熒光偏振檢測的制作方法

專利名稱：熒光偏振檢測的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種通過測量熒光各向異性來檢測被分析物與適體(aptamers)結合的方法。
背景技術：
1957年的免疫測定和1971年的酶連鎖免疫檢測劑測定技術的推廣是臨床醫學診斷的一次革命。直到最近，有利于診斷檢測的有分子識別能力的分子仍然被局限于抗體。近來，通過化學組合物方法選擇高親和力配合基的生物體外方法的發展，提供了一種獨特的新療法和診斷劑。這些方法能夠鑒別許多具有高親和力與特異性的不同寡核苷酸序列，例如，通過呈指數增長的配合基系統發育(SELEXTM)方式來確定寡核苷酸序列是常規鑒別寡核苷酸配合基的方法，也被稱為適體，也被認為是潛在的藥物。該方法中，一組完全隨機排列的RNAs(核糖核酸)被選出粘附于固定在硝化纖維素濾器上的特定的核酸附著蛋白質。被縛的RNAs或DNAs(脫氧核糖核酸)隨后被恢復進而放大成為DNA。DNA可被進一步特性化。這些寡核苷酸可在各種被分析物的鑒別中用作探測器，特定的蛋白質包括各種艾滋病病毒(HIV)酶、增長因子以及炎癥誘發酶(Sun，S.，Curr.Opin.Mol.THER.，2(1)100-5(2000))。
典型的用于識別和量化粘附于被分析物上適體的平臺受到了從反應物分離被束縛物方法的極大限制。從反應物分離被縛物的方法包括固相、液相色譜法及電泳。

發明內容
一方面，本發明提供了測定被分析物樣品的方法。粘附在載體上的具有熒光標識適體與樣品相聯結并以偏振光輻照，熒光團的熒光各向異性值可被測出，當熒光各向異性值大于沒有樣品的各向異性值時可確定被分析物的存在。
一個實施例中，具有熒光標識適體所粘附的載體是珠狀物，如硅膠珠。珠的直徑在1微米到10微米。特定的實施例中，珠的直徑約為5微米。珠可以懸浮于溶液也可以成二維排列。
另一實施例中，標識于適體上的熒光團是熒光素衍生物，四溴熒光素衍生物，香豆素衍生物以及玫瑰精衍生物。特定的實施例中，該熒光團是羧基熒光素(FAM)。
適體可以是一批適體中的一部分。一個實施例中，這一批適體包含有兩個或更多可設定地址的特定區域，每一可設定地址的特定區域含有單一種類的適體。另一實施例中，每一可設定地址的特定區域含有多個種類的適體。
在一個實施例中，用于輻照適體的偏振光是激光。
另一實施例中，其中的被分析物與某種病癥相關，樣品可從疑似病例的病人身上獲得。
在一個實施例中，被分析物是蛋白質，另一實施例中，被分析物是代謝物。
另一方面，樣品是從疑似病例的病人身上獲取的。通過從樣品中檢測有無被分析物就可以確定被分析物是否與該病癥有關。如果從病人身體采集的樣品中檢出被分析物，則該病人將被診斷為患上此疾病。


圖1示出了將凝血酶與溶解酵素和具FAM標識的抗凝血酶適體粘合的聯結體珠的反應動力學數據。
圖2示出了將GP120和FAM-518適體粘合的聯結體珠的反應動力學數據。
圖3示出了將溶解酵素和FAM-518適體粘合的聯結體珠的反應動力學數據。
圖4示出了GP120和FAM-518適體可逆粘合的聯結體珠的反應動力學數據。
具體實施例方式
一方面，本發明提供了一種通過測量被分析物與被標識的適體粘合后其熒光各向異性的變化來測定樣品中被分析物的方法。
定義如果不作別的說明，本發明中的科技術語是本領域專業技術人員所了解的一般含義。本文所述用于實現本發明的相同或相類似的材料和方法都是本領域專業人員所認知的。當然，本發明并不局限于所述材料和方法。本發明中，下列術語被定義為此處的“適體(aptamer)”是指可粘附相關被分析物的不同于雜交堿基對的特定的寡核苷酸。典型的適體含有DNA或RNA或它們的混合物。適體可以是自然存在的，或是合成的，或通過細胞重組而來。典型的適體是單股的，但也可以是雙股或三股。它們可以是自然存在的核苷酸，或以化學或非自然方式(如2-氨基嘌呤)改良后的核苷酸。見美國專利5,840,867。適體可經化學改良，如通過附加標識(如熒光團)，或附加分子以使適體和與其粘合的分子相交聯。具有相同序列或能與同種特定分子粘合的適體被視為是同一種類。適體的長度各異，但都小于100個核苷的長度。
已知的適體有很多，它們基于各自的特性而有特定的用途。作為選擇，新的適體可以基于其與相關特定分子粘合的能力而從一批隨機的寡核苷酸中選取并被識別和獲取。如美國專利5,475,096和5,270,613所述，新的適體可以通過呈指數增長的配合基系統發育(SELEXTM)的方式而被識別和獲取。
適體被一個或多個熒光團標識，熒光團也可以是熒光探針或熒光染料。“熒光團”是指可被特定波長的光波所激發而發出不同波長光的任何分子。熒光團包括但不局限于熒光素(美國專利5，188,934；6,008,379；6,020,481)，四溴熒光素，香豆素，玫瑰精(美國專利5,366,860；5,847,162；5,936,087；6,051,719；6,191,278)，如四甲基玫瑰精，苯甲嗪(美國專利6,140,500)，德州紅和丹磺酰衍生物。用以標識生物分子的熒光染料包括能量轉移染料捐體與受體對(美國專利5,863,727；5,800,996；5,945,526)，青色素(Kubista，WO97/45539)，以及其他任何可發出熒光探測信號的熒光標識體。熒光染料的實例有5-羧基熒光素(″5-FAM″)，6-羧基熒光素(″6-FAM″)，2′、4′、4、7-四氯熒光素，2′、4′、5′、7′、4、7-六氯熒光素。參見美國專利5,118,934。
熒光素可以與適體以任何方位結合，例如適體可以標識在中線、底部或任一端。適體可以以任何已知的方式標識，如利用熒光標識聯結物的標準DNA合成技術。同樣，未標識的聯結物可用于合成以及后續的與熒光團標識中(見例證Ruth，J.(1991)Oligo and Analogues，pp.255-282，Eckstein，F，Ed.，IRL Press，Oxford，UK；Vinayak R.(1999)Tetrahedron Lett.407611-7813.)。在以SELEXTM方法得到適體后，熒光團可被選擇性的混入以確保其不會使被分析物與適體的粘合物混亂。另外，確定適體粘合物中熒光團的位置也能確保被分析物的粘合導致的對熒光各向異性產生的重大改變。
“標識”是指任何可附著于多聚核苷酸并產生可探測信號的組成部分，例如熒光團。
“熒光”是指從樣品或染料中發散出的光，該光波波長長于照射在樣品或染料上光波的波長。照射在樣品或染料上光波通常稱為“激發”光波，其被樣品或染料所吸收然后發射出“分射”光。
“各向異性”是指系統中因為方向的改變而呈現出的不同特性。上下文中的“熒光各向異性”意指分射光的不同偏振。
本文中的“多聚核苷酸”和“寡核苷酸”可交替使用，是指核苷單體的單股、雙股、三股聚合體，包括2′-脫氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。多聚核苷酸可完全由脫氧核糖核苷酸、完全的核糖核苷酸或其混合體構成。多聚核苷酸由內核苷酸、核酸基及糖類組成，包括非天然基部、糖、L-DNA、核苷酸間鍵合。
“聯結物”是指含有共價鍵或原子鏈從而共價地將附著到另一分子或官能基的分子中的化學官能基，如，熒光團粘附于適體或適體粘附于載體。
聯結物由可拆卸的保護性基團組成，“保護性基團”是粘附于分子并可在選擇性地曝光于活化劑(如光)時被移除。
“載體”一詞是指任何可附著或固定適體的固體材料。如，載體可以是玻璃、金屬、硅、鍺、砷化鎵或塑料。載體包含“樹脂”，“固相”，“支撐物”等術語。載體可由有機聚合物組成，如聚苯乙烯，聚乙烯，聚丙烯，聚氟乙烯，聚乙烯氧化物，聚丙烯酰胺以及共聚物和接枝聚合體。載體也可是無機物，如玻璃，硅石，可控微孔玻璃珠(CPG)或反相硅石。載體的外形可以是珠狀，球體，粒子，微粒，凝膠體，纖維質或面狀。面狀可以是平面，絕對平面或非平面。載體還可以是多孔的或無孔的，也可能具有膨脹或非膨脹性。載體可被制成井狀，坑狀或其他形狀的容器、器皿、輪廓或位置。大多數的載體是成陣列排列。
“陣列”或“微陣列”意指事先設定的對適體在培養基上的空間排列位置。適體可直接附著于培養基上，或附著于同培養基相連接的載體上。在陣列被用于檢測單一被分析物時，適體可以是完全相同的；在陣列被用于檢測樣品中不同分子時，適體可能并不相同。陣列可包括一個或多個“可設定地址的特定區域”，即是說，物理位置包含已知種類的適體。在一個實施例中，一個可設定地址的區域包括多于一種適體。不管怎樣，每個區域內的適體種類是可被得知和測定的。
陣列內可包含任何數量的可設定地址的特定區域，如1到100個(少數)，100到1000個(中等數量)或1000個以上(多數)。另外，陣列內可設定地址的特定區域的密度各不相同。例如，可以增加培養基上可設定地址的特定區域的密度以減少所需培養基的尺寸。典型地，陣列的形式具有幾何學上的規則形狀，以利于成形，操作，堆砌，反應物或樣品導入，檢測和貯藏。陣列可以成行或成柱狀設置，每一區域內都有整齊的間距。同樣，該區域可以成組排列，隨機排列或以其他形式排列。在一個實施例中，陣列中含有大量可設定地址的特定區域，其構造使得每一區域在高吞吐量時在空間上都是可設定地址的。
在二維的陣列中，可設定地址的特定區域取決于在表面上的位置。然而，在一個實施例中，陣列在溶液中含有大量的粒子(如微珠)。每一粒子含有特定種類的適體。在這種情況下，適體的同一性可以通過粒子的特性而測定。如，這些粒子具有同樣的性質如形狀、式樣、發色團或熒光團。
“目標物”和“被分析物”都是指特定的分子或化合物，它們的存在與否以及數目都可被檢測，同時它們可與適體相合。被分析物可以是任何分子，包括但不局限于多肽、蛋白質、復雜蛋白質、寡核苷酸，DNA，RNA，碳水化合物，多聚糖，代謝物，營養物，藥物或小分子。適體可以自然存在或合成。在一個實施例中，適體來自于存活的或曾經存活的有機體(包括但不局限于原核生物，真核細胞，植物，動物和病毒)上的多肽衍生物。
在這里，“培養基”是指本發明中陣列底層上的核心物質。典型的，培養基是具有剛性或半剛性表面的載體。在一個實施例中，培養基的表面是平的。在其他實施例種，培養基的表面具有如下物理性質例如井狀、溝狀、凸起的或凹陷的層面。形成陣列的適體可能直接粘附在培養基上，或粘附于與其相連(粘附或包含于培養基)的載體上。
實現本發明的示例性模式本發明提供了通過測量被分析物與熒光標識適體的熒光各向異性的變化來檢測樣品上被分析物是否存在及其數量的方法。熒光各向異性來自于表征熒光團平均角位移的熒光偏振，其在吸收和發散光子時產生。
如上所述，被分析物不局限于任何形式，因而本發明中的方法可廣泛用于各個領域。分析物的同一性取決于被分析物的自然屬性，本領域的專業人員可視其特定情況而修正本測定方法。
一個或多個被分析物是否存在的檢測是通過樣品來測定的。樣品可以是希望測定被分析物存在性的任何組合物且不局限于任何形式。例如但不限于，在醫學檢驗中，可以檢測病人的體液(如血液)中是否存在與病癥相關的多肽(如傳染體)；在工業檢驗中，可以測定廢水中是否含有特定的有機物。
對同樣的被分析物來說其適體是確定的。適體可以是在以前的檢測中被認為可以與相應的被分析物相粘合的那一種。許多適體在本領域是熟知的。例如，已知適體選擇性的數據庫設立在奧斯丁的德克薩斯大學(http//aptamer.icmp.utexas.edu)。例如從索莫羅杰克(Somologic)(美國科羅拉多)或吉利得科技公司(Gilead Sciences，Inc.)(美國加利福尼亞)可商業購得大量不同的適體。如果與某種被分析物相特定的適體以前未見記述，它可被任何現有技術的方法所確定。與特定化合物相合的適體的確定方法已經公開，例如，依照美國專利5,475,096和5,270,613，通過呈指數增長的配合基系統發育(SELEXTM)的方式可以確定相應于特定配合基的適體種類。在SELEXTM方式中，一批隨機的RNA或單一的DNA序列被選用作期望的目標體。與目標體緊密聯結的序列將被隔離或增強。該選擇將基于前面的選擇而被多次重復以確定有用的適體。
一旦確定了適體，將會復制一個或多個以在檢驗中用以檢測被分析物的存在性。適體可以用任何現有技術已知的方法復制，因而它可通過標準程序化學合成而得。適體可以在合成過程中或合成完成后以任何現有技術已知得方法標識熒光團。例如，適體在合成過程中可以同改良后的核苷酸相結合而被標識。或者，適體也可在合成后經化學改良。經標識后的適體將和待分析的樣品聯結。在另一實施例中，適體可在SELEXTM步驟中被結合。這將有利于標識體在被分析物中位置的放置，從而確保被分析物粘合物的熒光各向異性的變化最大。
適體與待分析的樣品聯結時通常是被放置于載體上的。適體可以被直接地合成在載體上，或者，適體在合成后被粘附在載體上。例如可參見Southernet al.，Nuc.Acids Res.，20(7)1679-1684(1992)；Southern et al.，Genomics，131008-10017(1992)；WO02/30561；WO02/0750；WO96/40790；Maclean et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 942805-2810(1997)；以及美國專利5,744,305；5,405,783；5,445,934和6,261,776。適體可以以現有技術中任何已知的方法被粘附在載體上。例如3′-胺基-變型適體可以應用于載體的活性表面(Potyrailo et AL.，Analytical Chemistry，70(16)3419-3425(1998))。在一個實施例中，環氧丙醇丙基-三甲氧基-硅烷((glycidoxypropyl)trimethoxy silane)(GOPS)對玻璃表面具有活性。經過在3′末端添加胺基而變型后再被熒光標識的適體可以和玻璃培養基共價鍵和。未反應的適體在沖洗時會被洗刷掉，未反應的表面基團也會被阻斷。在一個實施例中，未反應的表面基團被0.1M的乙醇胺培養液所阻斷。在另一個實施例中，適體同5′端C6胺基標記(C6-aminolinker at the 5′end)粘合用以處理硅石微粒。
另一實施例中，適體通過聯結物分子而與載體相粘附。聯結物分子被放置在培養基表面。然后適體在一定條件下與聯結物分子結合，從而適體通過聯結物分子與培養基粘附。
在一特定的實施例中，適體陣列在含有聯結物分子的培養基內成形，該聯結物分子的遠端含有保護基團的功能基團。該陣列的成形方式記載于美國專利5,445,934；5,744,305和5,405,783中，在此作為參考。當聯結物分子暴露在適當的條件下(如光、輻射、電場、電流或其他催化劑)，會失去該保護基團而暴露出功能基團。將活化劑作用在特定的聯結物分子上時，確定部分的培養基將會被激活。例如，如果在光照下保護基團被除去，培養基的確定區域將被激發，從而激活了這一區域的聯結物分子。繼而特定種類的適體就可以與這些活性聯結物分子相聯結。過剩的適體將會丟失而未反應的聯結物分子將被阻斷。通過這種方式，就產生了含有特定適體的可設定地址的特定區域。培養基內不同離散區域內的聯結物分子同樣可被活化。第二特定種類的適體就可以粘合在第二離散區域。經過重復這一步驟，在培養基上就可形成含有大量可設定地址的特定區域(該區域內含有已知種類的適體)的陣列。在其他的實施例中，適體可以被直接合成在培養基的活性區域內而不是將事先合成好的適體粘附上去。
適體也可以粘合在懸浮于溶液中的載體上。例如，適體粘合在微珠上并懸浮于緩沖溶液中。在一實施例中，微珠懸浮于容器內(如微量滴定盤)，每一容器內的微珠含有同種類的適體。在這種情況下，只檢測一個被分析物就可以同時分析多個樣品。另一實施例中，每一容器內的微珠含有的適體不同種類，用于測定不同種類的被分析物。另一實施例中，每一容器內的微珠含有的適體不同種類，用于確定一個或多個不同種類的被分析物的存在。
確定樣品中相關被分析物存在性是通過測定附著在被分析物與適體的粘合物上的熒光團的熒光各向異性的改變來實現的。在沒有被分析物的空白試驗中測量熒光各向異性的基準線，隨后，向樣品中加入適體再次測量熒光各向異性，通過熒光各向異性的改變來確定是否有被分析物存在。或者，熒光各向異性的基準線也可以通過測定未附著樣品的涂有適體的載體的平行試驗來確定。
激發偏振器的位置決定了熒光的強度。偏振光可激發粘合在適體上的熒光團，任何現有技術已知的激發源都可應用。例如，氙弧燈的光線可被偏振并聚焦于特定的區域。另一實施例中使用的是激光激發源，從而省去了偏振激發。
熒光測量法可以是現有技術中已知的任何方法，如單路測定以及T型或L型直角，或利用熒光光度計(如市場上可購得的SPEX(美國新澤西州)公司的Flurolog-3TM儀器)進行幾何學上的正面散射收集。參見Lakowicz，″Principles of Fluorescence SPECTROSCOPY，″P.111-153，Plenum Press，NewYork，New York(1986)和Potyrailo et al.Anal.Chem.703419-3425(1998)。
典型的用于測定熒光各向異性的儀器包括激發源，可透過特定波長光波的過濾器，使光線偏振的偏振片，用于將激發光聚焦于適體(如培養基上可設定地址的特定區域)的透鏡等。在一實施例中使用的是激光，基于激光的特性，該實施例省去了偏振片和透鏡。
該儀器還可以有樣品艙，一個或多個用于偏振激發光線的散射偏振器，可透過特定波長光波的過濾器，以及用于收集和測定散射光數量的探測器。
熒光各向異性產生于熒光偏振，它表征了熒光團的平均角位移，而這又在吸收并散射光子時發生。
熒光各向異性(FA)可以通過測量散射強度(I)計算出來，公式為FA＝(Ivv-GIvh)/(Ivv+2GIvh)(I)此處的G是儀器修正因子，G＝Ihv/Ihh，下標v和h分別指偏振器的垂直和水平方向。
在一個實施例中，測量的條件是在25℃下探測1秒鐘。
通過測定粘合在被分析物上被熒光標識的適體熒光各向異性隨時間而變化的情況可以測定粘合在適體上的被分析物的反應動力學規律。
由于該方法的高靈敏度，可以用于測定樣品中的微量被分析物。如，適體中1到10pM范圍的被分析物都可被檢測到。
微珠陣列適體的陣列可用來確定樣品中是否存在一種或多種被分析物。本發明的一方面中，陣列中含有固定在培養基表面上的適體。一個實施例中，與被分析物相應的被標識的特定適體同微滴或微珠相粘合。該微珠繼而形成陣列用以測定一種或多種被分析物。參見Walton et al.Analytic.Chem.742240-2247(2002)；Zhou et al.Trends in Biotech.19S34-S39(2001)；WO02/24959；WO00/50903；WO00/61803以及美國專利5,340,422和6,074,609。
附有適體的微珠可以以自由態存在于溶液中，或物理地附著或粘合于培養基。當它們以自由態存在于溶液中時，熒光各向異性可用串流細胞儀來測定；如果微珠是附著在載體或培養基表面上時，它們會附著在特定的位置從而形成具有一個或多個可設定地址的特定區域的陣列。
“微滴”或“微珠”是細小的個別微粒。由于微珠通常是幾何球面，它們的形態可能不規則。一個實施例中，不規則的尺寸和形態確定了某一含有特定適體的微珠。通常微珠的直徑在1微米到10微米之間。或者，微珠的直徑可以在10納米到1毫米之間甚或10納米到100微米。微珠可以是任何能與適體相粘合的材料，包括但不局限于塑料，玻璃，陶瓷，金屬，纖維素，尼龍或乳膠。
單一微珠上的適體并不受任何局限。通常每一微珠含有至少105個適體。每一微珠上可能含有單一種類的適體，也可以含有超過一種適體。這將很有用處，例如，如果待測樣品中含有至少一種化合物時，沒有必要去弄清楚是存在哪一種特定物質。在另一實施例中，每一微珠內含有不同種的適體，每種適體含有不同的熒光團，這種方式下，每一微珠都能夠用于測定多種被分析物。
適體可以直接合成在微珠上，或者隨后借助聯結物分子而粘附在微珠上。例如，微珠的表面可以利用化學活性基團(如硫醇或胺)進行修正以使適于粘附適體。該修正技術是現有技術中已知的。適體可在粘附于微珠之前或之后再被熒光標識。
含有適體的微珠可用于檢測樣品中一種或多種被分析物的存在性。含有適體的微珠也可附著在載體上。通常微珠置于容器內的溶液中，如試管或微滴定盤。
微珠陣列可用于測定樣品中的單一被分析物。此時，陣列中的所有微珠都是同一種類，因而通常是同一種類適體的衍生物。
在一個實施例中，微珠和與被分析物相應的特定的經熒光標識的適體標識后，放置于容器中(試管或微滴定盤)的溶液內。加入足夠數量的含有適體的微珠以激發出可探測到的信號，溶液中通常含有至少106個微珠，然后向溶液中加入待分析樣品。分別在加入樣品前后按上述方法測量熒光各向異性。如果加入樣品后熒光各向異性發生變化則表明樣品中含有被分析物。
如果需要檢測多個樣品中是否含有同一被分析物，將會用到大量容器。可以使用許多單個容器(如小試管)。或者，各個容器可以聯結在一起以方便處理，如可使用多位微滴定盤。在一個實施例中，多位滴定盤的每一位置內的溶液中都含有同樣種類的含適體的微珠，接著在每一位置加入一種樣品。分別在加入樣品前后測量每一樣品的熒光各向異性，如果加入樣品后熒光各向異性發生變化則表明該樣品中含有相應的被分析物。
含有結合有適體的微珠陣列也可用于確定樣品中是否含有一種或多種被分析物。在該實施例中，微珠內含有大量的各種不同種類的適體，適體的數量等于或大于待檢測的被分析物的數量。
通常，各種存在的被分析物的同一性是重要的。因而確定每一位置上微珠內適體的種類是必要的，從而可以區分與其粘合的各種不同被分析物。這可以通過向陣列中放置已知適體的微珠來實現。或者，微珠可以隨機地分配于陣列中，在陣列成形后再測定陣列中個別微珠的特定位置。這可以用現有技術中的已知方法來完成。例如，微珠可以用熒光團、條形碼或紅外標記進行編碼。在一個實施例中，和特定適體互補的被熒光標識的寡核苷酸可用于確定含有該適體的微珠的準確位置。
在一個實施例中，陣列可用于測定樣品中兩種或以上被分析物的存在。先準備好特定于每一種類被分析物的含適體的微珠。不同種類的這種微珠被分別放置于容器內，因而每一容器內僅含有一種含特定于被分析物適體的微珠。在一個實施例中，將含適體的微珠置于微滴定盤的井內的溶液中，標注盛有特定種類含適體微珠的井的位置，然后將相應的特定樣品加入到上述每一井中，隨后分別在加入樣品前后測量每一樣品的熒光各向異性，通過比較各個結果(即是被標定位置的特定的含適體微珠的熒光各向異性的變化)就可以確定樣品中是否含有被分析物。
在另一實施例中，含有適體的微粒被物理地附著在培養基上而形成二維陣列。附著時，含有同種適體的微珠在可設定地址的特定區域內集中在一起，不同種類的微珠被以放置于微滴定盤的不同井內的方式物理隔離。或者，不同類的微粒也可被空間隔離。標記或確定每一特定于微珠的被分析物的位置。樣品和微珠相聯結，測量陣列中可設定地址的特定區域內熒光各向異性的變化。確定發生熒光各向異性變化的可設定地址的特定區域就可以確定該區域的樣品內是否含有該陣列位置上特定于該適體的被分析物。
另一實施例中，不需要測定被分析物特有的同一性就可以確定樣品中是否存在一組被分析物中的一種或多種。此時，不必要將陣列內的微珠分隔，陣列中同種微珠聚集在一起的區域會產生增強的信號，從而可以方便地測定出少量被分析物的存在。
非微珠陣列在非微珠陣列情況下，適體直接排列在用于測定被分析物的培養基表面上。非微珠陣列記載于美國專利5,445,934，5,405,783，5,744,305和6,365,418。利用現有技術中的已知方法即可以將適體通過聯結物附著在培養基上。或者，適體也可直接在培養基上合成。
通常的陣列中，一個培養基上含有一個或多個可設定地址的特定區域的適體。可設定地址的特定區域可以相互直接相鄰或通過縫隙或阻隔物理隔離。在一個實施例中，可設定地址的特定區域被充分隔離，從而激發某一特定區域來測定熒光各向異性時就不會激發到相鄰的區域。因此，如果待激發的區域小于可設定地址的特定區域，這些區域就可以相互相鄰而不必分隔。另一方面，如果待激發的區域的大小大于可設定地址的特定區域，則需要足夠的空間來隔離以防止重疊激發。
通常，每一可設定地址的特定區域包括一種適體。而在一個實施例中，至少一個可設定地址的特定區域包括超過一種適體。該方式是有用的，例如在確定多個被分析物中的一個存在時，并不關心特定分析物的識別。或者，可使用一組適體實現多叢被分析物檢測，其中每一適體在相同位置附著不同熒光團。每一熒光團具有不同的光譜特性，以區分多種附著的被分析物。
在其他實施例中，每一可分析地址的特定區域包括單一種類的適體。此時，在適體陣列上的位置的數量至少與使用的不同種類適體的數量相同，從而至少與被檢測的被分析物的數量相同。例如，若待檢測的樣品中存在十個被分析物，則在培養基上至少需十個可設定地址的特定區域。可設定地址的特定區域不受任何限制，而由待檢測的被分析物的數量以及陣列形成的培養基的物理尺寸確定。在一個實施例中，每一可設定地址的特定區域包括至少約105個適體。
通常，每一可設定地址的特定區域的適體組合物和位置是已知的。在一個實施例中，陣列中每一可設定地址的特定區域含有不同種類的適體。例如，如有十個待檢測的被分析物，陣列中就有十個可設定地址的特定區域，每一區域內的適體種類各不相同。另一實施例中，至少一個可設定地址的特定區域含有一種特定的適體。
陣列內適體的可設定地址的特定區域可以是任何幾何形狀。例如，該區域可以是圓形、矩形、正方形或不規則形狀。通常選擇適當的形狀以利于適體在培養基上的附著以及熒光各向異性的測定。
陣列的整體尺寸不受限制并決定于各種因素，包括每一可設定地址的特定區域內適體的數量，可設定地址的特定區域的數量，由于用于檢測熒光各向異性變化的系統導致的培養基尺寸大小的物理約束。在一個實施例中，所有可設定地址的特定區域陣列在培養基上的所占的面積不大于100cm2；另一實施例中，所有離散陣列在培養基上的所占的面積不大于10cm2。
在測定樣品中被分析物的存在性的時候，樣品是和含有適體的陣列相聯結的。在和樣品聯結的前后，每一可設定地址的特定區域的適體都能各自地被偏振光所激發，其中任何的熒光各向異性變化都可被測定。如果某一可設定地址的特定區域適體的熒光各向異性的改變被測量到，則樣品中存在的與該特定種類適體相對應的化合物就可被檢測出來。
示例性應用該分析樣品中是否存在特定被分析物的方法在眾多領域有廣泛用途，如醫藥行業、基礎生物學研究、制藥行業、農業、環境科學、工業分析的蛋白質體學等。
在另一實施例中，本發明中的陣列可用于診斷設備。在一實施例中，該陣列被用于確定某種疾病或疾病階段與特定蛋白質的表征水平之間的關系。更有一個實施例，在確定或已知某種疾病或疾病階段與特定蛋白質的表征水平之間的關系后，本發明中的陣列可用于診斷生物體是否感染某種特定的疾病或處于疾病的某一階段。相應地，在某一實施例中，本發明通過從確診病人體內獲取與該病癥相關的被分析物而提供了一種該病癥的診斷方法。例如，某病人被懷疑患上腫瘤，本發明中的方法就可用于檢測樣品中是否含有已知腫瘤細胞(而非正常細胞)的一種或多種表征蛋白質。同樣，如果某病人被懷疑接觸了傳染性物質，就可以檢測與該傳染物質相關的蛋白質，例如，如果某病人被懷疑感染了HIV，就可以檢測樣品中是否含有與HIV相關的蛋白質，如GP120MN。
確定并合成出與挑選的被分析物特定相關的適體，適體被熒光標識后附著在陣列中的載體上以用于檢測被分析物。以上述方法測定適體的熒光各向異性之后，將適體與從病體取來的樣品相聯結，如果與樣品相聯結的特定適體的熒光各向異性發生變化，則表明樣品中含有與該特定適體相關的被分析物。
同樣，本發明的分析方法可用于評價對被病體的治療效果。例如，在對病體治療前后通過檢測病人的生物樣品中是否含有與病癥相關的特定的被分析物，就可以得知某一特定資料方法的效果。
另一實施例中，該發明提供了一種比較兩個或以上細胞或細胞群內特定蛋白質表征的方法。該方法包括對樣品(如有機體內表征物或其片斷的一個或多個細胞)中的多種不同蛋白質進行平行分析。將表征本發明適體陣列特定蛋白質的待分析樣品進行培養，檢測樣品中是否含有相應的蛋白質和/或其含量。該方法中還可以有附加步驟表征出與陣列中至少一種適體相粘合的蛋白質的特性。此外還可以檢測被分析物而不是蛋白質的存在，如代謝物。
該方法可以比較細胞或細胞群蛋白質的表征方式，在各種隨機情況下，某種控制細胞或細胞群蛋白質的表征方式。例如，可用于比較癌細胞和控制細胞(群)的不同蛋白質表征方式。再例如，不同的狀況可以是將某種細胞(群)進行病毒感染，對細胞(群)進行緊張性刺激，或對細胞(群)施以藥物，例如潛能性治療(potential therapeutic)。在這種比較中，將含有表征物質(或其片斷)的第一種細胞(群)的樣品與適體陣列在適合蛋白質粘合的條件下進行培養，同樣，將含有表征物質(或其片斷)的第二種細胞(群)的樣品與第二種適體陣列(和第一種適體陣列一樣)一起進行培養。通過對第一種熒光標記的適體粘合物進行熒光各向異性變化測定而確定出其蛋白質的種類，再與相應的第二種蛋白質種類進行比較。
這種比較兩種細胞(群)的不同蛋白質表征的方法可用于潛在的新型藥物靶點(drug target)的確認以及藥物篩選(drug screening)。特別是，該方法可用于確定在某種疾病下細胞(如腫瘤細胞而非普通細胞)中的蛋白質是否過渡表征，這樣的蛋白質將成為藥物干涉的目標，如對這些不同表征的蛋白質施加抑止劑。
本發明中對該適體的分析還可用于評估某種特定藥物的效果和特異性。例如，處于特定藥物環境下的細胞(群)中的特定蛋白質的表征方式可以與沒有處于特定藥物環境下的細胞(群)中的特定蛋白質的表征方式相比較。
另一實施例中，該陣列可被用于確定某種疾病或疾病階段與特定蛋白質表征之間的關系。
本技術領域的專業人員對本發明所描述的方法能夠毫無困難地進行特殊應用。
實施例下述例證僅用于解釋本發明而并不能以任何方式限制本發明的范圍。
本說明書所引用的專利和參考文獻是指其整體。
實施例一A.一種粘合在含適體微珠上的蛋白質的分析方法粘附在特定蛋白質上帶有染料標記的適體其偏振各向異性隨著時間而改變。對三種鍵合在載體上的這種適體的熒光各向異性的變化情況進行了測量。
本實驗所用的三種熒光標識適體分別是從人體血漿提取的特定抗凝血酶適體(FAM標識，15mer)，特定于HIV-1蛋白質GP120MN的518適體(FAM標識，60mer)，以及特定于人類重組細胞堿性蛋白FGF的650適體(FAM標識，60mer)。
1.用于凝血酶的抗凝血酶適體對凝血酶和FAM標識的抗凝血酶適體粘合物進行測量。將購至于邦斯(Bangs)實驗室(俄亥俄州，美國)的5毫米硅石微粒在100℃1N的NaCl溶液中預處理1小時，接著將硅石微粒和3-胺基丙基三乙氧基硅烷(APTES；西格馬(Sigma)，美國)一起處理30分鐘，再用200標準強度的酒精稀釋至10mM。反應完成后，用酒精沖洗微粒3次再于60℃下置于Vacufuge(Eppendorf，德國)中通宵烘干。烘干后的硅烷化微粒在40℃下在DMF內用10mM的Bis(thiopropyl N-hydroxy succinidimyl)溶液(Sigma，美國)處理30分鐘，接著用酒精和DMF迅速沖洗。15mer的5’端C6-氨基鏈和3’端FAM的抗凝血酶適體用AB1340合成器合成而得，并經高性能液體色譜(HPLC)純化。10毫克的活性硅石微珠和硅烷以及NHS連同100Elm的適體在4℃下培養12小時。樣品經沖洗后真空干燥。
在偏振實驗中，100mg/ml的粘附有FAM標識的抗凝血酶適體的微珠的磷酸緩沖溶液(PBS)在環境條件下放置于160微升的石英試管中。試管置于SPEX Flurolog熒光計(新澤西州，美國)進行偏振測定。實驗過程中在樣品中混入一小塊磁激發條。向含適體微珠溶液中添加不同濃度的被分析凝血酶。在實驗過程中記錄不同時刻的偏振或各向異性值。
2.相應于GP120MN蛋白質的518適體本實驗測定GP120MN蛋白與粘附有518適體的微珠的粘合體。5’端C6-氨基鏈和3’端FAM的518適體用AB1340合成器合成而得。接著被標識的適體經HPLC純化。活性硅石微珠以上述方法制成并用100納米被標識的518適體在40℃下處理12小時。樣品經沖洗后真空干燥。
含有經FAM標識的518適體的微珠與GP120MN蛋白的粘合物的偏振實驗同上述方法一致。
3.相應于人體重組細胞FGF堿性蛋白的650適體本實驗測定人體重組細胞FGF堿性蛋白與粘附有650適體的微珠的粘合體。5’端C6-氨基鏈和3’端FAM的650適體用AB1340合成器合成而得并經HPLC純化。活性硅石微珠以上述方法制成并用100納米被標識的650適體在40℃下處理12小時。樣品經沖洗后真空干燥。
含有經FAM標識的650適體的微珠和人體重組細胞FGF堿性蛋白的粘合物的偏振實驗同上述方法一致。
B.蛋白質與含適體微珠粘合物的實驗結果對上述蛋白質與附著有5微米適體微粒的粘合物進行熒光各向異性測定。該分析所用的是附著在硅膠微粒上的3’端FAM標識的5’氨化抗凝血酶。附著有適體的凝血酶置于凝血酶蛋白質中，再測定熒光各向異性的變化情況。加入100nM的凝血酶后觀測到了各向異性的增大(如圖1)。這種變化類似于對含有凝血酶和凝血酶適體的粘合物溶液的觀測結果。在對非特異性溶解酵素粘合物、各種非特異性陽離子蛋白質適體的粘合物的分析中也觀測到同樣的結果(圖1)。
518適體(60mer)是與GP120MN(HIV-1)蛋白質相特定的。添加100nM的GP120后，觀測到熒光各向異性有大幅的增加(圖2)。該增加顯著大于并明顯區別于向非特定粘合物中添加1mg/ml的BSA或100nM的凝血酶的熒光各向異性測定結果。同時也觀測了溶解酵素與含FAM-518適體微珠的粘合體(圖3)。溶解酵素與FAM-518適體的粘合物在添加0.5％SDS的情況下是可逆的(圖4)。
權利要求
1.一種測定樣品中被分析物的方法，其特征在于，含有以下步驟(a)在樣品上聯結綁定有熒光團標識適體的載體；(b)用偏振光激發所述適體；(c)測量熒光團的熒光各向異性；并(d)當所測定的熒光各向異性大于沒有樣品的空白試驗所測量的各向異性時，就可以確定被分析物是否存在或含量。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述載體是微珠。
3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述微珠是硅石微珠。
4.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述微珠的直徑在1微米到10微米之間。
5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，所述微珠的直徑約為5微米。
6.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述微珠懸浮于溶液中。
7.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述微珠呈二維陣列分布。
8.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述適體含有10到100個核苷酸。
9.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，標識所述適體的熒光團從熒光素衍生物，四溴熒光素衍生物，香豆素衍生物或玫瑰精衍生物中選出。
10.根據權利要求9所述的方法，其特征在于，所述適體是經羧基熒光素標識。
11.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述適體是一個適體陣列中的一部分。
12.根據權利要求11所述的方法，其特征在于，所述陣列中含有兩個或兩個以上可設定地址的特定區域。
13.根據權利要求12所述的方法，其特征在于，每一可設定地址的特定區域內含有單一種類的適體。
14.根據權利要求12所述的方法，其特征在于，每一可設定地址的特定區域內含有多個種類的適體。
15.根據權利要求14所述的方法，其特征在于，每一適體標識有具獨特光譜特性的熒光團。
16.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述偏振光是激光。
17.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述被分析物與一種病癥有關。
18.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述樣品是從被懷疑患有某種病癥的病人采集而得。
19.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述被分析物是蛋白質。
20.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述被分析物是代謝物。
21.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述樣品采集于人體而被分析物與一種病癥相關。
全文摘要
本發明涉及通過測量由于被分析物與特定適體結合而產生的熒光各向異性來檢測樣品中的一種或多種被分析物的方法。所述適體固定于載體，并可以為陣列形式。
文檔編號G01N21/76GK1672050SQ03818456
公開日2005年9月21日 申請日期2003年7月28日 優先權日2002年8月2日
發明者邁克爾·M·塞克, 勞倫斯·格林菲爾德 申請人:美國艾培拉公司