，Adv.Enzymol.Relat.Areas Mol.Biol.4745-148；Chou等人，1979，Ann.Rev.Biochem.47251-276；和Chou等人，1979，Biophys.J.26367-384。此外，當前可利用計算機程序輔助預測二級結構。預測二級結構的一種方法是基于同源性建模。例如，序列同源性大于30％，或者相似性大于40％的兩種多肽或蛋白質通常具有相似的結構拓撲。蛋白質結構數據庫(PDB)的最近的擴大已經增強了二級結構，包括多肽或蛋白質結構中的潛在折疊數目的可預測性。見，Holm等人，1999，Nucl.Acid.Res.27244-247。已經提出(Brenner等人，1997，Curr.Op.Struct.Biol.7369-376)在給定多肽或蛋白質中有有限數目的折疊，并且一但解決結構的臨界數目，結構預測將變得十分準確。
預測二級結構的額外的方法包括“穿線(threading)”(Jones，1997，Curr.Opin.Struct.Biol.7377-87；Sippl等人，1996，Structure 415-19)、“概況分析”(Bowie等人，1991，Science253164-170；Gribskov等人，1990，Meth.Enzym.183146-159；Gribskov等人，1987，Proc.Nat.Acad.Sci.844355-4358)和“進化連接”(見Holm，1999，如前；和Brenner，1997，如前)。
在一些實施方案中，抗體變體包括糖基化變體，其中與親本多肽的氨基酸序列相比，糖基化位點的數目和/或類型已經被改變。在一些實施方案中，蛋白質變體含有比天然蛋白或多或少的N-連接的糖基化位點。N-連接的糖基化位點的特征是序列Asn-X-Ser或Asn-X-Thr，其中被指定為X的氨基酸殘基可以是除了脯氨酸之外的任一氨基酸殘基。產生該序列的氨基酸殘基置換為N-連接的糖鏈的加入提供了潛在的新位點。備選地，除去該序列的置換將除去已有的N-連接的糖鏈。還提供了N-連接的糖鏈的重排，其中一個或多個N-連接的糖基化位點(典型為天然發生的)被除去并產生一個或多個新的N-連接的位點。額外優選的抗體變體包括半胱氨酸變體，其中與親本氨基酸序列相比，一個或多個半胱氨酸殘基被缺失或者被另一氨基酸(例如絲氨酸)置換。當例如，分離不可溶的包含體之后抗體必須被再折疊成生物活性構象時，可以使用半胱氨酸變體。半胱氨酸變體通常比天然蛋白具有更少的半胱氨酸殘基，并且通常具有偶數半胱氨酸殘基以最小化未配對半胱氨酸殘基導致的相互作用。
根據一些實施方案，氨基酸殘基置換為(1)減小對蛋白質酶解的敏感性，(2)減小對氧化的敏感性，(3)改變對形成蛋白質復合體的結合親和性，(4)改變結合親和性，和/或(5)賦予或改變這些多肽上其他生理生化或功能性質的置換。根據一些實施方案，可以在天然發生的序列(在一些實施方案中，在形成分子間接觸的結構域之外的多肽部分中)中進行單個或多個氨基酸置換(在一些實施方案中，保守氨基酸置換)。在優選實施方案中，保守氨基酸置換通常不實質性地改變親本序列的結構特征(例如，置換氨基酸應該不傾向于斷開親本序列中發生的螺旋，或者破壞表征親本序列的其他類型的二級結構)。在Proteins，Structures and Molecular Principles，(Creighton，編者)，1984，W.H.Freeman and Company，New York；Introduction to ProteinStructure(C.Branden和J.Tooze，編者)，1991，GarlandPublishing，New York，N.Y.；和Thornton等人(1991)，Nature354105中描述了本領域公知的多肽二級結構和三級結構的實例。
抗體的制備天然發生的抗體結構單位通常含有四聚體。每種該四聚體通常由兩對相同的多肽鏈組成，每一對具有一條完全長度的“輕”鏈(通常分子量為約25kDa)和一條完全長度的“重”鏈(通常分子量為約50-70kDa)。每條鏈的氨基末端部分通常包括約100到110個或更多氨基酸的可變區，其通常負責抗原識別。每條鏈的羧基末端部分通常限定了負責效應物功能的恒定區。人輕鏈通常被分為κ和λ輕鏈。重鏈通常分為μ、δ、γ、α、或ε，并且分別限定抗體的同種型為IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。IgG具有幾種亞類，包括，但不限于，IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。IgM的亞類包括，但不限于，IgM1和IgM2。IgA被類似的細分成亞類，其包括，但不限于，IgA1和IgA2。在全長輕鏈和重鏈中，典型地，約12或更多氨基酸的“J”區連接可變區和恒定區，重鏈也包括約10個或更多氨基酸的“D”區。見，例如，FundamentalImmunology，第7章，第二版，(Paul，W.，等人)，1989，Raven Press，N.Y.(為了所有目的被完整并入作為參考)。每個輕鏈/重鏈對的可變區的組合形成了抗原結合位點。
每個重鏈和輕鏈的可變區通常表現出相同的一般結構，其含有四個相對保守的框架區(FR)，該框架區被三個高度區連接，該高度區稱為互補決定區或CDRs。來自每一對的兩條鏈的CDRs被框架區排列，該排列使得能夠結合特定表位。從N-末端到C-末端，輕鏈和重鏈可變區通常都含有結構域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。通常按照Kabat Sequences of Proteins of Immunologcal Interest(1987和1991，National Institutes of Health，Bethesda，Md.)、Chothia & Lesk，1987，J.Mol.Biol.196901-917，或Chothia等人，1989，Nature 342878-883)的定義將氨基酸分配給每個結構域。
隨著單克隆抗體的開發，抗體成為有用和有趣的藥物劑。使用通過連續培養細胞系產生抗體分子的任一方法產生單克隆抗體。制備單克隆抗體的適宜方法的實例包括Kohler等人(1975，Nature256495-497)的雜交瘤方法和人B-細胞雜交瘤方法(Kozbor，1984，J.Immunol.1333001；和Brodeur等人，1987，Monoclonal AntibodyProduction Techniques and Applications，(Marcel Dekker，Inc.，New York)，51-63頁)。
可以修飾單克隆抗體以用作治療劑。一個實例是“嵌合”抗體，其中重鏈和/或輕鏈的一部分與來自特定物種或屬于特定抗體類別或亞類的抗體中相應序列相同或同源，而鏈的剩余部分與來自另一物種或屬于另一抗體類別或亞類的抗體中相應序列相同或同源。其他實例是這些抗體的片段，只要這些片段表現出所希望的生物學活性。見，美國專利號4,816,567；和Morrison等人(1985)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA816851-6855。相關發展是“CDR-嫁接的”抗體，其中抗體含有來自特定物種或屬于特定抗體類別或亞類的一個或多個互補確定區(CDRs)，而抗體鏈的剩余部分來自另一物種或屬于另一抗體類別或亞類的抗體中相應序列相同或同源。
另一發展是“人源化”抗體。人源化非人抗體的方法是本領域中熟知的(見美國專利號5,585,089，和5,693,762)。通常，通過非-人動物產生人源化抗體，然后將通常來自該抗體的非-抗原識別部分的一些氨基酸殘基修飾以與相應同種型的人抗體中的所述殘基同源。可以使用例如，本領域中描述的方法(Jones等人，1986，Nature 321522-525；Riechmann等人，1988，Nature 332323-327；Verhoeyen等人，1988，Science 2391534-1536)，通過將嚙齒類可變區的至少一部分置換成人抗體的相應部分實施人源化。
更近并且更有希望的是開發人抗體而不用將抗原暴露于人(“完全人抗體”)。使用能夠產生人抗體的所有組成成分而不產生內源小鼠免疫球蛋白的轉基因動物(例如，小鼠)，通過用抗原(通常具有至少7個相鄰氨基酸)(任選綴合到載體)免疫產生這些抗體。見例如，Jakobovits等人，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA902551-2555；Jakobovits等人，1993，Nature362255-258；和Bruggermann等人，1993，Year in Immunol.733。在這些方法的一個實施例中，通過將編碼小鼠免疫球蛋白重鏈和輕鏈的內源小鼠免疫球蛋白基因座無能化，并將編碼人重鏈和輕鏈蛋白的基因座插入小鼠的基因組產生轉基因小鼠。部分修飾的動物沒有完全修飾，將這些部分修飾的動物雜交得到具有所有所希望的免疫系統修飾的動物。當施用免疫原時，這些轉基因動物產生對具有人(而不是鼠)氨基酸序列的那些抗原免疫特異的抗體，包括可變區。見PCT公布號WO96/33735和WO94/02602，這些文獻被并入作為參考。其他方法在美國專利號5,545,807、PCT公布號WO91/10741、WO90/04036、和EP 546073B1和EP 546073A1中描述，這些文獻被并入作為參考。也可以通過在宿主細胞中表達重組DNA或者在如此處描述的雜交瘤細胞中表達產生人抗體。
也可以從噬菌體展示文庫(如在Hoogenboom等人，1991，J.Mol.Biol.227381；和Marks等人，1991，J.Mol.Biol.222581中公開)產生完全人抗體。這些方法通過將抗體的所有組成組分展示在絲狀噬菌體的表面上，然后通過噬菌體對所選抗原的結合選擇噬菌體來模擬免疫選擇。一種該技術在PCT公布號WO99/10494中描述，其被并入作為參考，該文獻描述了使用這種方法分離MPL-和msk-受體的高親和性和功能激動抗體。
一旦確定了編碼這些抗體的核苷酸序列，也可以通過重組方法產生嵌合抗體、CDR-嫁接的抗體、人源化抗體和完全的人抗體。使用本領域中公知的材料和方法將編碼抗體的核酸導入宿主細胞并表達。
本發明提供了針對人IL-1R1的一種或多種完全人單克隆抗體。優選地，這些抗體結合IL-1R1的第三個結構域。在優選的實施方案中，本發明提供了編碼重鏈和輕鏈免疫球蛋白分子，特別是相應于其可變區的序列的核苷酸序列和含有重鏈和輕鏈免疫球蛋白分子，特別是相應于其可變區的序列的氨基酸序列。在優選的實施方案中，提供了相應于互補決定區(CDRs)，特別是CDR1到CDR3的序列。在另外的優選實施方案中，本發明提供了雜交瘤細胞系，其表達這些免疫球蛋白分子和從中產生的單克隆抗體，最優選地，純化的針對人IL-1R1的人單克隆抗體。
克隆和在酵母人工染色體(YACs)中重構Mb大小的人基因座并將酵母人工染色體導入小鼠種系提供了一種有利的方法以闡明非常大或者初步作圖的基因座的功能組分以及產生人類疾病的有用模型。此外，使用這些技術將小鼠基因座用它們的人等價物置換對于發育期間人基因產物的表達和調節、它們與其他系統的交流，和它們與疾病誘導和發展的關系提供了獨特的理解。
這種策略的一個重要的實際應用是小鼠體液免疫系統的“人源化”。將人免疫球蛋白(Ig)基因座導入小鼠中，其中內源Ig基因已經被失活，該導入為研究抗體的潛在的程序化表達和裝配以及它們在B-細胞發育中的角色提供了機會。此外，這種策略為產生完全人單克隆抗體(Mabs)，特別用作治療劑的完全人單克隆抗體提供了來源。預期完全人抗體使小鼠或小鼠來源的Mabs的內在免疫原性和變應原性應答最小，從而增加治療應用中所施用的抗體的效能和安全性。完全人抗體可用于治療慢性和復發性人疾病，如骨關節炎、類風濕性關節炎，和其他炎癥，其治療需要反復的抗體施用。
本領域技術人員可以用人Ig基因座大片段工程化小鼠抗體產生缺陷的小鼠品系從而這些小鼠產生人抗體而不產生小鼠抗體。大的人Ig片段可以保存大可變基因多樣性以及抗體產生和表達的正確調節。利用抗體多樣化和選擇以及對人蛋白免疫耐受的缺乏的小鼠機器，這些小鼠品系中再生的人抗體所有組成組分產生針對任一目標抗原，包括人抗原的高親和性抗體。使用雜交瘤技術，可以產生和選擇具有所希望的特異性的抗原-特異的人MAbs。
在一些實施方案中，技術人員可以使用來自不同于人的物種的恒定區以及這些小鼠中的人可變區以產生嵌合抗體。用全長IL-1R1、IL-1R1的可溶形式，或者其片段免疫這些動物可以產生本發明的抗體。見，例如，國際專利申請公布號WO93/12227。
本發明的抗-IL-1R1抗體的輕鏈和重鏈可變區的CDRs可以嫁接到相同或另一物種的框架區(FRs)。在一些實施方案中，抗-IL-1R1抗體的輕鏈和重鏈可變區的CDRs可以嫁接到共有人FRs。為了產生共有人FRs，對來自幾種人重鏈或輕鏈氨基酸序列的FRs進行比對以鑒定共有氨基酸序列。抗-IL-1R1抗體的重鏈或輕鏈的FRs可以被來自不同重鏈或輕鏈的FRs代替。抗-IL-1R1抗體的重鏈和輕鏈的FRs中的稀有氨基酸通常不被置換，然而剩下的FR氨基酸可被置換。稀有氨基酸是特定氨基酸，在FR中它們所處的位置中不通常發現這些氨基酸。本發明的抗-IL-1R1抗體的嫁接的可變區可以與不同于抗IL-1R1抗體的恒定區一起使用。備選地，嫁接的可變區是單鏈Fv抗體的部分。CDR嫁接在例如，美國專利號6,180,370、5,693,762、5,693,761、5,585,089、和5,530,101中描述，它們在此處為了任何目的被并入作為參考。
在一些實施方案中，本發明提供了抗IL1-R1抗體，其含有具有SEQID NO61、SEQ ID NO62、或SEQ ID NO63的氨基酸序列的人重鏈CDR1區；具有SEQ ID NO64、SEQ ID NO65、或SEQ ID NO66的氨基酸序列的人重鏈CDR2區；和/或具有SEQ ID NO67、SEQID NO68、或SEQ ID NO69的氨基酸序列的人重鏈CDR3區。
在另一實施方案中，本發明提供了抗-IL1-R1抗體，其含有具有SEQ ID NO70或SEQ ID NO71的氨基酸序列的人輕鏈CDR1區；具有SEQ ID NO72或SEQ ID NO73的氨基酸序列的人重鏈CDR2區；和/或具有SEQ ID NO74或SEQ ID NO75的氨基酸序列的人重鏈CDR3區。
優選使用轉基因小鼠制備本發明的抗體，該轉基因小鼠具有插入小鼠的抗體產生細胞中的人抗體-產生基因座的實質性部分，并且該小鼠被進一步工程化而在產生內源的鼠抗體方面有缺陷。這些小鼠能夠產生人免疫球蛋白分子和抗體并且不產生鼠免疫球蛋白分子和抗體或者所產生的量充分減少。用于實現該結果的技術在本說明書中公開的專利、申請和參考文獻中公開。在優選的實施方案中，技術人員可以使用如國際專利申請公布號WO 98/24893中公開的方法，該專利申請為了任何目的被并入作為參考。還見Mendez等人，1997，NatureGenetics 15146-156，該文獻為了任何目的被并入作為參考。
可通過各種技術產生本發明的單克隆抗體(MAbs)，這些技術包括常規單克隆抗體方法學，例如，Kohler和Milstein，1975，Nature 256495的標準體細胞雜交技術。盡管原則上優選體細胞雜交方法，但是也可使用產生單克隆抗體的其他技術，例如，B-淋巴細胞的病毒或癌基因轉化。
在優選的實施方案中，可以使用稱為“HuMab”小鼠的小鼠產生針對IL-1R1的人單克隆抗體，該小鼠含有人免疫球蛋白基因微基因座，該微基因座編碼未重排的人重鏈(μ和γ)和κ輕鏈免疫球蛋白序列，以及靶定突變，該突變失活內源的μ和κ鏈基因座。Lonberg等人，1994，Nature 368856-859。因此，小鼠表現出小鼠IgM或κ表達減少和免疫應答的降低，所導入的人重鏈和輕鏈轉基因經歷類別轉換和體細胞突變以產生高親和性的人IgGκ單克隆抗體。Lonberg等人，如前；Lonberg和Huszar，1995，Intern.Rev.Immunol.1365-93；Harding和Lonberg，1995，Ann.N.Y.Acad.Sci.764536-546。HuMab小鼠的制備在Taylor等人，1992，Nucleic Acids Res.206287-6295；Chen等人，1993，International Immunology 5647-656；Tuaillon等人，1994，J.Immunol.1522912-2920；Lonberg等人，1994，Nature 368856-859；Lonberg，1994，Handbookof Exp.Pharmacology 11349-101；Taylor等人，1994，InternationalImmunology579-591；Lonberg & Huszar，1995，-Intern.Rev.Immunol.1365-93；Harding & Lonberg，1995，Ann.N.Y.Acad.Sci 764536-546；Fishwild等人，1996，NatureBiotechnology 14845-851中詳細描述，所有它們的內容在此處被完整并入作為參考。還見美國專利號Lonberg和Kay的5,545,806、5,569,825、5,625,126、5,633,425、5,789,650、5,877,397、5,661,016、5,814,318、5,874,299、和5,770,429；以及Surani等人的美國專利號5,545,807；1993年公布的國際專利申請公布號WO93/1227；1992年12月23日公布的WO92/22646；和1992年3月19日公布的WO92/03918，所有這些文獻的公開被完整并入作為參考。備選地，在下面的實施例中描述的HCo7和HCo12轉基因小鼠品系被用于產生人抗-IL-1R1抗體。
備選地，如下產生IL-1R1特異的全人單克隆抗體。用目標IL-1R1-相關的抗原免疫含有人免疫球蛋白基因的轉基因小鼠。從表達抗體的小鼠得到淋巴細胞(如B-細胞)。這些回收的細胞與骨髓-型細胞系融合以制備無限增殖的雜交瘤細胞系，并且篩選和選擇這些雜交瘤細胞系以鑒定產生目標抗原特異的抗體的雜交瘤細胞系。在一些實施方案中，提供了產生IL-1R1特異的抗體的雜交瘤細胞系。
在優選的實施方案中，通過雜交瘤系產生本發明的抗體。在這些實施方案中，本發明的抗體結合IL-1R1，它們之間的解離常數(Kd)約為4pM到100pM。在本發明的一些實施方案中，抗體結合IL-1R1，Kd小于約20pM。在其他實施方案中，本發明的抗體結合IL-1R1的第三個結構域。在圖17中顯示了人和大鼠IL1-R1的第三個結構域的核苷酸和氨基酸序列。
在優選的實施方案中，本發明的抗體是IgG1、IgG2或IgG4同種型抗體，最優選IgG2同種型。在本發明的優選實施方案中，抗體含有人κ輕鏈和人IgG1、IgG2或IgG4重鏈。在具體實施方案中，抗體的可變區連接到不同于IgG1、IgG2或IgG4同種型的恒定區的恒定區。在一些實施方案中，本發明的抗體已經被克隆以在哺乳動物細胞中表達。
在一些實施方案中，對抗IL-1R1抗體的重鏈和輕鏈的保守氨基酸置換(和編碼核苷酸的相應修飾)產生的抗IL-1R1抗體將具有類似于抗IL-1R1抗體的功能和化學特征。相比，通過選擇重鏈和輕鏈的氨基酸序列中的置換可以實現抗-IL-1R1抗體的功能和/或化學特征的實質的修飾，這些置換在它們對保持(a)置換的區域中分子主鏈的結構，例如，作為折疊或螺旋構象，(b)靶標位點處分子的電荷或疏水性，或(c)側鏈的體積的效果方面顯著不同。
例如，“保守性氨基酸置換“可包括用非天然殘基置換天然氨基酸殘基，從而對該位置上氨基酸殘基的極性或電荷影響很小或沒有影響。此外，多肽中的任一天然殘基也可以用丙氨酸置換，如以前關于“丙氨酸掃描誘變”所描述的(Wells，1991，Methods Enzymol.202390(編者J.J.Langone)，Academic Press，London)。
本領域技術人員在希望時可以確定所希望的氨基酸置換(保守的或非保守的)。在一些實施方案中，氨基酸置換可用于鑒定抗-IL-1R1抗體的重要殘基，或者增加或降低此處描述的抗-IL-1R1抗體的親和性。
在備選實施方案中，本發明的抗體可以在不同于雜交瘤細胞系的細胞系中表達。在這些實施方案中，編碼特定抗體的序列可用于轉化適宜的哺乳動物宿主細胞。根據這些實施方案，可以利用將多核苷酸導入宿主細胞的任一公知的方法實現轉化，該方法包括，例如，將多核苷酸包裝在病毒(或者病毒載體)中并用該病毒(或載體)轉導宿主細胞，或者通過本領域中公知的轉染方法。這些方法由美國專利號4,399,216、4,912,040、4,740,461和4,959,455(所有都為了任何目的在此處被并入作為參考)例證。通常，所用的轉化方法取決于所要轉化的宿主。將異源多核苷酸導入哺乳動物細胞的方法是本領域中熟知的并且包括，但不限于，葡聚糖-介導的轉染、磷酸鈣沉淀、1，5-二甲基-1，5-二氮十一亞甲基聚甲溴化物(polybrene)介導的轉染、原生質體融合、電穿孔、多核苷酸在脂質體中的包被、和DNA微注射到細胞核中。
根據本發明的一些實施方案，使用標準連接技術將本發明的IL-1R1抗體的重鏈恒定區、重鏈可變區、輕鏈恒定區，或輕鏈可變區的氨基酸序列的核酸分子插入適宜的表達載體中。在優選的實施方案中，IL-1R1重鏈或輕鏈恒定區附加到適宜的可變區的C-末端并被連接到表達載體。所選的載體通常在所用的具體宿主細胞中是有功能的(即，載體與宿主細胞機器相容從而可以發生基因的擴增和/或基因的表達)。對于表達載體綜述，見Goeddel(編者)，1990，Meth.Enzymol.卷185，Academic Press.N.Y。
通常，用于任一種宿主細胞的表達載體將含有用于質粒維持和外源核苷酸序列的克隆和表達的序列。這些統稱為“側翼序列”的序列在一些實施方案中將通常包括一種或多種下面的核苷酸序列啟動子、一種或多種增強子序列、復制原點、轉錄終止序列、含有供體和受體剪接位點的完整內含子序列、編碼多肽分泌的引導序列的序列、核糖體結合位點、聚腺苷酸序列、用于插入編碼所要表達的多肽的核酸的多接頭區，和可選擇的標記物元件。下面討論這些序列的每一種。
任選地，載體可含有“標記”編碼序列，即位于IL-1R1多肽編碼序列的5’或3’末端的寡核苷酸分子；該寡核苷酸序列編碼聚His(如六聚His)，或者另一“標記”，如FLAG、HA(流感病毒血凝素)，或者myc，通過商業途徑可得到這些標記的抗體。該標記在多肽表達時通常被融合到該多肽，并且可作為親和純化或者從宿主細胞檢測IL-1R1抗體的方式。可以例如，通使用針對標記的抗體作為親和基質通過柱層析實現親和層析。任選地，可通過各種方法如使用一些用于切割的肽酶從純化的IL-1R1多肽除去標記，側翼序列可以是同源的(例如，來自與宿主細胞相同的物種和/或品系)、異源的(例如，來自不同于宿主細胞種類或品系的物種)、雜交的(例如，來自一種以上來源的側翼序列的組合)、合成的或天然的。同樣地，側翼序列的來源可以是任一種原核或真核生物，任一種脊椎動物或無脊椎動物生物，或者任一種植物，只要側翼序列在宿主細胞機器中是有功能的并且可被宿主細胞機器活化。
可通過本領域中熟知的方法之一得到用于本發明的載體的側翼序列。通常，用于此處的側翼序列將事先已經通過作圖和/或通過限制性內切酶消化鑒定并從而可以使用適宜的限制性內切酶從適當的組織來源分離。在一些情況中，可以知道側翼序列的全部核苷酸序列。這里，可以用此處描述關于核酸合成或克隆的方法合成側翼序列。
當知道了側翼序列的所有或僅一部分時，可以使用聚合酶鏈式反應(PCR)和/或通過使用適宜的探針如寡核苷酸和/或來自相同或另一物種的側翼序列片段篩選基因組文庫得到該側翼序列。當側翼序列是未知的時候，可以從更大的DNA分離含有側翼序列的DNA片段，該更大的DNA可能含有，例如，編碼序列或者甚至另一個或幾個基因。可通過限制性內切酶消化產生適當的DNA片段，然后使用瓊脂糖凝膠純化、Qiagen柱層析(Chatsworth，CA)，或者技術人員公知的其他方法實現分離。實現該目的的適宜酶的選擇對本領域普通技術人員是顯而易見的。
復制原點通常是通過商業途徑購買的那些原核表達載體的一部分，并且該原點有助于載體在宿主細胞中的擴增。如果所選載體不含有復制原點，可以基于公知的序列化學合成復制原點，并將其連接到載體。例如，來自質粒pBR322(New England Biolabs，Beverly，MA)的復制原點適于大多數革蘭氏陰性細菌，并且各種病毒原點(例如，SV40、多形瘤、腺病毒、皰疹性口腔炎病毒(VSV)，或者乳頭瘤病毒如HPV或BPV)可用于哺乳動物細胞中克隆載體。通常，哺乳動物表達載體不需要復制原點組分(例如，通常需要SV40原點僅僅是因為其也還含有病毒早啟動子)。
轉錄終止序列通常位于多肽編碼區末端的3’并且用于終止轉錄。通常，原核細胞中的轉錄終止序列是富含G-C的片段，接著是聚-T序列。盡管可以從文庫容易地克隆該序列或者甚至作為載體的一部分通過商業途徑購買，但是也可以使用核酸合成的方法(如本文中所描述的)容易地合成該序列。
選擇性標記基因編碼宿主細胞在選擇性培養基上存活和生長所必需的蛋白。典型的選擇標記基因編碼的蛋白(a)賦予原核宿主細胞對抗體或其他毒素，例如氨芐西林、四環素，或者卡那霉素抗性；(b)細胞的互補營養缺陷型缺陷；或(c)提供從復雜或已知成分培養基不能得到的關鍵營養。優選的可選擇標記是卡那霉素抗性基因、氨芐西林抗性基因，和四環素抗性基因。新霉素抗性基因也可以用于原核和真核宿主細胞的選擇。
其他可選擇基因也可用于擴增將要表達的基因。擴增是一種過程，其中更需要用于產生對生長或細胞存活關鍵的蛋白質的基因通常在重組細胞的連續世代的染色體中串聯重復。哺乳動物的適宜的選擇性標記的實例包括二氫葉酸還原酶(DHFR)和無啟動子的胸苷激酶。哺乳動物細胞轉化體被置于選擇壓力下，其中轉化體通過載體中存在的選擇性標記唯一地幸存。通過將所轉化的細胞培養在培養基中選擇劑濃度不斷增加的條件下來加強選擇壓力，從而導致選擇性基因和編碼另一種基因的DNA，如含有IL-1R1多肽的載體都擴增。結果，從擴增的DNA合成量不斷增加的多肽如IL-1R1多肽。
核糖體-結合位點通常是mRNA的翻譯起始所必須的并且其特征是SD序列(原核生物)或Kozak序列(真核生物)。該元件通常位于啟動子的3’和所要表達的多肽的編碼區的5’。
在一些情況中，如當在真核宿主細胞表達系統中希望糖基化時，可以操作各種前序列或者原序列以提高糖基化或產率。例如，可以改變特定信號肽的肽酶切割位點，或者加入原序列，其也影響糖基化。最后的蛋白質產物可以具有-1位(相對于成熟蛋白的第一個氨基酸)的一個或多個與表達關聯的額外的氨基酸，所述氨基酸可能沒有被完全除去。例如，最終蛋白質產物可以具有在肽酶切割位點發現的一個或多個氨基酸殘基，其附著到氨基末端。備選地，如果酶在成熟多肽的這些區域內切割，那么使用一些酶切割位點可導致所希望的多肽的稍微截短的形式。
本發明的表達和克隆載體將通常含有啟動子，其被宿主生物識別并可操作地連接到編碼抗IL-1R1抗體的分子。啟動子是位于結構基因的起始密碼子的上游(例如，5’)的未翻譯序列(通常約100到1000bp)，其控制結構基因的轉錄。啟動子通常分成兩種類別之一可誘導的啟動子和組成性啟動子。可誘導的啟動子應答培養條件中的某種變化，如營養物的存在或缺乏，或者溫度的改變，而啟動處于它們控制下的DNA的轉錄水平增加。另一方面，組成性啟動子，啟動連續的基因產物產生；即，對基因表達幾乎沒有或者沒有控制。熟知許多啟動子，它們被各種潛在的宿主細胞識別。通過限制酶消化從源DNA除去啟動子序列并將所希望的啟動子序列插入載體，可以將適宜的啟動子可操作地連接到編碼含有本發明的抗IL-1R1抗體的重鏈或輕鏈的DNA。
用于酵母宿主的適宜的啟動子也是本領域中公知的。酵母增強子可有利地與酵母啟動子一起使用。用于哺乳動物宿主細胞的適宜的啟動子是熟知的并且包括，但不限于，從病毒如多形瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(如腺病毒2)、牛乳頭瘤病毒、鳥肉瘤病毒、巨細胞病毒、逆轉錄病毒、乙型肝炎病毒和最優選地猿病毒40(SV40)的基因組得到的啟動子。其他適宜的哺乳動物啟動子包括異源哺乳動物啟動子，例如，熱休克啟動子和肌動蛋白啟動子。
另外的目標啟動子包括，但不限于SV40早啟動子區(Bernoist和Chambon，1981，Nature290304-10)；CMV啟動子；包含在勞氏肉瘤病毒的3’長末端重復的啟動子(Yamamoto等人，1980，Cell22787-97)；皰疹胸苷激酶啟動子(Wagner等人，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.USA781444-45)；金屬硫蛋白基因的調節序列(Brinster等人，1982，Nature29639-42)；原核生物表達載體如β-內酰胺酶啟動子(Villa-Kamaroff等人，1978，Proc.Natl.Acad.Sci.USA753727-31)；或者tac啟動子(DeBoer等人，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.USA8021-25)。還作為目標的是下面的動物轉錄控制區，其表現出組織特異性并且已經用于轉基因動物在胰腺腺泡細胞中有活性的彈性蛋白酶I基因控制區(Swift等人，1984，Cell38639-46；Ornitz等人，1986，Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.50399-409(1986)；MacDonald，1987，Hepatology7425-515)；在胰腺β細胞中有活性的胰島素基因控制區(Hanahan，1985，Nature315115-22)；在淋巴細胞中有活性的免疫球蛋白基因控制區(Grosschedl等人，1984，Cell38647-58；Adames等人，1985，Nature318533-38；Alexander etal.，1987，Mol.Cell.Biol.71436-44)；在睪丸、乳腺、淋巴和肥大細胞中有活性的小鼠乳腺腫瘤病毒控制區(Leder等人，1986，Cell45485-95)；在肝臟中有活性的白蛋白基因控制區(Pinkert等人，1987，Genes and Devel.1268-76)；在肝臟中有活性的α-feto-蛋白基因控制區(Krumlauf等人，1985，Mol.Cell.Biol.51639-48；Hammer等人，1987，Science23553-58)；在肝臟中有活性的α1-抗胰蛋白酶基因控制區(Kelsey等人，1987，Genes and Devel.1161-71)；在骨髓細胞中有活性的β-珠蛋白基因控制區(Mogram等人，1985，Nature315338-40；Kollias etal.，1986，Cell4689-94)；在腦中的少突膠質細胞中有活性的髓磷脂堿性蛋白基因控制區(Readhead等人，1987，Cell48703-12)；在骨骼肌中有活性的肌球蛋白輕鏈-2基因控制區(Sani，1985，Nature314283-86)；和在下丘腦中有活性的促性腺釋放激素基因控制區(Mason等人，1986，Science2341372-78)。
增強子序列可插入到載體以增強高級真核生物對編碼本發明的抗IL-1R1抗體的輕鏈或重鏈的DNA的轉錄。增強子是DNA的順式作用元件，通常長約10-300bp，作用于啟動子以增加轉錄。增強子是相對獨立于方向和位置的。已經在轉錄單位的5’和3’發現了增強子。公知可以從哺乳動物基因(例如，珠蛋白、彈性蛋白酶、白蛋白、α-feto-蛋白和胰島素)得到一些增強子序列。然而，通常使用來自病毒的增強子。本領域中公知的SV40增強子、巨細胞病毒早啟動子增強子、多形瘤增強子和腺病毒增強子是真核細胞啟動子活化的示例性增強元件。盡管增強子可以在核酸分子的5’或3’位置剪接到載體中，但是其通常位于啟動子的5’位。
可以從起始載體如通過商業途徑可得到的載體構建本發明的表達載體。這些載體可以含有或不含有所有希望的側翼序列。當一種或多種此處描述的側翼序列不存在于該載體時，可以單獨地得到這些側翼序列并將它們連接到載體。得到每種側翼序列的方法是本領域技術人員熟知的。
已經構建載體并且編碼抗-IL-1R1抗體的輕鏈或重鏈或者輕鏈和重鏈的核酸分子已經被插入到載體的適當位點后，所完成的載體可被插入到適宜的宿主細胞以擴增和/或多肽表達。可以通過熟知的方法將抗-IL-1R1抗體的表達載體轉化到所選的宿主細胞，該方法包括轉染、感染、磷酸鈣共沉淀、電穿孔、微注射、脂轉染、DEAE-葡聚糖介導的轉染，或者其他公知的技術。所選的方法將部分是所用的宿主細胞類型的函數。這些方法和其他適宜的方法是技術人員熟知的，并且在例如，Sambrook等人，(如前)中提出。
宿主細胞當在適宜的條件下培養時合成抗-IL-1R1抗體，隨后從培養基(如果宿主細胞將抗體分泌到培養基)或者直接從產生抗體的宿主細胞(如果其不被分泌)回收抗IL-1R1抗體。適宜的宿主細胞的選擇將取決于各種因素，如所希望的表達水平、所希望的或者活性所必要的多肽修飾(如糖基化或磷酸化)和折疊成生物活性分子的容易性。
可以得到的作為表達宿主的哺乳動物細胞系是本領域中熟知的并且包括，但不限于，可從美國典型培養物保藏中心(ATCC)得到的許多無限增殖的細胞系，包括但不限于中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、HeLa細胞、幼倉鼠腎(BHK)細胞、猴腎細胞(COS)、人肝細胞癌細胞(例如，HepG2)，和許多其他細胞系。在一些實施方案中，可以通過確定哪些細胞系具有高表達水平并產生具有組成性IL-1R1結合性質的抗體來選擇細胞系。在另一實施方案中，可以從來自不產生自身抗體但是能夠產生并分泌異源抗體的B細胞譜系選擇細胞系(例如，小鼠骨髓瘤細胞系NS0和SP2/0)。
本發明的抗體可用于檢測生物樣品中的IL-1R1和鑒定產生IL-1R1蛋白的細胞或組織。所述抗體結合IL-1R1并阻斷與其他結合化合物的相互作用，該抗體具有治療性用途，用以調節IL-1介導的疾病。在優選的實施方案中，針對IL-1R1的抗體可以阻斷IL-1R1與IL-1β或IL-1α的結合，從而導致IL-1信號轉導級聯的破壞。
特異結合IL-1R1的本發明抗體可用于治療IL-1介導的疾病，如下面所討論的。所述抗體可用于結合測定法中檢測IL-1R1結合以及它們抑制IL-1R1與IL-1β和IL-1R輔助蛋白(IL-1RAcP)或與IL-1α和IL-1RAcP形成復合物的能力。
在一些實施方案中，本發明提供了治療與IL-1介導的炎癥反應或者IL-1介導的免疫調節反應有關的醫學失調。本發明的方法包括將本發明的抗-IL1R1抗體施用于受到IL-1介導的炎癥或免疫調節疾病折磨的個體。如此處所用的，術語“病”、“疾病”、“醫學病癥”或“異常病癥”可以與術語“醫學失調”互換使用。
在具體實施方案中，本發明的方法包括對患者施用本發明的抗IL-1R1抗體，從而防止IL-1與其細胞表面受體(IL-1R1)的結合。
為了治療特征為IL-1的異常或過量表達或者IL-1信號異常或過量的醫學失調，將含有本發明的IL-1R1型I抗體施用于患者，所施用的量和持續的時間足夠引起反映該失調的嚴重性的至少一種指標的持續改善。如果患者在相隔1到4周的至少兩個場合表現出改善，那么認為該改善是“持續的”。改善的程度可基于病征或癥狀確定，并且也可以使用用于患者的調查表，如生命質量調查表。
可以評估反映患者疾病的程度的各種指標以確定治療的量和時間是否足夠。在使用第一劑抗體之前通過檢查患者確定所選的一種或多種指標的基線值。優選地，在第一劑施用前約60天內進行基線檢查。如果IL-1R抗體被用于治療急性癥狀，如，例如，治療外傷性損傷(外傷性膝損傷、中風、頭損傷，等)，那么在損傷或事件發生后從實際出發盡快施用第一劑。
通過抗體劑量的反復施用引起改善，直到患者表現出所選一種或多種指標高于基線的改善。在治療慢性病癥時，通過在至少1個月或更長，例如，1、2、或3個月或更長或者無限地期間內反復施用該藥物得到改善的程度。對于治療急性病癥，1到6周，或者甚至一劑通常就足夠了。
盡管根據一種或多種指標，治療后患者的疾病程度似乎改善了，但是可以無限地在相同水平上或者以更低的劑量或頻率繼續治療。一旦治療已經減小或停止，如果癥狀以后再次出現，其可能恢復到最初的水平。
任何一種有效施用途徑都可用于治療性施用抗體。可以通過關節內、靜脈內、肌內、病灶內、腹膜內、顱內、吸入或者通過大丸劑皮下注射或者通過連續灌輸注射抗體。例如，肺部疾病可包括鼻內和吸入方法。其他適宜的施用方法包括植入物的緩釋、氣溶膠吸入、滴眼液、口服制劑，包括丸劑、糖漿劑、錠劑或咀嚼樹膠，和局部制劑如洗劑、凝膠劑、噴霧劑、軟膏劑或其他適宜的技術。當治療與肺部失調有關的疾病時，通過吸入施用尤其有利。
在本發明的一個實施方案中，本發明的抗-IL-1R1抗體可以每月一次施用。在另一實施方案中，每兩周一次或每周一次施用抗體以治療此處公開的各種醫學失調。在再一個實施方案中，每周施用抗體至少兩次，在另一實施方案中，每天施用抗體至少一次。成年患者是18歲或以上的人。如果注射，那么每個成人劑量的有效量為1-200mg/m2或1-40mg/m2或約5-25mg/m2。備選地，可以施用flat劑量，其量為2-400mg/劑、2-100mg/劑或約10-80mg/劑。如果劑量將以每周施用1次以上，那么示例性劑量范圍和前面描述的劑量范圍相同或更低。在本發明的一個實施方案中，通過將含有1L-1受體抗體的注射可接受的制劑以80-100mg/劑施用，或者備選地含有80mg/劑的制劑治療下述各種適應癥。劑量被反復施用。如果使用不同于注射的施用途徑，那么根據標準醫學慣例適當調節劑量。例如，如果施用途徑是吸入，那么給藥可以是每周1到7次，劑量范圍為10mg/劑到50mg/劑。
在優選的實施方案中，本發明還提供了藥物組合物，其含有治療有效量的一種或多種本發明抗體以及藥學上可接受的稀釋劑、載體、溶解劑、乳化劑、防腐劑和/或佐劑。優選地，可接受的制劑物質在所用的劑量和濃度下對接受者是無毒的。在優選的實施方案中，提供了含有治療有效量的抗-IL-1R1抗體的藥物組合物。
在一些實施方案中，藥物組合物可含有用于改變、保持或保存例如，pH、摩爾滲透壓濃度、粘度、透明度、顏色、等滲性、氣味、無菌性、穩定性、溶解或釋放速度、組合物的吸收或滲透的制劑物質。在這些實施方案中，適宜的制劑物質包括，但不限于，氨基酸(如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、精氨酸或賴氨酸)、抗微生物劑、抗氧化劑(如抗壞血酸、亞硫酸鈉或亞硫酸氫鈉)、緩沖劑(如硼酸鹽、碳酸氫鹽、Tris-HCl、檸檬酸鹽、磷酸鹽或其他有機酸)、膨脹劑(如甘露醇或甘氨酸)、螯合劑(如乙二胺四乙酸(EDTA))、絡合劑(如咖啡因、聚乙烯吡咯烷酮、β-環糊精或羥丙基-β-環糊精)、填充劑、單糖、二糖、和其他糖類(如葡萄糖、甘露糖或糊精)、蛋白質(如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白)、著色劑、增味劑和稀釋劑、乳化劑、親水性聚合物(如聚乙烯吡咯烷酮)、低分子量多肽、鹽形成反離子(如鈉)、防腐劑(如苯扎氯銨、苯甲酸、水楊酸、硫柳汞、苯乙醇、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、雙氯苯雙胍己烷、山梨酸或過氧化氫)、溶劑(如甘油、丙二醇或聚乙二醇)、糖醇(如甘露醇或山梨醇)、懸浮劑、表面活性劑或增濕劑(如pluronics、PEG、聚山梨糖酯、聚山梨醇酯如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、triton、trimethamine、卵磷脂、膽固醇、tyloxapal)、穩定增強劑(如蔗糖或山梨醇)、張力增強劑(如堿金屬鹵化物，優選氯化鈉或鉀、甘露醇、山梨醇)、遞送載體、稀釋劑、賦形劑和/或藥學佐劑。見，Remington′s Pharmaceutical Sciences，第18版，(A.R.Gennaro，編者)，1990，Mack Publishing Company。
在一些實施方案中，本領域技術人員根據例如，所希望的施用途徑、遞送方式和所希望的劑量確定最佳藥物組合物。見，例如，Remington′s Pharmaceutical Sciences，如前。在一些實施方案中，這些組合物可影響本發明抗體的物理狀態、穩定性、體內釋放速度和體內清除速度。
在一些實施方案中，藥物組合物中的最初載體在性質上可以是水性或非水性的。例如，適宜的載體可以是注射用水、生理鹽水或人工腦脊液，可能補充用于腸胃外施用的組合物中常用的其他物質。中性緩沖鹽水或者與血清白蛋白混合的鹽水是進一步的示例性載體。在優選的實施方案中，藥物組合物含有pH約7.0-8.5的Tris緩沖液、pH約4.0-5.5的乙酸緩沖液，并且可以還包括山梨醇或適宜的替代物。在本發明的一些實施方案中，通過將所選的具有所希望的純度的組合物與任選的配制劑(Remington′s Pharmaceutical Sciences，如前)以凍干餅或者水性溶液的形式混合可以制備用于保存的抗IL-1R1抗體組合物。此外，在一些實施方案中，可以用適宜的賦形劑如蔗糖將抗IL-1R1抗體產物制備成凍干物。
可以選擇本發明的藥物組合物用于腸胃外遞送。可以選擇該組合物用于吸入或通過消化道遞送，如口服。這些藥學上可接受的組合物的制備是本領域內的技術。
制劑組分存在的濃度優選為施用位點可接受的。在一些實施方案中，用緩沖劑保持組合物在生理pH或者稍低的pH，典型地為約5到約8的pH范圍。
當預期腸胃外施用時，用于本發明的治療性組合物可以以無致熱原、腸胃外可接受的水性溶液的形式提供，該水性溶液含有藥學上可接受的載體中的所希望的抗IL-1R1抗體。用于腸胃外注射的尤其適宜的載體是無菌蒸餾水，其中抗IL-1R1抗體被制備成無菌、等滲溶液，適當保存。在一些實施方案中，該制劑可包括所希望的分子與一種試劑，如微球體、生物可侵蝕的微粒、聚合的化合物(如聚乳酸或聚乙醇酸)珠子或脂質體的制劑，該試劑可以使通過depot注射遞送的藥物緩釋或控釋。在一些實施方案中，也可以使用透明質酸，其具有促進循環中持續時間的作用。在一些實施方案中，可施用可移植的藥物遞送裝置導入所希望的抗體分子。
可以制備用于吸入的本發明的藥物組合物。在這些實施方案中，抗IL-1R1抗體被制備成用于吸入的干粉。在優選的實施方案中，抗IL-1R1抗體吸入溶液也可以與推進劑配制用于氣溶膠遞送。在一些實施方案中，溶液可被霧化。在國際專利公布號WO94/20069中還描述了肺部施用和制備方法，該專利被并入作為參考，其描述了化學修飾的蛋白的肺部遞送。
還預期制劑可以口服施用。以這種方式施用的抗-IL-1R1抗體可以與或不與用于固體劑型如片劑或膠囊劑的配制中通常使用的載體配制。在一些實施方案中，可以設計膠囊劑在胃腸道的某一點釋放制劑的活性部分，在該點生物利用度最大并且前-系統性降解最小。還可以包括額外的試劑以促進抗-IL-R1抗體的吸收。也可以利用稀釋劑、增味劑、低熔點蠟、植物油、潤滑劑、懸浮劑、片劑崩解劑，和結合劑。
優選提供本發明的藥物組合物含有與適于片劑生產的無毒賦形劑混合的有效量的一種或多種抗-IL-1R1抗體。將片劑溶于無菌水，或者另一種適宜的載體中，可以以單位-劑量形式制備溶液。適宜的賦形劑包括，但不限于，惰性稀釋劑，如碳酸鈣、碳酸鈉或碳酸氫鈉、乳糖，或磷酸鈣；或者結合劑，如淀粉、明膠、或阿拉伯樹膠；或者潤滑劑如硬脂酸鎂、硬脂酸或滑石粉。
另外的藥物組合物對于本領域技術人員將是顯然的，包括含有緩慢-或受控的遞送制劑的抗-IL-1R1抗體的制劑。制備各種其他緩慢-或受控的遞送方式的技術，如脂質體載體、生物-易侵蝕的微粒或者有孔珠和depot注射液，是本領域技術人員公知的。見，例如，國際專利公布號WO93/15722，其被并入參考文獻，該專利描述了用于遞送藥物組合物的有孔聚合微粒的控制。緩釋制劑可包括成形的物品形式的半透性聚合物基質，例如，膜劑或微膠囊劑。緩釋基質可包括聚酯、水凝膠、聚交酯(如在美國專利號3,773,919和歐洲專利公布號EP058481中公開的)、L-谷氨酸和γ乙基-L-谷氨酸的共聚物(Sidman等人，1983，Biopolymers 22547-556)、聚(2-羥乙基-甲基丙烯酸酯)(Langer等人，1981，J.Biomed.Mater.Res.15167-277和Ianger，1982，Chem.Tech.1298-105)、乙烯-乙酸乙烯共聚物(EVA)(Langer，如前)、或聚-D(-)-3-羥基丁酸(歐洲專利申請公布號EP133，988)。緩釋組合物也可以包括脂質體，其可通過本領域中公知的若干方法之一制備。見，例如，Eppstein等人，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 823688-3692；歐洲專利申請公布號EP 036,676、EP 088,046和EP 143,949。
體內施用的藥物組合物通常以無菌制劑提供。可通過無菌濾膜過濾實現除菌。當組合物被凍干時，可以在凍干和重構之前或之后用該方法除菌。用于腸胃外施用的組合物可以以凍干的形式保存或在溶液中保存。腸胃外組合物通常置于具有無菌入口的容器中，例如，靜脈內溶液包或者具有塞子的小瓶，該塞子可被皮下注射針頭穿透。
一旦已經配制了藥物組合物，其可以作為溶液、懸浮液、凝膠劑、乳劑、固體，或者作為脫水或凍干的粉末保存在無菌小瓶中。這些制劑可以以直接使用的形式保存或者以施用前重構的形式(例如，凍干的)保存。
本發明還提供了產生單劑量施用形式的試劑盒。本發明的試劑盒可以每個含有具有干燥蛋白的第一容器和具有水性制劑的第二容器。在本發明的一些實施方案中，提供了含有一個或多個室的預裝注射器(例如，液體注射器或lyosyringes)的試劑盒。
所用的含有抗-IL-1R1抗體的藥物組合物的有效量將取決于例如，治療背景和目標。本領域技術人員將明白治療的適宜劑量水平將部分根據所遞送的分子、所用的抗IL-IL-1R1抗體的適應癥、施用途徑和患者的大小(體重、體表面積或器官大小)和/或狀況(年齡和一般健康)而變。在一些實施方案中，臨床醫生可以確定劑量和更改施用途徑以得到最佳治療效果。典型劑量可以為約0.1μg/kg到約100mg/kg或者以上，這取決于上述因素。在優選的實施方案中，劑量可以為約0.1μg/kg到約100mg/kg；更優選地，約1μg/kg到約100mg/kg；甚至更優選5μg/kg到約100mg/kg。
給藥頻率將取決于所用的制劑中特定抗IL-1R1抗體的藥物動力學參數。通常，臨床醫生施用該組合物直到劑量達到實現所希望的效果的劑量。因此，組合物可以作為單劑施用，或者作為兩個或多個劑量(可以含有或不含有相同量的所希望的分子)隨時間施用，或者作為連續灌注液通過植入裝置或導管施用。適宜劑量的其他完善可由本領域普通技術人員常規地進行并且在他們常規實施的任務的范圍內。可通過使用適宜的劑量-應答數據確定合適的劑量。
藥物組合物的施用途徑是按照公知的方法，例如，經口，通過靜脈內注射、腹膜內、腦內(實質內)、腦室內、肌內、眼內、動脈內、門脈內，或病灶內途徑，通過緩釋系統或者通過植入裝置。在一些實施方案中，可通過大丸注射或通過連續灌注，或通過植入裝置施用組合物。
也可以通過膜、海綿或其他適宜的材料的植入局部施用該組合物，在這些材料上已經吸附或包被所希望的分子。在一些實施方案中，當使用植入裝置時，該裝置可植入適宜的組織或器官，或者可通過擴散、定時釋放的大丸劑，或者連續施用遞送所希望的分子。
還希望體外使用根據本發明的抗-IL-1R1抗體藥物組合物。在這些實例中，從患者除去的細胞、組織或器官被暴露于抗-IL-1R1抗體藥物組合物，之后這些細胞、組織和/或器官被隨后植入該患者體內。
具體地，，通過植入使用如此處描述的方法基因工程化而表達和分泌多肽的一些細胞遞送抗IL-1R1抗體。在一些實施方案中，這些細胞可以是動物或人細胞，并且可以是自體的、異體的或異種的。在一些實施方案中，細胞可被永生化。在其他實施方案中，為了減少免疫應答的機會，可以將細胞膠囊化以避免周圍組織的浸潤。在其他實施方案中，膠囊化材料典型地為生物相容的、半透性聚合物殼或膜，其允許蛋白質產物的釋放但是防止患者的免疫系統或者來自周圍組織的其他有害因子對細胞的破壞。
在一些實施方案中，本發明還包括將本發明的抗IL-1R1抗體或者藥物組合物與施用于同一患者的一種或多種其他藥物同時施用，根據適于該藥物的使用方案使用每種藥物。這包括預治療、同時治療、順次治療或交替方案。這些藥物的實例包括，但不限于，抗病毒劑、抗生素、鎮痛劑、皮質類固醇、炎癥細胞因子的拮抗劑、疾病-修飾性抗風濕病藥物(DMARDs)和非類固醇消炎劑。
在其他實施方案中，本發明的抗IL-1R1抗體或藥物組合物可以與其他細胞因子抑制劑組合施用，這些抑制劑包括拮抗，例如，RANKL、TGFβ、IFNγ、IL-6或IL-8和TNF，尤其TNFα的抑制劑。本發明的抗體與IL-6組合可用于治療和預防抽搐的復發，這些抽搐包括GABAA受體拮抗誘導的抽搐、與EEG猝發相關的抽搐和癲癇狀態期間發生的運動邊緣系統抽搐。本發明的抗體與INFγ抑制劑組合可用于治療自發性肺纖維樣變性和膀胱纖維樣變性。與IL-1受體抗體和RANKL抑制劑，例如，RANKL抗體組合可用于預防各種情況的骨破壞，包括但不限于各種風濕性失調、骨質疏松、多發性骨髓瘤或導致骨退化的其他惡性腫瘤，或者針對防止向骨轉移的抗腫瘤治療，或者與假體磨損碎片或與牙周炎相關的骨破壞。此外，本發明的抗體可以與IL-17抑制劑如IL-17受體的可溶形式(如IL-17RFc)或者與IL-17抗體或IL-17R抗體、IL-18結合蛋白、IL-19受體的可溶形式，和IL-18抗體、針對IL-18受體的抗體或者針對CD30-配體或針對CD4的抗體組合施用。
本發明還包括使用本發明的抗IL-1R1抗體或藥物組合物與TNF抑制劑，優選TNFRFc(ENBREL)和上述細胞因子或細胞因子抑制劑(它們是組合治療中的活性劑)的任一組合組合治療此處公開的醫學失調的方法。例如，根據本發明，組合治療方法可用于治療類風濕性關節炎、中風、哮喘、牛皮癬等。
此處描述的抗IL-1R1抗體或藥物組合物可以有效治療的病癥包括肺病如哮喘、慢性阻塞性肺病、肺泡蛋白質沉積、博來霉素誘導的肺病變和纖維樣變性、放射誘導的肺纖維樣變性、膀胱纖維樣變性、肺中的膠原積累、和ARDS，所有這些都可以用針對IL-1R的抗體和IL-4抑制劑和/或IL-13抑制劑，例如抑制IL-13和IL-4活性的IL-4R抗體組合治療。本發明公開的抗體和藥物組合物也可用于治療支氣管肺發育不良(BPD)、慢性阻塞性肺病(例如，肺氣腫和慢性支氣管炎)，和早產兒的慢性纖維樣變性肺病。此外，本發明的化合物、組合物和組合治療可用于治療職業性肺疾病，包括石棉肺、煤炭工人的塵肺、硅肺或與長期暴露于細小顆粒有關的類似病癥。在本發明的其他方面，所公開的化合物、組合物和組合治療用于治療bronchioliteransorganizing pneumonia、肺纖維樣變性，包括自發的肺纖維樣變性和放射誘導的肺纖維樣變性、肺肉樣瘤病；和變態反應，包括過敏性鼻炎、接觸性皮炎、特應性皮炎和哮喘。
這些組合物還可用于治療各種皮膚失調的患者，這些皮膚失調包括但不限于皰疹樣皮炎(Duhring氏病)、特應性皮炎、接觸性皮炎、風疹(包括慢性自發性風疹)，和自身免疫水皰病，包括尋常天皰瘡和大皰性類天皰瘡。可以用IL-1R抗體和IL-4和/或IL-13抑制劑組合治療的其他疾病包括myesthenia gravis、肉樣瘤病，包括肺肉樣瘤病、硬皮病、反應性關節炎、IgE過多綜合癥、多發性硬化和自發性嗜酸性粒細胞過多綜合癥。該組合物還可用于治療對藥物的變態反應和作為變態反應免疫治療的佐劑。
此處描述的IL-1受體抗體和藥物組合物用于治療原生動物疾病，包括瘧疾和血吸蟲病，和治療麻風的結節性紅斑、細菌或病毒性腦膜炎、結核病，包括肺結核；細菌或病毒感染繼發性肺炎和感染性單核細胞增多癥。
單獨用此處公開的藥物組合物或抗IL-1R1抗體或者與其他細胞因子抑制劑組合可以治療和/或防止心血管失調。可以治療的心血管失調包括主動脈動脈瘤；包括腹部主動脈動脈瘤、急性冠狀動脈綜合癥、動脈炎；血管阻塞，包括腦動脈阻塞；冠狀動脈旁路手術并發癥；局部缺血/再灌注損傷；心臟病，包括動脈粥樣硬化性心臟病、心肌炎，包括慢性自身免疫心肌炎和病毒性心肌炎；心力衰竭，包括慢性心力衰竭、充血性心力衰竭、心力衰竭的惡病體質；心肌梗塞、心臟手術或頸動脈氣囊血管成形術后的再狹窄和/或動脈粥樣硬化；沉默性心肌局部缺血、左心室泵機能障礙、左心室輔助裝置的移植后并發癥、Raynaud氏現象、血栓性靜脈炎、血管炎，包括川崎血管炎；靜脈閉塞病、巨細胞動脈炎、Wegener氏肉芽腫病、心肺旁路手術后精神錯亂，和Schoenlein-Henoch紫癜。
在一些實施方案中，本發明的抗IL-1R1抗體和藥物組合物也可用于治療慢性疼痛病癥，如慢性骨盆痛，包括慢性前列腺炎/骨盆痛綜合癥，和皰疹后痛。
本發明的抗IL-1R1抗體和藥物組合物也可用于治療內分泌系統失調，包括青少年發作糖尿病(包括自身免疫糖尿病和胰島素依賴的糖尿病)和成年發作糖尿病(包括非胰島素依賴的和肥胖-介導的糖尿病)。這些治療包括與糖尿病相關的繼發性病癥，如糖尿病性肥胖、糖尿病患者中腎移植排斥、肥胖-介導的胰島素抗性，和腎衰竭，其自身可以與蛋白尿和高血壓有關。用這些化合物也可以治療其他內分泌失調，包括多囊卵巢病、X-連鎖的腦白質腎上腺萎縮癥、甲狀腺功能不足和甲狀腺炎，包括Hashimoto氏甲狀腺炎(即，自身免疫甲狀腺炎)、甲狀腺細胞功能異常，包括甲狀腺機能異常綜合癥。
本發明的抗IL-1R1抗體或藥物組合物單獨或與其他治療劑組合可以治療或預防胃腸道系統的病癥。這些病癥包括腹腔病、Crohn氏病；潰瘍性結腸炎；自發性胃輕癱；胰腺炎，包括慢性胰腺炎；急性胰腺炎、炎性腸病和潰瘍，包括胃潰瘍和十二指腸潰瘍。
用此處描述的抗IL-1R1抗體或藥物組合物也可以治療或預防泌尿生殖系統的失調。這些失調包括腎小球性腎炎，包括自身免疫腎小球性腎炎、暴露于毒素導致的腎小球性腎炎或者溶血性鏈球菌或其他感染劑感染的繼發性腎小球性腎炎。本發明的化合物、組合物和組合治療還可以治療的是尿毒癥綜合癥及其臨床并發癥(例如，腎衰竭、貧血和肥大性心肌病)，包括與暴露于毒素、藥物或其他原因相關的尿毒癥綜合癥。本發明的抗體可以治療或預防膽囊壁炎癥導致吸收功能變化引起的并發癥。這些并發癥包括膽石病(膽結石)和膽總管石病(膽道結石)和膽石病和膽總管石病的復發。本發明的化合物、組合物和組合療法可治療的其他病癥是血液透析并發癥；前列腺病癥，包括良性前列腺增生、非細菌性前列腺炎和慢性前列腺炎；和血液透析并發癥。
此處還提供了使用本發明的抗IL-1R1抗體、組合物和組合治療治療各種血液和腫瘤疾病的方法。例如，抗IL-1R1抗體，單獨地或者與上述其他細胞因子抑制劑或其他活性劑組合，可用于治療各種形式的癌癥，包括急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、EB病毒陽性鼻咽癌、神經膠質瘤、結腸癌、胃癌、前列腺癌、腎細胞癌、宮頸癌和卵巢癌，肺癌(SCLC和NSCLC)，包括癌相關的惡病體質、疲勞、乏力、惡病體質和血鈣過多的副腫瘤性綜合癥。實體瘤，包括肉瘤、骨肉瘤，和癌，如腺癌(例如，乳腺癌)和鱗狀細胞癌也是可以治療的。其他可治療的癌包括esophogeal癌、胃癌、膽囊癌、白血病，包括急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、骨髓白血病，慢性或急性成淋巴細胞白血病和毛細胞白血病。用主題化合物、組合物和組合治療也可以治療其他具有侵染轉移潛力的惡性腫瘤，包括多發性骨髓瘤。
此外，所公開的抗-IL-1R1抗體可用于治療貧血和血樣失調，包括慢性自發性中性粒細胞減少、慢性病貧血、再生障礙性貧血，包括Fanconi氏再生障礙性貧血；自發性血小板減少性紫癜(ITP)、血栓性血小板減少性紫癜、myelodysplastic綜合癥(包括頑固性貧血、環狀成高鐵紅細胞頑固性貧血、過量原始細胞頑固性貧血、轉化的過量原始細胞頑固性貧血)；骨髓纖維化/骨髓外化生；和鐮刀形細胞vasocclusive crisis。
本發明的抗-IL-1R1抗體也可以治療各種淋巴增殖性失調，包括自身免疫淋巴增殖綜合癥(ALPS)、慢性成淋巴細胞白血病、毛細胞白血病、慢性淋巴白血病、外周T-細胞淋巴瘤、小淋巴細胞淋巴瘤、套(mantle)細胞淋巴瘤、濾泡細胞淋巴瘤、非洲淋巴瘤、EB病毒陽性T-細胞淋巴瘤、組織細胞淋巴瘤、Hodgkin氏病、擴散侵染性淋巴瘤、急性淋巴白血病、Tγ淋巴增殖病、皮膚B細胞淋巴瘤、皮膚T細胞淋巴瘤(例如，阿利貝爾氏病)和Sézary綜合癥。
本發明的抗體可以治療遺傳病癥如Gaucher氏病、Huntington病、線性IgA病，和肌營養不良。
通過所公開的IL-1受體抗體或者藥物組合物可以治療或預防的其他病癥包括頭或脊髓損傷導致的病癥，包括頭部創傷導致的硬膜下血腫。關于該治療，所描述的組合物和組合適于預防顱側神經損傷和防止和治療頸源性頭痛。所描述的組合物和組合還適宜治療與腦輻射相關的神經學上的副作用。
本發明的抗IL-1R1抗體和藥物組合物還用于治療肝臟病癥如肝炎，包括急性酒精肝炎、急性藥物誘導的或病毒性肝炎、甲肝、乙肝和丙肝、硬化性膽管炎、肝竇狀隙上皮，和未知原因導致的肝炎癥。
本發明的抗IL-1R1抗體或藥物組合物可以治療與聽力損失和與異常IL-1表達有關的失調。這些失調包括耳蝸神經相關的聽力損失，認為其由自身免疫過程導致，即，自身免疫神經損失。本發明的抗IL-1R1抗體或藥物組合物還可以治療或預防Meniere氏綜合癥和膽脂瘤、通常與聽力損失有關的中耳失調。
此處描述的抗體還可以治療骨和關節的非-關節炎性失調。這些失調包括導致骨損失的破骨細胞失調，如但不限于骨質疏松，包括絕經后骨質疏松、骨關節炎、導致牙齒松動或脫落的牙周炎，和關節替換后的假肢松動(通常與對磨損碎片的炎癥反應有關)。該后一病癥也稱為“矯形植入骨質溶解”。本發明的化合物、組合物和組合治療可以治療的另一病癥是暫時性下頜骨關節功能障礙(TMJ)。
本發明的抗IL-1R1抗體或者藥物組合物還可用于治療風濕性失調，包括成年人和青少年類風濕性關節炎；硬皮病、系統性紅斑狼瘡、痛風、骨關節炎、風濕性多肌痛、血清陰性脊椎關節病，包括關節強直性脊椎柱炎，和Reiter氏病，牛皮癬關節炎和慢性Lyme關節炎。本發明的抗體還可用于治療隨意肌和其他肌肉的炎癥，包括皮肌炎、包含體肌炎、多肌炎，和淋巴管平滑肌瘤病。
本發明抗體和藥物組合物的另一用途是治療和/或預防原發性淀粉樣變和繼發性淀粉樣變，其是各種病癥的特征，這些病癥包括阿爾茨海默氏病、繼發反應性淀粉樣變；Down氏綜合癥；和透析-相關的淀粉樣變。本發明的抗體或藥物組合物還可以治療遺傳性周期性發熱綜合癥，包括家族性地中海發熱、免疫球蛋白D過多和周期性發熱綜合癥與TNF-受體相關的周期性綜合癥(TRAPS)。
在其他實施方案中，本發明的抗體或藥物組合物可用于治療皮膚或粘膜相關的失調。這些失調包括皮膚棘怪松解病，包括Darier氏病、毛囊角化和尋常天皰瘡。可用本發明的抗體治療的額外的皮膚失調包括粉刺、酒糟鼻、斑禿、口瘡性口炎、大皰性類天皰瘡、燒傷、濕疹、紅斑，包括多形性紅斑和大皰性多形性紅斑(Stevens-Johnson綜合癥)、炎性皮膚病、扁平苔癬、線性IgA大皰病(兒童的慢性大皰性皮炎)、皮膚彈性喪失、粘膜表面潰瘍，包括胃潰瘍，嗜中性粒細胞皮炎(Sweet氏綜合癥)、皮肌炎、德佛札氏病、牛皮癬、壞疽性膿皮病、多中心網狀內皮系統組織細胞瘤病和毒性表皮壞死溶解。本發明的治療和組合治療可以治療的其他皮膚相關的病癥包括皰疹樣皮炎。
本發明的抗體或藥物組合物可以治療的額外的失調包括宿主抗移植物病，和實體器官移植，如心臟、肝臟、皮膚、腎臟、肺(肺移植氣道閉塞)或其他移植，包括骨髓抑制導致的并發癥。
所公開的抗-IL-1R1抗體或藥物組合物也可以治療或預防眼失調，其包括視網膜剝離，和炎性眼病，包括與吸煙和黃斑變性有關的炎性眼病。
如此處描述的抗體或藥物組合物可用于治療影響女性生殖系統的失調。實例包括，但不限于，多移植衰竭(multiple implant failure)/不育、胎兒流產綜合癥或IV胚胎流產(自發性流產)；驚厥前懷孕或驚厥；子宮內膜異位、慢性宮頸炎、和早產。
此外，本發明的抗體或藥物組合物可用于治療和/或預防坐骨神經痛、老化癥狀、嚴重藥物反應(例如，IL-2毒性或博來霉素誘導的肺病和纖維化)，或者在心臟或其他手術中同種異型血紅細胞輸血之前、之間或之后抑制炎癥反應，或者用于治療四肢或關節的外傷性損傷，如外傷性膝損傷。用所公開的抗IL-1R1抗體或藥物組合物可以治療的各種其他醫學病癥包括多發性硬化、Behcet氏綜合癥、Sjogren氏綜合癥、自身免疫溶血性貧血、β地中海貧血、肌萎縮性側索硬化(LouGehrig氏病)、帕金森氏病、和不明原因的腱鞘炎，以及與遺傳缺陷相關的各種自身免疫失調或疾病，包括x-連鎖的智力遲鈍。
此外，本發明的抗IL-1R1抗體或藥物組合物可用于治療中樞神經系統(CNS)損傷，包括中樞神經系統中炎癥刺激過程中神經毒性神經遞質釋放的影響，和抑制或防止中樞神經系統損傷部位膠質疤痕的形成。關于癲癇和抽搐的治療，本發明的抗IL-1R1抗體或藥物組合物可用于減小復發性抽搐的嚴重性和次數，并減小抽搐的有害作用的嚴重性，減少神經元損失、神經元退化和與抽搐相關的神經膠質增生。
本發明的抗體或藥物組合物的額外用途包括，但不限于，治療臨界疾病多發性神經病和肌病(critical illness polyneuropathy andmyopathy)(CIPNM)急性多發性神經病、神經性食欲缺乏、Bell氏麻痹、慢性疲勞綜合癥、可遺傳的癡呆，包括Creutzfeld-Jacob病；脫髓鞘神經病、Guillain-Barre綜合癥、脊椎間盤病、海灣戰爭綜合癥、慢性炎性脫髓鞘多發性神經病、重癥肌無力、沉默腦局部缺血、睡眠失調，包括發作性睡病和睡眠呼吸暫停；慢性神經元退化；和中風，包括腦缺血病。本發明抗體的額外用途是厭食和/或厭食性病癥、腹膜炎、內毒素性血癥和膿毒性休克、肉芽瘤形成、熱中風、Churg-Strauss綜合癥、急性感染后的慢性炎癥如結核和麻風病、系統性硬化和肥大性瘢痕形成。
在其他實施方案中，可以構建含有本發明的IL-1R1抗體之一的氨基酸序列的抗生物素蛋白融合蛋白用于各種目的。使用例如，哺乳動物表達載體可以產生抗生物素蛋白融合蛋白，該載體含有編碼與用于插入特異靶基因融合配偶體的多克隆位點鄰接的重組雞抗生物素蛋白的cDNA序列。該載體可以包括抗生物素蛋白序列與其內源信號序列，從而能夠分泌不天然含有信號序列的不連續的融合基因配偶體。載體表達的融合蛋白具有融合配偶體的N-末端部分的抗生物素蛋白標記。如此處描述的融合策略能夠分泌通常在細胞內表達的蛋白，如信號轉導基因或核激素受體。
備選地，可以使用編碼沒有內源信號序列的抗生物素蛋白，其可導致融合蛋白配偶體的C-末端被標記。C-末端抗生物素蛋白融合也容許基于融合配偶體的內源信號序列的蛋白質分泌。可應用這種策略糾正蛋白質加工和折疊或者確定被提議的信號序列的有效性。此外，載體可以含有編碼氨基酸序列的短核苷酸序列，該氨基酸序列可作為抗生物素蛋白和融合配偶體序列之間的特異酶切割底物。這種酶-可切割的序列允許為了純化或蛋白質釋放目的將融合配偶體與抗生物素蛋白分開。
本發明的抗生物素融合蛋白可用于，例如，抗體篩選、功能表征(確定抗體作為激動劑或拮抗劑、中和劑等的適用性)、表位作圖，或免疫策略。靶蛋白的抗生物素融合也可以用于藥物動力學、效能或其他標準測定法形式中，設計這些測定法是為了檢驗樣品或臨床患者樣品是否在血液、尿或其他組織樣品中存在治療性抗體。可以將抗生物素蛋白融合蛋白配偶體制備為全長或截斷的序列、特異分離的結構性結構域，或者作為與來自其他物種的融合配偶體的其他同系物的嵌合序列。
可以使用如此處描述的和本領域中公知的將基因導入細胞的任何一種標準方法來表達抗生物素蛋白融合蛋白。可通過在脂質，如Lipofectamine(Invitrogen，Carlsbad，CA)溶液中用抗生物素蛋白融合構建體轉染細胞在例如293或CHO細胞中表達蛋白。
可收集條件培養基和/或表達融合蛋白的細胞的細胞裂解物并將其應用于測定基質，如生物素-包被的聚苯乙烯珠或生物素-包被的ELISA板。可以在允許融合蛋白最佳表達的時間點收集條件培養基和/或細胞裂解物。該時間點可以由本領域技術人員通過實驗去定，但是通常為轉染后約48小時。也可以分析融合蛋白在細胞膜或細胞內的表達和結合已知的配體、受體或抗體的功能性。
可以通過利用生物素-抗生物素蛋白相互作用的任一公知的或者以前表征的方法分析本發明的抗生物素蛋白融合蛋白。這些方法包括，但不限于，流式細胞術和熒光成像/顯微術。例如，可將培養基中或細胞裂解物中的抗生物素蛋白融合應用于生物素-包被的珠子并用熒光標記的抗-抗生物素蛋白抗體染色以指示表達水平。而且，在多比色測定法形式中可以應用識別特定融合蛋白配偶體的熒光抗體。此外，在競爭性測定法中可以將對融合蛋白配偶體特異的未標記的抗體與熒光標記的抗體同時應用。
在一些實施方案中，本發明提供了使用抗生物素蛋白融合蛋白進行表位作圖的方法。下面提供了關于抗IL-1R1抗體的表位作圖的本發明的表位作圖方法的一個實例。然而，本領域技術人員將認識到這些方法可容易地應用于任一抗體的表位作圖并且不限于抗-IL-1R1抗體。例如，編碼雞抗生物素蛋白的cDNA(具有內源信號序列)可以與編碼融合到3’末端FLAG-標記序列的目標蛋白(即被確定表位所希望的抗體識別的蛋白)的cDNA的5’末端連接。可以用常規分子技術將FLAG-標記的融合基因裝配在表達載體中。可用常規技術產生一組突變的抗生物素-FLAG標記的蛋白，其中一些氨基酸已經被置換(例如，用來自另一動物物種的相應氨基酸殘基置換)。可以在宿主細胞中表達突變的和野生型蛋白并使用，例如，蛋白質印跡分析或者如此處描述的基于珠子的結合測定法檢測野生型或突變蛋白與目標抗體的結合。從而，通過確定突變蛋白中的哪些置換破壞了目標抗體的結合來限定表位。
實施例提供了下面的實施例，包括所實施的實驗和得到的結果，這些僅用于闡明性目的，不應被理解為限制本發明。
實施例1產生針對白介素-1受體型1(IL-1R1)的人單克隆抗體轉基因HuMab小鼠使用轉基因小鼠HCo7品系制備針對IL-1受體型1(IL-1R1)的完全人單克隆抗體，該轉基因小鼠HCo7品系表達人抗體基因。在這些小鼠品系的每一種中，已經如Chen等人(1993，EMBO J.12811-820)描述的將內源小鼠κ輕鏈純合地破壞，并且已經如國際專利申請公布號WO01/09187(并入參考文獻)的實施例1中描述的將內源小鼠重鏈基因純合地破壞。這些小鼠品系的每一個攜帶如Fishwild等人(1996，Nature Biotechnology 14845-851)中描述的人κ輕鏈轉基因KCo5。HCo7品系攜帶如美國專利號5,545,806、5,625,825、和5,545,807(并入參考文獻)中描述的HCo7人重鏈轉基因。HCo7品系在此處被稱為HuMab小鼠。
HuMab免疫為產生針對IL-1R1的完全人單克隆抗體。用來自昆蟲或哺乳動物細胞(例如，CHO細胞)的純化的重組IL-1R1作為抗原免疫HuMab小鼠。HuMab小鼠的一般免疫方案在Lonberg等人(1994，Nature 368856-859；Fishwild等人，如前；和國際專利申請號WO98/24884中描述，這些文獻的每一篇的教導都被并入作為參考。當第一次灌輸抗原時小鼠為6-16周齡。IL-1R1抗原的純化的重組制劑(25-50μg)(例如，從被轉染的表達IL-1R1的昆蟲或哺乳動物細胞純化)用于腹膜內(IP)或皮下(Sc)免疫HuMab小鼠。
使用完全弗氏佐劑中的抗原并注射兩次實現HuMab轉基因小鼠的免疫，然后用不完全弗氏佐劑中的抗原腹膜內免疫2-4周(高達共11次免疫)。數打小鼠被每種抗原免疫。用IL-1R1免疫HCo7品系的共149只小鼠。通過眶后取血監視免疫應答。
為了選擇結合IL-1R1的抗體的HuMab小鼠，如Fishwild等人(如前)描述的通過ELISA檢驗免疫小鼠的血清。簡言之，將從昆蟲或哺乳動物細胞純化的重組IL-1R1溶于PBS中，濃度為1-2μg/mL，將該溶液以50μL/孔包被微量滴定板并在4℃過夜孵育，然后將微量滴定板用200μL/孔PBS/Tween(0.05％)中的5％雞血清封閉。向每孔加入來自IL-1R1免疫的小鼠的血清稀釋液并在室溫孵育1-2小時。將板用PBS/Tween洗滌并用綴合辣根過氧化物酶(HRP)的山羊-抗-人IgG Fc-特異的多克隆試劑在室溫下孵育1小時。將板用PBS/Tween洗滌并用綴合辣根過氧化物酶(HRP)的山羊-抗-人IgG Fc-特異的多克隆試劑在室溫下孵育1小時。洗滌后，將板用ABTS底物顯色(Sigma ChemicalCo.，St.Louis，MO，目錄號.A-1888，0.22mg/mL)并通過分光光度計在415-495nm下分析OD。用具有抗-IL-1R1人免疫球蛋白的足夠效價的小鼠產生如下描述的單克隆抗體。
產生針對IL-1R1的人單克隆抗體的雜交瘤的制備通過靜脈內注射抗原強化來制備用于單克隆抗體產生的小鼠，強化后兩天處死小鼠，之后除去脾臟。從HuMab小鼠分離小鼠脾細胞并通過標準方案用PEG將其與小鼠骨髓瘤細胞系融合。通常，對每種抗原實施20-30個融合。
簡言之，用50％PEG(Sigma)將來自免疫小鼠的脾臟淋巴細胞的單一細胞懸浮液與P3X63-Ag8.653非分泌性小鼠骨髓瘤細胞(ATCC，記錄號CRL 1580)或者SP2/0非分泌性小鼠骨髓瘤細胞(ATCC，CRL1581)數目的1/4融合。將細胞以約1×105個/孔平鋪在平底微量滴定板中，然后在含有10％胎牛血清、10％P388D1-(ATCC記錄號CRL TIB-63)條件培養基、DMEM(Mediatech，目錄號CRL 10013，具有高葡萄糖、L-谷氨酰胺和丙酮酸鈉)中的3-5％origen(IGEN)加5 mM HEPES、0.055mM 2-巰基乙醇，50mg/mL慶大霉素和1×HAT(Sigma，目錄號CRLP-7185)的選擇性培養基中孵育約2周。1-2周后，將細胞培養在以HT代替HAT的培養基中。
對所得雜交瘤篩選抗原-特異抗體的產生。通過ELISA對每個孔篩選人-抗-IL-1R1單克隆IgG抗體。一旦發生大范圍的雜交瘤生長，通常在10-14天后監視培養基。將分泌抗體的雜交瘤再次涂板，再次篩選，如果對人IgG仍然陽性，那么通過有限稀釋將抗IL-1R1單克隆抗體亞克隆至少2次。體外培養穩定的亞克隆以在組織培養基中產生少量抗體用于鑒定。
選擇結合IL-1R1的人單克隆抗體如上述的ELISA測定法被用于篩選與IL-1R1免疫原表現出陽性反應性的雜交瘤。對分泌高親和性結合IL-1R1的單克隆抗體的雜交瘤亞克隆并進一步鑒定。為每種雜交瘤選擇一個保留親本細胞反應性(通過ELISA確定)的克隆以制備5-10個小瓶細胞庫，將其保存在液氮中。
如此處公開的實施同種型-特異的ELISA以確定產生的單克隆抗體的同種型。在這些實驗中，將微量滴定板孔用50μL溶液/孔包被，該溶液為溶于PBS中的1μg/ml小鼠抗-人κ輕鏈，并將板在4℃過夜孵育。用5％雞血清封閉后，將板與每種受試單克隆抗體的上清液和純化的同種型對照反應。將板在室溫下孵育1-2小時。然后將孔與人IgG1、IgG2或IgG4-特異的辣根過氧化物酶-綴合的山羊-抗人多克隆抗血清反應并將板顯色并如下描述的進行分析。
通過ELISA檢測從雜交瘤上清液純化的表現出對IL-1R1的顯著結合的單克隆抗體，用體外結合測定法和基于人軟骨細胞和全血細胞的測定法試驗這些單克隆抗體的生物學活性。表現出最佳活性的抗體被指定為15C4、26F5、27F2、24E12、和10H7。對抗體實施初步表位分選實驗。將ELISA板用人sIL-1R1(1+2+3結構域)、截斷的人sIL-1R1(1+2結構域)、大鼠sIL-1R1、人sIL-1R型II和卵白蛋白(負對照)包被。用綴合辣根過氧化物酶的抗-人Fc抗體(Pierce ChemicalCo.，Rockford，IL)檢測抗體結合。結果概述于表2。表2中的勾號(√)代表結合的陽性結果；“×”代表陰性結果。抗體15C4、26F5、27F2和24E12僅結合具有所有三個胞外結構域的IL-1R1蛋白，表明每一種抗體的表位都落在第三個結構域內。抗體10H7結合全長胞外結構域IL-1R1和僅有結構域1和2的截斷的蛋白，表明該抗體的表位位于結構域1或2內。所試驗的抗體都沒有與人II型受體或大鼠IL-1R1的交叉反應性。
表2
實施例2通過抗IL-1R1抗體體外抑制IL-1受體型1復合體形成在測定法中用重組蛋白體外評估抗體抑制IL-1信號化所需的胞外結合事件的能力，在該測定法中，IL-1對IL-1R的結合導致形成IL-1RAcP的高親和性結合位點。如下測量IL-1RAcP與IL-1-結合的IL-1R的結合(稱為“復合體形成”)。在結合測定法中，不存在(對照)或存在抗體時，在微量滴定板中孵育重組蛋白。將對照值與存在濃度為10fM到1μM的抗體時所得值比較得到IC50值。簡言之，如下實施測定法。將生物素化IL-1R1和鏈霉抗生物素蛋白-包被的珠子(Dynal，Dynabeads M-28)分散在微量滴定板中。然后將抗體的寬范圍濃度的連續稀釋液加入適宜的孔中。IL-1β或IL-1α以1nM濃度加入，用釕標記的IL1RAcP(根據IGEN方案用NHS-Tag(IGEN)制備)以5nM的終濃度加入。室溫下孵育1小時后，用ORIGENTM1.5或M8儀器(IGENInternational Inc.)分析結合反應。通過與IL-1R1結合珠子相關的電化學發光信號確定IL-1RAcP對IL-1結合的IL-1R1的結合。IL-1或IL-1RAcP結合的抗體競爭導致的信號減弱被計算為最大結合(無競爭)的ECL信號的百分比。
用PRISTM軟件建立這些結合測定法中每種抗體的抑制應答曲線并得到IC50。通過圖12中的圖描繪IL-1β誘導的結合事件的抑制結果。在下面的表3中顯示了抑制復合體形成的IC50。抗體15C4、26F5、27F2和24E12強烈抑制復合體形成。這些抗體都是IL-1R1第三結構域結合劑，如上述。抗體10H7屬于一類抗體，其結合缺少第三結構域的IL-1R的構建體。10H7是比第三結構域結合劑稍弱的IL-1驅動的IL-1RAcP結合的抑制劑。將通過本發明的抗體產生的復合體形成抑制與IL-lra抑制比較。第三結構域結合劑抑制復合體形成的能力與IL-1ra類似或稍強。
圖13描繪了抗體15C4抑制IL-1R1/IL-1α/RAcP復合體形成的能力。IL-1R1/IL-1α/RacP復合體形成的IC50是43pM。
表3
實施例3抗-IL-1R1抗體抑制IL-1β和IL-1ra對受體的結合用重組蛋白在測定法中評估抗-IL-1R1抗體抑制IL-1β或IL-1ra與IL-1R1結合的能力。反應混合物含有0.1mg/mL Dynabeads M-280鏈霉抗生物素蛋白(Dynal)和1nM生物素化IL-1R1。加入濃度為320nM到0.3nM的抗體。釕標記的IL-1β(5nM)或IL-1ra(1nM)的加入啟動結合，該結合在室溫下進行1h。如上使用ORIGENTM1.5或M8儀器(IGEN International Inc.)測量反應混合物。競爭被計算為最大結合(無競爭)的ECL信號的百分數。抗體15C4、26F5和27F2是最強的抗體，它們阻斷配體(IL-1β)與受體的結合，但是與IgG對照相比不顯著干擾IL-1ra的結合。相比，抗體24E12結合受體但是不阻斷IL-1β或IL-1ra與受體的結合。從而，抗體24E12代表與15C4、26F5和27F2所代表的類別不同的獨特類別的第三結構域結合劑。抗體10H7抑制IL-1β和IL-1ra與受體的結合。結果在圖14中總結。
實施例4軟骨細胞和人全血測定法將原代人軟骨細胞(Cell ApplicationsInc.，San Diego，CA)以10,000個細胞/孔的密度接種在96-孔板中，孔中含有含1％FBS和1％Pen Strep(GIBCO)的DMEM培養基。讓細胞過夜恢復，然后在20分鐘內加入濃度為10nM到0.1pM的抗-IL1-R1抗體。加入IL-1β至濃度為1pM(～EC50)并在37℃孵育16小時后收獲培養上清液。使用ELISA(Pierce-Endogen，Rockford，IL，Cat# EH2IL-65)根據生產商的使用說明書測量上清液中的IL-6水平。使用PRISM軟件為基于細胞的測定法中本發明的每種抗體建立抑制應答曲線并得到IC50值。與IL-1ra相比，抗體15C4、26F5和27F2是IL-1信號化的強烈抑制劑(圖15A)。抗體24E12和10H7明顯比15C4和27F2弱(圖15B)。在表4A和4B中顯示了人軟骨細胞對IL-1β誘導的IL-6產生的抑制的IC50值(分別相應于圖15A和15B)。
將抗IL-1R1單克隆抗體15C4、26F5和27F2與人全血細胞預孵育40-60分鐘，該全血細胞從正常志愿者收集并溶于肝素鈉真空容器(vacutainers)中。如下實施測定法將100μl新鮮分離的血液等分到96孔板的孔中。向含有10％人AB血清的RPMI培養基加入50μL抗體。然后以30pM(EC50)的濃度加入IL-1β。18小時后收獲培養上清液，并使用ELISA測量上清液中的IL-6水平。作為對照，將IL-1ra與全血預孵育40-60分鐘，并如上測量IL-6的產生。三種抗-IL-1R1抗體封閉IL-1活性的有效性與IL-1ra的相當(圖16)。在表5中顯示了人全血中IL-1誘導的IL-6產生的抑制的IC50值。
表4A
表4B
表5
實施例5誘變和表位作圖使用IL-1R1的定點誘變(Altered Sites In Vitro MutagenesisSystem，Promega，Madison WI)制備-組突變的蛋白(“突變蛋白”)，其中大鼠氨基酸殘基被相應的人序列置換。構建了15種不同的突變質粒(見圖17中編號的橫條)。編碼這些置換蛋白和親本IL-1R1的質粒被瞬時轉染到CHO細胞中。產生假轉染子作為陰性對照。用Centriprep10濃縮柱(Amicon)將來自這些細胞的條件培養基(CM)濃縮約20倍。通過SDS-PAGE和蛋白質印跡評估突變蛋白的表達。13種突變蛋白的表達水平允許評價抗體結合。將蛋白質加到凝膠、電泳并轉移到膜。將膜在溶于PBS和0.1％TWeen-20的1％奶封閉然后在室溫下用溶于PBS和0.1％Tween-20的0.5μg/mL抗IL-1R抗體15C4、27F2、或24E12孵育1小時。洗滌后，將膜用山羊抗-人IgG-Fc-HRP孵育。使用化學發光(ECL)底物(Pierce Chemical Co.，Rockford，IL)檢測信號。對抗體結合關鍵的人特異序列被鑒定為當用大鼠序列置換時ECL信號減弱或消除的那些序列。與24E12相比，15C4對突變體1、2、4和10的識別被削弱(圖18，頂欄)。類似地，27F2對1、2和4的識別被削弱(圖18，中間欄)。24E12對突變體12、13、14和15沒有顯著結合(圖18，底部欄)。
對人抗-IL-1R1抗體的分離和表征已經鑒定了三種不同類的競爭性抗體(圖19)。IL-1生物活性的最強烈的抑制劑(如通過基于細胞的生物測定闡明的)為結合IL-1R1的第三結構域并且防止IL-1-β解離的那些抗體。用一組第三結構域突變蛋白質實施表位作圖實驗，該實驗表明這類抗體(包括15C4、27F2和26F5)具有重疊但是不相同的構象表位。圖20和21在IL-1ra結合的IL-1受體的帶狀圖(Schreuder等人，1997，Nature 386194-200).中闡明了IL-1受體的第三結構域上15C4表位的位置，定義最強的抗體類結合的IL-1受體殘基以灰色圖解。這些抗體已經表現了優良的效價，從而這些表位限定了優良類別抗體的結合位點。15C4和27F2結合位點是重疊但不是相同的，如通過上述IL-1R1中15種不同位點的突變分析所確定的。位點在圖17中描繪為蛋白質序列上帶編號的橫條。相互作用的關鍵位點似乎在位點1(LSDIA；SEQ ID NO41)、2(VIDE；SEQ ID NO42)、4(YSV)和10(TCFA；SEQ ID NO43)的突變內。15C4和27F2結合位點包含在位點1和2內，因為在任一位點內用人殘基置換大鼠殘基都消除了結合。27F2與15C4的不同之處在于在位點4完全消除其結合，而15C4結合被減弱而不是完全除去。突變10也減弱15C4結合，但是27F2與該位點沒有明顯的相互作用。晶體結構的檢查揭示這些殘基限定第三結構域的一面，該面指向被結合的配體所占據的空間(圖20和21)(Vigers等人，1997，Nature 386190-194)。
所鑒定的第二類抗體的代表是10H7，這類抗體不需要第三結構域用于結合，并且不像優選的類，抑制IL-1ra結合。該類在生物測定中有活性，但是比優選的類別弱。
相比在生物測定中優選類別的抗體強烈抑制IL-1，24E12在生物測定中是無效抑制劑。抗體24E12抑制IL-1RAcP與IL-1-結合的IL-1R的結合。這類抗體的表位(通過突變體12、13、14和15限定)與IL-1R1的跨膜結構域接近，并且位于與IL-1和IL-1ra結合不直接相關的區域內(圖22)。
實施例6 克隆抗IL-1R1抗體的重鏈和輕鏈抗-IL-1R1 15C4 MAb輕鏈的克隆將三種雜交瘤表達的結合αIL-1R1的單克隆抗體15C4、27F2和26F5的輕鏈克隆到哺乳動物細胞表達載體pDSRα19中(見國際專利申請公布號WO 90/14363，其在此處為了任何目的被并入作為參考)。在此處清楚地描述了編碼15C4κ輕鏈的質粒的構建；用類似方法實施其他輕鏈種類的克隆。用TRIzol試劑(Invitrogen)制備αIL-1R1雜交瘤15C4總RNA，然后制備第一條鏈cDNA，用聚合酶鏈式反應(PCR)擴增方法從該第一條鏈cDNA得到αIL-1R1κ輕鏈可變區。用GeneRacerTM試劑盒(Invitrogen)，使用具有延伸接合體(adaptor)的隨機引物(5′-GGC CGG ATA GGC CTC CAN NNNNNT-3′；SEQ ID NO44)和5’RACE(cDNA末端的快速擴增)合成第一條鏈cDNA。對于全部輕鏈，正向引物是GeneRacerTM嵌套引物(5′GGA CAC TGA CAT GGA CTG AAGGAGTA-3′；SEQ ID NO45)并且反向引物是5′-GGG GTC AGG CTG GAACTG AGG-3′(SEQ ID NO46)。將RACE產物克隆到pCR4-TOPO(Invitrogen)中并確定DNA序列。15C4κ鏈共有DNA序列用于設計進行全長抗體鏈PCR擴增的引物。5’κPCR引物編碼信號序列的氨基末端、XbaI限制酶位點，和優化的Kozak序列(5′-CAG CAG AAG CTT CTAGAC CAC CAT GTC GCC ATC ACA ACT CAT TGGG-3′；SEQID NO47)。3’引物編碼羧基末端和終止密碼子，以及SalI限制性位點(5′-CTT GTCGAC TCA ACA CTC TCC CCT GTT GAA GCTC-3′；SEQ ID NO48)。
5’αIL-1R1 15C4 kappa primer(SEQ ID NO47)5’-CAG CAG AAG CTT CTA GAC CAC CAT GTC GCC ATC ACA ACTXbaI Kozak M S P S Q LCAT TGG G-3’I G (SEQ ID NO49)3’αIL-1R1 15C4 kappa primer(SEQ ID NO48)5’CTTGTC GACTCA ACA CTC TCC CCT GTT GAA GCT C-3’SalI * C E G R N F S (SEQ ID NO50)
用pCR415C4κ克隆并使用5’和3’αIL-1R115C4κ引物通過PCR擴增克隆得到全長αIL-1R1 15C4κ鏈克隆。PCR反應產生了733個堿基對的產物，其編碼αIL-1R1 15C4κ鏈的233個氨基酸殘基(包括19個氨基酸的κ鏈信號序列)。用QIAquickPCR純化試劑盒(QiagenCat.No.28104)純化PCR產物，將其用XbaI和SalI切割、凝膠分離并用QIAquick凝膠提取試劑盒(Qiagen Cat.No.28704)純化。該PCR片段含有完整αIL-1R1 15C4κ鏈，將該PCR片段連接到哺乳動物表達載體pDSRα19中。對15C4κ鏈表達克隆進行DNA測序以確定該克隆編碼15C4雜交瘤中鑒定的相同肽。最終表達載體pDSRα1915C4κ為5468個堿基對并含有表6中描述的7個功能區。
表6質粒堿基對編號
構建pDSR19hIgG1CH構建pDSRα19大鼠可變區/人恒定區IgG1(rVh/hCh1)Mab表達質粒，構建過程是將具有Xbal和BsmBI末端的大鼠抗體可變區PCR產物、人IgG1恒定區(CH1、鉸鏈、CH2和CH3結構域)和具有XbaI和SalI末端的線性化pDSRa19連接，其中人IgG1恒定區是通過將線性質粒pDSRα19hIgG1 CH(HindIII和BsmBI末端)的BsmBI和SalI片段用SalI切割并凝膠分離得到(見共有的和共同待決的2002年4月5日提交的美國臨時專利申請號60/370,407，“作為選擇性OPGL途徑抑制劑的人抗-OPGL中和抗體”，將其并入參考文獻)。最終表達載體pDSRα19大鼠可變區/人恒定區IgG1(rVh/hCh1)為6158個堿基對并且含有表7中描述的7個功能區。
表7質粒堿基對編號
用限制酶XbalI和BsmBI消化pDSR19大鼠可變區/人恒定區IgG1質粒除去大鼠可變區并用QIAquick凝膠提取試劑盒純化制備線性質粒pDSRα19hIgG1CH。線性質粒pDSRα19hIgG1CH含有1kbp人IgG1恒定區結構域，該質粒被用于接受從雜交瘤得到的αIL-1R抗體可變區。
克隆抗-IL1-R1 15C4 MAb重鏈將十種雜交瘤表達的結合αIL-1R1的單克隆抗體15C4、27F2和26F5的重鏈克隆到哺乳動物細胞表達載體pDSRα19中。已經清楚地描述了編碼15C4重鏈的質粒的構建；用類似方法實施其他重鏈種類的克隆。用TRIzol試劑從αIL-1RI雜交瘤15C4制備總RNA，然后制備第一條鏈cDNA，用PCR擴增方法從該第一條鏈cDNA得到αIL-1R115C4重鏈可變區。用GeneRacerTM試劑盒，使用具有延伸接合體的隨機引物(5′-GGC CGG ATA GGC CTC CAN NNNNNT-3′；SEQ ID NO44)和5’RACE(cDNA末端的快速擴增)合成第一條鏈cDNA。對于部分長度重鏈，正向引物是GeneRacerTM嵌套引物(5′GGA CAC TGA CAT GGA CTG AAGGAGTA-3′；SEQ ID NO45)并且反向引物是5′-TGA GGA CGC TGA CCACAC G-3′(SEQ ID NO 52.)。將RACE產物克隆到pCR4-TOPO中并確定DNA序列。15C4重鏈可變區共有DNA序列用于設計重鏈可變區PCR擴增的引物。5’重鏈PCR引物編碼信號序列的氨基末端、XbaI限制酶位點，和優化的Kozak序列(5′-CAG CAG AAG CTT CTA GAC CAC CATGGG GTC AAC CGC CAT CCT CG-3′；SEQ ID NO53)。3’引物編碼可變區的羧基末端，包括天然發生的有義鏈BsmBI位點(5′-GTG GAGGCA CTA GAG ACG GTG ACC AGG GTTCC-3′；SEQ ID NO54)。
5’αIL-1R1 15C4重鏈引物 (SEQ ID NO53)5’-CAG CAG AAG CTT CTA GAC CAC CATG GGG TCA ACC GCCXbaI Kozak M G S T AATC CTCG-3’I L (SEQ ID NO55)3’αIL-1R1 15C4重鏈引物(SEQ D NO54)5’-GTG GAG GCA CTAGAG ACGGTG ACC AGG GTT CC-3’T S A S S V T V L T G(SEQ ID NO56)BsmBI抗-IL1-R1 IgG1重鏈表達克隆的構建用pCR415C4重鏈克隆并使用5’和3’αIL-1R1 15C4重鏈引物通過PCR擴增得到全長αIL-1R115C4重鏈克隆。PCR反應產生了442個堿基對的產物，其編碼αIL-1R1 15C4重鏈可變區的137個氨基酸殘基(包括19個氨基酸的重鏈信號序列)。用QIAquickPCR純化試劑盒純化PCR產物，將其用XbaI和BsmBI切割、凝膠分離并用QIAquick凝膠提取試劑盒純化。將含有完整αIL-1R 15C4重鏈可變區的片段連接到哺乳動物表達載體pDSRα19hIgG1CH中。對15C4重鏈IgG1表達克隆進行DNA測序以確定該克隆編碼和在15C4雜交瘤中鑒定的相同的重鏈可變區肽。最終表達載體pDSRα1915C4 IgG1重鏈為6173個堿基對并含有表8中描述的7個功能區。
表8質粒堿基對編號
構建pDSR19hIgG2CH構建pDSRα19人可變區/人恒定區IgG2(hVh/hCh2)Mab表達質粒，構建過程是將具有Xbal和BsmBI末端的人抗體可變區PCR產物、人IgG2恒定區(CH1、鉸鏈、CH2和CH3結構域)的具有BsmBI和SalI末端的PCR產物和具有XbaI和SalI末端的線性化pDSRa19連接。最終表達載體pDSRα19人可變區/人恒定區IgG1(hVh/hCh2)(見共有的和共同待決的2002年4月5日提交的美國臨時專利申請號60/370,407，“作為選擇性OPGL途徑抑制劑的人抗-OPGL中和抗體”，將其并入參考文獻)為6164個堿基對并且含有表9中描述的7個功能區。
表9質粒堿基對編號
用限制酶XbalI和BsmBI消化pDSR19人可變區/人恒定區IgG2質粒除去人可變區并用QIAquick凝膠提取試劑盒純化制備線性質粒pDSRα19hIgG2CH。線性質粒pDSRα19hIgG2CH含有1kbp人IgG2恒定區結構域，該質粒被用于接受從雜交瘤得到的αIL-1R抗體可變區。
抗-IL1-R1 IgG2重鏈表達克隆的構建如上面描述的，將αIL-1R1 15C4重鏈可變區片段連接到哺乳動物表達載體pDSRα19hIgG2CH中。對15C4重鏈IgG2表達克隆進行DNA測序以確定該克隆編碼與在15C4雜交瘤中鑒定的相同的重鏈可變區肽。最終表達載體pDSRα1915C4IgG2重鏈為6161個堿基對并含有表10中描述的7個功能區。
表10質粒堿基對編號
構建pDSR19hIgG4CH構建pDSRα19人可變區/人恒定區IgG4(hVh/hCh4)Mab表達質粒，構建過程是將具有Xbal和BsmBI末端的人抗體可變區PCR產物、用BsmBI和SalI消化并凝膠分離的人IgG4恒定區(CH1、鉸鏈、CH2和CH3結構域)片段和具有XbaI和SalI末端的線性化pDSRa19連接。最終表達載體pDSRα19人可變區/人恒定區IgG4(hVh/hCh4)(見共有的和共同待決的2002年4月5日提交的美國臨時專利申請號60/370,407，“作為選擇性OPGL途徑抑制劑的人抗-OPGL中和抗體”，將其并入參考文獻)為6167個堿基對并且含有表11中描述的7個功能區。
表11質粒堿基對編號
用限制酶XbalI和BsmBI消化pDSR19人可變區/人恒定區IgG4質粒除去人可變區并用QIAquick凝膠提取試劑盒純化制備線性質粒pDSRα19hIgG4CH。線性質粒pDSRα19hIgG4CH含有1kbp人IgG4恒定區結構域，該質粒被用于接受從雜交瘤得到的αIL-1R抗體可變區。
抗-IL1-R1 IgG4重鏈表達克隆的構建如上面描述的，將αIL-1R1 15C4重鏈可變區片段連接到哺乳動物表達載體pDSRα19hIgG4CH中。對15C4重鏈IgG4表達克隆進行DNA測序以確定該克隆編碼與在15C4雜交瘤中鑒定的相同的重鏈可變區肽。最終表達載體pDSRα1915C4 IgG4重鏈為6164個堿基對并含有表12中描述的7個功能區。
表12質粒堿基對編號
實施例7在中國倉鼠卵巢(CHO)細胞中表達抗-IL-1R1抗體如美國專利號6,210,924(并入參考文獻)所描述的在中國倉鼠卵巢細胞，特別在CHO AM-1/D中產生重組抗-IL-1R1抗體。簡言之，將編碼抗-IL-1R1抗體的完整重鏈和輕鏈的DNA序列克隆到表達載體中。用能夠表達適宜的抗IL-1R1抗體的完整重鏈的表達載體和表達該抗體的完整輕鏈的表達載體共轉染CHO AM-1/D細胞。例如，為了產生26F5抗體，用能夠表達含有如SEQ ID NO38中提出的氨基酸序列的完整輕鏈的載體和能夠表達含有如SEQ ID NO20、SEQ ID NO22或SEQ ID NO24中提出的氨基酸序列的完整重鏈的載體共轉染細胞。為了產生27F2抗體，用能夠表達含有如SEQ ID NO38中提出的氨基酸序列的完整輕鏈的載體和能夠表達含有如SEQ ID NO26、SEQ IDNO28或SEQ ID NO30中提出的氨基酸序列的完整重鏈的載體共轉染細胞。為了產生15C4抗體，用能夠表達含有如SEQ ID NO40中提出的氨基酸序列的完整輕鏈的載體和能夠表達含有如SEQ ID NO32、SEQ ID NO34或SEQ ID NO36中提出的氨基酸序列的完整重鏈的載體共轉染細胞。表13概述了各種IL-1R1抗體的完整重鏈和完整輕鏈。名稱“.../IgG-”描述具體抗體的恒定區序列。
表13
用表達載體共轉染二氫葉酸還原酶缺陷型(DHFR-)CH0 AM-1/D細胞實現抗-IL-1R1抗體的穩定表達。用標準技術(磷酸鈣共沉淀)和DHFR選擇實施轉染。分離轉染的菌落并使其在24孔板中生長到匯合。檢驗轉染細胞所產生的抗體的適當折疊和中和活性。選擇過量產生適當折疊的IgG1、IgG2和IgG4同型的抗IL-1R1抗體的克隆并如下描述的純化抗體。
實施例8抗IL-1R1抗體的產生通過CHO細胞的克隆系中表達產生抗IL-1R1抗體。對于每個產生試驗，將來自單個小瓶的細胞在無血清的細胞培養基中解凍。細胞最初生長在T型燒瓶中，并通過一系列旋轉燒瓶連續放大直到產生足夠接種物接種20L生物反應器。生長5-10天后，將培養物用于接種300L生物反應器。再生長5-10天后，培養物用于接種2000L生物反應器。用補料分批培養基在2000L生物反應器中實施生產，其中加入含有濃縮培養基組分的營養料以維持細胞生長和培養物生活力。生產持續約2周，在該期間內抗-IL-R1抗體被細胞組成性地產生并分泌到細胞培養基中。
生產反應器被控制在固定pH、溫度和溶解氧水平通過二氧化碳氣體和碳酸鈉加入控制pH；通過空氣、氮氣和氧氣流控制溶解氧。
在生產末，將細胞培養液加到盤式離心機(disks tackcentrifuge)并使培養上清液與細胞分離。將濃縮物通過深度過濾器然后通過0.2μm濾器進一步澄清。然后通過切向流超濾濃縮澄清的條件培養基。該條件培養基被濃縮15-30倍。然后將所得濃縮的條件培養基純化或者冰凍后用于以后的純化。
實施例9用抗生物素蛋白-融合蛋白進行表位作圖為了產生抗生物素蛋白-融合蛋白，將編碼雞抗生物素蛋白的cDNA(具有內源信號序列)與編碼在3’端融合FLAG-標記序列的人或獼猴IL-1R1的成熟胞外結構域的cDNAs的5’末端連接。用常規分子技術將FLAG-標記的融合基因裝配在pALTERMAX載體中。抗生物素蛋白-人IL-1R1融合蛋白的氨基酸序列在圖23中顯示(SEQ ID NO59)。抗生物素蛋白-獼猴IL-1R1融合蛋白的氨基酸序列在圖24中顯示(SEQ IDNO60)。用改變的位點II哺乳動物體外誘變系統(Altered Sites IIMammalian In Vitro Mutagenesis System)(Promega Corp.)產生一組突變的抗生物素蛋白-cynoIL-1R1-FLAG蛋白，其中人氨基酸被相應獼猴殘基置換。突變在圖24中闡明。
用Cytofectine轉染試劑(Bio-Rad Laboratories，Inc.)將編碼抗生物素蛋白-cynoIL-1R突變體和野生型蛋白以及抗生物素蛋白-huIL-1R1-FLAG蛋白的質粒瞬時轉染到293T細胞中。假轉染子用作陰性對照。通過蛋白質印跡和基于珠子的結合測定法，使用從被轉染的細胞收獲的條件培養基(CM)分析這些蛋白與抗-huIL-1R1單克隆抗體(MAb)的結合。
對于蛋白質印跡分析，將CM以1∶3在非還原性SDS樣品緩沖液中稀釋，煮沸5-10分鐘并加到10％Tris-甘氨酸凝膠中。SDS-PAGE和蛋白質轉移后，將膜用PBS/0.1％Tween-20(PBST)中的3％BSA/1％卵清蛋白封閉并用抗-huIL-1R1 Mab染色。以1∶15,000在PBST中稀釋的山羊抗-人IgG-Fc-HRP抗體(Pierce Chemical Co.)用于次級檢測。抗-FLAG檢測用于對蛋白質加樣標準化。用FluorChem 8000數字成像系統(Alpha Innotech Corp.)實施圖像捕捉和光密度分析。將抗-huIL-1R1 MAb的信號強度對抗-FLAG抗體的值標準化以解決蛋白質加樣中的差異。抗體結合表達為對抗生物素蛋白-人IL-1R1-FLAG的結合百分數。
圖25A中顯示了蛋白質印跡的結果。圖25B顯示了一式兩份蛋白質印跡試驗的光密度分析。對抗體結合關鍵的人殘基是當置換成cyno-IL-1R1時恢復信號的那些人殘基。通常，突變1和2(圖24中闡明)單獨或者組合可以恢復對許多抗體(15C4/IgG2、5B8、1C2、24H2、16E9、26E4和20G1)的結合而突變10.1和10.2卻不能。這些抗體都不結合野生型cynoIL-1R1。兩種抗體(27F2和19C8)總是結合所有突變蛋白以及野生型cynoIL-1R1。這表明表位4(cynoIL-1R的殘基Y279-V281)是這些抗體的優勢表位，其中表位4在大鼠/人共生同源蛋白中鑒定并且在獼猴IL-1R1中沒有改變。表位4在圖24所示氨基酸序列中被粗體化、斜體化和下劃線化。
在多重基于珠子的結合測定中，將CM與生物素-包被的熒光珠孵育以捕獲抗生物素蛋白融合蛋白，每種融合蛋白一套珠子(BeadlyteMulti-Biotin 10plex Bead試劑盒；Upstate Biotechnologies)。洗滌珠子并將其在PBST中合并并等分到96-孔濾器底板(MilliporeCorp.)的孔中。以25μg/ml加入抗體(抗-huIL-1R1 MAbs或抗-FLAG-MAb)并孵育1小時。再次洗滌珠子并用藻紅蛋白-綴合的抗-小鼠IgG抗體和抗-人IgG(Fab’)2的混合物檢測抗體結合。孵育1小時后，洗滌珠子并將其重懸在PBST中。用Luminex100(Luminex Corp)測量平均熒光強度(MFI)。用MFI值標準化抗-FLAG MAb結合數據以解決蛋白質加樣中的差異。抗體結合表達為結合抗生物素蛋白-huIL-1Rl-FLAG的百分數(圖26)。抗-IL-1R1抗體與用人殘基突變的抗生物素蛋白-cynoIL1Rl-FLAG蛋白以及野生型獼猴和人IL-1R1蛋白的結合模式與圖25中所示的免疫印跡分析一致。
應該理解前面的公開著重于本發明的一些特定實施方案并且它們的所有修飾或備選等價方案都在所附權利要求書中提出的本發明的精神和范圍之內。
序列表<110>Varnum，BrianWitte，AlisonVezina，ChrisWong，Lu MinQian，Xueming<120>治療性人抗-IL-IR單克隆抗體<130>01，1554<160>79<170>Patentln version 3.0<210>1<211>990<212>DNA<213>人<400>1gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg60ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg120tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca180ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc240tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc300aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga360ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct420gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg480tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac540agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag600gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc660
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210 215 220Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly225 230 235 240Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser245 250 255Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg260 265 270Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro275 280 285Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala290 295 300Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val305 310 315 320Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr325 330 335Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr340 345 350Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu355 360 365Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys370 375 380Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser385 390 395 400Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp405 410 415Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser420 425 430Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala435 440 445
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys450 455 460<210>37<211>705<212>DNA<213>人<400>37atggaagccc cagctcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccgga60gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc120ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agctacttag cctggtacca acagaaacct180ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatccaaca gggccactgg catcccagcc240aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct300gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag cgtagcaact ggcctccgct cactttcggc360ggagggacca aggtggagat caaacgaact gtggctgcac catctgtctt catcttcccg420ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc480tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc540caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg600acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag660ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgt705<210>38<211>235<212>PRT<213>人<400>38Met Glu Ala Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro1 5 10 15
Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser20 25 30Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser35 40 45Val Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro50 55 60Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala65 70 75 80Arg Ple Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser85 90 95Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser100 105 110Asn Trp Pro Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys115 120 125Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu130 135 140Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe145 150 155 160Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln165 170 175Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser180 185 190Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu195 200 205Lys His Lys Val Tyr Ala Cys G1u Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser210 215 220Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys225 230 235<210>39<211>699
<212>DNA<213>人<400>39atgtcgccat cacaactcat tgggtttctg ctgctctggg ttccagcctc caggggtgaa60attgtgctga ctcagtctcc agactttcag tctgtgactc caaaggagaa agtcaccatc120acctgccggg ccagtcagag cattggtagt agcttacact ggtaccagca gaaaccagat180cagtctccaa agctcctcat caagtatgct tcccagtcct tctcaggggt cccctcgagg240ttcagtggca gtggatctgg gacagatttc accctcacca tcaatagcct ggaagctgaa300gatgctgcag cgtattactg tcatcagagt agtagtttac ctctcacttt cggcggaggg360accaaggtgg agatcaaacg aactgtggct gcaccatctg tcttcatctt cccgccatct420gatgagcagt tgaaatctgg aactgcctct gttgtgtgcc tgctgaataa cttctatccc480agagaggcca aagtacagtg gaaggtggat aacgccctcc aatcgggtaa ctcccaggag540agtgtcacag agcaggacag caaggacagc acctacagcc tcagcagcac cctgacgctg600agcaaagcag actacgagaa acacaaagtc tacgcctgcg aagtcaccca tcagggcctg660agctcgcccg tcacaaagag cttcaacagg ggagagtgt 699<210>40<211>233<212>PRT<213>人<400>40Met Ser Pro Ser Gln Leu Ile Gly Phe Leu Leu Leu Trp Val Pro Ala1 5 10 15Ser Arg Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val20 25 30Thr Pro Lys Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile35 40 45
Gly Ser Ser Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys50 55 60Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Phe Ser Gly Val Pro Ser Arg65 70 75 80Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser85 90 95Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Ala Tyr Tyr Cys His Gln Ser Ser Ser100 105 110Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr115 120 125Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu130 135 140Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro143 150 155 160Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly165 170 175Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr180 185 190Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His195 200 205Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val210 215 220Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys225 230<210>41<211>5<212>PRT<213>人<400>41
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<213>人工的<220>
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<223>PCR的寡核苷酸引物<400>46ggacactgac atggactgaa ggagta26<210>47<211>46<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR的寡核苷酸引物<400>47cagcagaagc ttctagacca ccatgtcgcc atcacaactc attggg 46<210>48<211>34<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR的寡核苷酸引物<400>48cttgtcgact caacactctc ccctgttgaa gctc 34
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<223>3’抗-IL-1R1 15C4κ引物編碼的氨基酸序列<400>50Cys Glu Gly Arg Asn Phe Ser15<210>51<211>1409<212>DNA<213>人<400>51tctagaccac catggacatc aggctcagct tagttttcct tgtccttttc ataaaaggtg60tccagtgtga ggtagaactg gtggagtctg ggggcggctt agtacaacct ggaaggtcca120tgacactctc ctgtgcagcc tcgggattca ctttcagaac ctatggcatg gcctgggtcc180gccaggcccc aacgaagggt ctggagtggg tctcatcaat tactgctagt ggtggtacca240cctactatcg agactccgtg aagggccgct tcactatttt tagggataat gcaaaaagta300ccctatacct gcagatggac agtccgaggt ctgaggacac ggccacttat ttctgtacat360
caatttcgga atactggggc cacggagtca tggtcaccgt ctctagtgcc tccaccaagg420gcccatcggt cttccccctg gcaccctcct ccaagagcac ctctgggggc acagcggccc480tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg aactcaggcg540ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga ctctactccc600tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca gcttgggcac ccagacctac atctgcaacg660tgaatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagaaagt tgagcccaaa tcttgtgaca720aaactcacac atgcccaccg tgcccagcac ctgaactcct ggggggaccg tcagtcttcc780tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag gtcacatgcg840tggtggtgga cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac gtggacggcg900tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc acgtaccgtg960tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag tacaagtgca1020aggtctccaa caaagccctc ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa gccaaagggc1080agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatcccg ggatgagctg accaagaacc1140aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc gtggagtggg1200agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg gactccgacg1260gctccttctt cctctatagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag caggggaacg1320tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag aagagcctct1380ccctgtctcc gggtaaatga taagtcgac 1409<210>52<211>19<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR的寡核苷酸引物<400>52tgaggacgctgaccacacg 19<210>53<211>44<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR的寡核苷酸引物<400>53cagcagaagc ttctagacca ccatggggtc aaccgccatc ctcg 44<210>54<211>32<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR的寡核苷酸引物<400>54gtggaggcac tagagacggt gaccagggtt cc 32<210>55<211>7<212>PRT<213>人工的<220>
<223>5’抗-IL-1R1 15C4重鏈引物編碼的氨基酸序列<400>55Met Gly Ser Thr Ala Ile Leu1 5
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<223> 3’抗-IL-1R1 15C4重鏈引物編碼的氨基酸序列<400>56Thr Ser Ala Ser Ser Val Thr Val Leu Thr Gly1 5 10<210>57<211>1415<212>DNA<213>人<400>57tctagaccac catggacatg agggtccccg ctcagctcct ggggctcctg ctattgtggt60tgagaggtgc cagatgtgag gtccagctgg tgcagtctgg gggaggcttg gtacatcctg120gggggtccct gagactctcc tgtgcaggct ctggattcac cttcagtggc catgctttgc180actgggttcg ccaggctcca ggaaaaggtc tggagtgggt atcaggtatt ggtactcatg240gtgggacata ctatgcagac tccgtgaagg gccgattcac catctccaga gacaatgcca300agaactcctt gtttcttcaa atgaacagcc tgagcgccga ggacatggct gtgtattact360gtacaagaag aaactgggga caatttgact actggggcca gggaaccctg gtcaccgtct420ctagtgcctc caccaagggc ccatcggtct tccccctggc gccctgctcc aggagcacct480ccgagagcac agcggccctg ggctgcctgg tcaaggacta cttccccgaa ccggtgacgg540tgtcgtggaa ctcaggcgct ctgaccagcg gcgtgcacac cttcccagct gtcctacagt600cctcaggact ctactccctc agcagcgtgg tgaccgtgcc ctccagcaac ttcggcaccc660agacctacac ctgcaacgta gatcacaagc ccagcaacac caaggtggac aagacagttg720
agcgcaaatg ttgtgtcgag tgcccaccgt gcccagcacc acctgtggca ggaccgtcag780tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc cctgaggtca840cgtgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accccgaggt ccagttcaac tggtacgtgg900acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccacggga ggagcagttc aacagcacgt960tccgtgtggt cagcgtcctc accgttgtgc accaggactg gctgaacggc aaggagtaca1020agtgcaaggt ctccaacaaa ggcctcccag cccccatcga gaaaaccatc tccaaaacca1080aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggag gagatgacca1140agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta ccccagcgac atcgccgtgg1200agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacacctccc atgctggact1260ccgacggctc cttcttcctc tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg tggcagcagg1320ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac acgcagaaga1380gcctctccct gtctccgggt aaatgataag tcgac 1415<210>58<211>1418<212>DNA<213>人<400>58tctagaccac catggacatg agggtccccg ctcagctcct ggggctcctg ctattgtggt60tgagaggtgc cagatgtgag gtccagctgg tgcagtctgg gggaggcttg gtacatcctg120gggggtccct gagactctcc tgtgcaggct ctggattcac cttcagtggc catgctttgc180actgggttcg ccaggctcca ggaaaaggtc tggagtgggt atcaggtatt ggtactcatg240gtgggacata ctatgcagac tccgtgaagg gccgattcac catctccaga gacaatgcca300agaactcctt gtttcttcaa atgaacagcc tgagcgccga ggacatggct gtgtattact360gtacaagaag aaactgggga caatttgact actggggcca gggaaccctg gtcaccgtct420
ctagtgccag caccaagggg ccatccgtct tccccctggc gccctgctcc aggagcacct480ccgagagcac agccgccctg ggctgcctgg tcaaggacta cttccccgaa ccggtgacgg540tgtcgtggaa ctcaggcgcc ctgaccagcg gcgtgcacac cttcccggct gtcctacagt600cctcaggact ctactccctc agcagcgtgg tgaccgtgcc ctccagcagc ttgggcacga660agacctacac ctgcaacgta gatcacaagc ccagcaacac caaggtggac aagagagttg720agtccaaata tggtccccca tgcccatcat gcccagcacc tgagttcctg gggggaccat780cagtcttcct gttcccccca aaacccaagg acactctcat gatctcccgg acccctgagg840tcacgtgcgt ggtggtggac gtgagccagg aagaccccga ggtccagttc aactggtacg900tggatggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag ttcaacagca960cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaac ggcaaggagt1020acaagtgcaa ggtctccaac aaaggcctcc cgtcctccat cgagaaaacc atctccaaag1080ccaaagggca gccccgagag ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccag gaggagatga1140ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctaccccagc gaca1cgccg1200tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct cccgtgctgg1260actccgacgg ctccttcttc ctctacagca ggctaaccgt ggacaagagc aggtggcagg1320aggggaatgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac tacacacaga1380agagcctctc cctgtctctg ggtaaatgat aagtcgac1418<210>59<211>485<212>PRT<213>人<400>59Met Val His Ala Thr Ser Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ser Leu
1 5 10 15Ala Leu Val Ala Pro Gly Leu Ser Ala Arg Lys Cys Ser Leu Thr Gly20 25 30Lys Trp Thr Asn Asp Leu Gly Ser Asn Met Thr Ile Gly Ala Val Asn35 40 45Ser Lys Gly Glu Phe Thr Gly Thr Tyr Thr Thr Ala Val Thr Ala Thr50 55 60Ser Asn Glu Ile Lys Glu Ser Pro Leu His Gly Thr Gln Asn Tlr Ile65 70 75 80Asn Lys Arg Thr Gln Pro Thr Phe Gly Phe Thr Val Asn Trp Lys Phe85 90 95Ser Glu Ser Thr Thr Val Phe Thr Gly Gln Cys Phe lle Asp Arg Asn100 105 110Gly Lys Glu Val Leu Lys Thr Met Trp Leu Leu Arg Ser Ser Val Asn115 120 125Asp Ile Gly Asp Asp Trp Lys Ala Thr Arg Val Gly Ile Asn Ile Phe130 135 140Thr Arg Leu Arg Thr Gln Lys Glu Gln Leu Leu Ala Ser Leu Leu Glu145 150 155 160Ala Asp Lys Cys Lys Glu Arg Glu Glu Lys Ile Ile Leu Val Ser Ser165 170 175Ala Asn Glu Ile Asp Val Arg Pro Cys Pro Leu Asn Pro Asn Glu His180 185 190Lys Gly Thr Ile Thr Trp Tyr Lys Asp Asp Ser Lys Thr Pro Val Ser195 200 205Thr Glu Gln Ala Ser Arg Ile His Gln His Lys Glu Lys Leu Trp Phe210 215 220Val Pro Ala Met Val Glu Asp Ser Gly His Tyr Tyr Cys Val Val Arg225 230 235 240
Asn Ser Ser Tyr Cys Leu Arg Ile Lys Ile Ser Ala Lys Phe Val Glu245 250 255Asn Glu Pro Asn Leu Cys Tyr Asn Ala Gln Ala Ile Phe Lys Gln Lys260 265 270Leu Pro Val Ala Gly Asp Gly Gly Leu Val Cys Pro Tyr Met Glu Phe275 280 285Phe Lys Asn Glu Asn Asn Glu Leu Pro Lys Leu Gln Trp Tyr Lys Asp290 295 300Cys Lys Pro Leu Leu Leu Asp Asn Ile His Phe Ser Gly Val Lys Asp305 310 315320Arg Leu Ile Val Met Asn Val Ala Glu Lys His Arg Gly Asn Tyr Thr325 330 335Cys His Ala Ser Tyr Thr Tyr Leu Gly Lys Gln Tyr Pro Ile Thr Arg340 345 350Val Ile Glu Phe Ile Thr Leu Glu Glu Asn Lys Pro Thr Arg Pro Val355 360 365Ile Val Ser Pro Ala Asn Glu Thr Met Glu Val Asp Leu Gly Ser Gln370 375 380Ile Gln Leu Ile Cys Asn Val Thr Gly Gln Leu Ser Asp Ile Ala Tyr385 390 395 400Trp Lys Trp Asn Gly Ser Val Ile Asp Glu Asp Asp Pro Val Leu Gly405 410 415Glu Asp Tyr Tyr Ser Val Glu Asn Pro Ala Asn Lys Arg Arg Ser Thr420 425 430Leu Ile Thr Val Leu Asn Ile Ser Glu Ile Glu Ser Arg Phe Tyr Lys435 440 445His Pro Phe Thr Cys Phe Ala Lys Asn Thr His Gly Ile Asp Ala Ala450 455 460Tyr Ile Gln Leu Ile Tyr Pro Val Thr Asn Phe Gln Lys Asp Tyr Lys465 470 475480
Asp Asp Asp Asp Lys485<210>60<211>485<212>PRT<213>人工的<220>
<223>抗生物素蛋白彌猴IL-1R1-FLAG嵌合蛋白<400>60Met Val His Ala Thr Ser Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ser Leu1 5 10 15Ala Leu Val Ala Pro Gly Leu Ser Ala Arg Lys Cys Ser Leu Thr Gly20 25 30Lys Trp Thr Asn Asp Leu Gly Ser Asn Met Thr Ile Gly Ala Val Asn35 40 45Ser Lys Gly Glu Phe Thr Gly Thr Tyr Thr Thr Ala Val Thr Ala Thr50 55 60Ser Asn Glu Ile Lys Glu Ser Pro Leu His Gly Thr Gln Asn Thr Ile65 70 75 80Asn Lys Arg Thr Gln Pro Thr Phe Gly Phe Thr Val Asn Trp Lys Phe85 90 95Ser Glu Ser Thr Thr Val Phe Thr Gly Gln Cys Phe Ile Asp Arg Asn100 105 110Gly Lys Glu Val Leu Lys Thr Met Trp Leu Leu Arg Ser Ser Val Asn115 120 125Asp Ile Gly Asp Asp Trp Lys Ala Thr Arg Val Gly Ile Asn Ile Phe130 135 140Thr Arg Leu Arg Thr Gln Lys Glu Gln Leu Leu Ala Ser Leu Leu Glu145 150 155 160
Ala Asp Lys Cys Asn Glu Arg Glu Glu Lys Ile lle Leu Val Ser Ser165 170 175Ala Asn Glu Ile Asp Val Arg Pro Cys Pro Leu Asn Pro Asn Glu Tyr180 185190Lys Gly Thr Ile Thr Trp Tyr Lys Asn Asp Ser Lys Thr Pro Ile Serl95 200205Thr Glu Gln Ala Ser Arg Ile His Gln His Lys Lys Lys Leu Trp Phe210 215220Val Pro Ala Lys Val Glu Asp Ser Gly His Tyr Tyr Cys Val Val Arg225 230 235 240Asn Ser Ser Tyr Cys Leu Arg Ile Lys Ile Thr Ala Lys Phe Val Glu245 250 255Asn Glu Pro Asn Leu Cys Tyr Asn Ala Glu Ala Ile Phe Lys Gln Arg260 265 270Leu Pro Val Ala Gly Asp Gly Gly Leu Val Cys Pro Tyr Met Glu Phe275 280 285Phe Lys Asp Glu Asn Asn Glu Leu Pro Lys Leu Leu Trp Tyr Lys Asp290 295 300Cys Lys Pro Leu Leu Leu Asp Asn Ile His Phe Ser Gly Val Lys Asp305 310 315 320Arg Leu Ile Val Met Asn Val Ala Glu Lys His Arg Gly Asn Tyr Thr325 330 335Cys His Ala Ser Tyr Thr Tyr Leu Gly Lys Gln Tyr Pro Ile Thr Arg340 345 350Val Ile Glu Phe Ile Thr Leu Glu Glu Asn Lys Pro Thr Arg Pro Val355 360 365Ile Val Ser Pro Ala Asn Glu Thr lle Glu Val Asp Leu Gly Ser Gln370 375 380Ile Gln Leu Ile Cys Asn Val Thr Gly Gln Leu Ser Asp Thr Ala Tyr385 390 395 400
Trp Lys Trp Asn Gly Ser Phe Ile Asp Glu Asp Asp Pro Val Leu Gly405 410 415Glu Asp Tyr Tyr Ser Val Glu Asn Pro Ala Asn Lys Arg Arg Ser Thr420 425 430Leu Ile Thr Val Leu Asn Ile Ser Glu Thr Glu Ser Arg Phe Tyr Lys435 440 445His Pro Phe Thr Cys Leu Ala Arg Asn Thr His Gly Met Asp Ala Ala450 455 460Tyr Val Gln Leu Ile Tyr Pro Val Thr Lys Phe Gln Lys Asp Tyr Lys465 470 475 480Asp Asp Asp Asp Lys485<210>61<211>5<212>PRT<213>人<400>61Asn Tyr Gly Met His15<210>62<211>8<212>PRT<213>人<400>62Thr Phe Ser Asn Tyr Gly Met His1 5<210>63<211>5<212>PRT<213>人
<400>63Phe His Trp Ile Ala1 5<210>64<211>17<212>PRT<213>人<400>64Gly Ile Trp Asn Asp Gly Ile Asn Lys Tyr His Ala His Ser Val Arg1 5 10 15Gly<210>65<211>17<212>PRT<213>人<400>65Ala Ile Trp Asn Asp Gly Glu Asn Lys His His Ala Gly Ser Val Arg1 5 10 15Gly<210>66<211>17<212>PRT<213>人<400>66Ile Ile His Pro Gly Ala Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln1 5 10 15Gly
<210>67<211>11<212>PRT<213>人<400>67Ala Arg Ser Phe Asp Trp Leu Leu Phe Glu Phe1 5 10<210>68<211>11<212>PRT<213>人<400>68Gly Arg Tyr Phe Asp Trp Leu Leu Phe Glu Tyr1 5 10<210>69<211>9<212>PRT<213>人<400>69Gln Arg Glu Leu Asp Tyr Phe Asp Tyr1 5<210>70<211>11<212>PRT<213>人<400>70Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala1 5 10<210>71<211>11<212>PRT<213>人
<400>71Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Ser Ser Leu His1 5 l0<210>72<211>7<212>PRT<213>人<400>72Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr1 5<210>73<211>7<212>PRT<213>人<400>73Tyr Ala Ser Gln Ser Phe Ser1 5<210>74<211>10<212>PRT<213>人<400>74Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro Leu Thr1 5 10<210>75<211>9<212>PRT<213>人<400>75His Gln Ser Ser Ser Leu Pro Leu Thr
1 5<210>76<211>111<212>PRT<213>人<400>76Pro Val Ile Val Ser Pro Ala Asn Glu Thr Met Glu Val Asp Leu Gly1 5 10 15Ser Gln Ile Gln Leu Ile Cys Asn Val Thr Gly Gln Leu Ser Asp Ile20 25 30Ala Tyr Trp Lys Trp Asn Gly Ser Val Ile Asp Glu Asp Asp Pro Val35 40 45Leu Gly Glu Asp Tyr Tyr Ser Val Glu Asn Pro Ala Asn Lys Arg Arg50 55 60Ser Thr Leu Ile Thr Val Leu Asn Ile Ser Glu Ile Glu Ser Arg Phe65 70 75 80Tyr Lys His Pro Phe Thr Cys Phe Ala Lys Asn Thr His Gly Ile Asp85 90 95Ala Ala Tyr Ile Gln Leu Ile Tyr Pro Val Thr Asn Phe Gln Lys100 105 110<210>77<211>350<212>DNA<213>人<400>77cctgtgattg tgagcccagc taatgagaca atggaagtag acttgggatc ccagatacaa60ttgatctgta atgtcaccgg ccagttgagt gacattgctt actggaagtg gaatgggtca120gtaattgatg aagatgaccc agtgctaggg gaagactatt acagtgtgga aaatcctgca180aacaaaagaa ggagtaccct catcacagtg cttaatatat cggaaattga aagtagattt240
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Tyr Arg Tyr Pro Phe Ile Cys Phe Val Lys Asn Thr His Ile Leu Glu85 90 95Thr Ala His Val Arg Leu Val Tyr Pro Val Pro Asp Phe Lys Lys100 105 110
權利要求
1.特異結合白介素-1受體型1(IL-1R1)的分離的人抗體，其含有重鏈和輕鏈，其中重鏈包含含有如在SEQ ID NO10、SEQ ID NO14、或SEQ ID NO16任一個中提出的氨基酸序列的重鏈可變區，或者其抗原結合片段或具有免疫學功能的免疫球蛋白片段。
2.特異結合白介素-1受體型1(IL-1R1)的分離的人抗體，其含有重鏈和輕鏈，其中輕鏈包含含有如在SEQ ID NO12或SEQ ID NO18任一個中提出的氨基酸序列的輕鏈可變區，或者其抗原結合片段或具有免疫學功能的免疫球蛋白片段。
3.特異結合白介素-1受體型1(IL-1R1)的分離的人抗體，其含有重鏈和輕鏈，其中重鏈含有如在SEQ ID NO20、SEQ ID NO22、SEQID NO24、SEQ ID NO26、SEQ ID NO28、SEQ ID NO30、SEQID NO32、SEQ ID NO34、或SEQ ID NO36任一個中提出的氨基酸序列，或者其抗原結合片段或具有免疫學功能的免疫球蛋白片段。
4.特異結合白介素-1受體型1(IL-1R1)的分離的人抗體，其含有重鏈和輕鏈，其中輕鏈含有如在SEQ ID NO38或SEQ ID NO40任一個中提出的氨基酸序列，或者其抗原結合片段或具有免疫學功能的免疫球蛋白片段。
5.特異結合白介素-1受體型1(IL-1R1)的分離的人抗體，其中抗體含有a)重鏈，該重鏈具有含有SEQ ID NO10中提出的氨基酸序列的重鏈可變區、其抗原結合片段，或者其具有免疫學功能的免疫球蛋白片段；和輕鏈，該輕鏈具有含有SEQ ID NO12中提出的氨基酸序列的輕鏈可變區、其抗原結合片段，或者其具有免疫學功能的免疫球蛋白片段；b)重鏈，該重鏈具有含有SEQ ID NO14中提出的氨基酸序列的重鏈可變區、其抗原結合片段，或者其具有免疫學功能的免疫球蛋白片段；和輕鏈，該輕鏈具有含有SEQ ID NO12中提出的氨基酸序列的輕鏈可變區、其抗原結合片段，或者其具有免疫學功能的免疫球蛋白片段；或c)重鏈，該重鏈具有含有SEQ ID NO16中提出的氨基酸序列的重鏈可變區、其抗原結合片段，或者其具有免疫學功能的免疫球蛋白片段；和輕鏈，該輕鏈具有含有SEQ ID NO18中提出的氨基酸序列的輕鏈可變區、其抗原結合片段，或者其具有免疫學功能的免疫球蛋白片段。
6.權利要求5的抗體，其中重鏈含有具有SEQ ID NO10中提出的氨基酸序列的重鏈可變區、其抗原結合片段，或者其具有免疫學功能的免疫球蛋白片段，并且輕鏈含有具有SEQ ID NO12中提出的氨基酸序列的輕鏈可變區、其抗原結合片段，或者其具有免疫學功能的免疫球蛋白片段。
7.權利要求6的抗體，其中重鏈可變區含有與SEQ ID NO10中提出的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，并且其中輕鏈可變區含有與SEQ ID NO12中提出的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，并且其中該抗體特異結合白介素-1受體型1(IL-1R1)。
8.權利要求5的抗體，其中重鏈含有具有SEQ ID NO14中提出的氨基酸序列的重鏈可變區、其抗原結合片段，或者其具有免疫學功能的免疫球蛋白片段，并且輕鏈含有具有SEQ ID NO12中提出的氨基酸序列的輕鏈可變區、其抗原結合片段，或者其具有免疫學功能的免疫球蛋白片段。
9.權利要求8的抗體，其中重鏈可變區含有與SEQ ID NO14中提出的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，并且其中輕鏈可變區含有與SEQ ID NO12中提出的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，并且其中該抗體特異結合白介素-1受體型1(IL-1R1)。
10.權利要求5的抗體，其中重鏈含有具有SEQ ID NO16中提出的氨基酸序列的重鏈可變區、其抗原結合片段，或者其具有免疫學功能的免疫球蛋白片段，并且輕鏈含有具有SEQ ID NO18中提出的氨基酸序列的輕鏈可變區、其抗原結合片段，或者其具有免疫學功能的免疫球蛋白片段。
11.權利要求10的抗體，其中重鏈可變區含有與SEQ ID NO16中提出的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，并且其中輕鏈可變區含有與SEQ ID NO18中提出的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，并且其中該抗體特異結合白介素-1受體型1(IL-1R1)。
12.特異結合白介素-1受體型1(IL-1R1)的分離的人抗體，其中抗體含有a)含有如SEQ ID NO38中提出的氨基酸序列的輕鏈、其抗原結合片段或具有免疫學功能的免疫球蛋白片段；和b)含有如SEQ ID NO20、SEQ ID NO22、SEQ ID NO24、SEQ ID NO26、SEQ ID NO28或SEQ ID NO30中提出的氨基酸序列的重鏈、其抗原結合片段或具有免疫學功能的免疫球蛋白片段。
13.權利要求12的抗體，其中重鏈含有具有SEQ ID NO20中提出的氨基酸序列的重鏈可變區、其抗原結合片段，或者其具有免疫學功能的免疫球蛋白片段，并且輕鏈含有具有SEQ ID NO38中提出的氨基酸序列的輕鏈可變區、其抗原結合片段，或者其具有免疫學功能的免疫球蛋白片段。
14.權利要求13的抗體，其中重鏈可變區含有與SEQ ID NO20中提出的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，并且其中輕鏈可變區含有與SEQ ID NO38中提出的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，并且其中該抗體特異結合白介素-1受體型1(IL-1R1)。
15.權利要求12的抗體，其中重鏈含有具有SEQ ID NO22中提出的氨基酸序列的重鏈可變區、其抗原結合片段，或者其具有免疫學功能的免疫球蛋白片段，并且輕鏈含有具有SEQ ID NO38中提出的氨基酸序列的輕鏈可變區、其抗原結合片段，或者其具有免疫學功能的免疫球蛋白片段。
16.權利要求15的抗體，其中重鏈可變區含有與SEQ ID NO22中提出的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，并且其中輕鏈可變區含有與SEQ ID NO38中提出的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，并且其中該抗體特異結合白介素-1受體型1(IL-1R1)。
17.權利要求12的抗體，其中重鏈含有具有SEQ ID NO24中提出的氨基酸序列的重鏈可變區、其抗原結合片段，或者其具有免疫學功能的免疫球蛋白片段，并且輕鏈含有具有SEQ ID NO38中提出的氨基酸序列的輕鏈可變區、其抗原結合片段，或者其具有免疫學功能的免疫球蛋白片段。
18.權利要求17的抗體，其中重鏈可變區含有與SEQ ID NO24中提出的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，并且其中輕鏈可變區含有與SEQ ID NO38中提出的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，并且其中該抗體特異結合白介素-1受體型1(IL-1R1)。
19.權利要求12的抗體，其中重鏈含有具有SEQ ID NO26中提出的氨基酸序列的重鏈可變區、其抗原結合片段，或者其具有免疫學功能的免疫球蛋白片段，并且輕鏈含有具有SEQ ID NO38中提出的氨基酸序列的輕鏈可變區、其抗原結合片段，或者其具有免疫學功能的免疫球蛋白片段。
20.權利要求19的抗體，其中重鏈可變區含有與SEQ ID NO26中提出的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，并且其中輕鏈可變區含有與SEQ ID NO38中提出的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，并且其中該抗體特異結合白介素-1受體型1(IL-1R1)。
21.權利要求12的抗體，其中重鏈含有具有SEQ ID NO28中提出的氨基酸序列的重鏈可變區、其抗原結合片段，或者其具有免疫學功能的免疫球蛋白片段，并且輕鏈含有具有SEQ ID NO38中提出的氨基酸序列的輕鏈可變區、其抗原結合片段，或者其具有免疫學功能的免疫球蛋白片段。
22.權利要求21的抗體，其中重鏈可變區含有與SEQ ID NO28中提出的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，并且其中輕鏈可變區含有與SEQ ID NO38中提出的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，并且其中該抗體特異結合白介素-1受體型1(IL-1R1)。
23.權利要求12的抗體，其中重鏈含有具有SEQ ID NO30中提出的氨基酸序列的重鏈可變區、其抗原結合片段，或者其具有免疫學功能的免疫球蛋白片段，并且輕鏈含有具有SEQ ID NO38中提出的氨基酸序列的輕鏈可變區、其抗原結合片段，或者其具有免疫學功能的免疫球蛋白片段。
24.權利要求23的抗體，其中重鏈可變區含有與SEQ ID NO30中提出的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，并且其中輕鏈可變區含有與SEQ ID NO38中提出的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，并且其中該抗體特異結合白介素-1受體型1(IL-1R1)。
25.特異結合白介素-1受體型1(IL-1R1)的分離的人抗體，其中抗體含有a)含有如SEQ ID NO40中提出的氨基酸序列的輕鏈、其抗原結合片段或其具有免疫學功能的免疫球蛋白片段；和b)含有如SEQ ID NO32、SEQ ID NO34或SEQ ID NO36中提出的氨基酸序列的重鏈、其抗原結合片段或其具有免疫學功能的免疫球蛋白片段。
26.權利要求25的抗體，其中重鏈含有具有SEQ ID NO32中提出的氨基酸序列的重鏈可變區、其抗原結合片段，或者其具有免疫學功能的免疫球蛋白片段，并且輕鏈含有具有SEQ ID NO40中提出的氨基酸序列的輕鏈可變區、其抗原結合片段，或者其具有免疫學功能的免疫球蛋白片段。
27.權利要求26的抗體，其中重鏈可變區含有與SEQ ID NO32中提出的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，并且其中輕鏈可變區含有與SEQ ID NO40中提出的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，并且其中該抗體特異結合白介素-1受體型1(IL-1R1)。
28.權利要求25的抗體，其中重鏈含有SEQ ID NO34中提出的氨基酸序列、其抗原結合片段，或者其具有免疫學功能的免疫球蛋白片段，并且輕鏈含有SEQ ID NO40中提出的氨基酸序列、其抗原結合片段，或者其具有免疫學功能的免疫球蛋白片段。
29.權利要求28的抗體，其中重鏈可變區含有與SEQ ID NO34中提出的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，并且其中輕鏈可變區含有與SEQ ID NO40中提出的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，并且其中該抗體特異結合白介素-1受體型1(IL-1R1)。
30.權利要求25的抗體，其中重鏈含有SEQ ID NO36中提出的氨基酸序列、其抗原結合片段，或者其具有免疫學功能的免疫球蛋白片段，并且輕鏈含有SEQ ID NO40中提出的氨基酸序列、其抗原結合片段，或者其具有免疫學功能的免疫球蛋白片段。
31.權利要求30的抗體，其中重鏈可變區含有與SEQ ID NO36中提出的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，并且其中輕鏈可變區含有與SEQ ID NO40中提出的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，并且其中該抗體特異結合白介素-1受體型1(IL-1R1)。
32.權利要求1、2、3、4、5、12或25的抗體，其中重鏈和輕鏈通過柔性接頭連接形成單鏈抗體。
33.權利要求32的抗體，其是單鏈Fv抗體。
34.權利要求1、2、3、4、5、12或25的抗體，其是Fab抗體片段。
35.權利要求1、2、3、4、5、12或25的抗體，其是Fab’抗體片段。
36.權利要求1、2、3、4、5、12或25的抗體，其是(Fab’)2抗體片段。
37.權利要求1、2、3、4、5、12或25的抗體，其中該抗體是完全人抗體。
38.權利要求1、2、3、4、5、12或25的抗體，其中該抗體抑制IL-1與其受體的結合。
39.治療患者中IL-1介導的疾病的方法，該方法包括對患者施用藥學有效量的權利要求38的抗體。
40.藥物組合物，其含有藥學上可接受的載體和治療有效量的權利要求38的抗體。
41.治療患者中IL-1介導的疾病的方法，該方法包括對患者施用權利要求40的藥物組合物。
42.含有可變區和恒定區的重鏈，其中可變區含有SEQ ID NO10、SEQ ID NO14、或SEQ ID NO16中任一個提出的氨基酸序列，或者其抗原結合片段或具有免疫學功能的免疫球蛋白片段。
43.含有如在SEQ ID NO20、SEQ ID NO22、SEQ ID NO24、SEQ ID NO26、SEQ ID NO28、SEQ ID NO30、SEQ ID NO32、SEQ ID NO34、或SEQ ID NO36任一個中提出的氨基酸序列的重鏈，或者其抗原結合片段或具有免疫學功能的免疫球蛋白片段。
44.含有可變區和恒定區的輕鏈，其中可變區含有SEQ ID NO12或SEQ ID NO18任一個中提出的氨基酸序列，或者其抗原結合片段或具有免疫學功能的免疫球蛋白片段。
45.含有如在SEQ ID NO38或SEQ ID NO40任一個中提出的氨基酸序列的輕鏈，或者其抗原結合片段或具有免疫學功能的免疫球蛋白片段。
46.分離的人抗體，其含有a)人重鏈框架區、人重鏈CDR1區、人重鏈CDR2區、和人重鏈CDR3區，其中人重鏈CDR 3區具有氨基酸序列SEQ ID NO67、SEQ IDNO68或SEQ ID NO69；和b)人輕鏈框架區、人輕鏈CDR1區、人輕鏈CDR2區、和人輕鏈CDR3區，其中人輕鏈CDR3區具有氨基酸序列SEQ ID NO74或SEQ IDNO75；其中該抗體特異結合白介素-1受體型1(IL-1R1)。
47.權利要求46的分離的人抗體，其中人重鏈CDR2區具有氨基酸序列SEQ ID NO64、SEQ ID NO65或SEQ ID NO66并且人輕鏈CDR2區具有氨基酸序列SEQ ID NO72或SEQ ID NO73。
48.權利要求46的分離的人抗體，其中人重鏈CDR1區具有氨基酸序列SEQ ID NO61、SEQ ID NO62或SEQ ID NO63并且人輕鏈CDR1區具有氨基酸序列SEQ ID NO70或SEQ ID NO71。
49.含有人重鏈CDR1區的分離的人抗體，其中重鏈CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO61、SEQ ID NO62或SEQ ID NO63，并且其中該抗體特異結合白介素-1受體型1(IL-1R1)。
50.含有人重鏈CDR2區的分離的人抗體，其中重鏈CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO64、SEQ ID NO65或SEQ ID NO66，并且其中該抗體特異結合白介素-1受體型1(IL-1R1)。
51.含有人重鏈CDR3區的分離的人抗體，其中重鏈CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO67、SEQ ID NO68或SEQ ID NO69，并且其中該抗體特異結合白介素-1受體型1(IL-1R1)。
52.含有人輕鏈CDR1區的分離的人抗體，其中輕鏈CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO70或SEQ ID NO71，并且其中該抗體特異結合白介素-1受體型1(IL-1R1)。
53.含有人重鏈CDR2區的分離的人抗體，其中重鏈CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO72或SEQ ID NO73，并且其中該抗體特異結合白介素-1受體型1(IL-1R1)。
54.含有人重鏈CDR3區的分離的人抗體，其中重鏈CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO74或SEQ ID NO75，并且其中該抗體特異結合白介素-1受體型1(IL-1R1)。
55.特異結合SEQ ID NO76的多肽的分離的人抗體。
56.權利要求55的抗體，其中該抗體特異結合IL1-R1的表位4。
57.權利要求5、12或25的抗體，其是IgG2抗體。
58.權利要求5、12或25的抗體，其特異結合SEQ ID NO76的多肽。
59.權利要求5、12或25的抗體，其特異結合IL1-R1的表位4。
60.對所選抗原進行表位作圖的方法，該方法包括a)產生一組融合蛋白，其中每種融合蛋白含有(i)抗生物素蛋白和(ii)抗原的片段；b)篩選與所述抗原的一種或多種特異結合配偶體結合的融合蛋白組；c)在含有生物素的介質上分離融合蛋白，其中抗生物素蛋白結合生物素；和d)分析被特異結合配偶體結合的融合蛋白以確定所述特異結合配偶體在該抗原上的結合位點。
61.權利要求60的方法，其中特異結合配偶體是抗體。
全文摘要
描述了與白介素－1受體型1(IL－1R1)相互作用的抗體。還描述了通過施用藥學有效量的針對IL－1R1的抗體治療IL－1介導的疾病的方法。另外還描述了使用針對IL－1R1的抗體檢測樣品中IL－1R1的量的方法。
文檔編號G01N33/53GK1742021SQ03824846
公開日2006年3月1日 申請日期2003年9月5日 優先權日2002年9月6日
發明者B·瓦納姆, C·韋茲納, A·維特, X·錢, F·馬丁, H·黃, G·埃利奧特 申請人:安姆根有限公司