使用熒光化抗體的熒光分析方法

專利名稱：使用熒光化抗體的熒光分析方法
技術領域：
本發明涉及使用與抗體結合后從非熒光性轉為熒光性的色素的熒光分析方法。
背景技術：
對于學術研究或疾病的診斷、治療而言，分析生物體內的生物體成份或各種化學物質(醫藥品、環境污染物等)是非常重要的。但是，用于分析這些物質的通常的現有方法需要復雜的、很花時間的用于采取體液、摘除組織或除去夾雜物的前處理，所以人們一直期望開發出可簡便分析生物體內物質等的高靈敏度分析方法。
因此，作為使這類分析成為可能的方法之一，人們開發了使用熒光色素標識抗體的免疫測定法(immunoassay及immuno-metric-assay)。即，利用該免疫測定法，根據抗原抗體反應的特異的分子識別功能，使高選擇性的分析成為可能，且即使不除去雜質，也可通過熒光分析選擇性測量測定對象物。而熒光色素標識抗體通常使用預先以熒光色素標識過的抗體，根據抗原結合部位識別某一特定物(抗原)。另外，在日本特開平4-211363號公報中，揭示了具有兩個抗原結合部位，其一由組織(tissue)纖維蛋白溶酶原激活劑惹起、而另一個由熒光物質等標記引起的二重特異性雜交(hybrid)單克隆抗體。另外，在日本特開平9-5324號公報中，揭示了相對于將非熒光色素附加于免疫性物質形成的抗原的抗體。另外，在日本特開平11-183477號公報中，還揭示了一種在胰島素的存在下測定基于胰島素及孔雀綠(MG)的結合物質(MG標識胰島素)與將該結合物質作為抗原的抗MG-Ins抗體的抗原抗體反應的熒光強度變化的熒光免疫測定方法。

發明內容
本發明人發現抗原抗體反應是不可逆的，這對本領域技術人員而言是技術常識(例如《熒光免疫分析》宮孔潔等，講談社Scientificp.57-58(1985)；K.Ichihara et al.，Clinica Chimica Acta Vol.98，p.87～100(1979)；等)，在現有的免疫測定法中，難以實時連續分析生物體內物質等的量的變化。
另外，本發明人還發現在日本特開平11-183477號公報所述的MG標識胰島素與抗MG-Ins抗體的抗原抗體反應時，在識別胰島素的部位(胰島素識別部位)，引起胰島素和MG標識胰島素的競爭反應，最終幾乎所有的MG標識胰島素占據胰島素識別部位而達到穩定狀態，即，胰島素和MG標識胰島素的競爭反應是不可逆反應；以及因此使用利用該抗原抗體反應的免疫測定法難以實時連續分析生物體內物質等的量的變化。
本發明就是鑒于上述現有技術所具有的問題而完成的發明，其目的是提供利用抗原抗體反應可簡便、高靈敏度并能實時連續進行分析(包括圖像)生物體內物質等的熒光分析方法。
本發明人為達成上述目的而深入研究后，結果發現意想不到的是，在非熒光性色素單體及免疫性物質單體的存在下，使用本發明的發明人已申請的日本特開平9-5324號公報所述的抗體——即相對于將免疫物質附加在非熒光性色素而形成的抗原的抗體——的抗原抗體反應是可逆的，另外還發現通過利用可逆的抗原抗體反應進行熒光分析，達成了上述目的，從而實現了本發明。
即，本發明涉及一種熒光分析方法，其特征在于，包括得到抗體色素溶液與含有測定對象物質的被檢測體溶液的混合溶液的混合工序，上述抗體色素溶液含有各自具有預定濃度的抗體和色素，上述抗體的抗原結合部位的一部分識別色素，其余的一部分識別測定對象物質，上述色素被上述抗體識別，且與上述抗體結合時由非熒光性轉為熒光性；用勵起光照射上述混合溶液，測定由上述混合溶液發出的熒光的強度，得到測定值的測定工序；以及基于預先求得的熒光強度和測定對象物質濃度的關系，由上述測定值求得上述測定對象物質的濃度的計算工序。
在本發明的熒光分析方法中，在上述抗體色素溶液和上述被測體溶液的混合溶液中，上述色素和上述測定對象物質通過抗原抗體反應分別與上述抗體結合，與抗體結合的色素由非熒光性轉為熒光性。此時，由于色素與抗體的結合受到共存的測定對象物質的量的影響，所以由與抗體結合的色素發出的熒光的強度隨著共存的測定對象物質的量而被阻礙或被增強。因此，在一定的溶液中，色素和抗體的量與熒光強度和測定對象物質濃度相關，根據該關系(檢量線)，由熒光強度的實際測定值求得測定對象物質的濃度。因此，在本發明的熒光分析方法中，可通過抗原抗體反應的特異的分子識別機能進行選擇性高的高靈敏度分析，且即使不除去夾雜物，利用不易受夾雜物影響的熒光分析也可有選擇地簡便測量測定對象物質。于是，本發明的抗原抗體反應，即識別上述抗體中的上述色素的部分和上述色素的結合反應，以及識別上述抗體中的上述測定對象物質的部分和上述測定對象物質的結合反應，與抗原抗體反應是不可逆的這一現有技術常識相反，是可逆的，上述抗體中的上述色素和識別上述測定對象物質的部分被上述色素、上述測定對象物質等占據，而未達到穩定狀態，所以，利用與測定對象物質量的變動相應地改變熒光強度，而能實時連續地進行分析(包括圖像)。
因此，在本發明的熒光分析方法中，在上述計算工序后，還可包括另將被測體溶液添加到上述混合溶液中混合，實行上述測定工序和上述計算工序，反復求得測定對象物質的濃度的連續分析工序。由于包括該連續分析工序，所以可實時連續分析測定對象物質的濃度。
另外，上述計算工序優選包括根據隨著上述被測體溶液的添加的體積變化修正上述測定值，得到熒光強度修正值的工序；根據預先求得的熒光強度修正值和混合溶液中的測定對象物質濃度的關系，由上述熒光強度修正值求得上述混合溶液中的測定對象物質的濃度的工序；由上述混合溶液中的測定對象物質濃度求得上述被測體溶液中的測定對象物質的濃度的工序。通過包括上述工序，即使在忽略伴隨著被測體溶液的添加的混合溶液中的色素和抗體的濃度變化的情況下，也可修正為沒有這樣的濃度變化的狀態，充分防止了分析精度的降低。
而且，本發明的熒光分析方法還可以包括得到抗體色素溶液和含有預定濃度的測定對象物質的標準溶液的混合溶液的混合工序，上述抗體色素溶液含有各自具有預定濃度的抗體和色素，上述抗體的抗原結合部位的一部分識別色素，其余的一部分識別測定對象物質，上述色素被上述抗體識別，且與上述抗體結合時由非熒光性轉為熒光性；用勵起光照射上述混合溶液，測定由上述混合溶液發出的熒光的強度，得到測定值的測定工序；將標準溶液添加到上述混合溶液中混合，然后實行上述測定工序，反復求得熒光強度的測定值的連續測定工序；以及根據上述測定工序和上述連續測定工序中所得到的測定值和上述測定對象物質的添加量求得熒光強度和測定對象物質濃度的關系，制作檢量線的工序。通過包括這樣的工序，可高效率地得到熒光強度和測定對象物質濃度的關系，即檢量線。
另外，上述檢量線制作工序優選包括根據隨著添加上述標準溶液的體積變化修正上述測定值，得到熒光強度修正值的工序；算出上述混合溶液中的測定對象物質的濃度的工序；求得上述熒光強度修正值和上述混合溶液中的測定對象物質濃度的關系的工序。通過包括上述工序，即使在忽略伴隨著被測體溶液的添加的混合溶液中的色素和抗體的濃度變化的情況下，也可修正為沒有這樣的濃度變化的狀態，充分防止了檢量線的精度的降低。
另外，本發明的上述色素優選為具有三苯甲烷結構的色素或具有二苯甲烷結構的色素，更優選為孔雀綠或金胺O(槐黃)。
另外，本發明的上述抗體優選為(i)以上述色素和上述測定對象物質的結合物質為抗原形成的抗體，或(ii)將利用抗體識別且在與上述抗體結合時由非熒光性轉為熒光性所必要的結構與上述色素共通的色素與上述測定對象物質的結合物質用作抗原而形成的抗體，這樣的抗體和色素的組合更優選為(i)上述抗體為將孔雀綠和上述測定對象物質的結合物質作為抗原而形成的抗體，上述色素是孔雀綠的組合，或(ii)上述抗體是將孔雀綠和上述測定對象物質的結合物質作為抗原而形成的抗體，上述色素是金胺O。
另外，利用本發明的熒光分析方法的上述測定對象物質優選為選自應成為免疫測定對象的蛋白質、荷爾蒙、維生素、菌體、環境污染物質、醫藥品。


圖1為作為抗原的MG-測定對象物質復合體的示意圖。
圖2為抗原識別部位識別MG和測定對象物質兩者的狀態示意圖。
圖3為MG和抗體的抗原抗體反應的示意圖。
圖4為測定對象物質和抗體的抗原抗體反應的示意圖。
圖5為抗體、MG和測定對象物質三者的抗原抗體反應示意圖。
圖6A及圖6B分別為測定對象物質對抗體-MG間的抗原抗體反應的影響的示意圖。
圖7為MG-抗體半衰期長于測定對象物質-抗體的示意圖。
圖8為本發明的檢量線的制作方法的優選實施方式的流程圖。
圖9為本發明的熒光分析方法的優選實施方式的流程圖。
圖10為抗MG-Ins血清的抗體值的曲線圖。
圖11為抗MG-Ins Fab和MG反應后的MG熒光光譜圖。
圖12為MG濃度和MG熒光強度的關系曲線圖。
圖13為胰島素濃度和MG熒光強度的關系(檢量線)曲線圖。
圖14為抗MG-Ins IgG和AO反應后的AO熒光光譜圖。
圖15為胰島素濃度和AO熒光強度的關系(檢量線)曲線圖。
圖16為反復添加胰島素和抗胰島素IgG后的AO熒光強度變化曲線圖。
具體實施例方式
下面，參照附圖詳細說明本發明的熒光分析方法的優選實施方式。另外，在附圖中，對相同或相當的部分標柱相同符號。
色素本發明所用的色素無特別限制，只要是在水等通常溶劑中為非熒光性，當與后述抗體結合時轉為熒光性的物質即可。另外，本發明中的非熒光性是指實質上為非熒光性，在通常的測定條件下顯示不出熒光光譜或僅顯示出極弱的熒光，優選為實質上利用市售裝置等不能進行熒光分析(熒光分光分析)的色素(西川泰治等《熒光磷光分析法》、共立出版社，30頁，1984年)。該實質上顯示不出熒光性的色素優選為熒光量子收率在特定條件下小于1％的色素，更優選為熒光量子收率在特定條件下為0.01％以下的色素。
另外，在本發明中，“當色素與抗體結合時由非熒光性轉為熒光性”是指當實質上非熒光性的色素與抗體結合時變成熒光性(熒光性增高)，通過得到用通常熒光分析所得靈敏度之上的分析靈敏度，使熒光分析成為可能，優選為從色素的熒光量子收率在通常的測定條件下為極小的狀態(例如0.01％以下)，利用本發明的處理而與抗體結合(相互作用)，變化到熒光量子收率大的狀態(例如1％以上)。
在本發明中，色素從非熒光性轉為熒光性時的熒光強度的增加優選為熒光量子收率至少增加10倍以上，更優選為至少增加100倍以上，特別優選為至少增加1000倍以上。
另外，本發明中可用的色素不一定必須在可見光區域有吸收(在350nm以上有極大吸收)，也可以是紫外區域有吸收(在350nm以下具有極大吸收)或吸收帶延及可見光區域的色素。
可用在本發明中的色素的分子結構無特別限制，可使用含有各種發色團(chromophore)的色素，優選使用pH值在中性附近含有穩定的發色團的色素。
這樣的色素優選為例如分子結構中具有三苯甲烷骨架的色素(例如參照講談社Scientific社，大河原信編《色素手冊》)，這樣的三苯甲烷系色素特別優選為具有下述化學結構的孔雀綠(MG)。
另外，這樣的色素還優選為例如分子結構中具有二苯甲烷骨架的色素(例如參照講談社Scientific社，大河原信編《色素手冊》)，這樣的二苯甲烷系色素特別優選為具有下述化學結構的金胺O(AO)。

當使用這樣的孔雀綠或金胺O時，可得到約1000倍以上的熒光量子收率的增加。另外，除這些色素外，還可優選利用CCVJ(9-(二氰乙烯基)久洛尼定)系色素、ANS(苯胺基萘)系色素、TNS(對甲苯胺基萘)系色素、DNP(2，4-二硝基苯)系色素。
另外，孔雀綠在水溶液中基本上無熒光，當與抗MG抗體結合后變成熒光性。本發明人推測，這是因為孔雀綠的分子內運動因抗體而受到抑制，結果孔雀綠在吸收勵起光后與在水溶液中時相比，在分子內運動的熱過程(＝非輻射過程)中回到基態的概率相對減少，在輻射過程中失去活性的概率(＝發出熒光)相對增加。這一推論適于具有同樣化學結構或同樣失活過程的所有色素(二苯甲烷系色素、三苯甲烷系色素)。此外，還可從其它方面了解到機理不同但也是利用抗體顯著增強熒光強度的色素(Tomomichi Iwaki et al.，Biochemistry 1993，Vol.32，p.7589-7592；蛋白核酸酶另冊《熒光測定原理及其在生物體系中的應用》小野寺昌彥(金岡佑一等編集)共立出版，1974年，p.189-197)。
測定對象物質可適用于本發明的熒光分析方法的測定對象物質無特別限制，只要是與上述色素結合的物質(復合體)能起到抗原的功能的物質即可。另外，本發明的測定對象物質本身不一定必須是免疫性物質。即，通常，相對于免疫耐受性-低抗原性物質得不到抗體，但在本發明中，因為使用人工化合物的色素與測定對象物質結合的復合體作為抗原而得到抗體，所以，即使測定對象物質本身是免疫耐受性-低抗原性物質，與色素的復合體成為免疫性的可能性很高，可通過后述方法得到抗體。
因此，在本發明的熒光分析方法中，除無機離子或有機離子之外的廣泛物質可適用為測定對象物質，其中優選為選自應成為免疫測定對象的蛋白質(胰島素等)、激素、維生素、菌體、環境污染物質及醫藥品的物質作為測定對象物質。
另外，只要測定對象物質本身在成為抗原時具有足夠大的分子量(通常約為5000以上)，則所有這樣的測定對象物質均可調制后述抗體。即，即使測定對象物質對免疫的動物而言是免疫耐受性物質(是該動物品種的生物體內成份的情況等)，也可調制后述抗體。這是因為本發明的抗原不是測定對象物質本身，而且是交聯人工制品色素的人工制品。
另外，即使測定對象物質本身在成為抗原時不具備足夠的分子量，也可調制再通過共價鍵與相對于色素和測定對象物質的復合體具備抗原性的擔體交聯的物質，將該物質用作抗原。在該情況下，也得到了抗原識別部位形成識別色素和測定對象物質兩者的形態的下述抗體。
抗體本發明所用的抗體是其抗原結合部位的一部分識別色素且余下的部分識別測定對象物質的抗體。即，本發明的抗體的一個抗原結合部位在空間上被分解為多個部分，其中的一部分識別色素，而余下的部分識別測定對象物質。這樣的一個抗原結合部位具有多個不同機能的技術是現有技術中不存在的、而由本發明人初次發現的技術。
這樣的本發明的抗體優選為以本發明的熒光分析方法中所用的色素和測定對象物質的結合物質為抗原而形成，例如在分析所用的色素是孔雀綠時，上述抗體優選為將孔雀綠和測定對象物質的結合物質作為抗原而形成的抗體。
另外，分析中所用的色素不一定必須與用于得到抗體的色素相同，也可使用利用抗體識別且與抗體結合時由非熒光性轉為熒光性所必需的結構兩者共通的色素。這樣的結構共通的色素的組合可舉出孔雀綠和金胺O的組合。因此，例如當分析中所用的色素是金胺O時，上述抗體可為孔雀綠和測定對象物質的結合物質作為抗原而形成的抗體。
色素和測定對象物質的復合體(抗原)的制作本發明的上述色素和測定對象物質的復合體(抗原)的制作方法無特別限制，例如可在規定時間攪拌混合上述測定對象物質和色素，使用凝膠過濾色譜法分離色素和測定對象物質的復合體的抗原組分。
而且，在需要時，可通過使用例如利用免疫反應的精制手段精制所得到的抗原(川島紘一郎(譯)《免疫測定入門》，南山堂，第70頁，1987年)。另外，所得抗原的濃度可用例如Lowry法定量。
抗血清的制作本發明的上述抗體可以用下述免疫工序制作。
即，本發明的上述抗體可通過將上述復合體(抗原)投藥給免疫動物，然后從免疫動物身上采取血液，由該血液分離抗血清而制作。對服用上述復合體(抗原)的免疫動物無特別限制，可使用兔子、天竺鼠等。另外，可使用的免疫佐劑也無特別限制，例如可優選使用通常的弗羅因德氏不完全佐劑、鋁佐劑等。且對可用的免疫注射法也無特別限制，例如，對于天竺鼠，可優選使用皮下注射、腹腔內注射等。另外，抗血清的產生確認和采取如有需要可通過實施追加免疫，進行試驗采取，研究抗體價來進行。
對分離采取的抗血清的方法無特別限制，可用通常的方法，例如使采取的血液凝固后，利用離心分離來分離血清。對所得抗血清的上述復合體(抗原)有特異性的抗體活性可優選用酶免疫反應等測定(圖解《熒光抗體法——原理、技術及應用》川生明著，p.135～138、SoftScience社(1983))。
IgG組分的制作在本發明中，可使用上述抗血清中的抗體，也可使用精制抗血清而得的IgG組分作為抗體。對由這樣的抗血清精制IgG組分的方法無特別限制，可優選使用鹽析法、凝膠過濾法、離子交換色譜法等，特別是可優選使用蛋白質A法。還可利用離心法進一步濃縮所得IgG組分，這樣可將IgG組分調至規定濃度。
抗原結合性片段(Fab)的制作在本發明中，更優選將由上述IgG組分調制的抗原結合性片段(Fab)用作抗體。當使用抗原結合性片段(Fab)時，有更可靠地防止生成與測定對象物質與免疫復合體的沉淀的趨勢。對由這樣的IgG組分調制抗原結合性片段(Fab)的方法無特別限制，例如可使用消化酶(消化酶木瓜酶等)消化IgG組分，得到抗原結合性片段(Fab)。另外，優選通過蛋白質A法等免疫沉降法等精制所得抗原結合性片段(Fab)，也可進一步通過離心法濃縮。這樣可將抗原結合性片段(Fab)調至預定濃度。
本發明的熒光分析方法的原理在本發明的熒光分析方法中，當在溶液中混合上述抗體、色素和測定對象物質時，通過色素和測定對象物質分別與抗原抗體的反應而與抗體結合，與抗體結合的色素由非熒光性轉為熒光性。此時，色素與抗體的結合受共存的測定對象物質的量的影響，與抗體結合的色素發出的熒光強度根據共存的測定對象物質的量而被阻礙或被增強。且與現有技術的抗原抗體反應是不可逆的常識相反，本發明的抗原抗體反應是可逆的，根據測定對象物質的量的變動而改變熒光強度。本發明人推測，該本發明的熒光分析方法的原理如下所述。并以代表本發明所用的色素的使用孔雀綠(以下表示為MG)的情況為例進行說明。
由于MG單獨用作抗原時分子量過小，所以在得到抗MG抗體時，將MG與分子量更大的物質(擔體)以共價鍵交聯的化合物作為抗原投藥給動物。此時，當選擇擔體作為測定對象物質時，抗原通過MG和測定對象物質的共價鍵而成為復合體(如圖1所示的MG-測定對象物質復合體)。這樣所得的抗體(IgG等)中含有圖2所示的其抗原識別部位識別MG和測定對象物質兩者的形態的物質。
當在溶液中混合該抗體和MG時，引起抗原抗體反應，如圖3所示，MG與抗體的抗原結合部位(非共價鍵)結合。該鍵的離解速度常數為kd-MG。另一方面，與在溶液中混合測定對象物質和該抗體時同樣，如圖4所示，測定對象物質在抗體的抗原結合部位(非共價鍵)結合。該離解速度常數為kd-anal。但由于MG和測定對象物質都僅是抗原(即MG-測定對象物質復合體)的一部分，所以發明人推測MG單獨和抗體的結合(以下稱為“MG-抗體結合”)、測定對象物質單獨和抗體的結合(“以下稱為“測定對象物質-抗體結合”)都比最初的抗原MG-測定對象物質復合體和抗體的結合弱。即，當MG-測定對象物質復合體和抗體的結合的離解速度常數為kd-Ag時，離解速度常數小的一方難以離解，即，因為結合強，所以各離解速度常數的關系為kd-Ag＜kd-MGkd-Ag＜kd-anal接著，在混合該抗體、MG及測定對象物質三者后，如圖5所示，MG和測定對象物質都與抗體的抗原結合部位結合。而當MG和測定對象物質二者容納于抗原結合部位時，因為與MG-測定對象物質復合體結合于抗體的圖2所示狀態接近，所以發明人推測最為穩定。但此時，測定對象物質有可能對MG-抗體結合造成影響，MG也有可能對測定對象物質-抗體結合造成影響。所以發明人推測其反應速度論由MG和測定對象物質各自在抗原結合部位內所占位置(哪個更靠內)和各自的離解速度常數決定。例如，當MG結合于比測定對象物質更靠近內部的位置時，在測定對象物質先與抗體結合時，如圖6A所示，MG的結合受到阻礙，另一方面，如果MG先結合，如圖6B所示，通過此后的測定對象物質的結合，MG的結合與MG單獨的情況相比，穩定化進一步增強。這種增強與MG-抗體結合的kd-MG表觀上的減小一致。即，當該表觀離解速度常數為kd-MG′時，kd-MG′＜kd-MG。于是，當kd-MG、kd-anal程度相同，就推測該阻礙和增強發生很大差別。
但當兩者不同時，阻礙和增強有一方占優勢。通常抗原抗體復合體的半衰期t1/2用t1/2＝0.693/kd求得。即，kd小的一方半衰期長。因此，在kd-MG＜kd-anal時，如圖7所示，MG-抗體結合的半衰期變得更長。則即使發生圖6A所示的阻礙，測定對象物質也在較短時間內從抗體離解，然后MG結合，以更長的半衰期繼續形成MG-抗體結合。于是，測定對象物質可與該位置結合，引起其結果增強(成為kd-MG′＜kd-MG)。而當kd-anal＜kd-MG(MG的一方離解快)時，即使MG結合，在測定對象物質結合并受到增強以前也會從抗體上離解，所以難以引起增強而由阻礙支配。
本發明人推測實際上kd-MG和kd-anal的大小關系隨所得抗體而各不相同，單克隆抗體時為各抗體克隆，多克隆抗體時為所含的各單克隆抗體的總體發生阻礙、增強的任一方面。
本發明利用的就是該現象。即，當注目于MG-抗體結合時，在MG和抗體保持在一定量的情況下，阻礙或增強的程度依賴于共存的測定對象物質的量，這表現在MG的熒光強度的變化上。因此，通過測定MG的熒光強度變化，可檢測、定量測定對象物質。
于是，本發明的上述抗原抗體反應與現有技術的抗原抗體反應是不可逆的常識相反，是可逆的。因此，根據測定對象物質的量的變動而變動MG的熒光強度，通過測定其熒光強度變化，可實時連續分析測定對象物質。
檢量線的制作本發明的熒光分析方法優選為在實際試料測定以前，預先求得表示熒光強度和測定對象物質的關系的檢量線。根據圖8所示的流程圖詳細說明本發明的檢量線的制作方法的優選實施方式。
在圖8所示的流程圖中，首先，調制分別以規定濃度(抗體濃度YμM、色素濃度ZμM)含有抗原結合部位的一部分識別色素且余下的一部分識別測定對象物質的上述抗體和與抗體結合時由非熒光性轉為熒光性的上述色素的抗體色素溶液Aml(S101)。另外，所用溶劑無特別限制，優選為pH為中性附近，優選為pH6.5～7.5的緩沖液，這樣的溶劑可舉出例如磷酸緩沖生理鹽水。
然后將該抗體色素溶液加入熒光測定用容器，設置(set)在根據使用的色素等分別設定勵起光波長及熒光波長為規定值的熒光分光光度計中。這時，設定次數n的初值為n＝1(S102)。另外，優選保持吸收池座(cell holder)的溫度為一定溫度，保持溫度優選為在25～37℃范圍內的溫度。另外，優選以規定時間攪拌容器中的溶液。
再將含有規定濃度(XμM)測定對象物質的標準溶液Bnml添加到容器中的溶液中，攪拌所得混合溶液規定時間，進行色素及測定對象物質和抗體的抗原抗體反應(S103，混合工序)。另外，標準溶液中所用的溶劑無特別限制，與抗體色素溶液中所用的溶劑一樣，優選為pH為中性附近的緩沖液(例如磷酸緩沖生理鹽水)。
接著，用具有規定勵起光波長的勵起光照射容器中的混合溶液，測定由該混合溶液發出的具有規定熒光波長的熒光的強度，取得測定值In(S104，測定工序)。另外，對勵起光的照射及熒光強度的具體測定方法無特別限制，熒光強度測定值In優選為取得規定測定時間中的熒光強度的平均值或積分值。另外，還可將未添加測定對象物質的狀態下的熒光強度作為空白值，將實際熒光強度測定值減去空白值的值作為熒光強度的測定值In(且此時，相對于實際測定值，在實施根據隨著添加標準溶液等的體積變化的修正后，減去空白值)。
然后根據隨著添加上述標準溶液的體積變化修正如上所述得到的熒光強度測定值In，算出與抗體濃度為YμM且色素濃度為ZμM的溶液中的熒光強度相當的熒光強度修正值In′(S105)。另外，修正熒光強度的體積變化時的計算式為下式(1)In′=In×{(A+Σn-1nBn)/A}---(1)]]>當次數n＝1時，為I1′＝I1×{(A+B1)/A} (1)′
另外，算出測定熒光強度后的混合溶液中的測定對象物質的濃度Xn′μM(S106)。另外，計算混合溶液中的測定對象物質濃度時的計算式為下式(2)Xn′=X×{Σn-1nBn/(A+Σn-1nBn)}---(2)]]>當次數n＝1時，為X1′＝X×{B1/(A+B1)}(2)′這樣得到次數n＝1時的熒光強度修正值In′及測定對象物質濃度Xn′后，次數n加1(S108)，再進行上述標準溶液Bnml的添加混合(S103)、熒光強度測定值In的取得(S104)、熒光強度修正值In′的計算(S105)及測定對象物質濃度Xn′的計算(S106)，得到次數n＝2時的熒光強度修正值In′及測定對象物質Xn′。另外，次數n＝2時，上述式(1)變為I2′＝I2×{(A+B1+B2)/A} (1)″當次數n＝2時，為X2′＝X×{(B1+B2)/(A+B1+B2)}(2)″反復進行S108→S103→S104→S105→S106→S107(連續測定工序)，至這樣得到的熒光強度修正值In′即使添加標準溶液也無變化為止，即(In′-In-1′)的值為設定值(例如零)以下(S107)為止，分別得到次數n從1～n時的熒光強度修正值In′及測定對象物質濃度Xn′。
然后根據這樣得到的次數n從1～n時的熒光強度修正值In′及測定對象物質濃度Xn′，制作表示熒光強度修正值In′及測定對象物質濃度Xn′的關系的檢量線(S109，檢量線制作工序)。另外，對將這些數值繪成檢量線的具體方式無特別限制，適當利用最小二乘法等公知方法可得到精度更高的檢量線。
實際試料的測定根據圖9所示的流程圖詳細說明本發明的熒光分析方法的優選實施方式。
在圖9所示的流程圖中，首先，與制作檢量線時一樣，調制分別以規定濃度(抗體濃度YμM、色素濃度ZμM)含有抗原結合部位的一部分識別色素且余下的一部分識別測定對象物質的上述抗體和與抗體結合時由非熒光性轉為熒光性的上述色素的抗體色素溶液Aml(S201)。另外，所用溶劑無特別限制，與制作檢量線時所用的溶劑一樣，優選為pH為中性附近的緩沖液，例如磷酸緩沖生理鹽水。另外，抗體色素溶液中的抗體濃度及色素濃度與制作檢量線時一樣，分別為YμM、ZμM。
然后將該抗體色素溶液加入熒光測定用容器，與制作檢量線時一樣，設置在分別將勵起光波長及熒光波長設定為規定值的熒光分光光度計中。這時，設定次數n的初值為n＝1(S202)。另外，優選保持吸收池座的溫度與制作檢量線時同樣的溫度，保持溫度優選為在25～37℃范圍內的溫度。另外，優選以規定時間攪拌容器中的溶液。
再將被測體溶液Bnml添加到容器中的溶液中，攪拌所得混合溶液規定時間，進行色素及測定對象物質和抗體的抗原抗體反應(S203，混合工序)。另外，被測體溶液也可直接使用作為測定對象的體液等，也可為用溶劑稀釋到規定倍的溶液。該稀釋中所用溶劑無特別限制，與抗體色素溶液中所用的溶劑一樣，優選為pH為中性附近的緩沖液，例如磷酸緩沖生理鹽水。
接著，用具有規定勵起光波長的勵起光照射容器中的混合溶液，測定由該混合溶液發出的具有規定熒光波長的熒光的強度，取得測定值In(S204，測定工序)。另外，對勵起光的照射及熒光強度的具體測定方法無特別限制，與制作檢量線時一樣，熒光強度測定值In優選為取得規定測定時間中的熒光強度的平均值或積分值。
然后根據隨著添加上述標準溶液的體積變化修正如上所述得到的熒光強度測定值In，算出與抗體濃度為YμM且色素濃度為ZμM的溶液中的熒光強度相當的熒光強度修正值In′(S205)。另外，修正熒光強度的體積變化時的計算式為下式(3)In′=In×{(A+Σn=1nBn)/A}---(3)]]>當次數n＝1時，為I1′＝I1×{(A+B1)/A} (3)′然后根據表示預先求得的熒光強度修正值In′和測定對象物質濃度Xn′的關系的檢量線，由熒光強度修正值In′求出混合溶液中的測定對象物質的濃度Xn′μM(S206)。
于是，可由這樣求得的混合溶液中的測定對象物質的濃度Xn′算出上述被測體溶液Bnml中的測定對象物質的濃度XnμM(S207)。另外，計算被測體溶液中的測定對象物質濃度時的計算式為下式(4)Xn={Xn′×A+Σn=1nBn)-Σn=1n-1XnBn}/Bn---(4)]]>當次數n＝1時，為X1＝{X1′×(A+B1)}/B1(4)′另外，在本實施方式中，上述熒光強度修正值In′的計算(S205)、混合溶液中的測定對象物質濃度Xn′的計算(S206)及被測體溶液中的測定對象物質的濃度Xn的計算(S207)相當于本發明的計算工序。
這樣就可測定被測體溶液中的測定對象物質濃度Xn，由于如上所述，本發明的抗原抗體反應是可逆的，所以使如下所述地連續測定其它被測體溶液成為可能。即，當需要測定其它被測體溶液時(S208)，次數n加1(S209)，再進行上述標準溶液Bnml的添加混合(S203)、熒光強度測定值In的取得(S204)、熒光強度修正值In′的計算(S205)、混合溶液中的測定對象物質濃度Xn′的計算(S206)及被測體溶液中的測定對象物質的濃度Xn的計算(S207)，就可測定第二次(次數n＝2)的被測體溶液中的測定對象物質濃度Xn。另外，次數n＝2時，上述式(3)變為I2′＝I2×{(A+B1+B2)/A} (3)″上述式(4)變成X2＝{X2′×(A+B1+B2)-(X1×B1)}/B2(4)″然后反復進行上述S209→S203→S204→S205→S206→S207→S208(連續分析工序)，至無需測定其它被測體溶液(S208)為止，就可連續測定多個(次數n為1～n)被測體溶液中的測定對象物質濃度Xn。另外，這樣的測定對象物質濃度的連續測定可反復進行，直至抗體相對于測定對象物質飽和等即使添加被測體溶液熒光強度也不再變化的程度。
由于在上述本實施方式的熒光分析方法中利用抗原抗體反應，所以可通過特異的分子識別機能進行高選擇性的高靈敏度分析，且通過熒光分析，即使不除去夾雜物也可有選擇地簡便測量測定對象物質。而且，因為本發明的抗原抗體反應與現有技術的抗原抗體反應是不可逆的常識相反，是可逆的，所以利用對應于測定對象物質的量的變動改變熒光強度(增強或阻礙)，就可進行實時連續分析。
實施例下面，根據實施例更具體地說明本發明，但本發明并不限于這些實施例，在不脫離本發明的技術構思的范圍內，可進行各種變更。
實施例1使用抗MG-Ins抗體的Fab和MG的胰島素的定量(1-1)試藥及實驗動物實施例所用的主要試藥及實驗動物如下。孔雀綠(MG，AldrichChemical Company，Inc.制)、孔雀綠異硫氰酸酯(MGITC，MolecularProbes Inc.制)、金胺O(AO，Aldrich Chemical Company，Inc.制)、二甲亞砜(DMSO，和光純藥工業(株)制)、胰島素(豬，和光純藥工業(株)制)、SDS(Sodium Dodecyl Sulfate，和光純藥工業(株)制)、抗豬胰島素抗體(免疫動物Guinea Pig，Sigma制)、天竺鼠(Crj；Hartley，雄性，三周，SPF，體重225～240g，日本Chars-River(株)制)、麻醉劑(NEMBUTAL Sodium Solution，50mg/ml，Dynabot(株)制)、RAS(Ribi Adjuvant System MPL+TDM+CWS Emulsion，R-730(RIBI Immuno Chem Research，Inc.制)、0.1M磷酸緩沖液(PB，pH7.0)、抗原涂敷用緩沖液(50mM碳酸鈉緩沖液，pH8.4(+)NaN3)、清洗用緩沖液(磷酸緩沖生理鹽水，pH7.2(+)0.05％Tween20)、阻擋用緩沖液(磷酸緩沖生理鹽水，pH7.2，0.5％Gelatin)，96孔微量滴定板(ELISATESTPLATEF-FORM 2X8 F-STRIPS BINDUNG，greiner制)、過氧化物酶標識山羊抗天竺鼠IgG抗體(Peroxidase標識Goat抗Guinea PigIgG抗體，ORGANON TEKNIKA CORPORATION Cappel ResearchProduct制)、試料前處理用筒(離心濃縮用MINICENT-30或ULTRACENT-30、東曹(株)制、分組分子量30000道爾頓)、顯色試藥套件(ABTS Peroxidase Substrate System，Kirkegaard & PerryLaboratories Inc.制)、固定化番木瓜蛋白酶(Sigma制)。
(1-2)使用儀器實施例所用的主要機器如下。讀卡機(BIO-RAD MODEL 3550MICROPLATE READER)、離心機(HITACHI SCR18B，日立制作所制)、離心機轉子(RPR-18-3，日立制作所制)、離心機(Labnet FORCE7，Labnet International Inc.制)、離心機(KOKUSAN MODEL H-103RS，國產離心機(株)制)、渦流攪拌機(AUTOMATIC MIXER S-100，TAITEC(株)制)、熒光分光光度計(Fluorolog，instruments S.A.Inc.制)、循環機(BU150P，YAMATO科學(株)制)，小轉子(孔內盛榮堂制)、熒光測定用容器(孔內盛榮堂制)、高速液體色譜儀(LaChrom系統接口D-7000，UV檢測器D-7400，泵D-7100，脫氣器D-7610、日立制作所制)。
(1-3)共通實驗法(蛋白質試料的離心濃縮及蛋白定量的方法)含有蛋白質的試料使用試料前處理用筒(ULTRACENT-30或MINISENT-30)和離心機(HITACHI SCR18B或Labnet Force7)，在3000xg下離心濃縮。溶劑取代也在離心濃縮時同時進行。
另外，試料的蛋白質濃度使用市售的試藥套件(BCA Protein AssayReagent Kit，PIERCE制)及標準蛋白質溶液(馬IgG標準液，濃度2mg/ml，ImmunoPure Horse IgG Standard，PIERCE制)，并用BCA法定量。即，將蛋白質試料(根據需要用PB稀釋的物質)、標準蛋白質溶液稀釋系列(25～1500μg/ml)及PB(檢量級用空白試料)各25μl加入容量1.5ml的埃彭道夫管，向其中添加試藥套件的反應液(根據BCA Protein Assay Reagent Kit Manual(Pierce制)調制必要量)500μl并攪拌，在37℃下加溫30～60分鐘。然后從各埃彭道夫管將300μl分注到96孔微量滴定板，用讀卡機測定595nm的吸光度。然后根據標準蛋白質溶液稀釋系列濃度-吸光度的關系制成的檢量線求得蛋白質試料的蛋白濃度。
(1-4)抗原(MG-Ins復合體)的調制如下所述進行抗原的孔雀綠(MG)和胰島素(Ins)的共有結合物(MG-Ins復合體)的調制和精制。即，將胰島素4.7mg及孔雀綠異硫氰酸酯(MGITC)0.6mg(溶于20μl的二甲亞砜)溶于2ml的0.1M碳酸鈉緩沖液(pH9.8)，用鋁輪給容器遮光，在4℃下攪拌一夜。在該反應中，孔雀綠異硫氰酸酯與胰島素的氨基結合，得到MG-Ins復合體。然后，為除去未反應成份，將所得反應液供至經0.1M磷酸鈉緩沖液(PB，pH7.0)平衡過的凝膠過濾柱(Econo-Pac 10DG，BIO-RAD制)，用4ml的PB使未反應成份從柱中溶出，得到MG-Ins組分(約1.2mg/ml)。
(1-5)利用免疫調制抗血清將MG-Ins組分330μl和生理鹽水1.7ml添加到RAS的小藥瓶中，用渦流攪拌機劇烈攪拌，調制抗原和佐劑的乳液。
再用麻醉劑(NEMBUTAL)麻醉(投藥量15ml/kg)4只天竺鼠，將上述乳液在每只的頸部投藥0.5ml(皮下注射(0.1ml×4個位置)，在腹腔投藥0.1ml。在該初次免疫后，以一周的間隔，將等量的抗原和佐劑投藥三次，進行追加免疫。
在最后的追加免疫一周后，將用醚麻醉的天竺鼠開腹，由腎大靜脈采全血。再將所得血液采集到10ml試管中，在孵卵器中加溫到37℃，使之形成血餅。然后用離心機(KOKUSAN MODEL H-103RS)進行離心分離(3000rpm、4℃、10min)分離血餅，得到抗血清。
(1-6)抗體價的測定利用酶免疫測定法測定抗血清的抗體價。即，首先將抗原涂敷用緩沖液6.3ml添加到MG-Ins組分700μl中，分注到96孔微量滴定板的各孔中0.1ml，在4℃下靜置一夜，使抗原(MG-Ins復合體)吸附涂敷在板的各孔內面。然后除去板內的抗原溶液，將0.1ml的清洗用緩沖液添加至各孔，以清洗孔內。進行三次該清洗操作后，為防止非特異吸附，將阻擋用緩沖液0.1ml添加到各孔中，在4℃下靜置一夜。然后除去阻擋用緩沖液，再進行三次利用清洗用緩沖液的清洗。
再用PB稀釋抗血清，調制稀釋系列(稀釋倍數500～32000倍)。再調制用PB稀釋5倍未投放抗原的天竺鼠的血清，作為對照。相對于該對照物的抗體價，該抗血清稀釋系列所顯示的抗體價實質上相當于100～6400倍稀釋的抗體價。將該抗血清稀釋系列及對照血清稀釋液各0.1ml添加到上述板的各孔中，在4℃下靜置一夜，進行抗原抗體反應。
從這樣進行抗原抗體反應的上述板中除去抗血清稀釋系列和對照血清稀釋液，進行三次利用清洗用緩沖液0.1ml的清洗操作。然后在各孔中分別添加0.1ml過氧化物酶標識山羊抗天竺鼠IgG抗體的1000倍稀釋液(用PB稀釋)，在4℃下靜置一夜。然后，進行三次利用清洗用緩沖液0.1ml的清洗操作，將顯示過氧化物酶的酶活性的顯色試劑(2，2′-連氮-二[3-乙基-苯基噻唑啉]磺酸酯，ABTS)的反應液(根據試藥套件ABTS Peroxidase Substrate System的指南調制)0.1ml分注到各孔中，在37℃下加溫30分鐘進行酶反應。然后將SDS的1％水溶液0.1ml添加到各孔中，使酶反應停止，用讀卡機測定各孔的吸光度(405nm)。所得結果如圖10所示。
由圖10所示結果可知各天竺鼠的抗血清分別稀釋到800倍或1600倍，顯示出強于對照血清的抗體活性，得到MG-Ins復合體特異的抗血清。將這樣的四只天竺鼠的抗血清的混合物(以下稱為“抗MG-Ins血清”)用于下述實驗。
(1-7)抗MG-Ins IgG組分的調制將固定了與IgG特異結合的蛋白質Protein A的樹脂{rProtein ASepharose Fast Flow(Pharmacia Biotech AB制)}0.7ml填充于塑料制柱(內徑約7mm、長約8mm)中(以下稱為“蛋白質A柱”)，用3ml的PB清洗。
然后用1ml的PB稀釋抗MG-Ins血清1ml，通過安裝在5ml可任意使用的注射器上的筒型過濾器(0.45μ、W-25-5、東曹(株)制)除去微粒。將其添加到蛋白質A柱中，使IgG與蛋白質A結合，然后使10ml的PB流過柱，清洗除去沒有與蛋白質A結合的成份。再使4ml的0.1M檸檬酸緩沖液(pH4.0)流過蛋白質A柱，使IgG從蛋白質A離解，得到抗MG-Ins IgG組分。再使10ml的PB流過蛋白質A柱，再生該柱。在離心濃縮所得抗MG-Ins IgG組分時溶劑取代PB。根據需要，反復上述操作，調制后述實驗所需量的抗MG-Ins IgG組分。
(1-8)來自抗MG-Ins IgG組分的抗原結合性片段(Fab)的調制、分離精制用消化酶番木瓜蛋白酶消化IgG，調制Fab。即，首先，將固定化的番木瓜蛋白酶8.7mg加入容量2.2ml的埃彭道夫管中，添加200μl的PB，攪拌后進行離心分離，除去上清液，清洗固定化番木瓜蛋白酶。反復進行兩次該清洗后，使固定化番木瓜蛋白酶懸濁在1ml的20mM磷酸緩沖液(pH7.0，(+)10mM EDTA(+)20mM半胱氨酸)中。再添加500μl的20mM磷酸緩沖液和500μl的抗MG-Ins IgG組分(IgG濃度約4.5mg/ml)的混合液，使半胱氨酸的最終濃度為10mM，加溫到37℃，振蕩數小時，進行酶反應。然后進行酶反應液的輕度離心分離，采集上清，將所得上清添加到蛋白質A柱中，使未消化的IgG與蛋白質A結合。然后再使10ml的PB流過蛋白質A柱，進行采取，再離心濃縮，得到含有抗MG-Ins抗體的Fab(以下稱為“抗MG-Ins Fab”)的組分(5.20mg/ml，34.7μM as IgG＝69.3μM as Fab)。
(1-9)與抗MG-Ins Fab結合的孔雀綠的熒光光譜的測定如下所示，測定利用抗原抗體反應使MG與抗MG-Ins Fab結合時的MG的熒光光譜。即，將兩成份混合，使抗MG-Ins Fab濃度為0.955μM、MG濃度為0.907μM(溶劑為磷酸緩沖生理鹽水(pH7.2，PBS))，在25℃下攪拌5分鐘，進行抗原抗體反應。然后使用熒光分光光度計在勵起光波長620nm、熒光波長630～750nm、勵起光側和熒光側的帶通寬均為5nm的條件下，測定由上述混合溶液發出的熒光光譜。所得熒光光譜的未處理數據減去相同條件下測定的磷酸緩沖生理鹽水的本底以及增加利用裝置函數的修正值的熒光光譜如圖11所示。確認水溶液中基本上無熒光的孔雀綠與抗MG-Ins Fab結合轉為熒光性。
另外，使抗MG-Ins Fab濃度為1μM、MG濃度在0～0.9μM的范圍內變化，同上所述地測定熒光光譜。所得結果如圖12所示。另外，縱軸是MG發出的熒光的強度值(每秒平均值，CPScount per second)。
根據圖12所示的結果，抗體和色素的相對量的優選值，即色素相對于抗體不飽和且得到較強色素熒光的值，在以下定量中，相對于抗MG-Ins Fab濃度1μM采用MG濃度0.4μM。另外，每次與每次的調整多克隆抗體時的該相對值有可能不同，另外，即使來自相同的多克隆抗體，也有可能因調整的Fab的精制純度，表觀上呈現不同。
(1-10)使用抗MG-Ins Fab和孔雀綠的胰島素的定量[1-10-1]檢量線的制作如下所示，制作相對于一定量(1μM)的抗MG-Ins Fab和一定量(0.4μM)的MG的表示胰島素濃度和熒光強度的關系檢量線。另外，所用胰島素形成含鋅的多分子締合體，所以事前溶于含有最終濃度為0.1％的SDS的PB中，使該締合體離解。然后，將所得胰島素溶液供至用PBS平衡過的凝膠過濾柱(Fast Desaliting column HR 10/10，Pharmacia制)，在下述定量中，使用從該胰島素溶液中除去SDS的產物。
(1)將熒光分光光度計設定為勵起光波長620nm、熒光波長650nm，保持吸收池座的溫度在一定溫度(25℃)。
(2)調制含有1μM(Y＝1μM)的抗MG-Ins Fab和0.4μM(Z＝0.4μM)的MG的2ml(A＝2ml)抗體色素溶液(溶劑為磷酸緩沖生理鹽水)(pH7.2、PBS)(S101)。
(3)將所得抗體色素溶液加入熒光測定用標準容器內，將該容器設置在熒光分光光度計中，用小轉子攪拌容器中的溶液30秒。并將次數設為初值(n＝1)(S102)。
(4)將26.5μM(X＝26.5μM)的胰島素標準溶液(溶劑為PBS)10μl(B1＝0.01ml)添加到容器中的溶液中，用小轉子攪拌5分鐘，進行抗原抗體反應(S103)。
(5)用勵起光照射容器中的溶液，測定從該溶液中發出的MG的熒光強度30秒，求得熒光強度每秒平均值(熒光強度測定值I1)(S104)。另外，將胰島素濃度為0μM時的熒光強度作為空白值，實際測定值減去空白值為測定值。
(6)用下述計算式修正(根據隨著添加標準溶液的體積變化的修正)所得熒光強度測定值(I1)，求得體積變化修正值(熒光強度修正值I1′)(S105)。
I1′＝I1×{(A+B1)/A}(1)′(7)由胰島素標準溶液的濃度(X)，使用下述計算式求得測定熒光強度的混合溶液的胰島素濃度(胰島素濃度修正值X1′)(S106)。
X1′＝X×{B1/(A+B1)}(2)′(8)次數n加1(S108)，再重復上述(4)～(7)(S103→S104→S105→S106)，求得次數n＝2時的熒光強度修正值I2′及胰島素濃度修正值(X2′)。另外，次數n＝2時，使用下述計算式。
I2′＝I2×{(A+B1+B2)/A} (1)″X2′＝X×{(B1+B2)/(A+B1+B2)}(2)″(9)重復上述(8)(S108→S103→S104→S105→S106→S107)，至所得熒光強度修正值In′即使添加標準溶液也不變化、即(In′-In-1′)值至零以下(S107)的程度，分別求得次數n為1～n時的熒光強度修正值(In′)及胰島素濃度修正值(Xn′)。另外，使用下述計算式。
In′=In×{(A+Σn=1nBn)/A}---(1)]]>
Xn′=X×{Σn=1nBn/(A+Σn=1nBn)}---(2)]]>將次數n為1～n時相對于(10)所得的胰島素濃度修正值(Xn′)的熒光強度修正值(In′)繪成圖，制成胰島素濃度為0～1.8μM范圍的檢量線(S109)。所得檢量線如圖13所示。
由圖13所示結果可確認使用抗MG-Ins Fab和孔雀綠時，隨著胰島素濃度的增加，孔雀綠的熒光強度也增加，即，可確認引起熒光增強。且由于在胰島素濃度修正值(Xn′)和熒光強度修正值(In′)之間，在0～1.7μM的范圍內有正線性相關關系，所以可通過測定孔雀綠的熒光強度對該范圍的胰島素濃度定量，且即使胰島素濃度在約為0.13μM的這樣的低濃度下也可進行定量，檢測靈敏度(約0.1μM)高。
實際試料的測定使用上述所得檢量線，如下所述地對實際試料中的胰島素濃度定量。實際試料的被測體溶液是體液、其濃縮液或用PBS等稀釋的溶液。
(11)將熒光分光光度計設定為勵起光波長620nm、熒光波長650nm，保持吸收池座的溫度在一定溫度(25℃)。
(12)調制含有1μM(Y＝1μM)的抗MG-Ins Fab和0.4μM(Z＝0.4μM)的MG的2ml(A＝2ml)抗體色素溶液(溶劑為磷酸緩沖生理鹽水)(pH7.2、PBS)(S201)。
(13)將所得抗體色素溶液加入熒光測定用標準容器內，用熒光分光光度計調整該容器，用小轉子攪拌容器中的溶液30秒。另外，次數設定為初值(n＝1)(S202)。
(14)將被測體溶液20μl(B1＝2.020ml)添加到容器中的溶液中，用小轉子攪拌5分鐘，進行抗原抗體反應(S203)。
(15)用勵起光照射容器中的溶液，測定從該溶液中產生的MG的熒光強度30秒，求得熒光強度每秒鐘的平均值(熒光強度測定值I1)(S204)。另外，將被測體溶液未添加時的熒光強度作為空白，實際的測定值減去空白的值用作測定值。
(16)用下述計算式修正(按照伴隨著添加被測體溶液的體積變化的修正)所得熒光強度測定值(I1)，求得體積變化修正值(熒光強度修正值I1′)(S205)。
I1′＝I1×{(A+B1)/A}(3)′
(17)根據表示預先求得的熒光強度修正值(In′)和胰島素濃度修正值(Xn′)的關系的檢量線，由上述熒光強度修正值(I1′)求得混合溶液中的胰島素濃度(X1′)(S206)。
(18)由所得混合溶液中的胰島素濃度(X1′)，使用下述計算式求得被測體溶液中的胰島素濃度(X1)(S207)。
X1＝{X1′×(A+B1)}/B1(4)′結果確認這樣求得的被測體溶液中的胰島素濃度(X1)為0.26μM，與用其它方法(BCA法)求得的被測體溶液中的胰島素濃度一致。
(19)然后，在需要測定其它被測體溶液時(S208)，次數n加1(S209)，再次重復上述(14)～(18)(S203→S204→S205→S206→S207)，可求得其它被測體溶液中的胰島素濃度(X2)。另外，當次數n＝2時，使用下述計算式。
I2′＝I2×{(A+B1+B2)/A} (3)″X2＝{X2′×(A+B1+B2)-(X1×B1)}/B2(4)″(20)重復上述(S209→S203→S204→S205→S206→S207→S208)，至無需測定其它被測體溶液(S208)，由此可連續測定多個(次數n為1～n)被測體溶液中的胰島素濃度(Xn)。另外，這樣的連續測定可反復多次，直至抗體相對于胰島素飽和等即使添加被測體溶液熒光強度也不發生變化的程度。另外，采用下述計算式。
In′=In×{(A+Σn=1nBn)/A}---(3)]]>Xn={Xn′×(A+Σn=1nBn)-Σn=1n-1XnBn}/Bn---(4)]]>實施例2使用抗MG-Ins抗體的Fab和AO的胰島素的定量在水溶液中實質上呈無熒光的金胺O(AO)的化學結構的一部分與孔雀綠(MG)的化學結構是共通的。因此本發明人推測AO也與抗MG-Ins IgG和抗MG-Ins Fab進行交叉反應轉為熒光性。另外本發明人推測因為AO的尺寸小于MG分子，所以與抗體的結合弱，kd大，因此，AO的kd有可能大于胰島素的kd，此時，與實施例1相反，因胰島素的存在而引起熒光阻礙，在胰島素濃度和熒光強度之間的反比例關系可以成立。因此，根據這樣的胰島素濃度和熒光強度間的反比例關系，可定量胰島素，代替MG使用AO進行下述試驗。
(2-1)與抗MG-Ins IgG結合的金胺O的熒光光譜的測定如下所示，測定以抗原抗體反應使AO與抗MG-Ins IgG結合時的AO的熒光光譜。即，將兩成份混合，使抗MG-Ins IgG濃度為1μM、AO濃度為1μM的混合(溶劑為磷酸緩沖生理鹽水(pH7.2、PBS))，在25℃下攪拌5分鐘，進行抗原抗體反應。然后使用熒光分光光度計，在勵起光波長400nm、熒光波長450～650nm、勵起光側和熒光側的帶通寬均為5nm的條件下，測定由上述混合溶液發出的熒光光譜。所得熒光光譜的未處理數據減去相同條件下測定的磷酸緩沖生理鹽水的本底，加上利用裝置函數的修正值的熒光光譜如圖14所示。結果確認在水溶液中實質上無熒光的金胺O也與抗MG-Ins IgG結合轉為熒光性。
(2-2)使用抗MG-Ins Fab和金胺O的胰島素的定量[2-2-1]檢量線的制作除使抗MG-Ins Fab濃度為2μM，使用0.4μM的金胺O代替0.4μM的孔雀綠，勵起光波長400nm、熒光波長520nm外，與上述[1-10-1]一樣，制作胰島素濃度在0～7.7μM范圍的檢量線。所得檢量線如圖15所示。
由圖15所示結果確認當使用抗MG-Ins Fab和金胺O時，隨著胰島素濃度增加，金胺O的熒光強度減少，即，引起熒光阻礙。而且由于在胰島素濃度修正值(Xn′)和熒光強度修正值(In′)之間，在0～4.23μM的范圍內存在負線性相關關系，所以可通過測定金胺O的熒光強度對該范圍的胰島素濃度定量，且即使胰島素濃度在約為0.13μM的這樣的低濃度下也可進行定量，檢測靈敏度(約0.1μM)高。另外，本發明人推測胰島素濃度高于4.23μM的高濃度區域內AO熒光強度達到一定值的理由是因為作為抗MG-Ins Fab的基礎的抗MG-Ins IgG是多克隆抗體，含有與AO結合非常強的IgG。
實際試料的測定除使用上述所得檢量線，使抗MG-Ins Fab濃度為2μM，使用0.4μM的金胺O代替0.4μM的孔雀綠，勵起光波長400nm、熒光波長520nm之外，與上述[1-10-2]一樣求得被測體溶液中的胰島素濃度(X1)。結果確認這樣求得的被測體溶液中的胰島素濃度(X1)為0.26μM，與通過其它方法(BCA法)求得的被測體溶液中的胰島素濃度一致。
另外，除上述改變之外，與上述[1-10-2]一樣，重復上述S209→S203→S204→S205→S206→S207→S208至無需測定其它被測體溶液，由此可連續測定多個(次數n為1～n)被測體溶液中的胰島素濃度(Xn)。另外，這樣的連續測定可反復多次，直至抗體相對于胰島素飽和等即使添加被測體溶液熒光強度也不發生變化的程度。
(2-3)抗原抗體反應可逆性的驗證試驗應當確認反復將胰島素和抗豬胰島素IgG(以下稱為“抗胰島素IgG”)添加到含有抗MG-Ins Fab和金胺O的溶液中，在同一試料內改變游離胰島素的濃度時，本發明的方法的測定值也隨之發生變化，即，本發明的抗原抗體反應是可逆的，且能進行實時分析。在與上述[2-2-1]同樣的測定條件下測定熒光強度，所得結果如圖16所示。
首先，調制含有2μM的抗MG-Ins Fab和0.4μM的金胺O的2ml的PBS溶液，加入熒光測定用容器內，測定AO熒光強度，此時的熒光強度為相對值1。
再將胰島素添加到該容器中的溶液內，使濃度為1.26μM，攪拌5分鐘后測定熒光強度，AO熒光強度的相對值減少到0.97。
再向該溶液中添加一定量(0.135μM)的抗胰島素IgG，同樣進行攪拌后測定熒光強度，AO熒光強度的相對值回復到大約為1。這是因為抗胰島素IgG和胰島素結合，使溶液中變得不存在游離胰島素，所以熒光強度恢復到原值。
然后向該溶液內再添加胰島素，使濃度變成2.39μM，同樣攪拌后測定熒光強度，AO熒光強度的相對值再次減少，但將抗胰島素IgG分兩次添加到該溶液中后(第一次0.128μM、第二次0.127μM)，AO熒光強度的相對值得到恢復。然后再次將胰島素添加到該溶液內，使濃度變成3.37μM，同樣攪拌后測定熒光強度，AO熒光強度的相對值減少。
由圖16所示結果可確認本發明的抗原抗體反應是可逆的，本發明的方法的測定值(熒光強度)隨著測定對象物量的改變可逆地變動(增加-減少)，且由于本發明的方法的測定值(熒光強度)相對于測定對象物的量有相關關系，所以通過測定熒光強度的變動，可實時測量測定對象物。
產業可利用性利用本發明就可提供利用抗原抗體反應簡便、高靈敏度且實時地連續分析(包括圖像)生物內物質等的熒光分析方法。
權利要求
1.一種熒光分析方法，其特征在于，包括得到抗體色素溶液和含有測定對象物質的被檢測體溶液的混合溶液的混合工序，所述抗體色素溶液含有各自具有預定濃度的抗體和色素，所述抗體的抗原結合部位的一部分識別色素，其余的一部分識別測定對象物質，所述色素被所述抗體識別，且與所述抗體結合時由非熒光性轉為熒光性；用勵起光照射所述混合溶液，測定由所述混合溶液發出的熒光的強度，得到測定值的測定工序；和基于預先求得的熒光強度與測定對象物質濃度的關系，由所述測定值求得所述測定對象物質的濃度的計算工序。
2.如權利要求1所述的熒光分析方法，其特征在于，還包括在所述計算工序后，將被測體溶液再次添加到所述混合溶液中混合，實行所述測定工序及所述計算工序，反復求得測定對象物質的濃度的連續分析工序。
3.如權利要求1或2所述的熒光分析方法，其特征在于，所述計算工序包括根據隨著所述被測體溶液的添加的體積變化修正所述測定值，得到熒光強度修正值的工序；根據預先求得的熒光強度修正值和混合溶液中的測定對象物質濃度的關系，由所述熒光強度修正值求得所述混合溶液中的測定對象物質的濃度的工序；和由所述混合溶液中的測定對象物質濃度求得所述被測體溶液中的測定對象物質的濃度的工序。
4.如權利要求1～3任一項所述的熒光分析方法，其特征在于，還包括得到抗體色素溶液和含有預定濃度的測定對象物質的標準溶液的混合溶液的混合工序，所述抗體色素溶液含有各自具有預定濃度的抗體和色素，所述抗體的抗原結合部位的一部分識別色素，其余的一部分識別測定對象物質，所述色素被所述抗體識別，且與所述抗體結合時由非熒光性轉為熒光性；用勵起光照射所述混合溶液，測定由所述混合溶液發出的熒光的強度，得到測定值的測定工序；將標準溶液再次添加到所述混合溶液中混合，然后實行所述測定工序，反復求得熒光強度的測定值的連續測定工序；和根據所述測定工序和所述連續測定工序中所得的測定值和所述測定對象物質的添加量求得熒光強度和測定對象物質濃度的關系，制作檢量線的工序。
5.如權利要求4所述的熒光分析方法，其特征在于，所述檢量線制作工序包括根據隨著添加所述標準溶液的體積變化修正所述測定值，得到熒光強度修正值的工序；算出所述混合混合溶液中的測定對象物質的濃度的工序；和求得所述熒光強度修正值和所述混合溶液中的測定對象物質濃度的關系的工序。
6.如權利要求1～5任一項所述的熒光分析方法，其特征在于，所述色素選自具有三苯甲烷結構的色素或具有二苯甲烷結構的色素。
7.如權利要求1～5任一項所述的熒光分析方法，其特征在于，所述色素是孔雀綠或金胺O。
8.如權利要求1～7任一項所述的熒光分析方法，其特征在于，所述抗體是將所述色素和所述測定對象物質的結合物質作為抗原形成的抗體，或是將利用抗體識別的、且在和所述抗體結合時由非熒光性轉為熒光性所必要的結構與所述色素共通的色素與所述測定對象物質的結合物質作為抗原，而形成的抗體。
9.如權利要求1～8任一項所述的熒光分析方法，其特征在于，所述抗體是將孔雀綠和所述測定對象物質的結合物質作為抗原而形成的抗體，所述色素是孔雀綠。
10.如權利要求1～8任一項所述的熒光分析方法，其特征在于，所述抗體是將孔雀綠和所述測定對象物質的結合物質作為抗原而形成的抗體，所述色素是金胺O。
11.如權利要求1～8任一項所述的熒光分析方法，其特征在于，所述抗體是由精制抗血清而得到的IgG組分調制的抗原結合性片段。
12.如權利要求1～11任一項所述的熒光分析方法，其特征在于，所述測定對象物質為選自應作為免疫測定對象的蛋白質、荷爾蒙、維生素、菌體、環境污染物質、醫藥品的任一種。
全文摘要
本發明涉及一種利用抗原抗體反應可簡便、高靈敏度且實時連續地分析(包括圖像)生物體內物質等的熒光分析方法。本發明的熒光分析方法包括得到抗體色素溶液和含有測定對象物質的被檢測體溶液的混合溶液的混合工序，上述抗體色素溶液含有各自具有預定濃度的抗體和色素，上述抗體的抗原結合部位的一部分識別色素，其余的一部分識別測定對象物質，上述色素被上述抗體識別，且與上述抗體結合時由非熒光性轉為熒光性；用勵起光照射上述混合溶液，測定由上述混合溶液發出的熒光的強度，得到測定值的測定工序；和基于預先求得的熒光強度和測定對象物質濃度的關系，由上述測定值求得上述測定對象物質的濃度的計算工序。
文檔編號G01N33/58GK1682112SQ03822359
公開日2005年10月12日 申請日期2003年9月18日 優先權日2002年9月19日
發明者治部雅貴 申請人:浜松光子學株式會社